Summary
이 단계별 프로토콜 실험 설정 및 hiPSC-ECs에 염증 반응의 평가 대 한 데이터 분석 및 생리 적 흐름에서 백혈구 접착의 분석에 대 한 자세한 설명을 제공합니다.
Abstract
내 피 세포 (ECs) 제한 하거나 upregulated 인 프로 접착제 수용 체의 특징이 잘 캐스케이드를 통해 영향을 받는 조직으로 백혈구 신규 모집을 촉진 하 여 선 동적인 응답의 규칙에 대 한 필수적입니다에 염증 성 방 아 쇠에 따라 백혈구 세포 표면입니다. 과 선 동적인 응답 다 인구에 있는 개인 사이 유전 배경이 이러한 차이에 기여할 수 있다. 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs) 따라서 셀 유전자 id와 어떤 유전 이체의 무제한 소스 또는 기증자의 변이 나타내는 ECs (hiPSC-ECs)의 신뢰할 수 있는 원본으로 표시 되었습니다. hiPSC-ECs 따라서 기증자 특정 셀에 선 동적인 응답 모델링에 대 한 사용할 수 있습니다. 선 동적인 응답 생리 흐름 아래 hiPSC ECs에 백혈구 접착을 결정 하 여 모델링할 수 있습니다. 이 단계별 프로토콜 실험 설정 및 hiPSC-ECs에 염증 반응의 평가 대 한 데이터 분석 및 생리 적 흐름에서 백혈구 접착의 분석에 대 한 자세한 설명을 제공합니다.
Introduction
염증은 많은 병 적인 조건, 포함 심장 혈관 및 신경 퇴행 성 질환, 패 혈 증 및 불리 한 약물 응답 (ADRs)에서 중추적인 역할을 한다. 내 피 세포 (ECs) 전자 selectin, 세포 접착 분자 1 (ICAM-1) 등 혈관 세포 접착 분자-1 (VCAM-1) 그들의 표면에 프로 접착제 수용 체의 유도 통해 선 동적인 응답 조절에 필수적인 역 1 , 2. 다른 직물에 microvascular ECs 전시 선 동적인 응답3,4이 알려져 있습니다. 또한, 유전적 배경이 나 특정 유전 조건이 발생할 수 있습니다 개인; 염증 성 반응 차이 그러므로 다른 개인에서 ECs의 접근이 중요 하다. 최근, 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)5, 거의 모든 개인에서 파생 될 수 있는, 더 안정적이 고 재생 소스 ECs6,,78, 의 역할을 표시 했다 9. 따라서, 선 동적인 응답 및 hiPSC-ECs에 백혈구 신규 모집의 평가 뿐만 아니라 특정 유전 질환의 모델링을 위한 귀중 한 뿐만 아니라 간 개별 다양성의 표시를 제공 하 고를 위한 도구로 사용 하 맞춤된 의학 미래.
흐름 분석 공부 내 피 백혈구 상호 작용에 대 한 유용한 도구를 제공 합니다. 미세 장치에 진보 혈관 침대 전용 전단 응력 레벨의 정확한 제어와 생리 유체 흐름 조건의 재생산 가능 라이브 이미징 백혈구 캡처, 압 연, 크롤링, 접착 및 환생의 이벤트의 캐스케이드의 모니터링 가능 그러나 내 피-백혈구 상호 작용 연구를 몇 가지 흐름 분석 실험 개발 되었습니다, 그리고, 그들은 모두 기본 ECs10,11,,1213활용. 여기, 우리는 자세히 설명 hiPSC-ECs 생리 흐름 아래에 인간 백혈구 접착의 평가 대 한 분석 결과. 이 절차에서는 우리는 8 개의 병렬 채널 미세 칩에 시드 종양 괴 사 인자 알파 (TNFα), 분리, 같은 프로-염증 성 자극으로 hiPSC EC 자극의 최적화 조건 설명 합니다. 우리는 미세 칩에 붙일 레이블된 백혈구 중단 hiPSC-ECs의 관류에 대 한 단계별 프로토콜을 설명 하 고, 라이브 셀 이미징 부착 백혈구의 계산 자동화.
이 프로토콜은 hiPSC-ECs 약물 스크리닝, 질병 모델링 및 개인된 재생 의학에에서 선 동적인 응답의 평가 대 한 유용 합니다.
Protocol
1입니다. 솔루션 및 시 약의 준비
- 혈소판 가난한 플라스마 파생 된 혈 청 (1%), 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자 (bFGF, 20 ng/mL) 및 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF, 50 ng/mL)을 인간의 Endothelial-SFM (참조 테이블의 추가 하 여 완전 한 인간의 Endothelial SFM 매체 (EC SFM 전체)를 준비 재료). 매체는 0.22 μ m 기 공 필터를 통해 필터링 하 고 최대 2 주까지 4 ° C에서 그것을 저장.
- 소 태아 혈 청 (10%)를 추가 하 여 완전 한 RPMI 매체를 준비 2-mercaptoethanol (0.05 nM), L-글루타민 (1%), 페니실린 스 (25 U/mL) RPMI 매체 ( 재료의 표참조). 4 ° C에서 최대 3 주 동안 저장 합니다.
2. 코팅의 미세 칩
- 10 cm 멸 균 페 트리 접시에 무 균 바이오를 놓습니다.
- 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 없이 캘리포니아2 +/Mg2 + 를 50 µ g/mL의 최종 농도에 재고 솔루션을 재구성 하 여 fibronectin 작업 솔루션을 준비 합니다. 바이오 칩 당 작업 솔루션의 80 µ L을 추정 합니다.
- 바이오 칩의 각 채널에 fibronectin 작업 솔루션의 10 µ L를 주사. 한 피 펫을 사용 하 여 작은 10 µ L 팁 그리고 채널 입구와 피 펫 팁 (그림 1C, 왼쪽) 사이의 긴밀 접촉을 형성 해야 합니다.
- 포함 하는 바이오 페 트리 접시의 뚜껑을 닫고 습도 챔버 (그림 2B)에 배치 합니다. 밤새 4 ° C에서 챔버를 저장 합니다. 챔버 축이다, 습도 챔버의 바닥에 깨끗 한 휴지를 배치 하 고 살 균 H2o.의 5 mL을 추가
- 다음 날, 분석 결과, 전에 미리 인큐베이터에서 37 ° C에서 바이오 따뜻한.
3입니다. hiPSC-ECs의 준비
참고: 여기에 설명 된 프로토콜에서 hiPSC-ECs 분화, 정화, cryopreserved 이었고 앞서 설명한8로 해 동.
- 눈 녹은 물 및 플레이트 hiPSC-ECs 한 0.1% 젤라틴 코팅 T75 플라스 크, 3 ~ 4 일 사전 분석 결과에 완전 한 EC SFM 전체에.
- 분석 결과, 이전 밤 EC SFM 전체 10 ng/mL TNFα 보충을 추가 하 여 TNFα와 hiPSC-ECs를 자극 하 고 품 어 앞에서 설명한 737 ° C에서 하룻밤 (h ~ 12).
4. hiPSC-ECs 분리와 미세 칩에 시드
- 분석 결과의 날, 인큐베이터에서 hiPSC-ECs의 플라스 크를 걸릴 하 고 현미경 세포를 검사 하십시오. HiPSC-ECs는 80-100% 합칠 전형적인 EC와 같은 형태를가지고 확인 하십시오.
- 셀 문화 후드에 플라스 크를 전송 합니다.
- HiPSC-ECs의 플라스 크에서 중간 발음
- 짧게 없이 Ca2 +/Mg2 +PBS의 10 mL를 추가 하 여 셀 문화를 씻어. PBS 발음
- 1 x 분리 효소의 플라스 크 당 4 mL를 추가 합니다. 실 온 (RT) (그림 1B)에서 5 분 동안 품 어.
- 플라스 크 당 인간의 Endothelial SFM 매체의 8 mL을 추가 하 여 분리 반응을 중지 합니다. 부드럽게 분리 하 고 5 mL 피 펫을 사용 하 여 15 mL 원뿔 튜브에 hiPSC-ECs 정지를 수집 합니다.
- 현 탁 액에 있는 셀의 총 수를 계산 합니다.
- 실시간에서 3 분에 대 한 300 x g 에서 세포를 원심
- 발음은 상쾌한 고 107 셀/mL x 1.5의 최종 농도에 EC SFM 전체에 셀 펠 릿을 resuspend.
- 인큐베이터에서 바이오와 페 트리 접시를 꺼내와 셀 문화 후드에 그것을 전송.
- 미세 칩의 모든 채널에서 fibronectin 솔루션 발음
- 작은 10 µ L 팁 (그림 1C, 중간)는 피 펫을 사용 하 여 각 채널에 세포 현 탁 액의 6 µ L를 삽입할. 세포 현 탁 액 주입의 앞에 잘 혼합 되어 있는지 확인 하 고 셀 강수량을 피하십시오.
- 바이오 현미경 검사와 세포는 균일 하 게 배포 하 고 셀 밀도 높다 (그림 2C).
- 37 ° c.에 15 분 동안 바이오 칩을 품 어
- 각 채널의 양쪽에서 중간 저수지로의 EC SFM 전체 40 µ L를 추가 합니다.
- 37 ° C (그림 1C, 오른쪽)에서 1 시간에 대 한 바이오를 품 어.
- 각 채널의 양쪽에서 저수지로 EC SFM 전체의 또 다른 50 µ L를 추가 합니다.
5입니다. 인간 백혈구의 준비
참고: 여기에 설명 된 프로토콜에서 상용 monocytic 셀 라인 (THP-1) 사용 되었다. 또는 주변 혈액 단 세포 또는 호 중구를 사용할 수 있습니다. 말 초 혈액에 monocytes 그리고 호 중구의 격리 표준 절차11를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 셀 문화 후드에이 단락에 설명 된 모든 단계를 수행 합니다.
- 50 mL 원뿔 튜브에 백혈구를 수집 합니다.
- 없이 Ca2 +/Mg2 +PBS의 10 mL와 함께 백혈구를 씻어. RT (그림 1D)에서 3 분에 대 한 300 x g 에서 셀 원심
- 상쾌한 발음 및 DiOC6 염료와 PBS의 1 mL에 셀 펠 릿 resuspend (ex λ = 485 nm, λem 501 = nm) (1:5, 000). 실시간에서 10 분 동안 어둠 속에서 셀을 품 어
- 없이 Ca2 +/Mg2 +PBS의 10 mL와 함께 백혈구를 씻어. 원심 실시간 반복 세척 단계에서 3 분에 대 한 300 x g 에서 셀 한 번 더.
- 현 탁 액에 있는 셀의 총 수를 계산 합니다.
- 발음은 상쾌한 고 2.5 x 106 셀/mL의 최종 농도에 완전 한 RPMI 중간에 셀 펠 릿 resuspend.
6입니다. 미세 펌프의 준비
- 8 채널 매니폴드와 미세 펌프를 조립 한다.
- 펌프 설치 운영 소프트웨어를 PC에 연결 합니다.
- 미세 소프트웨어를 시작 하 고 개방형 프로토콜 을 클릭 하 여 프로토콜을 로드할 미세 프로토콜을 선택 하려면 PC에 이동.
- 설치 폴더를 선택 하 고 분석 결과 단계 실행을 클릭 하 여 소프트웨어와 펌프를 연결 합니다.
- 올바른 흐름 속도 제어에 대 한 채널의 형상을 정의: 형상을 설치 폴더에 업데이트 형상 을 선택 하 고 분석 결과 단계 실행을 클릭 합니다.
참고: 주사기와 사용할 채널 형상 정보 일치 하는지 확인 (형상 ID = 1, 채널 수 = 8, 채널 폭 800.0 µ m, 채널 깊이 = 120.0 µ m, 주사기 볼륨 = = 250 µ L)와 샘플의 점도 (액체 점도 = 1.0). - 80%의 에탄올을 포함 하는 50 mL 원뿔 튜브에 유입 케이블 (오렌지)를 배치 하 여 펌프를 씻어. 50 mL 원뿔 빈 관 (폐기물 컨테이너)에서 콘센트 케이블 (녹색)를 배치 합니다.
- 희미하게/펌프 희미하게 폴더 선택 하 고 분석 결과 단계 실행 을 클릭 합니다 (볼륨을 씻어 2000 µ L, 세척 볼륨 단계 = 250 µ L, 희미하게 방향 = = 출력). 한 번 더 세척 단계를 반복 합니다.
- 단계 (6.6-6.7) 인간의 Endothelial SFM 문화 매체와 셀 문화 학년 물, 세척 펌프를 반복 합니다.
- 매니폴드의 세척 단계로 진행 합니다.
- 수동으로 올바른 위치 (표시 OFF 는 왼쪽 설정 되어)에 3 방향 어댑터를 배치 하 여 주사기와 매니폴드 사이의 밸브를 엽니다.
- 희미하게/매니폴드 세척 폴더에서 설정 전류 채널/오픈 단계를 선택 하 고 모든 밸브 매니폴드의 열 분석 결과 단계 실행 을 클릭 합니다.
- 뒤 셀 문화 학년 물 5 mL 주사기에서 80% 에탄올 5 mL를 눌러 수동으로 매니폴드를 씻어.
- 인간의 Endothelial SFM 문화 매체의 5 mL 주사기에서 밀어 매니폴드를 씻어.
- 매니폴드에 갇혀 있다 모든 큰 공기 방울을 제거 합니다. 이렇게 하려면 8 잘 핀 어댑터 10 cm는 매체와 페 트리 접시에 놓고 모든 큰 공기 방울 사라 때까지 주사기와 밀고/당기 수행 (작은 거품 문제 되지 않습니다).
- 희미하게/매니폴드 세척 폴더에서 설정 전류 채널/닫기 단계를 선택 하 고를 닫습니다 모든 밸브 매니폴드의 분석 결과 단계 실행 을 클릭 합니다.
- 매니폴드 어댑터에 펌프에서 녹색 콘센트 케이블을 연결 합니다.
- 3-방향 밸브를 닫습니다 주사기 OFF 위치로 다시 전환 합니다.
- 희미하게/케이블 희미하게 폴더를 선택 하 고 각 케이블에서 모든 거품 제거는 보장 RPMI 매체와 각 포트를 개별적으로, 세척을 실행 분석 결과 단계 클릭 (볼륨 분배 = 100 µ L).
참고: 각 밸브 매니폴드의 열린된 한--하나, 매체의 8, 그리고 100 μ 1은 적절 하 게 각 개별 채널을 통해 폐쇄 다른 채널을 유지 하는 동안. 액체 각 핀에서 실행 하는 것 다는 것을 확인 하십시오. 아무 액체 나오는 경우에, 공기 방울이 또는 한 덩어리의 표시입니다.
7. 준비에 대 한 미세 칩의 라이브 영상
- 미세 설정 준비, 라이브 이미징 챔버는 37 ° C에 미리 equilibrated 그리고 CO2 의 수준에 도달 5% (그림 3A, B) 확인 합니다.
- 바이오 인큐베이터에서가지고 고에 현미경 칩 홀더 위치. 이미징 단계 (그림 3C) 현미경에 칩 홀더를 탑재 합니다.
- 매니폴드를 통해 펌프에는 바이오 칩을 연결 하기 위해 칩의 콘센트 저수지 주변 8-핀 어댑터를 배치 및 매체에서 모든 핀을 깊게 (하지만 완전히 연결 하지 마십시오).
- 희미하게 선택 | 칩에 연결 폴더와 클릭 RPMI 칩을 연결 하기 전에 매체를 분배 하 실행 분석 단계 (볼륨 분배 30 mL =). 매체는 적절 하 게, 일단 8 핀 어댑터를 바이오 칩의 콘센트에 넣습니다.
참고: 이 단계 동안 모든 채널에 (개방)로 설정 되어 하 고 매체의 30 µ L 각 채널을 통해 적절 하 게이 채널 오프 (폐쇄)으로 설정 됩니다. 그러면 그 공기 거품이 미세 칩의 채널에 소개 될 것 이다. - 수동으로 매체를 피펫으로와 바이오 칩의 모든 입구 저수지에서 발음.
- 희미하게 선택 | 희미하게 칩 폴더와 클릭 실행 분석 결과 단계 각 채널에서 죽은 세포/이물질 제거 하 한 채널을 통해 EC SFM 전체 매체의 40 mL perfuse (희미하게 볼륨 40 µ L, 최대 희미하게 전단 = = 40 다 인/cm2).
8. 흐름 접착 분석 결과 및 이미지 수집
- 수동으로 매체는 피 펫에 대 한 관심의 채널의 입구 저수지에서 발음.
- 관심의 채널의 입구 저수지에 단계 5.6에서 백혈구의 100 µ L를 추가 합니다.
참고: 부드럽게 세포를 단일 세포 현 탁 액을 혼합. - 셀 분석 결과에서 | 설명 단계 폴더, 설정 전류 채널/단계 설명 , 채널 목록에서 관심만 현재 채널 선택 및 설정 에 (오픈) 선택한 설정 다른 모든 7 채널 오프 (폐쇄).
- 세포 분석 실험을 선택 | 설명 단계 폴더와 클릭 분석 결과 단계 실행.
참고: 그 5 분에 대 한 채널을 통해 입구 저수지에서 백혈구 정지를 지속적인 부정적인 압력 적용 변수 흐름 율 분배 확인 (세트 전단 = 상수, 전단 응력 =-0.5 다 인/cm2, 기간 = 00시 05분: 00, 스캔 지연 = 00시: 00). 전단 응력의 음수 값 흐름의 올바른 방향을 보장합니다. - 입구 저수지에서 나머지 백혈구 발음
- 입구 저수지에 완전 한 RPMI 매체의 100 µ L를 추가 합니다. 셀 분석 결과/단계 설명 폴더 선택 하 고 모든 비 점착 백혈구에 밖으로 세척 하기 위하여 5 분 RPMI 매체와 채널을 perfuse를 분석 결과 단계 실행 클릭 (설정 전단 = 상수, 전단 응력 =-0.5 다 인/cm2, 기간 = 00: 05:00, 스캔 지연 = 00시: 00).
- 적어도 3 ~ 4 (대표 지역 캡처되는지 확인) 하 준수 백혈구의 이미지를 채널의 다른 위치에서 이미지를 취득 합니다.
- 채널의 모든 나머지의 기능 평가 위한 8.1-8.7 단계를 반복 합니다.
참고: 여러 개의 채널을 한 번에 실행 가능 하다. 이렇게 하려면 단계 8.3 동안 관심의 모든 채널을 엽니다. 그리고 관심의 여러 채널에 대 한 모든 전술 단계 8.4 –8.7을 수행.
9. 분석 결과 완료 하 고 미세 펌프 청소
- 실험을 완료 한 후 수출 하 고 RAW 포맷으로 모든 이미지를 저장 합니다.
- 결과 저장 하는 동안 미세 펌프 및 매니폴드 프로토콜을 청소를 실행 합니다.
- 미세 펌프에 대 한 셀 문화 학년 물 4 mL perfusing에 의해 희미하게/펌프 희미하게 폴더를 먼저 실행 하는 방법, 80%의 4 mL 뒤 에탄올 6.6-6.7 단계에 설명 된 대로 몇 분 동안 공기를 실행 하 여 펌프 건조.
- 매니폴드를 청소 하기 위해 주사기와 희미하게/매니폴드 세척 단계를 실행 합니다. 셀 문화 학년 물으로 주사기와 80% 에탄올으로 처음 단계 6.10-6.11 세척에 설명 및 다음 매니폴드 밸브를 열고 단계를 따릅니다. 주사기를 통해 공기를 밀어 매니폴드를 건조. 단계 6.10 및 6.15에 설명 된 대로 주사기 밸브와 매니폴드 밸브를 닫습니다.
10. 부착 백혈구의 계산
- 다운로드 및 이미지 프로세싱 소프트웨어14 http://cellprofiler.org에서 설치.
참고: 이 연구에서 처리 하는 이미지 소프트웨어 버전 2.1.1 사용 하 여 수행 되었다. 최신 버전을 사용 하는 경우 파이프라인 부 적응이 필요할 수 있습니다. - 파이프라인 Count_leukocytes.cpipe. 다운로드 파일을 클릭 | 가져오기 | 파이프라인 파일에서 Count_leukocytes.cpipe파이프라인을 선택 하는 PC에 이동.
- 드래그-앤-드롭 입력 모듈에 파일 목록 창에 부착 백혈구의 인수 RAW 이미지와 폴더 | 이미지 분석에 대 한 섹션.
- 분석 모듈을 통해 백혈구의 전형적인 크기 지정 | IdentifyPrimaryObjects. 부착 백혈구의 최소 및 최대 직경 픽셀 단위로 지정 합니다.
- 분석 모듈을 통해 필터링 조건을 선택 | FilterObjects. 픽셀에서 개체의 최소 허용된 영역을 지정 합니다.
- 분석 이미지 버튼을 눌러 분석을 시작 합니다.
참고: 모든 RAW 이미지 처리, 그리고 결과 기본 출력 폴더에 저장 됩니다. Image.txt 출력 파일에는 각 처리 이미지 (각 번호 하나의 이미지, 즉, 각 취득된 보기의 필드에 해당)에 부착 백혈구 수가 포함 되어 있습니다.
Representative Results
첫째, hiPSC-ECs의 TNFα를 시험 한다, 프로-염증 성 에이전트와 함께 자극 응답은 이전7을 설명 합니다. 12 h에 대 한 TNFα 치료는 치료 시작 후 6 h에서 피크와 전자 selectin의 upregulation를 트리거합니다. 또한, ICAM-1 upregulated 6-12 h 후 처리입니다. 비록 우리가 VCAM-1의 예상된 upregulation를 관찰 하지 않았다, 일반적으로 기본 인간 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVECs)에서 관찰 된다. 우리는 백혈구 접착 분석 결과 대 한 가장 편리한 수에 하룻밤 (12 h) TNFα 치료를 발견.
최적의 hiPSC-ECs 분리 한 단일 세포 현 탁 액 셀 덩어리의 무료 발생 한다. 그림 2C 주입 후 바로 최적의 hiPSC-EC 밀도를 보여 줍니다. 일반적으로, 주입 후 15 분, hiPSC-ECs 채널의 하단에 첨부 고 (그림 2D)을 확산 시작 합니다. 1 h 주입 후 hiPSC-ECs는 채널에 따라 잘 확산된 단층을 형성 하 고 흐름 분석 결과 (그림 2E)를 시작할 준비가 될 것입니다.
형광 추적기와 백혈구의 라벨은 도움이 단계에서 이미지 자동 이미지 정량화에 대 한 그것은 쉽게 셀 식별 단계, ECs의 단층에 준수는 백혈구 특히 있기 때문에 그것은 종종 어려운 다른 종류를 구별 하는 소프트웨어에 대 한
무료 오픈 소스 이미지 프로세싱 소프트웨어 부착 백혈구의 자동화 된 정량화에 대 한 매우 유용 합니다. 프로토콜 여기에 설명 된 파이프라인 백혈구 (그림 4A)의 형광 이미지의 적응형 임계 처리를 사용 하 여 기본 개체 식별을 기반으로 합니다. 또한 최소한의 영역을 기반으로 개체를 식별의 필터링 세포 파편, autofluorescence 또는 어떤 다른 일반적인 형광 신호 (그림 4 C, D) 등 잘못 식별 된 개체를 필터링.
8 개의 병렬 채널 미세 칩에 한 두 개의 독립적인 그룹의 비교, 예를 들어, ECs 독립적인 hiPSCs, 건강 한 기증자 등 유전 질환을 가진 환자에서에서 분화. 치료 ECs, 또는 전처리 ICAM-1 차단 항 체와 같은 추가 컨트롤 잘10,11으로 포함 될 수 있습니다. 2 ~ 3 미세 칩은 한 번에 처리할 수 있습니다. 결론의 견고성, 최소 3 개의 독립적인 생물 실험 독립 일에 수행 것이 좋습니다.
그림 1 : HiPSC-ECs 및 백혈구의 흐름 분석 결과 대 한 준비. (A)의 hiPSC-ECs 프로-염증 성 자극 (TNFα)과 사전 치료. (B) hiPSC-ECs 효소 분리, 원심 분리, 및 물의 resuspension의 도식 적인 표현입니다. (C) hiPSC-EC 정지 (C, 중간)의 주입 채널 (C, 왼쪽), 코팅의 도식 표현 세포 미세 칩 첨부 파일 hiPSC-ECs 후 문화 매체 추가. (D) 백혈구 세척 단계, 형광 성 염료 DiOC6와 물의 resuspension 라벨의 도식 적인 표현입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : HiPSC-ECs와 미세 칩. (A) 미세 칩 10 cm 배양 접시에에서. (B) 습도 챔버는 부 화에 대 한 사용. (C, D, E) HiPSC-ECs는 미세에서의 대표 이미지는 주입 후 0 분 (C), 15 분 (D), 1 h (E) 채널. 눈금 막대 = 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 라이브 셀 이미징 및 백혈구 관류 분석 결과의 실험 설정. (A, B) (B)의 라이브 셀 이미징 및 흐름 분석 결과의 실험 설치 사진 (A) 및 회로도 표현: (1)-마운트 라이브 이미징 챔버 (5% CO2, 37 ° C, 습도), (2) 거꾸로 형광 현미경-미세 펌프, (3)-8 채널 매니폴드의 (4)-현미경 제어 및 이미지 수집, (5)-미세 펌프 제어용 PC 대 PC (C) 미세 칩 8 채널 매니폴드에 플레이트 홀더 고정 및 현미경의 전동된 스테이지에의 삽입된 튜브와 함께. (D)의 흐름 분석 결과의 주요 단계 도식 적인 표현입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 이미지 분석 및 부착 백혈구의 자동된 감지. (A) 백혈구의 식별에 대 한 지정 된 설정으로는 소프트웨어를 처리 하는 이미지의 대화 창. (B) 지정 된 필터링 된 이미지 프로세싱 소프트웨어의 대화 창을 기준 확인 된 개체에 따라 최소한의 허용 표면 영역 (SA분 = 70 px). 백혈구의 올바른 식별 및 작은 표면 영역 (SA)의 일반적인 개체의 필터링의 (C) 예 (픽셀 (최소, 최대)에서 전형적인 직경 = (9, 15); 필터링 기준 SA분 = 70 px). 허용된 개체는 녹색으로 묘사 되 고 버려진된 개체는 바이올렛에 묘사 된. 전형적인 직경의 잘못 된 범위 때문에 백혈구의 잘못 된 식별의 (D) 예 (픽셀 (최소, 최대)에서 전형적인 직경 = (3, 15); 필터링 기준 SA분 = 70 px). 허용된 개체는 녹색으로 묘사 되 고 버려진된 개체는 바이올렛에 묘사 된. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
이 프로토콜 hiPSC EC 치료 프로-염증 성 자극, TNFα, hiPSC-ECs 라이브 이미징 및 부착 백혈구의 자동화 된 계산을 사용 하 여 흐름 분석 결과에서 백혈구 접착의 기능 평가 등의 특성을 설명 합니다.
HiPSC-ECs TNFα와의 하룻밤 자극 길쭉한 모양을 일반적으로 ECs에서 활성화 된 프로-염증 성 표현 형을 나타내는 결과. 최적화 단계 식 수준의 전자 selectin, ICAM-1, VCAM 1 FACs7,8, 그리고 기본 인간 탯 줄 정 맥 ECs (HUVECs)에 의해 확인 되어야 한다는 긍정적인 컨트롤로 포함 되어야 하는 것이 좋습니다.
최적의 hiPSC-ECs 분리 및 밀도 시드 confluent 단층 세포 덩어리를 형성 하지 않고 달성 하 고 나 막 신 채널을 도달 한다. 그것은 다시 중단 백혈구 직전 관류 셀 강 수를 방지 하 고 각 채널을 시 금 때 일정 농도 유지 하는 중요 한. 인간 주변 혈액 백혈구, monocytes, 호 중구 등 사용할 수 있습니다, 또는 THP-1 또는 HL-60 대 안으로 사용 될 수와 같은 monocytic 세포 라인을 설립.
미세 설정의 어셈블리 그리고 흐름 분석 결과, hiPSC-ECs 부착 백혈구의 분리 될 수 있습니다으로 미세 튜브와 채널에 갇혀에서 기포를 방지 하기 위해 중요 하다. 액체-액체 인터페이스 또는 미세 설정의 준비 하는 동안 추가 세척 단계 관 기포를 방지 하기 위해 도울 수 있었다.
그것은 프로토콜 어디 하나 셀을 준비 하 고 두 번째 준비 미세 시스템 및 흐름 분석 결과 두 연산자에 의해 실행 되는 것이 좋습니다. 이렇게 하면 ECs는 처리 하기 전에 일정 시간 창 내에서 미세 칩으로 도금 및 정확성과 결과의 재현성을 향상 시킵니다. 또한,이 또한 멀게 실험 결과에서 바이어스를 방지 하려면 설정을 수 있습니다.
자동화 이미지 처리 파이프라인으로 성공적인 셀 검출, 높은 신호 대 잡음 비율 초점에서 이미지 하 고 셀 덩어리 같은 일반적인 개체의 autofluorescence를 피하기 위하여 중요 하다. 중요 한 중요성 확인 될 필요가 있는 부착 백혈구의 전형적인 크기의 최소 및 최대 한계의 정확한 사양이 이다. 하나 ImageJ의 선 측정 도구를 사용 하 여 백혈구의 일반적인 크기를 예측할 수 있습니다. 예를 들어, 우리의 분석에서 우리는 10.3-17.1 µ m (그림 4C)의 실제 크기에 해당 하는 9-15 픽셀의 범위를 사용. 잘못 된 범위, 예를 들어, 3-15 픽셀 (3.4-17.1 µ m)를 사용 하는 경우 단일 백혈구 하나의 셀으로 식별 됩니다 하지만 오히려 그 분할할 별도 개체 (그림 4D)로 식별 됩니다. 이것은 개체의 잘못 된 번호를 식별할 수 있습니다.
많은 개체의 낮은 강도 및 작은 표면 지역 보다 백혈구 제공된 적응형 임계 처리 방법을 사용 하 여 검색 될 수 있습니다. 이 때문에 autofluorescence 또는 다른 일반적인 형광 신호를 걸릴 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 이러한 일반적인 개체, 그들의 지역 단일 백혈구의 일반적인 영역 보다 작은 경우 필터링 수 있습니다 최소 허용된 표면 영역 (그림 4C)를 정의 하 여.
여기에 설명 된 흐름 분석 결과 수 elucidating이 두 세포의 상호 작용 하는 EC 단층에 백혈구 접착의 직접 평가 유형, 하지만 다른 세포 유형, pericytes는 혈관 벽에 존재와 같은 및 또한 수를 고려 하지 않습니다. 백혈구 넘쳐 흐름15의 규정에 참여 합니다. 다른 세포 유형 3 차원 문화 microenvironment 통합 시스템의 생리 적인 관련성 향상 시킬 수 있습니다. 이러한 제한에도 불구 하 고 여기에 설명 된 선 동적인 응답의 평가 대 한 흐름 분석 결과 제공 합니다 유용한 도구 기본 특성 및 질병에 대 한 hiPSC-ECs의 모델링 응용 프로그램을.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 다음 보조금을 인정 하 고 싶습니다: 유럽 연구 위원회 (ERCAdG 323182 STEMCARDIOVASC); 네덜란드 기관-온-칩 이니셔티브, 교육, 문화 및 과학 네덜란드 (024.003.001)의 정부에 의해 투자 하는 NWO 중력 프로젝트.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vena8 Endothelial+ biochip | Cellix Ltd | V8EP-800-120-02P10 | |
| Mirus Evo Nanopump | Cellix Ltd | MIRUS-EVO-PUMP | 1 x syringe pump; 1 x VenaFluxAssay Software; 1 x tubing kit; power supply and cables. |
| 8-channel manifold MultiFlow8 | Cellix Ltd | MIRUS-MULTIFLOW8 | |
| Humidified box | Cellix Ltd | HUMID-BOX | |
| Fluorescence imaging system Leica AF6000 | Leica Microsystems | ||
| Electron-multiplying charge-coupled device camera | Hamamatsu | C9100 | |
| Biological safety cabinet/laminar flow-hood | Cleanair | ||
| CO2 cell-culture incubator | Panasonic | MCO-170AICUV | |
| Centrifuge | Hitachi | himac-CT6EL | |
| Handheld pipetman (P-10 (10 mL), P-200 (200 µL), P-1000 (1,000 µL) | Gilson international | 4807 (10µl), 4810 (200µl), 4809 (1000µl) | |
| Sterile plastic pipette | Greiner Bio-One | 606180 (5ml), 607180 (10ml) | |
| Petri dish | VWR/ Duran Group | 391-0860 | |
| Culture flasks (75 cm2) | CELLSTAR | 658,170 | |
| Centrifuge tube (15 mL) | CELLSTAR | 188271 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin from porcine skin, type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Fibronectin (Bovine plasma) | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-169 | |
| Human Endothelial-SFM | Life Technologies | 11111-044 | |
| Human VEGF 165 IS, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-109-386 | |
| Human FGF-2, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-093-842 | |
| Platelet-poor Plasma Derived Serum, bovine | Biomedical Technologies | BT-214 | |
| Recombinant Human TNF-α | Tebu-bio | 300-01A-A | |
| TrypLE Select | Life Technologies | 12563029 | |
| DiOC6(3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 21875-034 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Life Technologies | 31350010 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Life Technologies | 15070-063 | |
| Distilled water | Life Technologies | 15230-089 | |
| Ethanol absolute | Merck | 1.00983.2500 | |
| VCAM-1 | R&D systems | FAB5649P | |
| E-Selectin | R&D systems | BBA21 | |
| ICAM-1 | R&D systems | BBA20 | |
| Name | Company | Software version | Comments |
| Cellrofiler | CellProfiler | 2.1.1 | |
| VenaFluxAssay Software | Cellix Ltd | 2.3.a |
References
- Vestweber, D. How leukocytes cross the vascular endothelium. Nature Reviews Immunology. 15 (11), 692-704 (2015).
- Hajishengallis, G., Chavakis, T. Endogenous modulators of inflammatory cell recruitment. Trends in Immunology. 34 (1), 1-6 (2013).
- Molema, G. Heterogeneity in endothelial responsiveness to cytokines, molecular causes, and pharmacological consequences. Seminars in thrombosis and hemostasis. 36 (3), 246-264 (2010).
- Aird, W. C. Endothelial Cell Heterogeneity. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), a006429 (2012).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 1-16 (2016).
- Lin, Y., Gil, C. H., Yoder, M. C. Differentiation, Evaluation, and Application of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Endothelial Cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (11), 2014-2025 (2017).
- Halaidych, O. V., Freund, C., et al. Inflammatory Responses and Barrier Function of Endothelial Cells Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. , (2018).
- Orlova, V. V., vanden Hil, F. E., Petrus-Reurer, S., Drabsch, Y., ten Dijke, P., Mummery, C. L. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (6), 1514-1531 (2014).
- Orlova, V. V., Drabsch, Y., et al. Functionality of endothelial cells and pericytes from human pluripotent stem cells demonstrated in cultured vascular plexus and zebrafish xenografts. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (1), 177-186 (2014).
- Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress. Journal of Visualized Experiments. (85), 1-6 (2014).
- Muller, W. A., Luscinskas, F. W. Assays of transendothelial migration in vitro. Methods in enzymology. 443, 155-176 (2008).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions. Journal of Visualized Experiments. (66), 1-5 (2012).
- Vajen, T., Heinzmann, A. C. A., et al. Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets. Journal of Visualized Experiments. (134), (2018).
- Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte Migration into Inflamed Tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
