Summary
Denne trinnvise protokollen gir en detaljert beskrivelse av eksperimentelle oppsett og dataanalyse for vurdering av inflammatoriske svar i hiPSC-ECs og analyse av leukocytter vedheft under fysiologiske flyt.
Abstract
Endotelceller (ECs) er avgjørende for regulering av provoserende svar begrense eller tilrettelegge leukocytter rekruttering til berørte vev via en godt karakterisert kaskade av Pro lim reseptorer som er upregulated på den leukocytter celleoverflaten på inflammatorisk utløseren. Inflammatorisk svar varierer mellom individer i befolkningen og genetisk bakgrunnen kan bidra til disse forskjellene. Menneskelige indusert pluripotent stamceller (hiPSCs) har vist seg å være en pålitelig kilde til ECs (hiPSC-ECs), dermed representerer en ubegrenset kilde av celler som fange genetisk identiteten og genetisk varianter eller mutasjoner av donor. hiPSC-ECs kan derfor brukes til modellering inflammatorisk svar i donor-spesifikke celler. Inflammatorisk svar kan modelleres ved å bestemme leukocytter vedheft til hiPSC-ECs under fysiologiske flyt. Denne trinnvise protokollen gir en detaljert beskrivelse av eksperimentelle oppsett og dataanalyse for vurdering av inflammatoriske svar i hiPSC-ECs og analyse av leukocytter vedheft under fysiologiske flyt.
Introduction
Betennelse spiller en sentral rolle i mange pathological betingelser, inkludert hjerte og nevrodegenerative lidelser, sepsis og ugunstige narkotika svar (ADR). Endotelceller (ECs) spiller en viktig rolle i å regulere inflammatorisk svar via induksjon av Pro lim reseptorer, som E-selectin, intercellulær adhesjon molekyl-1 (ICAM-1) og vascular celle vedheft molekyl-1 (VCAM-1) på overflaten deres 1 , 2. mikrovaskulær ECs i ulike vev er kjent for å ha heterogenitet i inflammatorisk svar3,4. Videre kan genetisk bakgrunn eller enkelte genetisk resultere i forskjeller i inflammatorisk svar mellom individer; Det er derfor viktig å ha tilgang til ECs fra ulike individer. Mer nylig menneskelige indusert pluripotent stamceller (hiPSCs)5, som kan utledes fra nesten alle individ, ble vist som en pålitelig og fornybar kilde ECs6,7,8, 9. derfor vurdering av inflammatorisk respons og leukocytter rekruttering i hiPSC-ECs er verdifull, ikke bare for modellering av visse genetiske lidelser, men også å gi indikasjoner på Inter-individuelle variasjon og bruke som et verktøy for personlig medisin i fremtiden.
Flyt analyser gir et nyttig verktøy for å studere endothelial-leukocytter interaksjon. Fremskritt innen microfluidic enheter kan gjengivelse av fysiologiske strømningsforhold med nøyaktig kontroll av vaskulær seng-spesifikke skjæring stress nivåer. Live bildebehandling kan overvåking av kaskade av hendelser av leukocytter fange, rullende, gjennomgang, vedheft og transmigration. Flere flyt analyser å studere endothelial-leukocytter interaksjon har blitt utviklet, men de alle bruker primære ECs10,11,12,13. Her vil vi beskrive i detalj analysen for vurdering av menneskelig leukocytter vedheft til hiPSC-ECs under fysiologiske flyt. Her beskriver vi optimalisert betingelser for hiPSC-EC stimulering med pro-inflammatoriske stimuli, som tumor nekrose faktor alpha (TNFα), dissosiasjon, såing i microfluidic brikke med åtte parallelle kanaler. Vi beskriver en trinnvis protokoll for perfusjon av hiPSC-ECs av fluorescently merket leukocytter microfluidic sjetonger, live celle bildebehandling og automatisert telling av tilhenger leukocytter.
Denne protokollen er nyttig for vurdering av inflammatoriske svar i hiPSC-ECs i narkotikarelaterte screening, sykdom modellering og personlig regenerativ medisin.
Protocol
1. forberedelse av løsninger og reagenser
- Forberede fullstendig menneskelig Endothelial-SFM medium (EF-SFM FULL) ved å legge til blodplater-fattige plasma-avledet serum (1%), grunnleggende fibroblast vekstfaktor (bFGF, 20 ng/mL) og vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF, 50 ng/mL) til menneskelig Endothelial-SFM (se tabell av Materialer). Filtrere mediet gjennom et 0.22 µm pore filter og lagre den på 4 ° C 2 uker.
- Forberede komplett RPMI medium ved å legge til fosterets bovin serum (10%), 2-mercaptoethanol (0,05 nM), L-glutamin (1%), Penicillin-Streptomycin (25 U/mL) til RPMI middels (se Tabell for materiale). Lagre på 4 ° C 3 uker.
2. coating av Microfluidic Chips
- Plass et sterilt biochip i en 10 cm sterilt Petriskål.
- Klargjør fibronectin fungerende løsning ved å gjenoppbygge lager løsningen i fosfat-bufret saltvann (PBS) uten Ca2 +/Mg2 + å en final konsentrasjon av 50 µg/mL. Anslå 80 µL av fungerende løsning per biochip.
- Injisere 10 µL av fibronectin fungerende løsning i hver kanal av biochip. Bruke en pipette med små 10 µL tips og sørg for å danne en tett kontakt mellom kanal innløpet og pipette spissen (figur 1 c, venstre).
- Lukk lokket på Petriskål som inneholder biochip og plassere den i en fuktet kammer (figur 2B). Lagre kammeret ved 4 ° C over natten. Humidify kammeret, plassere en ren silkepapir nederst fuktet kammeret og legge til 5 mL steril H2O.
- Dagen før analysen, forvarme biochip på 37 ° C i inkubator.
3. forberedelse av hiPSC-ECs
Merk: I protokollen beskrevet her, ble hiPSC-ECs differensiert, renset, cryopreserved og tint som beskrevet tidligere8.
- Tine og plate hiPSC-ECs i hele EU-SFM FULL i en 0,1% gelatin-belagt MT75 kolbe, tre-fire dager før analysen.
- Natten før analysen, stimulere hiPSC-ECs med TNFα ved å legge EU-SFM FULL med 10 ng/mL TNFα og ruge overnatting (~ 12 h) på 37 ° C, som beskrevet tidligere 7.
4. hiPSC-ECs dissosiasjon og såing til Microfluidic Chip
- På dagen for analysen, ta kolbe av hiPSC-ECs settefiskanlegg og undersøke celler under microscope. Kontroller at hiPSC-ECs er 80-100% confluent og har en typisk EC-lignende morfologi.
- Overføre kolbe til celle kultur panseret.
- Sug opp mediet kolbe av hiPSC-ECs.
- Kort vask i cellekultur ved å legge 10 mL PBS uten Ca2 +/Mg2 +. Sug opp PBS.
- Legge til 4 mL per kolbe av 1 x dissosiasjon enzym. Inkuber i 5 minutter ved romtemperatur (RT) (figur 1B).
- Stoppe dissosiasjon reaksjonen ved å legge til 8 mL av menneskelig Endothelial-SFM medium per kolbe. Forsiktig løsne og samle hiPSC-ECs suspensjon i et 15 mL konisk rør med en 5 mL pipette.
- Tell antall celler i suspensjon.
- Sentrifuge cellene på 300 x g i 3 minutter på RT.
- Sug opp nedbryting og resuspend celle pellet i EF-SFM FULL til en siste konsentrasjon på 1,5 x 107 celler/mL.
- Ta ut Petriskål med biochip settefiskanlegg og overføre den til celle kultur panseret.
- Sug opp den fibronectin løsningen fra alle kanaler av microfluidic chip.
- Injisere 6 µL av cellen suspensjon i hver kanal bruker en pipette med en liten 10 µL tips (figur 1 c, midten). Kontroller at celle suspensjon er blandet godt før injeksjon og unngå celle nedbør.
- Undersøk biochip under mikroskopet og sikre at cellene er fordelt, og cellen tetthet er høy (figur 2C).
- Inkuber biochip i 15 min på 37 ° C.
- Legge til 40 µL av EF-SFM FULL til middels reservoarene fra begge sider av hver kanal.
- Inkuber biochip 1t på 37 ° C (figur 1 c, høyre).
- Legge til en annen 50 µL av EF-SFM FULL i reservoarene fra begge sider av hver kanal.
5. forberedelse av menneskelig leukocytter
Merk: I protokoll beskrevet her, ble et kommersielt tilgjengelig monocytic celle linje (THP-1) brukt. Alternativt, perifert blod mononukleære celler eller nøytrofile kan brukes. Isolering av perifert blod monocytter og nøytrofile kan utføres ved hjelp av standard prosedyre11. Utføre alle trinnene som er beskrevet i dette avsnittet i celle kultur hette.
- Samle leukocytter i et 50 mL konisk rør.
- Vask av leukocytter med 10 mL PBS uten Ca2 +/Mg2 +. Sentrifuge cellene på 300 x g i 3 minutter på RT (figur 1 d).
- Sug opp nedbryting og resuspend celle pellet i 1 mL av PBS med DiOC6 fargestoff (λex = 485 nm, λem = 501 nm) (1:5, 000). Inkuber cellene i mørket 10 min på RT.
- Vask av leukocytter med 10 mL PBS uten Ca2 +/Mg2 +. Sentrifuge cellene på 300 x g i 3 minutter på RT. Gjenta trinnet vask en gang.
- Tell antall celler i suspensjon.
- Sug opp nedbryting og resuspend celle pellet komplett RPMI medium til en siste konsentrasjon av 2.5 x 106 celler/mL.
6. forberedelse av Microfluidic pumpen
- Montere microfluidic pumpen med 8-kanals manifold.
- Koble pumpen til en PC med installert operativsystemet programvare.
- Start microfluidic programvare og laste protokollen ved å klikke Åpne protokollen og navigere på PCen for å velge microfluidic protokollen.
- Koble programvaren og pumpen ved å velge installasjonsmappen og klikke Kjør analysen trinn.
- Definere geometrien av kanalene for den flytkontrollen: Velg Oppdateringen geometri i Geometri Setup -mappen og klikk Kjør analysen trinn.
Merk: Kontroller at geometri detaljene samsvarer med sprøyten og kanaler brukes (geometri ID = 1, antall kanaler = 8, kanal bredde = 800.0 µm, kanal dybde = 120.0 µm, sprøytevolum = 250 µL) og viskositet av prøven (flytende viskositet = 1.0). - Vask pumpen ved å plassere innløp kabelen (oransje) inn i 50 mL konisk røret som inneholder 80% etanol. Legg stikkontakt kabelen (grønn) i 50 mL konisk tom tube (avfallsbeholderen).
- Velg mappen Bleke/pumpe bleke og klikk Kjør analysen trinn (vaske volum = 2000 µL, Wash volum trinn = 250 µL, bleke retning = Output). Gjenta trinnet vask igjen.
- Gjenta pumpen vaske trinn (trinn 6.6-6,7) med celle kultur klasse vann og menneskelige Endothelial-SFM kultur medium.
- Fortsette med vask trinn av manifold.
- Åpne ventilen mellom sprøyten og manifolden manuelt ved å plassere 3-veis kortet i riktig posisjon (indikator slås av til venstre).
- Velg Sett gjeldende kanal/Open trinn i mappen Bleke/Manifold vask og klikk Kjør analysen trinn for å åpne alle ventiler av manifold.
- Vask manifold manuelt ved å trykke 5 mL av 80% etanol fra sprøyten, etterfulgt av 5 mL celle kultur klasse vann.
- Vask manifold ved å skyve 5 mL av menneskelig Endothelial-SFM kultur medium fra sprøyten.
- Fjern alle store luftbobler som er fanget i manifold. Dette plasserer det 8-og pin-kortet i 10 cm Petriskål med mediet og utføre skyve/trekke med sprøyten til alle store luftbobler er borte (små bobler er ikke et problem).
- Velg Sett gjeldende kanal/lukke trinn i mappen Bleke/Manifold vask og klikk Kjør analysen trinn for å lukke alle ventiler av manifold.
- Koble grønne stikkontakt kabelen fra pumpen til manifold kortet.
- Gå 3-veis ventilen tilbake til stillingen å lukke sprøyten .
- Velg Bleke/kabel bleke mappen og klikk Kjør analysen trinn å vaske hver port med RPMI medium, sikre at alle bobler er fjernet fra hver kabel (dispensere volum = 100 µL).
Merk: Hver ventil av manifold er åpnet en etter en, 1 til 8, og 100 μL av mediet er utlevert gjennom hver individuell kanal mens holde andre kanaler stengt. Kontroller at væsken går fra hver pin. Hvis det er ingen væske kommer ut, er det en indikasjon på en luftboble eller tette.
7. forberedelse av Microfluidic Chip for Live bildebehandling
- Sikre at microfluidic oppsett er klare, og live bildebehandling kammeret er pre equilibrated 37 ° c og nivået av CO2 når 5% (figur 3A, B).
- Ta av biochip fra inkubator, og plasser den i mikroskopet chip holderen. Montere chip holderen på mikroskopet imaging scenen (Figur 3 c).
- For å koble til biochip til pumpen via manifolden, plasser 8-pinners adapteren nær stikkontakt reservoarene av chip og utdype alle pinnene i medium (men ikke koble helt).
- Velg bleke | Koble til Chip mappe og klikk Kjør analysen trinn til å dispensere RPMI medium før chip (dispensere volum = 30 mL). Når mediet er utlevert, kobler 8-pinners adapteren til utløpet av biochip.
Merk: I dette trinnet, alle stasjonene er satt til på (åpen) og 30 µL av mediet er utlevert gjennom hver kanal og etter kanalene er satt til Off (lukket). Dette sikrer at ingen luft bobler vil bli introdusert i kanaler for microfluidic chip. - Manuelt Sug opp mediet alle innløp reservoarer av biochip med en pipette.
- Velg bleke | Chip bleke mappe og klikk Kjør analysen trinn perfuse 40 mL av EF-SFM FULL medium gjennom hver av kanalene en etter en å kvitte seg med døde celler/rusk fra kanal (bleke volum = 40 µL, maksimum bleke skjær = 40 dynes/cm2).
8. flyt vedheft analysen og Image Vinningen
- Manuelt Sug opp mediet innløp reservoaret av kanalen interesse med en pipette.
- Legge til 100 µL av leukocytter fra trinn 5.6 innløp reservoaret på kanalen av interesse.
Merk: Bland forsiktig cellene for å gjøre en enkeltcelle suspensjon. - I celle analysen | Trinnbeskrivelse mappen, velg Sett gjeldende kanal/trinn beskrivelse , og i listen over kanaler, velger du bare kanalen rundt og satt til på (åpen) og satt alle andre syv kanaler til av (lukket).
- Velg celle analysen | Trinnbeskrivelse mappe og klikk Kjør analysen trinn.
Merk: Kontroller at Variable Flow Rate Dispensing gjelder konstant negative trykket å trekke leukocytter suspensjon fra innløpet reservoaret gjennom kanalen i 5 min (Shear sett = konstant, skjæring stress =-0.5 Dyn/cm2, varighet = 00:05:00, Skanne forsinkelse = 00:00:00). Negativ verdien av skjæring stress sikrer riktig vei flyt. - Sug opp de gjenværende leukocytter fra innløpet reservoaret.
- Legge til 100 µL av komplett RPMI medium innløp reservoaret. Velg celle analysen/steg beskrivelse -mappen og klikk Kjør analysen trinn for å perfuse kanal for 5 min med RPMI medium for å vaske ut alle ikke-tilhenger leukocytter (Shear sett = konstant, skjæring stress =-0.5 Dyn/cm2, varighet = 00: 05:00, skanning forsinkelse = 00:00:00).
- Hente bilder fra minst tre til fire forskjellige posisjoner på kanalen å image adhered leukocytter (for å sikre at representant områder er fanget).
- Gjenta 8.1-8,7 funksjonelle vurdering av resten av kanalene.
Merk: Det er mulig å kjøre flere kanaler samtidig. Gjør åpne alle kanaler rundt under trinn 8.3. og utføre alle nevnte trinnene 8.4 –8.7 for flere kanaler rundt.
9. fullfører analysen og rengjøring Microfluidic pumpen
- Etter endt eksperimentet, eksportere og lagre alle bilder i RAW-format.
- Mens lagre resultatene, kjører du microfluidic pumpen og manifolden rengjøring protokollen.
- For microfluidic pumpen, kjøre mappen Bleke/pumpe bleke først ved perfusing 4 mL celle kultur klasse vann, etterfulgt av 4 mL av 80% etanol som beskrevet i trinnene 6.6-6,7 tørr pumpen ved å kjøre luft i flere minutter.
- For å rense manifolden, kjører du Bleke/Manifold Wash trinn med sprøyten. Fremgangsmåten for å åpne sprøyten og mangfoldige ventilene som beskrevet i fremgangsmåten 6.10-6.11 vask først med 80% etanol og neste med celle kultur klasse vann. Tørr manifold ved å skyve air via sprøyten. Lukke ventilen sprøyten og mangfoldige ventilene som beskrevet i fremgangsmåten 6.10 og 6.15.
10. telling av tilhenger leukocytter
- Dataoverføre og installere bildebehandlingen programvare14 fra http://cellprofiler.org.
Merk: Bildebehandling i denne studien ble utført benytter programvare versjon 2.1.1. Hvis bruker en nyere versjon, kreve mindre tilpasning i rørledningen. - Last ned rørledningen Count_leukocytes.cpipe. Klikk fil | Importer | Rørledningen fra filen og navigere på PC å velge rørledningen Count_leukocytes.cpipe.
- Dra og slipp en mappe med ervervet RAW-bilder av tilhenger leukocytter til filen listevinduet i inn moduler | Bilder delen for analyse.
- Angi vanlig størrelse av leukocytter via analyse moduler | IdentifyPrimaryObjects. Angi minimal og maksimal diameteren på tilhenger leukocytter i piksler.
- Velg filtreringskriteriene via analyse moduler | FilterObjects. Angi minimalt godtatte området for objekter i piksler.
- Starte analysen ved å trykke knappen analyser bilder .
Merk: Alle de rå bildene skal behandles, og resultatene lagres i en standard output-mappen. Image.txt utdatafilen inneholder antall tilhenger leukocytter hver behandlet bildet (hver tilsvarer ett bilde, dvs. hver ervervet synsfelt).
Representative Results
Først, responsen av hiPSC-ECs stimulering med pro-inflammatoriske agent TNFα bør undersøkes, som tidligere beskrevet7. TNFα behandling for 12t utløser oppregulering av E-selectin med en topp på 6 h etter behandlingen starter. I tillegg er ICAM-1 upregulated 6-12 h etter behandling. Selv om vi ikke observerer den forventede oppregulering av VCAM-1, er det vanligvis observert i primære menneskelige umbilical blodåre endotelceller (HUVECs). Vi fant overnatting (12 h) TNFα behandling å være det mest praktisk for leukocytter vedheft analysen.
Optimal hiPSC-ECs dissosiasjon skal resultere i en enkeltcelle suspensjon gratis celle klumper. Figur 2C illustrerer den optimale hiPSC-EC tettheten rett etter injeksjon. Vanligvis 15 min etter injeksjon, hiPSC-ECs feste til bunnen av kanalen og begynner å spre (figur 2D). 1t etter injeksjon, hiPSC-ECs danner en spredning monolayer langs kanalen og klar til å begynne flyt analysen (figur 2E).
Merking av leukocytter med fluorescerende tracer er gunstig for fase kontrast bilder i automatiserte bilde kvantifisering, som det gjør celle identifikasjon trinnet enklere, spesielt fordi leukocytter overholder monolayer av ECs og det er vanskelig for programvare for å skille forskjellige celletyper.
Gratis åpen kildekode-bildebehandling er svært nyttig for automatisert kvantifisering av tilhenger leukocytter. Rørledningen beskrevet i protokollen her er basert på primære serviceobjekt-IDen ved hjelp av dynamisk terskelverdi fluorescerende bilder av leukocytter (figur 4A). Filtrering av identifisert objekter basert på et minimalt område i tillegg filtrerer ut feilaktig identifisert objekter, for eksempel celle rusk, autofluorescence eller noen andre ikke-spesifikke fluorescerende signal (Figur 4 C, D).
En microfluidic chip med åtte parallelle kanaler kan sammenligningen av to uavhengige grupper, for eksempel ECs differensiert fra uavhengige hiPSCs, for eksempel friske blodgivere eller pasienter med genetiske lidelser. Tilleggskontroller, for eksempel ubehandlet ECs eller forbehandling med et ICAM-1 blokkerer antistoff kan inkluderes som vel10,11. To til tre microfluidic chips kan behandles om gangen. Robust konklusjonene bør minst tre uavhengige biologiske eksperimenter utført på uavhengige dager.
Figur 1 : Forberedelse av hiPSC-ECs og leukocytter for flyt analysen. (A) forbehandling av hiPSC-ECs med pro-inflammatoriske stimulans (TNFα). (B) skjematisk fremstilling av hiPSC-ECs enzymatisk dissosiasjon, sentrifugering og rørets. (C) skjematisk fremstilling av belegg av kanalene (C, venstre), injeksjon av hiPSC-EC suspensjon (C, midten) og celle kultur medium tillegg etter hiPSC-ECs vedlegg i microfluidic chip. (D) skjematisk fremstilling av leukocytter vask trinn, merking med fluorescerende farge DiOC6 og rørets. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Microfluidic brikke med hiPSC-ECs. (A) Microfluidic chip i en 10 cm Petriskål. (B) fuktet kammeret brukes for inkubasjon. (C, D, E) Representant bilder av hiPSC-ECs i microfluidic kanal 0 min (C), 15 min (D), 1 h (E) etter injeksjon. Skala bar = 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Eksperimentelle oppsett av levende celle bildebehandling og leukocytter perfusjon analysen. (A, B) Bilde (A) og skjematisk fremstilling (B) av eksperimentelle oppsett av levende celle bildebehandling og flyt analysen: (1) - invertert fluorescerende mikroskop med montert live bildebehandling kammer (5% CO2, 37 ° C, fuktet), (2) - microfluidic pumpe, (3) - 8-kanals manifold, (4) - PC til mikroskopet kontroll og bilde oppkjøp, (5) - PC for microfluidic pumpe kontroll. (C) Microfluidic chip med innsatte slangen av 8-kanals manifold fast i en plate holder og montert motorisert stadium av mikroskopet. (D) skjematisk fremstilling av de viktigste trinnene flyten analysen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Analyse og Automatisert påvisning av tilhenger leukocytter. (A) dialogvinduet av bildebehandlingen med angitt innstillinger for identifikasjon av leukocytter. (B) dialogvinduet av bildebehandling med angitte filtrering kriteriene for de identifiserte objektene basert på minimal tillatt areal (SAmin = 70 px). (C) eksempel på riktig identifikasjon av leukocytter og filtrering av ikke-spesifikke objekter av små arealet (SA) (typisk diameter i pixel (Min, Max) = (9, 15); Filtrering kriterier SAmin = 70 px). Akseptert objekter vises i grønt og forkastet objekter vises i fiolett. (D) eksempel på feil identifisering av leukocytter på grunn av feil rekke typiske diameter (typisk diameter i pixel (Min, Max) = (3, 15); Filtrering kriterier SAmin = 70 px). Akseptert objekter vises i grønt og forkastet objekter vises i fiolett. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Denne protokollen beskriver karakterisering av hiPSC-EC behandling med pro-inflammatoriske stimuli, som TNFα, funksjonell vurdering av leukocytter vedheft til hiPSC-ECs i flyt analysen bruker live bildebehandling og automatiserte teller av tilhenger leukocytter.
Overnatting stimulering av hiPSC-ECs med TNFα resulterer i avlange utseendet som vanligvis angir en aktivert pro-inflammatoriske fenotypen i ECs. Under optimalisering scenen, uttrykk nivåer av E-selectin, ICAM-1, VCAM-1 må verifiseres av FACs7,8og primære menneskelige umbilical blodåre ECs (HUVECs) er tilrådelig å inngå som positive kontroller.
Optimal hiPSC-ECs dissosiasjon og seeding tetthet skal nås for å oppnå en confluent monolayer uten å danne celle klumper og kanal tresko. Det er viktig å suspendere leukocytter rett før perfusjonsmåling for å unngå celle nedbør og opprettholde en konstant konsentrasjon når assaying hver kanal. Menneskelige perifert blod leukocytter, som monocytter og nøytrofile kan brukes eller etablert monocytic linjer, som THP-1 eller HL-60 kan brukes som et alternativ.
Da microfluidic oppsettet og under flyt analysen er det avgjørende å unngå luftbobler fra å bli fanget i microfluidic rør og kanaler som de kan medføre brøkdel av hiPSC-ECs og/eller tilhenger leukocytter. Væske-til-væske-grensesnittet eller innlemmelse av ekstra vask trinnene under utarbeidelsen av microfluidic kan bidra til å unngå luftbobler.
Det anbefales at protokollen drives av to operatører hvor man forbereder cellene og andre forbereder microfluidic systemet og flyt analysen. Dette sikrer at ECs er belagt i microfluidic chips i en konstant-vinduet før behandling og forbedrer nøyaktigheten og reproduserbarhet resultatene. I tillegg kan dette også definere blendet eksperimenter å unngå skjevhet i resultatene.
For vellykket celle gjenkjenning med automatisert bildebehandlingen pipeline, er det viktig å hente bilder i fokus med en høy signal-til-støy-forhold og unngå autofluorescence av ikke-spesifikke objekter, for eksempel celle klumper. Avgjørende er riktig spesifikasjon av minimal og maksimal grensene for vanlig størrelse av tilhenger leukocytter som må identifiseres. Man kan beregne vanlig størrelse av leukocytter bruke et linje-måleverktøy i ImageJ. For eksempel i vår analyse brukte vi området 9 – 15 piksler som tilsvarer den fysiske størrelsen på 10,3-17.1 µm (figur 4C). Når du bruker et galt utvalg, f.eks 3 til 15 piksler (3,4-17.1 µm), en enkelt leukocytter identifiseres ikke som en celle, men heller sin kapittel identifiseres som separate objekter (Figur 4 d). Dette fører til falske antallet objekter identifiseres.
Mange objekter av svak og mindre arealet enn leukocytter kan oppdages ved hjelp av metoden gitt dynamisk terskelverdi. Dette kan ta sted på grunn av autofluorescence eller noen andre ikke-spesifikke fluorescerende signaler. Likevel, disse ikke-spesifikke objekter, området er lavere enn en enkelt leukocytter, typiske området kan filtreres ved å definere minimal akseptert areal (figur 4C).
Flyt analysen beskrevet her kan direkte vurdering av leukocytter vedheft til en EU-monolayer, Klargjørende samspillet mellom disse to cellen typer, men tar ikke hensyn til andre cellen skriver, som pericytes som er tilstede i vaskulære veggen og kan også delta i regulering av leukocytter bloduttredelse15. Integrere en 3D kultur microenvironment med andre celletyper kan forbedre fysiologiske relevansen av systemet. Til tross for disse begrensningene gir flyt analysen for vurdering av inflammatoriske svar beskrevet her et verdifullt verktøy for grunnleggende karakterisering og sykdom modellering programmer av hiPSC-ECs.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å erkjenne følgende tilskudd: europeiske Research Council (ERCAdG 323182 STEMCARDIOVASC); Nederland Organ-on-Chip initiativ, en NWO gravitasjon prosjektet finansiert av Kunnskapsdepartementet, kultur og vitenskap av regjeringen i Nederland (024.003.001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vena8 Endothelial+ biochip | Cellix Ltd | V8EP-800-120-02P10 | |
| Mirus Evo Nanopump | Cellix Ltd | MIRUS-EVO-PUMP | 1 x syringe pump; 1 x VenaFluxAssay Software; 1 x tubing kit; power supply and cables. |
| 8-channel manifold MultiFlow8 | Cellix Ltd | MIRUS-MULTIFLOW8 | |
| Humidified box | Cellix Ltd | HUMID-BOX | |
| Fluorescence imaging system Leica AF6000 | Leica Microsystems | ||
| Electron-multiplying charge-coupled device camera | Hamamatsu | C9100 | |
| Biological safety cabinet/laminar flow-hood | Cleanair | ||
| CO2 cell-culture incubator | Panasonic | MCO-170AICUV | |
| Centrifuge | Hitachi | himac-CT6EL | |
| Handheld pipetman (P-10 (10 mL), P-200 (200 µL), P-1000 (1,000 µL) | Gilson international | 4807 (10µl), 4810 (200µl), 4809 (1000µl) | |
| Sterile plastic pipette | Greiner Bio-One | 606180 (5ml), 607180 (10ml) | |
| Petri dish | VWR/ Duran Group | 391-0860 | |
| Culture flasks (75 cm2) | CELLSTAR | 658,170 | |
| Centrifuge tube (15 mL) | CELLSTAR | 188271 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin from porcine skin, type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Fibronectin (Bovine plasma) | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-169 | |
| Human Endothelial-SFM | Life Technologies | 11111-044 | |
| Human VEGF 165 IS, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-109-386 | |
| Human FGF-2, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-093-842 | |
| Platelet-poor Plasma Derived Serum, bovine | Biomedical Technologies | BT-214 | |
| Recombinant Human TNF-α | Tebu-bio | 300-01A-A | |
| TrypLE Select | Life Technologies | 12563029 | |
| DiOC6(3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 21875-034 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Life Technologies | 31350010 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Life Technologies | 15070-063 | |
| Distilled water | Life Technologies | 15230-089 | |
| Ethanol absolute | Merck | 1.00983.2500 | |
| VCAM-1 | R&D systems | FAB5649P | |
| E-Selectin | R&D systems | BBA21 | |
| ICAM-1 | R&D systems | BBA20 | |
| Name | Company | Software version | Comments |
| Cellrofiler | CellProfiler | 2.1.1 | |
| VenaFluxAssay Software | Cellix Ltd | 2.3.a |
References
- Vestweber, D. How leukocytes cross the vascular endothelium. Nature Reviews Immunology. 15 (11), 692-704 (2015).
- Hajishengallis, G., Chavakis, T. Endogenous modulators of inflammatory cell recruitment. Trends in Immunology. 34 (1), 1-6 (2013).
- Molema, G. Heterogeneity in endothelial responsiveness to cytokines, molecular causes, and pharmacological consequences. Seminars in thrombosis and hemostasis. 36 (3), 246-264 (2010).
- Aird, W. C. Endothelial Cell Heterogeneity. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), a006429 (2012).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 1-16 (2016).
- Lin, Y., Gil, C. H., Yoder, M. C. Differentiation, Evaluation, and Application of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Endothelial Cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (11), 2014-2025 (2017).
- Halaidych, O. V., Freund, C., et al. Inflammatory Responses and Barrier Function of Endothelial Cells Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. , (2018).
- Orlova, V. V., vanden Hil, F. E., Petrus-Reurer, S., Drabsch, Y., ten Dijke, P., Mummery, C. L. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (6), 1514-1531 (2014).
- Orlova, V. V., Drabsch, Y., et al. Functionality of endothelial cells and pericytes from human pluripotent stem cells demonstrated in cultured vascular plexus and zebrafish xenografts. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (1), 177-186 (2014).
- Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress. Journal of Visualized Experiments. (85), 1-6 (2014).
- Muller, W. A., Luscinskas, F. W. Assays of transendothelial migration in vitro. Methods in enzymology. 443, 155-176 (2008).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions. Journal of Visualized Experiments. (66), 1-5 (2012).
- Vajen, T., Heinzmann, A. C. A., et al. Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets. Journal of Visualized Experiments. (134), (2018).
- Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte Migration into Inflamed Tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
