Summary
Этот шаг за шагом протокол содержит подробное описание экспериментальной установки и анализ данных для оценки воспалительные реакции в hiPSC-ECs и анализ лейкоцитарной адгезии при физиологических потока.
Abstract
Эндотелиальные клетки (ECs) имеют важное значение для регуляции воспалительной реакции путем ограничения или содействие лейкоцита вербовки в пораженных тканей через хорошо изученных Каскад про клей рецепторов, которые являются upregulated на Лейкоцитарные клеточной поверхности после воспалительных триггера. Воспалительные реакции отличаются между людьми в населенности и генетический фон может способствовать эти различия. Человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) были показали, чтобы быть надежным источником ECs (hiPSC-ECs), таким образом представляющих неограниченный источник клеток, которые захватывают генетической идентичности и любом генетические варианты или мутации донора. hiPSC-ECs, поэтому может использоваться для моделирования воспалительных реакций в клетках конкретных доноров. Воспалительные реакции могут быть смоделированы путем определения лейкоцитарной адгезии к hiPSC-ECs под физиологических потока. Этот шаг за шагом протокол содержит подробное описание экспериментальной установки и анализ данных для оценки воспалительные реакции в hiPSC-ECs и анализ лейкоцитарной адгезии при физиологических потока.
Introduction
Воспаление играет ключевую роль во многих патологических состояний, включая сердечно-сосудистые и нейродегенеративных расстройств, сепсис и побочных реакций (АДР). Эндотелиальные клетки (ECs) играют важную роль в регулировании воспалительные реакции через индукции про клей рецепторов, таких как E-селектина, межклеточной адгезии молекулы-1 (ICAM-1) и сосудистой клеток адгезии молекулы-1 (VCAM-1) на их поверхности 1 , 2. Микроваскулярная ECs в разных тканях, как известно, выставлять гетерогенность в воспалительных реакций3,4. Кроме того генетический фон или определенные генетические условия может привести к различиям в воспалительных реакций между людьми; Поэтому важно иметь доступ к ECs от разных людей. Совсем недавно, человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs)5, которые могут быть получены от практически любого лица, были продемонстрированы в качестве источника надежной и возобновляемых ECs6,,78, 9. Таким образом, оценка воспалительных реакций и лейкоцитарной вербовки в hiPSC-ECs ценные, не только для моделирования некоторых наследственных заболеваний, но и указания межличностная изменчивость и использовать в качестве инструмента для персонализированной медицины в будущем.
Анализов потока обеспечивают является полезным инструментом для изучения эндотелиальной лейкоцита взаимодействия. Достижения в microfluidic приборы включить воспроизведение условий физиологические жидкости с точный контроль уровней сосудистой кровати конкретных касательное напряжение. Живые изображения позволяет мониторинг каскад событий захвата лейкоцитов, прокатки, ползать, адгезии и трансмиграции. Были разработаны несколько анализов потока для изучения эндотелиальной лейкоцита взаимодействия, однако все они используют первичный ECs10,11,12,13. Здесь мы будем описывать подробно assay для оценки человеческого лейкоцитарного адгезии к hiPSC-ECs под физиологических потока. В этой процедуры мы опишем оптимизированные условия hiPSC-EC стимуляции провоспалительных раздражителей, таких как фактор некроза опухоли альфа (TNFα), диссоциация, посев microfluidic чип с восьми параллельных каналов. Мы описывать шаг за шагом протокол для перфузии hiPSC-ECs с подвеской дневно обозначенные лейкоциты microfluidic фишек, живут клеток и автоматизированный подсчет адэрентных лейкоцитов.
Этот протокол является полезным для оценки воспалительные реакции в hiPSC-ECs в скрининга наркотиков, болезни моделирования и персональной восстановительной медицины.
Protocol
1. Подготовка растворов и реагентов
- Подготовка полного среднего человека Endothelial-УЛП (EC-УЛП полная), добавляя тромбоцитов плохой плазмы производные сыворотки (1%), основные фибробластический фактор роста (bFGF, 20 нг/мл) и Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF, 50 нг/мл) для человека Endothelial-УЛП (см. таблицы Материалы). Через поры фильтра 0.22 мкм фильтр средних и хранить его на 4 ° C на срок до 2 недель.
- Подготовка полного среднего RPMI, добавив плода бычьим сывороточным (10%), 2-меркаптоэтанол (0,05 Нм), L-глютамин (1%), пенициллин-стрептомицином (25 ед/мл) RPMI средний (см. Таблицу материалы). Хранить при 4 ° C до 3 недель.
2. покрытие Microfluidic чипсы
- Место стерильным биочип в Петри стерильные 10 см.
- Подготовьте фибронектин рабочего раствора путем воссоздания Стоковый раствор в фосфат амортизированное saline (PBS) без Ca2 +/Mg2 + до конечной концентрации 50 мкг/мл. По оценкам 80 мкл рабочего раствора на биочип.
- Inject 10 мкл рабочего раствора фибронектин в каждом канале биочип. Использование пипетки с небольшой 10 мкл советы и убедитесь, что образуют плотный контакт между впускного канала и наконечник пипетки (рис. 1 c, слева).
- Закройте крышку Петри, содержащие биочип и поместите его в камере увлажненные (рис. 2B). Храните в камере при температуре 4 ° C на ночь. Чтобы увлажнить палата, место чистой папиросной бумаги в нижней палаты увлажненные и добавьте 5 мл стерильной H2O.
- Следующий день, перед assay, предварительно теплой биочип при 37 ° C в инкубаторе.
3. Подготовка hiPSC-ECs
Примечание: В протоколе, описанные здесь hiPSC-ECs были продифференцированы, очищенный, замораживают и растаяло как описано выше8.
- Оттепель и плита hiPSC-ECs в полной полный EC-УЛП в одном 0,1% желатина покрытием T75 колбу, три-четыре дня до assay.
- Ночь перед assay, стимулировать hiPSC-ECs с TNFα, добавив EC-УЛП полный дополнена 10 нг/мл TNFα и инкубировать на ночь (~ 12 ч) при 37 ° C, как описано выше 7.
4. hiPSC-ECs диссоциации и посев в Microfluidic чип
- В день assay принимать настой hiPSC-ECs из инкубатора и изучить клетки под микроскопом. Убедитесь, что hiPSC-ECs 80 – 100% притока и имеют типичный EC-как морфология.
- Перевести колбу на капот культуры клеток.
- Аспирационная среднего из колбы hiPSC-ECs.
- Кратко мыть клеточной культуры путем добавления 10 мл PBS без Ca2 +/Mg2 +. Аспирационная PBS.
- Добавьте 4 мл флакон 1 x диссоциации фермента. Инкубируйте 5 мин при комнатной температуре (RT) (рис. 1B).
- Остановите реакции диссоциации, добавив 8 мл среды человеческого Endothelial-УЛП за флакон. Аккуратно отсоедините и собирать hiPSC-ECs подвеска в 15 мл Конические трубки с помощью пипетки 5 мл.
- Подсчитать общее количество клеток в суспензии.
- Центрифуга клетки на 300 x g 3 мин на RT.
- Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в полной EC-УЛП в конечной концентрации 1,5 x 10-7 кл/мл.
- Возьмите Петри с биочип из инкубатора и перенести его на капот культуры клеток.
- Аспирационная фибронектин решение от всех каналов microfluidic чипа.
- Inject 6 мкл суспензии клеток в каждый канал с помощью пипетки с небольшой 10 мкл наконечником (рис. 1 c, средние). Убедитесь, что суспензию клеток смешивается задолго до инъекции и избежать клеток осадков.
- Проверьте биочип под микроскопом и убедитесь, что ячейки равномерно распределены, и высокая плотность клеток (рис. 2 c).
- Инкубировать биочип 15 мин при температуре 37 ° C.
- Мкл 40 полный EC-УЛП в средних водоемы с обеих сторон каждого канала.
- Инкубируйте биочип за 1 ч при 37 ° C (рис. 1 c, право).
- Еще 50 мкл полный EC-УЛП в водоемы с обеих сторон каждого канала.
5. Подготовка лейкоциты человека
Примечание: В протоколе, описанные здесь был использован коммерчески доступных monocytic клеток линии (THP-1). В качестве альтернативы может использоваться мононуклеаров периферической крови или нейтрофилов. Изоляции периферической крови моноцитов и нейтрофилов может производиться с использованием стандартной процедуры11. Выполните все шаги, описанные в этом пункте в капюшоне культуры клеток.
- Соберите лейкоцитов в 50 мл Конические трубки.
- Вымойте лейкоциты с 10 мл PBS без Ca2 +/Mg2 +. Центрифуга клетки на 300 x g 3 мин на RT (рис. 1 d).
- Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл PBS с DiOC6 краситель (λex = 485 Нм, λет = 501 Нм) (1:5, 000). Инкубировать клетки в темноте за 10 мин на RT.
- Вымойте лейкоциты с 10 мл PBS без Ca2 +/Mg2 +. Центрифуга клетки на 300 x g 3 мин на RT. Repeat Стиральная шаг еще раз.
- Подсчитать общее количество клеток в суспензии.
- Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в полной RPMI среднего до конечной концентрации 2,5 х 106 клеток/мл.
6. Подготовка Microfluidic насоса
- Соберите насос microfluidic с 8-канальный коллектор.
- Подключите насос к компьютеру с установленной программное обеспечение.
- Запустите программу microfluidic и загрузить протокол, нажав Открытый протокол и перейдите на ПК для выбора протокола microfluidic.
- Подключение программного обеспечения и насос, выбрав папку установки и нажав Запустить шаг Assay.
- Определение геометрии каналов для правильного потока скорость контроля: выберите Обновление геометрии в папке Установки геометрии и нажмите Запустить шаг Assay.
Примечание: Убедитесь, что геометрические детали соответствуют шприц и каналы, которые будут использоваться (геометрии ID = 1, количество каналов = 8, ширина канала = 800.0 мкм, глубина канала = 120.0 мкм, объем шприца = 250 мкл) и вязкости образца (жидкости вязкость = 1.0). - Промойте насос, поместив входной кабель (оранжевый) в 50 мл конические трубка, содержащая 80% этанола. Место выхода кабеля (зеленый) в конической пустой Тюбик 50 мл (контейнер для отходов).
- Выберите папку Размыва/насос размыва и нажмите Запустить Assay шаг (мыть объем = 2000 мкл, мыть объем шаг = 250 мкл, размыва направление = выход). Стиральная Повторите еще раз.
- Повторите насоса Стиральная шаги (шаги 6.6 – 6,7) клеток культуры класс водой, и человека Endothelial-УЛП питательной среды.
- Продолжите выполнение шага Стиральная коллектора.
- Вручную откройте клапан между шприц и коллектора, поставив адаптер 3-way в правильное положение (индикатор OFF повернул налево).
- Выберите Набор текущий канал/открыть шаг в папке Размыва/коллектор мыть и нажмите Запустить Assay шаг откроет все клапаны коллектора.
- Вымойте коллектор вручную, нажав 5 мл 80% этанола из шприца, следуют 5 мл воды класса культуры клеток.
- Вымойте коллектора, нажав 5 мл человека Endothelial-УЛП питательной среды из шприца.
- Удалите все большие воздушные пузыри, которые оказались в ловушке в коллекторе. Чтобы сделать это, поместите 8-Ну контактный адаптер в 10 см Петри со средой и выполнять толкания/потянув с шприца до тех пор, пока все большие воздушные пузырьки исчезли (маленькие пузырьки являются не проблемой).
- Выберите Набор текущий канал/закрыть шаг в папке Размыва/коллектор мыть и нажмите Запустить шаг Assay закрыть все клапаны коллектора.
- Подключите кабель зеленые розетки от насоса к коллектор адаптер.
- Переключатель 3-ходовой клапан обратно в положение " OFF " для закрытия шприца.
- Выберите папку Размыва размыва/кабель и нажмите Запустить шаг Assay мыть каждый порт среду RPMI индивидуально, обеспечение того, что все пузыри удаляются из каждого кабеля (распределять объем = 100 мкл).
Примечание: Каждый клапан коллектора открыт один в 1, 1-8 и 100 мкл среды распределяется через каждого отдельного канала, в то время как сохраняя другие каналы закрыты. Убедитесь, что жидкость проходит от каждого PIN-код. Если жидкости не выходит, это признак воздушный пузырь или засорить.
7. Подготовка Microfluidic чип для жить изображений
- Убедитесь, что готовы microfluidic установок и живой тепловизионные камеры предварительного уравновешенной до 37 ° C и уровень CO2 достигает 5% (Рисунок 3А, B).
- Возьмите биочип из инкубатора и расположите его в держатель чип микроскопа. Смонтируйте держатель чип на микроскопе изображение стадии (рис. 3 c).
- Чтобы подключить биочип с насосом через коллектор, место 8-контактный адаптер недалеко от водохранилища выходе чипа и углублять все контакты в среде (но не подключайте полностью).
- Выберите обесцветить | Подключиться к чип папку и нажмите Запустить шаг Assay отказаться RPMI среднего до подключения чип (распределять объем = 30 мл). После того, как носитель разливают, вставьте 8-контактный адаптер в розетку биочип.
Примечание: Во время этого шага все каналы установлены на (открытый) и 30 мкл среды распределяется через каждый канал и после этого каналы устанавливаются Off (закрытые). Это гарантирует, что нет воздуха, что пузыри будут вводиться в каналы microfluidic чипа. - Вручную удалить средство от всех водохранилищ входе биочип с пипеткой.
- Выберите обесцветить | Чип размыва папку и нажмите кнопку Запустить Assay шаг к perfuse 40 мл EC-УЛП полной среды через каждого из каналов по одному, чтобы избавиться от мертвых клеток/мусора из канала (объем смыва = 40 мкл, максимум размыва сдвига = 40 дин/см2).
8. поток адгезии пробирного и видеосъемка
- Вручную удалить носитель из водохранилища впускного канала интерес с пипеткой.
- Добавьте 100 мкл лейкоциты с шагом 5.6 водохранилище впускного канала интерес.
Примечание: Аккуратно перемешайте ячеек для подвески одной ячейки. - В Assay клетки | Шаг описание папку, выберите Набор текущий канал/шаг описание и, в списке каналов, выберите только текущий канал интерес и установить на (открытый) и установить все семь каналов Off (закрытые).
- Выберите Assay клетки | Шаг описание папку и нажмите кнопку Запустить шаг Assay.
Примечание: Убедитесь, что Переменная скорость потока дозирования применяется постоянная отрицательное давление тянуть лейкоцита подвеска из входе водохранилища через канал 5 мин (ножницы набор = константа, касательное напряжение = -0,5 дин/см2, длительность = 00:05:00, Сканировать задержка = 00:00:00). Отрицательное значение напряжения сдвига обеспечивает правильное направление потока. - Аспирационная оставшиеся лейкоцитов из впускного коллектора.
- Добавьте 100 мкл полного среднего RPMI впускного коллектора. Выберите ячейку Assay/шаг описание папку и нажмите Запустить Assay шаг к perfuse канал на 5 мин с RPMI среднего для того, чтобы промыть все non сторонник лейкоцитов (ножницы набор = константа, касательное напряжение = -0,5 дин/см2, длительность = 00: 05:00, сканирования задержка = 00:00:00).
- Получение изображений из различных позиций по крайней мере три-четыре канала изображения придерживался лейкоцитов (чтобы убедиться, что представитель области зафиксированы).
- Повторите шаги 8.1 – 8,7 для функциональной оценки всех остальных каналов.
Примечание: Это возможно для запуска нескольких каналов одновременно. Чтобы сделать это, откройте все каналы интерес во время шага 8.3. и выполнить все вышеупомянутые шаги 8.4 –8.7 для нескольких каналов интерес.
9. Завершение анализа и очистки Microfluidic насос
- После завершения эксперимента, экспортировать и сохранить все изображения в формате RAW.
- При сохранении результатов, запустите насос microfluidic и коллектором, очистка протокол.
- Для microfluidic насоса сначала запустите папке Размыва/насос размыва , perfusing 4 мл воды класса культуры клеток, следуют 4 мл 80% этанола, как описано в шагах 6.6 – 6.7 сухой насос, запустив воздуха в течение нескольких минут.
- Для того чтобы очистить коллектор, выполните шаг Размыва/коллектор мыть с шприца. Выполните шаги для открытия шприц и многообразие клапаны, как описано в шагах 6.10-6.11 мыть впервые с 80% этанола и следующий с водой класса культуры клеток. Сухие коллектора, нажав воздуха через шприц. Закройте клапан шприц и многообразие клапаны, как описано в шагах 6.10 и 6.15.
10. Подсчет адэрентных лейкоцитов
- Скачать и установить программное обеспечение14 от http://cellprofiler.org обработки изображений.
Примечание: Обработки изображений в этом исследовании была выполнена с использованием программного обеспечения версии 2.1.1. При использовании более новой версии, конвейер может потребоваться незначительные адаптации. - Скачать конвейера Count_leukocytes.cpipe. Щелкните файл | Импорт | Трубопровод из файла и перейдите на PC выбрать трубопровода Count_leukocytes.cpipe.
- Перетащите папку с приобретенными RAW изображений адэрентных лейкоцитов в окно Список файлов в ввода модулей | Изображения секции для анализа.
- Укажите типичный размер лейкоцитов через анализ модули | IdentifyPrimaryObjects. Укажите минимальный и максимальный диаметр адэрентных лейкоцитов в пикселях.
- Выберите критерии фильтрации через анализ модули | FilterObjects. Укажите области минимально признанных объектов в пикселях.
- Запустите анализ, нажав на кнопку Analyze изображения .
Примечание: Все исходные изображения будут обработаны, и результаты будут сохранены в папке выходных данных по умолчанию. Выходной файл Image.txt содержит количество адэрентных лейкоцитов в каждом обработанные изображения (каждое число соответствует одно изображение, то есть, каждый приобретенных поле зрения).
Representative Results
Во-первых реакция hiPSC-ECs стимуляции провоспалительных агент, который должен рассматриваться TNFα, как описано ранее7. TNFα лечение 12 h вызывает upregulation по E-селектина с пика в 6 ч после начала лечения. Кроме того ИКАМ-1-upregulated 6-12 ч после лечения. Хотя мы не наблюдали ожидаемых upregulation VCAM-1, это обычно наблюдается в первичных человеческих пупочную вену эндотелиальных клеток (HUVECs). Мы нашли на ночь (12 h) TNFα лечение будет наиболее удобным для assay адгезии лейкоцитов.
Оптимальное hiPSC-ECs диссоциации должно привести к одной ячейки подвеска бесплатно скопления клеток. Рисунок 2 c иллюстрирует оптимальное hiPSC-EC плотность сразу после инъекции. Как правило 15 мин после инъекции, hiPSC-ECs прикрепить к нижней части канала и начинают распространяться (Рисунок 2D). 1 ч после инъекции, hiPSC-ECs образуют хорошо распространение монослоя вдоль канала и будут готовы приступить к assay потока (рис. 2е).
Маркировки лейкоцитов с флуоресцентные трассирующими выгодно для фазы, контрастность изображения в автоматизированных изображения количественной оценки, как это делает шаг идентификации клеток легче, особенно потому, что лейкоциты придерживаться монослоя ECs и зачастую трудно для программного обеспечения для различения различных типов клеток.
Бесплатный открытым исходным кодом обработки изображений программное обеспечение является очень полезным для автоматизированного количественного определения адэрентных лейкоцитов. Трубопровод, указанных в протоколе здесь основан на идентификации первичного объекта с использованием адаптивного порога флуоресцентных изображений лейкоцитов (рис. 4A). Фильтрация определены объекты, основанные на минимальной площади дополнительно фильтрует ложно выявленных объектов, таких как клетки мусора, Аутофлюоресценция или любые другие неспецифические флуоресцентные сигнал (рис. 4 C, D).
Один microfluidic чип с восьми параллельных каналов позволяет сравнение двух независимых групп, например, ECs продифференцировано от независимых hiPSCs, таких как здоровых доноров или больных с генетическими нарушениями. Дополнительные элементы управления, например необработанных ECs, или предварительной обработки с ИКАМ-1 блокирующие антитела могут быть включены как хорошо10,11. Два-три microfluidic чипы могут быть обработаны одновременно. Для надежности выводов рекомендуется не менее трех независимых биологические эксперименты, проведенные на независимых дней.
Рисунок 1 : Подготовка hiPSC-ECs и лейкоцитов для потока assay. (A) Предварительная обработка hiPSC-ECs с про воспалительных стимул (TNFα). (B) схематическое представление hiPSC-ECs ферментативные диссоциации, центрифугирование и ресуспендирования. Схематическое представление (C) покрытия из каналов (C, слева), инъекции подвеска hiPSC-EC (C, средний) и клеточной культуры среднего сложения после hiPSC-ECs вложений в microfluidic чип. (D) схематическое представление лейкоцита Стиральная шаг, маркировки с Люминесцентную краску DiOC6 и ресуспендирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Чип Microfluidic с hiPSC-ECs. (A) Microfluidic чип в 10 см Петри. (B) увлажненный камеры, используемые для инкубации. (C, D, E) Представитель изображений hiPSC-ECs в microfluidic канал 0 мин (C), 15 (D), 1 h (E) после инъекции. Шкалы бар = 200 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Экспериментальная установка assay живой клетки изображений и лейкоцитарной перфузии. (A, B) Фото (A) и схематическое представление (B) экспериментальной установки assay изображений и поток живой клетки: (1) - Перевернутый флуоресцентный микроскоп с навесные живой тепловизионные камеры (5% CO2, 37 ° C, увлажняется), (2) - microfluidic насос, (3) - 8-канальный коллектор, (4) PC - PC для управления и изображений приобретение микроскопа, (5) - для управления насосом microfluidic. (C) Microfluidic чип с вставленной трубы коллектора 8-канальный фиксированной в пластину держателя и смонтированы в моторизованного столика микроскопа. (D) схематическое представление основных этапов анализа потока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Изображение анализа и автоматического обнаружения адэрентных лейкоцитов. (A) диалоговое окно обработки изображений программное обеспечение с указанными параметрами для идентификации лейкоцитов. (B) диалоговое окно программного обеспечения обработки изображений с указанным фильтрации критерии определены объекты, основанные на минимально приняты площадь поверхности (SAмин = 70 px). (C) пример правильной идентификации лейкоцитов и фильтрация объектов неспецифической небольшой площади поверхности (SA) (Типичный диаметр пиксела (мин, Макс) = (9, 15); Фильтрация критерии SAмин = 70 px). Признанных объектов изображены зеленым цветом и брошенные предметы изображаются в фиолетовый. (D) пример неправильной идентификации лейкоцитов из-за неправильного спектр типичных диаметр (Типичный диаметр пиксела (мин, Макс) = (3, 15); Фильтрация критерии SAмин = 70 px). Признанных объектов изображены зеленым цветом и брошенные предметы изображаются в фиолетовый. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Этот протокол описывает характеристика лечения hiPSC-EC с про воспалительных раздражители, например TNFα, функциональной оценки лейкоцитарной адгезии к hiPSC-ECs в assay потока, используя живые изображения и автоматизированный подсчет адэрентных лейкоцитов.
На ночь стимуляции hiPSC-ECs с TNFα приводит удлиненные внешний вид, который обычно указывает на активированные провоспалительных фенотип в ECs. На этапе оптимизации выражение уровня E-селектина, ИКАМ-1 и VCAM-1 должны быть проверены СУИМ7,8и основной человека пупочную вену ECs (HUVECs) желательно, чтобы быть включены в качестве позитивных элементов.
Оптимальное hiPSC-ECs диссоциации и заполнения плотность должна быть достигнута для достижения вырожденная однослойная без образуя скопления клеток и направить закупоривает. Крайне важно вновь приостановить лейкоциты прямо перед перфузии для того, чтобы избежать осадки клеток и поддерживать постоянной концентрации при опробование каждого канала. Лейкоцитов периферической крови человека, например, моноцитов и нейтрофилов может использоваться, или создана monocytic клеточных линий, таких как THP-1 или HL-60 может использоваться в качестве альтернативы.
Во время Ассамблеи microfluidic установки и во время анализа потока важно, чтобы предотвратить пузырьки воздуха от застревания в microfluidic трубы и каналы, как они могут привести к отряд hiPSC-ECs и/или сторонником лейкоцитов. Жидкость жидкость интерфейс или включение дополнительной стирки шагов в ходе подготовки microfluidic установки может помочь предотвратить пузырьков воздуха.
Желательно, что протокол управляется двумя операторами, где один готовит клетки и второй готовит microfluidic системы и потока assay. Это гарантирует, что ECs покрыты в microfluidic фишки в постоянный промежуток времени до их обработки и улучшает точность и воспроизводимость результатов. Кроме того это также позволяет настраивать ослепленный эксперименты избежать предвзятости в результатах.
Для обнаружения успешного клеток с автоматизированный конвейер обработки изображения важно, чтобы получить изображения в фокусе с высоким соотношением сигнал шум и избежать аутофлюоресценция неспецифической объектов, таких как клетки сгустки. Важнейшее значение имеет правильное спецификация минимальных и максимальных пределов типичный размер адэрентных лейкоциты, которые должны быть определены. Типичный размер лейкоцитов, используя инструмент измерения линии в ImageJ можно оценить. Например в нашем анализе мы использовали диапазон 9 – 15 пикселей, который соответствует физическому размеру 10.3 – 17,1 мкм (рис. 4 c). При использовании неправильно диапазона, например, 3 – 15 пикселей (3.4 – 17,1 мкм), один лейкоцита определяется не как одну ячейку, а скорее его подкомпоненты идентифицируются как отдельные объекты (рис. 4 d). Это приводит к ложным количество объектов должны быть определены.
Многие объекты низкой интенсивности и меньше площадь поверхности, чем лейкоциты могут быть обнаружены с помощью метода предоставленный адаптивного порога. Это может занять место благодаря аутофлюоресценция или любые другие неспецифической флуоресцентный сигналы. Тем не менее эти не-объекты, если их площадь меньше чем типичные области одного лейкоцитов, можно фильтровать путем определения минимально признанных площадь поверхности (рис. 4 c).
Проба потока, описанные здесь позволяет прямой оценки лейкоцитарной адгезии к ЕС монослоя, изучение взаимодействия этих двух клеток типов, но не принимать во внимание другие типы, такие как pericytes, которые представлены в сосудистой стенке и может также участие в регуляции лейкоцита кровоподтек15. Интеграции с другими типами клеток микроокружения 3D культуры может улучшить физиологические актуальность системы. Несмотря на эти ограничения пробирного потока для оценки воспалительных реакций, описанные здесь обеспечивает ценный инструмент для основных характеристик и болезни моделирование приложений hiPSC-ECs.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы признать следующие гранты: Европейский исследовательский совет (ERCAdG 323182 STEMCARDIOVASC); Нидерланды в орган на чипе инициатива, НВО гравитации проекта, финансируемого министерством образования, культуры и науки правительства Нидерландов (024.003.001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vena8 Endothelial+ biochip | Cellix Ltd | V8EP-800-120-02P10 | |
| Mirus Evo Nanopump | Cellix Ltd | MIRUS-EVO-PUMP | 1 x syringe pump; 1 x VenaFluxAssay Software; 1 x tubing kit; power supply and cables. |
| 8-channel manifold MultiFlow8 | Cellix Ltd | MIRUS-MULTIFLOW8 | |
| Humidified box | Cellix Ltd | HUMID-BOX | |
| Fluorescence imaging system Leica AF6000 | Leica Microsystems | ||
| Electron-multiplying charge-coupled device camera | Hamamatsu | C9100 | |
| Biological safety cabinet/laminar flow-hood | Cleanair | ||
| CO2 cell-culture incubator | Panasonic | MCO-170AICUV | |
| Centrifuge | Hitachi | himac-CT6EL | |
| Handheld pipetman (P-10 (10 mL), P-200 (200 µL), P-1000 (1,000 µL) | Gilson international | 4807 (10µl), 4810 (200µl), 4809 (1000µl) | |
| Sterile plastic pipette | Greiner Bio-One | 606180 (5ml), 607180 (10ml) | |
| Petri dish | VWR/ Duran Group | 391-0860 | |
| Culture flasks (75 cm2) | CELLSTAR | 658,170 | |
| Centrifuge tube (15 mL) | CELLSTAR | 188271 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin from porcine skin, type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Fibronectin (Bovine plasma) | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-169 | |
| Human Endothelial-SFM | Life Technologies | 11111-044 | |
| Human VEGF 165 IS, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-109-386 | |
| Human FGF-2, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-093-842 | |
| Platelet-poor Plasma Derived Serum, bovine | Biomedical Technologies | BT-214 | |
| Recombinant Human TNF-α | Tebu-bio | 300-01A-A | |
| TrypLE Select | Life Technologies | 12563029 | |
| DiOC6(3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 21875-034 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Life Technologies | 31350010 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Life Technologies | 15070-063 | |
| Distilled water | Life Technologies | 15230-089 | |
| Ethanol absolute | Merck | 1.00983.2500 | |
| VCAM-1 | R&D systems | FAB5649P | |
| E-Selectin | R&D systems | BBA21 | |
| ICAM-1 | R&D systems | BBA20 | |
| Name | Company | Software version | Comments |
| Cellrofiler | CellProfiler | 2.1.1 | |
| VenaFluxAssay Software | Cellix Ltd | 2.3.a |
References
- Vestweber, D. How leukocytes cross the vascular endothelium. Nature Reviews Immunology. 15 (11), 692-704 (2015).
- Hajishengallis, G., Chavakis, T. Endogenous modulators of inflammatory cell recruitment. Trends in Immunology. 34 (1), 1-6 (2013).
- Molema, G. Heterogeneity in endothelial responsiveness to cytokines, molecular causes, and pharmacological consequences. Seminars in thrombosis and hemostasis. 36 (3), 246-264 (2010).
- Aird, W. C. Endothelial Cell Heterogeneity. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), a006429 (2012).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 1-16 (2016).
- Lin, Y., Gil, C. H., Yoder, M. C. Differentiation, Evaluation, and Application of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Endothelial Cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (11), 2014-2025 (2017).
- Halaidych, O. V., Freund, C., et al. Inflammatory Responses and Barrier Function of Endothelial Cells Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. , (2018).
- Orlova, V. V., vanden Hil, F. E., Petrus-Reurer, S., Drabsch, Y., ten Dijke, P., Mummery, C. L. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (6), 1514-1531 (2014).
- Orlova, V. V., Drabsch, Y., et al. Functionality of endothelial cells and pericytes from human pluripotent stem cells demonstrated in cultured vascular plexus and zebrafish xenografts. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (1), 177-186 (2014).
- Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress. Journal of Visualized Experiments. (85), 1-6 (2014).
- Muller, W. A., Luscinskas, F. W. Assays of transendothelial migration in vitro. Methods in enzymology. 443, 155-176 (2008).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions. Journal of Visualized Experiments. (66), 1-5 (2012).
- Vajen, T., Heinzmann, A. C. A., et al. Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets. Journal of Visualized Experiments. (134), (2018).
- Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte Migration into Inflamed Tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
