Summary
Detta stegvisa protokoll ger en detaljerad beskrivning av experiment och dataanalys för bedömning av inflammatoriskt svar i hiPSC-ECs och analys av leukocyt vidhäftning under fysiologiska flöde.
Abstract
Endotelceller (ECs) är viktigt för regleringen av inflammatoriskt svar genom att begränsa eller att underlätta leukocyt rekrytering till drabbade vävnader via en välkarakteriserad kaskad av Pro självhäftande receptorer som är uppreglerad på den leukocyt cellytan vid inflammatoriska utlösaren. Inflammatoriskt svar skiljer sig mellan individer i befolkningen och den genetiska bakgrunden kan bidra till dessa skillnader. Mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) har visat sig vara en pålitlig källa till ECs (hiPSC-ECs), som alltså representerar en obegränsad källa av celler som fångar den genetiska identiteten och eventuella genetiska varianter eller mutationer av givaren. hiPSC-ECs kan därför användas för modellering inflammatoriskt svar i givare-specifika celler. Inflammatoriskt svar kan modelleras genom att bestämma leukocyt vidhäftning till de hiPSC-ECs under fysiologiska flöde. Detta stegvisa protokoll ger en detaljerad beskrivning av experiment och dataanalys för bedömning av inflammatoriskt svar i hiPSC-ECs och analys av leukocyt vidhäftning under fysiologiska flöde.
Introduction
Inflammation spelar en nyckelroll i många sjukdomstillstånd, inklusive kardiovaskulära och neurodegenerativa sjukdomar, sepsis och biverkningarna reaktioner (ADRs). Endotelceller (ECs) spelar en viktig roll i regleringen av inflammatoriskt svar via induktion av Pro självhäftande receptorer, såsom E-selektin, intercellulära celladhesionsmolekyl-1 (ICAM-1 och andra) och vaskulär celladhesionsmolekyl-1 (VCAM-1) på deras yta 1 , 2. mikrovaskulära ECs i olika vävnader är kända för att uppvisa heterogenitet i inflammatoriskt svar3,4. Dessutom kan genetisk bakgrund eller vissa genetiska förhållanden leda till skillnader i inflammatoriskt svar mellan individer; Det är därför viktigt att ha tillgång till ECs från olika individer. Mer nyligen, mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs)5, som kan härledas från praktiskt taget alla individ, visades att fungera som en pålitlig och förnyelsebar källa av ECs6,7,8, 9. därför bedömningen av inflammatoriskt svar och leukocyt rekrytering i hiPSC-ECs är värdefulla, inte bara för modellering av vissa genetiska sjukdomar, men också att ge indikationer på interindividuell variabilitet och använda som ett verktyg för personlig medicin i framtiden.
Flöde-analyser ger ett användbart verktyg för att studera endothelial-leukocyt interaktion. Framsteg i ultrakalla enheter möjliggöra reproduktion av fysiologiska strömningsförhållanden med exakt kontroll av vaskulära säng-specifika shear stressnivåer. Levande imaging tillåter övervakning av kaskaden av händelser av leukocyt capture, rulla, krypa, adhesion och migration. Flera flöde analyser att studera endothelial-leukocyt interaktion har utvecklats, men de alla använder primära ECs10,11,12,13. Här beskriver vi i detalj analysen för bedömningen av humant leukocyt vidhäftning till hiPSC-ECs under fysiologiska flöde. I den här proceduren beskriver vi optimerade villkor för hiPSC-EG stimulering med pro-inflammatoriska stimuli, såsom tumörnekrosfaktor alfa (TNFα), dissociation, sådd i en mikroflödessystem chip med åtta parallella kanaler. Vi beskriva ett stegvisa protokoll för perfusionen i hiPSC-ECs med upphävandet av fluorescently märkta leukocyter i ultrakalla marker, live cell imaging och automatiserad inventering av vidhäftande leukocyter.
Detta protokoll är användbara för bedömning av inflammatoriskt svar i hiPSC-ECs i drogkontroll, sjukdom modellering och personlig regenerativ medicin.
Protocol
1. beredning av lösningar och reagenser
- Förbereda komplett mänskliga Endothelial-SFM medium (EG-SFM FULL) genom att lägga till trombocyt-fattiga plasmaderiverade serum (1%), basic fibroblast tillväxtfaktor (bFGF, 20 ng/mL) och vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF, 50 ng/mL) till mänskliga Endothelial-SFM (se tabellen Material). Filtrera mediet genom ett 0,22 µm porstorlek filter och lagra den på 4 ° C i upp till 2 veckor.
- Förbereda komplett RPMI medium genom att lägga till fostrets bovint serum (10%), 2-merkaptoetanol (0,05 nM), L-glutamin (1%), Penicillin-Streptomycin (25 U/mL) till RPMI medium (se Tabell för material). Förvaras vid 4 ° C i upp till 3 veckor.
2. beläggning av mikrofabricerade Chips
- Placera en steril biochip i en 10 cm steril petriskål.
- Förbereda Fibronektin fungerande lösning genom beredning av stamlösning i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) utan Ca2 +/Mg2 + till en slutlig koncentration på 50 µg/mL. Uppskatta 80 µL av fungerande lösning per biochip.
- Injicera varje kanal i biochip 10 µL av Fibronektin fungerande lösning. Använd en pipett med små 10 µL tips och se till att bilda en tät kontakt mellan kanal inloppet och pipettspetsen (figur 1 c, vänster).
- Stäng locket på petriskål som innehåller biochip och placera den i en fuktig kammare (figur 2B). Lagra i kammaren vid 4 ° C över natten. Att fukta kammaren, placera ett rent läskpapper längst ned på den befuktade kammaren och tillsätt 5 mL steril H2O.
- Nästa dag, innan analysen, varma före biochip vid 37 ° C i inkubatorn.
3. förberedelse av hiPSC-ECs
Obs: I protokollet som beskrivs här, var hiPSC-ECs differentierade, renat, fryst tillstånd och tinade som tidigare beskrivits8.
- Blidväder och platta hiPSC-ECs i fullständig EG-SFM FULL i en 0,1% gelatin-belagd T75-kolv, tre till fyra dagar före analysen.
- Natten före analysen, stimulera hiPSC-ECs med TNFα genom att lägga till EG-SFM FULL kompletteras med 10 ng/mL TNFα och inkubera över natten (~ 12 h) vid 37 ° C, som tidigare beskrivits 7.
4. hiPSC-ECs Dissociation och Seeding i mikroflödessystem Chip
- På dagen för analysen, ta kolven hiPSC-ECS från inkubatorn och undersöka cellerna i Mikroskop. Se till att hiPSC-ECs är 80 – 100% konfluenta och har en typisk EG-morfologi.
- Över kolven till cell kultur huven.
- Aspirera på medellång från kolven hiPSC-ECS.
- Kort tvätta cellkulturen genom att tillsätta 10 mL PBS utan Ca2 +/Mg2 +. Aspirera PBS.
- Tillsätt 4 mL per kolv av 1 x dissociation enzym. Inkubera i 5 minuter i rumstemperatur (RT) (figur 1B).
- Stoppa dissociation reaktionen genom att tillsätta 8 mL av mänskliga Endothelial-SFM medium per kolv. Försiktigt loss och samla hiPSC-ECs suspensionen i en 15 mL koniska rör med 5 mL pipett.
- Räknas det totala antalet celler i suspensionen.
- Centrifugera cellerna vid 300 x g i 3 min vid RT.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i EG-SFM FULL koncentration av 1,5 x 107 celler/mL.
- Ta ut petriskål med biochip från inkubatorn och överföra den till cell kultur huven.
- Aspirera Fibronektin lösningen från alla kanaler av mikroflödessystem chip.
- Injicera 6 µL cellsuspension i varje kanal med pipett med små 10 µL spets (figur 1 c, mitten). Kontrollera att cellsuspensionen blandas väl före injektion och undvika cell utfällning.
- Granska biochip under mikroskopet och se till att cellerna är jämnt fördelad och cell densiteten är höga (figur 2 c).
- Inkubera i biochip under 15 minuter vid 37 ° C.
- Tillsätt 40 µL av EG-SFM FULL till medelstora reservoarerna från båda sidor av varje kanal.
- Inkubera i biochip för 1 h vid 37 ° C (figur 1 c, höger).
- Lägga till en annan 50 µL av EG-SFM FULL i reservoarerna från båda sidor av varje kanal.
5. beredning av humana leukocyter
Obs: I protokollet som beskrivs här, användes en kommersiellt tillgängliga monocytic cellinje (THP-1). Alternativt, perifera mononukleära blodceller eller neutrofiler kan användas. Isolering av perifert blod monocyter och neutrofiler kan utföras med standardförfarande11. Utföra alla steg som beskrivs i denna punkt i en cell kultur huva.
- Samla in i leukocyter i en 50 mL konisk tub.
- Tvätta leukocyter med 10 mL PBS utan Ca2 +/Mg2 +. Centrifugera cellerna vid 300 x g i 3 min vid RT (figur 1 d).
- Aspirera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 1 mL PBS med DiOC6 färgämne (λex = 485 nm, λem = 501 nm) (1:5, 000). Inkubera cellerna i mörkret i 10 min på RT.
- Tvätta leukocyter med 10 mL PBS utan Ca2 +/Mg2 +. Centrifugera cellerna vid 300 x g i 3 min vid RT. upprepa steget tvätt en gång.
- Räknas det totala antalet celler i suspensionen.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i komplett RPMI medium till en slutlig koncentration av 2,5 x 106 celler/mL.
6. beredning av mikrofabricerade pumpen
- Montera mikroflödessystem pump med 8-kanals grenröret.
- Ansluta pumpen till en PC med den installerade operativsystem.
- Starta programvaran mikroflödessystem och ladda protokollet genom att klicka på Öppna protokoll och navigera på datorn för att välja mikroflödessystem protokollet.
- Anslut programvaran och pumpen genom att markera mappen Setup och klicka på Kör test steg.
- Definiera geometri av kanalerna för kontrollen rätt flöde rate: Välj Uppdatering geometri i mappen Geometri Setup och klicka på Kör test steg.
Obs: Kontrollera att geometri Detaljer matchar sprutan och kanaler som skall användas (geometri ID = 1, antal kanaler = 8, kanalbredd = 800.0 µm, kanal djup = 120,0 µm, spruta volym = 250 µL) och viskositeten av provet (vätskans viskositet = 1,0). - Tvätta pumpen genom att placera intagskabel (orange) i 50 mL koniska röret som innehåller 80% etanol. Placera outlet kabeln (grön) i 50 mL koniska tom röret (behållaren).
- Välj mappen Blekt/Pump blekt och klicka på Kör test steg (tvätta volym = 2000 µL, volym TVÄTTNINGSSTEGET = 250 µL, blekt riktning = utgång). Upprepa tvätt en gång till.
- Upprepa pumpen tvätt steg (steg 6,6 – 6,7) med cell kultur grade vatten och mänskliga Endothelial-SFM odlingsmedium.
- Fortsätt med tvätt steg av grenröret.
- Manuellt öppna ventilen mellan sprutan och samlingsröret genom att placera den 3-vägs adaptern i rätt position (indikator OFF vrids till vänster).
- Välj Uppsättning aktuell kanal/öppna steg i mappen Grenrör/blekt tvätt och klicka på Kör test steg för att öppna alla ventiler i grenröret.
- Tvätta samlingsröret manuellt genom att trycka 5 mL 80-procentig etanol från sprutan, följt av 5 mL cell kultur grade vatten.
- Tvätta grenröret genom att trycka 5 mL av mänskliga Endothelial-SFM odlingsmedium från sprutan.
- Ta bort alla stora luftbubblor som är fångade i grenröret. För att göra detta, placera 8-väl pin adaptern i den 10 cm petriskål med medlet och utföra trycka/dra med sprutan tills alla stora luftbubblor är borta (små bubblor är inte ett problem).
- Välj Uppsättning aktuell kanal/Stäng steg i mappen Grenrör/blekt tvätt och klicka på Kör test steg för att stänga alla ventiler i grenröret.
- Anslut grön outlet kabeln från pumpen till grenrör adaptern.
- Byta 3-vägs ventilen tillbaka till OFF -läge att stänga sprutan.
- Välj Blekt/kabel blekt mapp och klicka på Kör test steg tvätta varje port med RPMI medium individuellt, att säkerställa att alla luftbubblor avlägsnas från varje kabel (fördela volym = 100 µL).
Obs: Varje ventil av grenröret är öppnade en-för-en, 1 till 8, och 100 μL av medium dispenserats genom varje enskild kanal medan att hålla de andra kanalerna stängda. Se till att vätskan körs från varje stift. Om det finns ingen vätska kommer ut, är det en indikation på en luftbubbla eller en täppa.
7. förberedelse av mikroflödessystem Chip för Live Imaging
- Säkerställa att de mikroflödessystem installationerna är redo, och levande imaging kammaren är pre skakade till 37 ° C och nivån av CO2 når 5% (figur 3A, B).
- Ta biochip från inkubatorn och placera den i mikroskopet chip hållaren. Montera hållaren för chip på mikroskopet imaging scenen (figur 3 c).
- För att ansluta biochip till pumpen via samlingsröret, placera den 8-pin adaptern nära outlet behållarna av chip och fördjupa alla stift på medellång (men Anslut inte helt).
- Välj den blekt | Ansluta till Chip mapp och klicka på Kör test steg att dosera RPMI medium innan du ansluter chippet (fördela volym = 30 mL). När mediet dispenserats, infoga 8-pin adaptern i uttaget av biochip.
Obs: Under detta steg, alla kanaler är inställt på på (öppna) och 30 µL av medium dispenserats genom varje kanal och efter detta kanalerna är inställd på Off (stängd). Detta säkerställer att ingen luft bubblor kommer att införas i kanalerna av mikroflödessystem chip. - Manuellt aspirera på medellång från alla inlopp reservoarer av biochip med en pipett.
- Välj den blekt | Chip blekt mapp och klicka på Kör test steg att BEGJUTA 40 mL EG-SFM FULL medium genom alla kanaler-taget bli av döda celler/skräp från kanalen (blekt volym = 40 µL, maximal blekt skjuvning = 40 dynes cm2).
8. flöde vidhäftning test och bild förvärv
- Manuellt aspirera på medellång från inlopp reservoaren av kanalisera av intresse med en pipett.
- Tillsätt 100 µL av leukocyter från steg 5,6 till inlopp reservoaren av kanalisera av intresse.
Obs: Blanda försiktigt cellerna för att göra en enskild cell suspension. - I Cell analys | Steg beskrivning mapp, Välj Uppsättning aktuell kanal/steg beskrivning och i listan över kanaler, väljer du endast den aktuella kanalen av intresse och inställt på On (öppen) och ställa in alla andra sju kanaler till Off (stängd).
- Välj Cell analysen | Steg beskrivning mapp och klicka på Kör test steg.
Obs: Kontrollera att Variabel Flow Rate dispensering gäller konstant undertryck att dra leukocyt fjädringen från reservoaren inlopp genom kanalen för 5 min (Shear set = konstant, skjuvspänningen = -0,5 dyn/cm2, längd = 00:05:00, Skanna dröjsmål = 00:00:00). Det negativa värdet på skjuvspänningen säkerställer rätt riktning av flödet. - Aspirera återstående cellväggar från reservoaren inlopp.
- Tillsätt 100 µL av komplett RPMI medium till reservoaren inlopp. Markera Cell Assay/steg beskrivning mapp och klicka på Kör test steg BEGJUTA kanalen för 5 min med RPMI medium för att tvätta ut alla icke-anhängare leukocyter (Shear set = konstant, skjuvspänningen = -0,5 dyn/cm2, längd = 00:05:00, Scan delay = 00:00:00).
- Hämta bilder från minst tre olika positioner av kanalen till bild de klibbade leukocyter (för att säkerställa att representativa områden fångas).
- Upprepa steg 8,1 – 8,7 för funktionell bedömning av hela resten av kanalerna.
Obs: Det är möjligt att köra flera kanaler samtidigt. För att göra det., öppna alla kanaler av intresse under 8.3-steg. och utför alla ovannämnda steg 8,4 – 8,7 för flera kanaler av intresse.
9. att slutföra analysen och rengöring av mikrofabricerade pumpen
- Efter avslutad experimentet, exportera och spara alla bilder i RAW format.
- Samtidigt spara resultaten, kör mikroflödessystem pumpen och samlingsröret rengöring protokoll.
- För mikroflödessystem pumpen först köra mappen Blekt/Pump bortspolning av startas 4 mL cell kultur grade vatten, följt av 4 mL 80% etanol enligt beskrivningen i steg 6,6 – 6,7 torka pumpen genom att köra luften i flera minuter.
- För att rengöra samlingsröret, kör Grenrör/blekt TVÄTTNINGSSTEGET med sprutan. Följ stegen för att öppna sprutan och insug ventilerna som beskrivs i steg 6.10 – 6.11 tvätta först med 80% etanol och nästa med cell kultur grade vatten. Torka grenröret genom att trycka luft via sprutan. Stäng ventilen spruta och insug ventilerna enligt beskrivningen i steg 6.10 och 6.15.
10. räkna av vidhäftande leukocyter
- Hämta och installera bildbehandling programvara14 från http://cellprofiler.org.
Obs: Bildbehandling i denna studie utfördes med hjälp av programvara version 2.1.1. Om du använder en nyare version, kan rörledningen kräva mindre anpassning. - Hämta rörledningen Count_leukocytes.cpipe. Klicka på Arkiv | Importera | Försäljningsförloppet från filen och navigera på PC att välja rörledningen Count_leukocytes.cpipe.
- Dra-och-släpp en mapp med förvärvade RAW-bilder av vidhäftande leukocyter till fönstret fil i modulerna Input | Bilder avsnitt för analys.
- Ange typiska storleken på leukocyter via analys moduler | IdentifyPrimaryObjects. Ange minimal och maximal diameter av vidhäftande leukocyter i pixlar.
- Välj filtreringsvillkor via analys moduler | FilterObjects. Ange området minimalt accepterade av objekt i bildpunkter.
- Börja analysen genom att trycka på knappen analysera bilder .
Obs: Alla RAW-bilder kommer att behandlas, och resultaten kommer att sparas i en standard output mapp. Image.txt utdatafilen innehåller numrerar av vidhäftande leukocyter i varje bearbetade bilden (varje nummer motsvarar en bild, dvs varje förvärvade synfält).
Representative Results
Först beskrivits hiPSC-ECs svar på stimulering med pro-inflammatorisk agent TNFα ska prövas, som tidigare7. TNFα behandling för 12 h utlöser uppreglering av E-selektin med topp på 6 h efter behandlingsstart. Dessutom är ICAM-1 uppreglerad 6-12 h efter behandling. Även om vi inte iakttog den förväntade uppreglering av VCAM-1, är det vanligen observerats i primära mänskliga navel ven endotelceller (HUVECs). Vi hittade övernattning (12 h) TNFα behandling vara det mest bekväma för leukocyt vidhäftning analysen.
Optimala hiPSC-ECs dissociation bör resultera i en enskild cell suspension gratis cell klumpar. Figur 2 c visar den optimala hiPSC-EG densiteten direkt efter injektion. Normalt 15 min efter injektion, hiPSC-ECs fäster till botten av kanalen och starta att sprida (figur 2D). 1 h efter injektion, hiPSC-ECs bildar en väl spridda enskiktslager längs kanalen och kommer att vara redo att påbörja flöde analysen (figur 2E).
Märkning av leukocyter med fluorescerande spårämne är fördelaktigt för fas bilder med kontrast automatiserad bild kvantifiering, eftersom det gör det cell identifiering steget lättare, särskilt eftersom cellväggar följer enskiktslager av ECs och det är ofta svårt för programvaran för att skilja olika celltyper.
Gratis öppen källkod bildbehandlingsprogram är mycket användbart för automatiserad kvantifiering av vidhäftande leukocyter. Rörledningen beskrivs i protokollet här baseras på primära objektet identifiering med adaptiv tröskelvärde av fluorescerande bilder av leukocyter (figur 4A). Filtrering av identifierade objekt baserat på en minimal yta dessutom filtrerar bort felaktigt identifierade objekt, såsom cellfragment, autofluorescens eller någon annan icke-specifik fluorescerande signal (figur 4 C, D).
En mikroflödessystem chip med åtta parallella kanaler tillåter jämförelse av två oberoende grupper, exempelvis ECs åtskilt från oberoende hiPSCs, såsom friska donatorer eller patienter med genetiska sjukdomar. Ytterligare kontroller, till exempel obehandlad ECs, eller förbehandling med en ICAM-1 blockerande antikropp kan ingå som väl10,11. Två till tre mikroflödessystem chip kan bearbetas samtidigt. För robustheten i slutsatserna rekommenderas minst tre oberoende biologiska experiment utförs på oberoende dagar.
Figur 1 : Förberedelse av hiPSC-ECs och leukocyter för flöde analysen. (A) förbehandling av hiPSC-ECs med pro-inflammatoriska stimulans (TNFα). (B) Schematisk bild av hiPSC-ECs enzymatisk dissociation, centrifugering och resuspension. (C) Schematisk framställning av beläggning av kanalerna C, vänster, injektion av hiPSC-EG upphängning (C, mitten) och cell odlingsmedium tillägg efter hiPSC-ECs fastsättning i mikroflödessystem chip. (D) Schematisk bild av leukocyt tvätt steg, märkning med fluorescerande färg DiOC6 och resuspension. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Mikroflödessystem chip med hiPSC-ECs. (A) mikroflödessystem chip i en 10 cm petriskål. (B) den befuktade kammaren används för inkubation. (C, D, E) Representativa bilder av hiPSC-ECs i mikroflödessystem kanal 0 min (C), 15 min (D), 1 h (E) efter injektion. Skalstapeln = 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3 : Experimentell setup levande cell imaging och leukocyt perfusion analysens. (A, B) Foto a och schematisk representation (B) av den experimentella setup levande cell imaging och flöde analysens: (1) - inverterad fluorescerande Mikroskop med monterade levande imaging kammare (5% CO2, 37 ° C, tilluften), (2) - mikroflödessystem pump, (3) - 8-kanals Grenrör, (4) - PC för Mikroskop kontroll och bild förvärv, (5) - PC för mikroflödessystem pumpstyrning. (C) mikroflödessystem chip med infogade slangen av 8-kanals samlingsröret fast i en tallrik hållare och monterad i den motorized etappen av mikroskopet. (D) Schematisk bild av de stora steg i flödet analysen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Bild analys och automatiserad detektion av vidhäftande leukocyter. (A) dialogfönstret för bildbehandling programvara med angivna inställningar för identifiering av leukocyter. (B), dialogfönstret för programvaran bildbehandling med angivna filtrering kriterier identifierade objekt baserat på minimalt accepterade yta (SAmin = 70 px). (C) exempel på korrekt identifiering av leukocyter och filtrering av icke-specifika objekt av liten yta (SA) (typisk diameter i pixel (Min, Max) = (9, 15); Filtrering kriterier SAmin = 70 px). Accepterade objekt skildras i grönt och kasserade objekt skildras i violett. (D) exempel på felaktig identifiering av leukocyter på grund av den felaktiga rad typiska diameter (typiska diameter i pixel (Min, Max) = (3, 15); Filtrering kriterier SAmin = 70 px). Accepterade objekt skildras i grönt och kasserade objekt skildras i violett. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Det här protokollet beskriver karakterisering av hiPSC-EG behandling med pro-inflammatoriska stimuli, såsom TNFα, funktionell bedömning av leukocyt vidhäftning till hiPSC-ECs i flödet analysen använder levande imaging och automatiserad inventering av vidhäftande leukocyter.
Övernattning stimulering av hiPSC-ECs med TNFα resulterar i den avlånga utseende som anger vanligtvis en aktiverad pro-inflammatoriska fenotyp i ECs. Under optimering, uttryck nivåer av E-selektin, ICAM-1, VCAM-1 bör kontrolleras av FACs7,8, och primära mänskliga navel ven ECs (HUVECs) är tillrådligt att inkluderas som positiva kontroller.
Optimala hiPSC-ECs dissociation och seedning densitet bör uppnås för att uppnå en konfluenta enskiktslager utan att bilda cell klumpar och kanalisera träskor. Det är viktigt för återsuspendering leukocyter precis innan perfusion för att undvika cell nederbörd och behålla en konstant koncentration när testmetoder varje kanal. Människans perifera leukocyter, såsom monocyter och neutrofiler kan användas, eller etablerat monocytic cellinjer, såsom THP-1 eller HL-60 kan användas som ett alternativ.
Vid montering av mikrofabricerade setup och under flöde analysen är det kritiskt för att undvika luftbubblor från att bli instängd i ultrakalla slangar och kanaler eftersom de kan resultera i avskildheten av hiPSC-ECs eller fastsittande leukocyter. Vätska-till-fluid gränssnitt eller inkorporering av ytterligare tvätt steg under utarbetandet av mikrofabricerade setup kunde hjälpa för att förhindra luftbubblor.
Det är tillrådligt att protokollet drivs av två aktörer där förbereder en cellerna och andra förbereder mikroflödessystem system och flöde analysen. Detta säkerställer att ECs är klädd i ultrakalla marker inom en konstant tidsfönster före bearbetning och förbättrar noggrannheten och reproducerbarheten för resultaten. Dessutom, tillåter detta också att inrätta blindad experiment för att undvika bias i resultaten.
För framgångsrik cell detektering med automatiserad bildbehandling rörledning, är det viktigt att förvärva bilder i fokus med högt signal-brus-förhållande och undvika autofluorescens av icke-specifika objekt, till exempel cell klumpar. Av avgörande betydelse är den rätt specifikationen av minimum- och maximumvärde gränserna för typiska storleken av vidhäftande leukocyter som måste identifieras. Man kan uppskatta leukocyter med en rad mätverktyg i ImageJ typisk storlek. Till exempel i vår analys använde vi spänna av 9 – 15 pixlar vilket motsvarar den fysiska storleken på 10,3 – 17,1 µm (figur 4 c). När du använder ett fel intervall, t.ex., 3-15 pixlar (3,4 – 17,1 µm), en enda leukocyt identifieras inte som en cell, men snarare dess kapitlen identifieras som separata objekt (figur 4 d). Detta leder till falskt antalet objekt identifieras.
Många föremål av en låg intensitet och mindre yta än leukocyter kan upptäckas med hjälp av medföljande adaptiv tröskelvärde metoden. Detta kan ta plats på grund av autofluorescens eller några andra icke-specifika fluorescerande signaler. Ändå, dessa icke-specifika objekt, om deras område är lägre än det typiska området av en enda leukocyt, kan filtreras genom att definiera minimalt accepterade ytan (figur 4 c).
Flöde analysen beskrivs här tillåter direkt bedömning av leukocyt vidhäftning till en EG enskiktslager, belysa samspelet mellan dessa två cell typer, men tar inte hänsyn till andra cell typer, såsom pericyter som är närvarande i kärlväggen och kanske också delta i regleringen av leukocyt extravasering15. Integrera en 3D kultur närmiljön med andra celltyper kan förbättra den fysiologiska betydelsen av systemet. Trots dessa begränsningar ger flöde analysen för bedömningen av inflammatoriskt svar som beskrivs här ett värdefullt verktyg för grundläggande karakterisering och sjukdom modellering program hiPSC-ECS.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna de följande bidrag: Europeiska forskningsrådet (ERCAdG 323182 STEMCARDIOVASC); Nederländerna orgel-on-Chip initiativ, en NWO Gravitation projekt finansierat av ministeriet för utbildning, kultur och vetenskap av regeringen av Nederländerna (024.003.001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vena8 Endothelial+ biochip | Cellix Ltd | V8EP-800-120-02P10 | |
| Mirus Evo Nanopump | Cellix Ltd | MIRUS-EVO-PUMP | 1 x syringe pump; 1 x VenaFluxAssay Software; 1 x tubing kit; power supply and cables. |
| 8-channel manifold MultiFlow8 | Cellix Ltd | MIRUS-MULTIFLOW8 | |
| Humidified box | Cellix Ltd | HUMID-BOX | |
| Fluorescence imaging system Leica AF6000 | Leica Microsystems | ||
| Electron-multiplying charge-coupled device camera | Hamamatsu | C9100 | |
| Biological safety cabinet/laminar flow-hood | Cleanair | ||
| CO2 cell-culture incubator | Panasonic | MCO-170AICUV | |
| Centrifuge | Hitachi | himac-CT6EL | |
| Handheld pipetman (P-10 (10 mL), P-200 (200 µL), P-1000 (1,000 µL) | Gilson international | 4807 (10µl), 4810 (200µl), 4809 (1000µl) | |
| Sterile plastic pipette | Greiner Bio-One | 606180 (5ml), 607180 (10ml) | |
| Petri dish | VWR/ Duran Group | 391-0860 | |
| Culture flasks (75 cm2) | CELLSTAR | 658,170 | |
| Centrifuge tube (15 mL) | CELLSTAR | 188271 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin from porcine skin, type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Fibronectin (Bovine plasma) | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-169 | |
| Human Endothelial-SFM | Life Technologies | 11111-044 | |
| Human VEGF 165 IS, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-109-386 | |
| Human FGF-2, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-093-842 | |
| Platelet-poor Plasma Derived Serum, bovine | Biomedical Technologies | BT-214 | |
| Recombinant Human TNF-α | Tebu-bio | 300-01A-A | |
| TrypLE Select | Life Technologies | 12563029 | |
| DiOC6(3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 21875-034 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Life Technologies | 31350010 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Life Technologies | 15070-063 | |
| Distilled water | Life Technologies | 15230-089 | |
| Ethanol absolute | Merck | 1.00983.2500 | |
| VCAM-1 | R&D systems | FAB5649P | |
| E-Selectin | R&D systems | BBA21 | |
| ICAM-1 | R&D systems | BBA20 | |
| Name | Company | Software version | Comments |
| Cellrofiler | CellProfiler | 2.1.1 | |
| VenaFluxAssay Software | Cellix Ltd | 2.3.a |
References
- Vestweber, D. How leukocytes cross the vascular endothelium. Nature Reviews Immunology. 15 (11), 692-704 (2015).
- Hajishengallis, G., Chavakis, T. Endogenous modulators of inflammatory cell recruitment. Trends in Immunology. 34 (1), 1-6 (2013).
- Molema, G. Heterogeneity in endothelial responsiveness to cytokines, molecular causes, and pharmacological consequences. Seminars in thrombosis and hemostasis. 36 (3), 246-264 (2010).
- Aird, W. C. Endothelial Cell Heterogeneity. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), a006429 (2012).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 1-16 (2016).
- Lin, Y., Gil, C. H., Yoder, M. C. Differentiation, Evaluation, and Application of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Endothelial Cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (11), 2014-2025 (2017).
- Halaidych, O. V., Freund, C., et al. Inflammatory Responses and Barrier Function of Endothelial Cells Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. , (2018).
- Orlova, V. V., vanden Hil, F. E., Petrus-Reurer, S., Drabsch, Y., ten Dijke, P., Mummery, C. L. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (6), 1514-1531 (2014).
- Orlova, V. V., Drabsch, Y., et al. Functionality of endothelial cells and pericytes from human pluripotent stem cells demonstrated in cultured vascular plexus and zebrafish xenografts. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (1), 177-186 (2014).
- Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress. Journal of Visualized Experiments. (85), 1-6 (2014).
- Muller, W. A., Luscinskas, F. W. Assays of transendothelial migration in vitro. Methods in enzymology. 443, 155-176 (2008).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions. Journal of Visualized Experiments. (66), 1-5 (2012).
- Vajen, T., Heinzmann, A. C. A., et al. Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets. Journal of Visualized Experiments. (134), (2018).
- Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte Migration into Inflamed Tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
