Summary
Adım adım bu iletişim kuralı deneysel kurulum ve inflamatuar hiPSC ECs yanıt-e doğru değerlendirilmesi için veri analizi ve lökosit yapışma fizyolojik akış altında analiz ayrıntılı açıklamasını sağlar.
Abstract
Endotel hücreleri (ECs) inflamatuar yanıt düzenlenmesi için temel sınırlama veya lökosit işe alım iyi karakterize bir çağlayan ile etkilenen doku içine upregulated olan yanlısı tutkal reseptörlerinin kolaylaştırılması üzerinde Akyuvar hücre yüzeyine inflamatuar tetiği üzerine. İnflamatuar yanıt bireyler nüfus arasındaki farklılık gösterebilir ve genetik arka plan bu farklılıklara katkıda bulunabilir. İnsan indüklenmiş pluripotent kök hücreler (hiPSCs) güvenilir bir kaynak olarak ECs (hiPSC-ECs), böylece hücrelerin genetik kimlik ve herhangi bir genetik varyantların yakalama sınırsız bir kaynak veya bağış mutasyonlar gösteren gösterilmiştir. hiPSC-ECs bu nedenle donör özgü hücrelerdeki inflamatuar yanıt model oluşturma için kullanılabilir. İnflamatuar yanıt lökosit yapışma için fizyolojik akış altında hiPSC ECs belirlenerek modellenebilir. Adım adım bu iletişim kuralı deneysel kurulum ve inflamatuar hiPSC ECs yanıt-e doğru değerlendirilmesi için veri analizi ve lökosit yapışma fizyolojik akış altında analiz ayrıntılı açıklamasını sağlar.
Introduction
İltihap birçok patolojik koşullar, kardiyovasküler dahil olmak üzere ve nörodejeneratif hastalıklar, sepsis ve advers ilaç yanıt (advers) önemli bir rol oynamaktadır. Endotel hücreleri (ECs) inflamatuar yanıt E-selektin, hücreler arası adezyon molekülü-1 (ICAM-1) ve vasküler hücre adezyon molekülü-1 (VCAM-1) onların yüzeyi gibi yanlısı tutkal reseptörlerinin indüksiyon yoluyla düzenlenmesinde önemli bir rol oynamak 1 , 2. farklı dokularda mikrovasküler ECs heterojenite inflamatuar yanıt3,4sergi bilinmektedir. Ayrıca, genetik arka plan veya belirli genetik koşullar inflamatuar yanıt bireyler arasında farklılıklar neden olabilir; Bu nedenle erişim için ECs farklı bireyler olması önemlidir. Daha yakın, hemen hemen herhangi bir kişi elde edilebilir, insan indüklenmiş pluripotent kök hücreler (hiPSCs)5, ECs6,7,8, güvenilir ve yenilenebilir kaynağı olarak hizmet gösterilmiştir 9. bu nedenle, inflamatuar yanıt ve lökosit istihdam hiPSC-ECs değerlendirme aynı zamanda arası bireysel farklılıklarına belirtileri sağlamak ve için bir araç olarak kullanmak için sadece bazı genetik bozukluklar, modelleme için değerlidir Kişiselleştirilmiş tıp içinde belgili tanımlık gelecek.
Akış deneyleri lökosit endotel etkileşim eğitim için yararlı bir araç sağlar. Mikrosıvısal aygıtların gelişmeler fizyolojik sıvı akış koşulları üreme ile vasküler yatak özel kesme stres düzeyleri hassas kontrol sağlar. Canlı görüntüleme lökosit yakalama, inişli çıkışlı, tarama, yapışma ve hicret olayların çağlayan izleme sağlar. Lökosit endotel etkileşim çalışmaya çeşitli akış deneyleri geliştirilmiştir, ancak, onlar tüm birincil ECs10,11,12,13yararlanmak. Burada, insan lökosit yapışma için hiPSC-ECs fizyolojik akış altında değerlendirilmesi için tahlil detaylı olarak anlatacağız. Bu yordam, biz bir mikrosıvısal çip ile sekiz paralel kanal içine tohum hiPSC-EC stimülasyon gibi tümör nekrozis faktör alfa (TNFα), ayrılma, pro-inflamatuar uyaranlara ile en iyi duruma getirilmiş koşulları açıklanmaktadır. HiPSC-ECs perfüzyon mikrosıvısal fiş fluorescently etiketli lökositlerin süspansiyon için adım adım bir protokol tanımlamak, hücre görüntüleme yaşadığımız ve yapışık lökosit sayma otomatik.
Bu protokol inflamatuar hiPSC-ECs uyuşturucu tarama, hastalık modelleme ve kişiselleştirilmiş rejeneratif tıp yanıt-e doğru değerlendirilmesi için yararlıdır.
Protocol
1. hazırlanması çözümleri ve Kimyasalları
- Tam insan Endothelial-SFM Orta (EC-SFM tam) trombosit-yoksul plazma elde edilen serum (% 1), temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF, 20 ng/mL) ve vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF, 50 ng/mL) insan Endothelial-SFM (görmek tablo ekleyerek hazırlamak Malzemeler). Orta 0,22 µm gözenek filtre ile filtre ve 4 ° C'de 2 hafta için saklayın.
- Fetal Sığır serum (% 10), ekleyerek tam RPMI orta hazırlamak 2-mercaptoethanol (0,05 nM), L-glutamine (% 1), penisilin-streptomisin (25 U/mL) RPMI Orta ( Tablo malzemelerigörmek). 4 ° C'de 3 haftaya kadar saklayın.
2. kaplama mikrosıvısal fişleri
- Steril biochip 10 cm steril Petri kabına yerleştirin.
- Fibronektin çalışma çözüm fosfat tamponlu tuz (PBS) olmadan Ca2 +/Mg2 + 50 µg/mL nihai bir konsantrasyon için hisse senedi çözümde başlamaktan tarafından hazırlayın. Çalışma çözüm biochip başına 80 µL tahmin ediyoruz.
- Fibronektin çalışma çözüm 10 µL biochip her kanal enjekte. Bir pipet ile küçük 10 µL ipuçlarını kullanın ve kanal giriş ve Pipet Ucu (Şekil 1 c, sol) arasında sıkı bir temas kurmaya emin olun.
- Biochip içeren Petri kabına kapağını kapatın ve bir oksijen odası (Şekil 2B) yerleştirin. Gecede odası 4 ° C'de depolayın. Odası nemlendirmek için temiz bir kağıt mendil oksijen odasının altındaki yer ve 5 mL steril H2O. ekleyin
- Önce tahlil, ertesi gün önceden biochip kuluçka 37 ° C'de ısıtın.
3. hiPSC-ECs hazırlanması
Not: Burada açıklanan iletişim kuralında, hiPSC-ECs farklılaşmış, saf, cryopreserved ve yukarıda açıklanan8olarak çözdürülen.
- Tezcan ve plaka hiPSC-ECs içinde tam EC-SFM tam bir %0,1 jelatin kaplı T75 şişesi, üç dört gün önce tahlil içine.
- EC-SFM 10 ng/mL ile TNFα takıma tam ekleyerek hiPSC-ECs ile TNFα gecesi öncesinde tahlil, teşvik ve kuluçkaya geceleme (~ 12 h) yukarıda açıklanan 7olarak 37 ° C'de.
4. hiPSC-ECs ayrılma ve tohumlama mikrosıvısal çip içine
- Tahlil gününde, hiPSC-ECs şişeye kuluçka makinesi almak ve hücrelerin mikroskop altında incelemek. HiPSC-ECs % 80 – 100 birleşmesi ve tipik bir EC benzeri morfoloji var emin olun.
- Şişeye hücre kültür kapağın aktarın.
- HiPSC-ECs şişeye ortamından Aspire edin.
- Kısaca hücre kültürü PBS 10 mL olmadan Ca2 +/Mg2 +ekleyerek yıkayın. PBS Aspire edin.
- 4 mL şişe 1 x ayrılma enzim başına ekleyin. (RT) (Şekil 1B) Oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
- Ayrışma reaksiyonu 8 mL şişe başına insan Endothelial-SFM orta ekleyerek durdurmak. Yavaşça bağlantısını kesin ve hiPSC-ECs süspansiyon 5 mL pipet kullanarak 15 mL konik tüp içinde toplamak.
- Toplam süspansiyon hücreleri sayar.
- 300 x g 3 dk RT. az için hücreleri santrifüj kapasitesi
- Süpernatant Aspire edin ve 1.5 x 107 hücre/mL nihai bir konsantrasyon için hücre Pelet EC-SFM tam resuspend.
- Kuluçka makinesi üzerinden biochip ile Petri kabına çıkar ve hücre kültür hood için transfer.
- Fibronektin çözüm mikrosıvısal çip Tüm kanallardan Aspire edin.
- Hücre süspansiyon 6 µL bir pipet ile bir küçük 10 µL ucu (Şekil 1 c, orta) kullanarak her kanal içine enjekte. Hücre süspansiyon de enjeksiyon önce karıştırılır emin olun ve hücre yağış kaçının.
- Biochip mikroskop altında incelemek ve hücrelerin eşit şekilde dağıtılır ve hücre yoğunluğu yüksek olduğundan emin olun (Şekil 2C).
- 37 ° C'de 15 dakika biochip kuluçkaya
- EC-SFM FULL of 40 µL orta rezervuar içine her kanal her iki taraftan ekleyin.
- Biochip 37 ° C'de (Şekil 1 c, sağ) 1 h için kuluçkaya.
- EC-SFM FULL of başka bir 50 µL rezervuarlar içine her kanal her iki taraftan ekleyin.
5. insan lökosit hazırlanması
Not: Burada açıklanan protokolünde bir piyasada bulunan Monositik hücre satır (THP-1) kullanıldı. Alternatif olarak, periferik kan mononükleer hücreler veya nötrofil kullanılabilir. Yalıtım periferik kan monosit ve nötrofil standart prosedür11kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bir hücre kültür başlıklı bu paragrafta açıklanan tüm adımları gerçekleştirin.
- Lökosit 50 mL konik tüp içinde toplamak.
- Lökosit PBS 10 mL olmadan Ca2 +/Mg2 +ile yıkayın. 300 x g RT (Şekil 1 d) adlı 3 dk de hücreleri santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant Aspire edin ve hücre Pelet PBS 1 ml DiOC6 boya ile resuspend (λex 485 = nm, λem 501 = nm) (1:5, 000). 10 dk RT. az karanlık hücrelerde kuluçkaya
- Lökosit PBS 10 mL olmadan Ca2 +/Mg2 +ile yıkayın. Hücreleri 300 x g RT. tekrar çamaşır adım 3 dakika için de bir kez daha santrifüj kapasitesi.
- Toplam süspansiyon hücreleri sayar.
- Süpernatant Aspire edin ve hücre Pelet 2. 5 x 106 hücre/mL nihai bir konsantrasyon tam RPMI orta resuspend.
6. mikrosıvısal pompa hazırlanması
- 8-kanal manifold mikrosıvısal pompalı bir araya getirin.
- Pompa yüklü işletim yazılımı ile bir bilgisayara bağlayın.
- Mikrosıvısal yazılım başlatın ve Açık protokol tıklatarak iletişim kuralını yükleyin ve üstünde belgili tanımlık PC mikrosıvısal protokolü seçin gidin.
- Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı ve pompa Kurulum klasörünü seçip Tahlil adım Çalıştır'ıtıklatarak bağlanın.
- Doğru akış hızı denetimi kanallarda geometrisini tanımlar: Güncelleştirme geometri Geometri Kur klasöründe seçin ve Tahlil adım Çalıştır'ıtıklatın.
Not: Geometri ayrıntıları şırınga ve kullanılacak kanallar aynı olduğundan emin olun (geometri kimliği = 1, kanal sayısı = 8, kanal genişliği 800.0 µm, Kanal derinliği = 120.0 µm, şırınga hacmi = 250 µL =) ve örnek viskozitesi (sıvı viskozitesi = 1,0). - Pompa giriş kablosu (turuncu) yerleştirerek %80 etanol içeren 50 mL konik tüp yıkayın. Çıkış kablosu (yeşil) 50 mL konik boş tüp (atık konteyner) yerleştirin.
- Silinerek geçiş/pompa silinerek geçiş klasörü seçin ve Tahlil adım Çalıştır'ı tıklatın (yıkayın cilt 2000 µL, yıkama birim adım = 250 µL, silinerek geçiş yön = çıkış =). Bir kez daha çamaşır adımı yineleyin.
- Adımlarla (adım 6,6-6,7), hücre kültürü sınıf su ve insan Endothelial-SFM kültür orta yıkama pompası yineleyin.
- Manifold yıkama adımıyla devam edin.
- El ile vana şırınga ve manifoldu arasında yanında duvar ilanı 3-şekilde bağdaştırıcı doğru konuma (sola döndü OFF göstergesi) açın.
- Küme geçerli kanal/açık adım Silinerek geçiş/Manifold yıkama klasörü seçin ve manifold bütün vanaları açmak için Çalıştırmak tahlil adım ' ı tıklatın.
- Manifold el ile 5 mL hücre kültür sınıf su takip şırıngadan 5 mL % 80 etanol de iterek yıkayın.
- Manifold şırıngadan insan Endothelial-SFM kültür orta 5 mL iterek yıkayın.
- Manifold içinde sıkışıp kalırlar tüm büyük hava kabarcıkları kaldırın. Bunu yapmak için 10 cm Petri kabına orta ile 8-şey PIN bağdaştırıcısı yerleştirin ve tüm büyük hava kabarcıkları yok olana şırınga ile itme/çekme gerçekleştirmek (küçük baloncuklar bir sorun değildir).
- Silinerek geçiş/Manifold yıkama klasöründe Kümesi geçerli kanal/kapat adımını seçin ve manifold bütün vanaları kapatmak için Çalıştırmak tahlil adım ' ı tıklatın.
- Yeşil çıkış kablosunu pompası manifold bağdaştırıcısına bağlayın.
- 3-yollu vana şırınga kapatmak için tekrar OFF konumuna geçin.
- Silinerek geçiş/kablo silinerek geçiş klasörü seçin ve tek tek, her bağlantı noktası RPMI orta ile yıkamak için Tahlil adım koşmak tüm kabarcıklar her kablo kaldırılır kontrol ettikten tıklatın (birim dağıtmak 100 µL =).
Not: Manifold her Vana teker teker açılan, diğer kanallar tutmak kapalı iken 1 8 ve 100 μL orta için tek tek her kanalı ile reçete. Sıvı her iğnesinden yayınladığından emin olun. Hiçbir sıvı ortaya çıkıyor, bir hava kabarcığı veya bir takunya belirtisi tek.
7. mikrosıvısal çip için hazırlanması canlı görüntüleme
- Mikrosıvısal kurulumları hazırız ve canlı görüntüleme odası 37 ° C için önceden dengelenmiş ve %5 (Şekil 3A, B) CO2 düzeyine ulaşır emin olun.
- Biochip kuluçka makinesi almak ve mikroskop çip tutucu içinde konumlandırın. Chip sahibi sahne (Şekil 3 c) görüntüleme mikroskobunun bağlayın.
- Biochip pompa manifold üzerinden bağlanmak için 8 pinlik bağdaştırıcı çip çıkış rezervuar yakın yerleştirin ve orta tüm pins derinleştirmek olmakla birlikte tamamen bağlamayın.
- Silerek geç seçin | Çip için bağlamak klasör ve tıklayın çip bağlanma öncesi RPMI orta dağıtmak için Tahlil adım çalıştırmak (birim dağıtmak 30 mL =). Bir kez orta reçete, 8 pinlik bağdaştırıcı biochip prize takın.
Not: Bu adımda, tüm kanallar üzerinde (açık) ayarlanır ve orta 30 µL her kanalı ile reçete ve bu kanalları (kapalı) kapalı olarak ayarlanır. Bu baloncuklar mikrosıvısal çip kanallarına tanıtılacaktır hava sağlar. - El ile bir pipet ile biochip tüm giriş rezervuarlar ortamından Aspire edin.
- Silerek geç seçin | Chip silinerek geçiş ağıl ve tıkırtı her bir-yanında-kanaldan ölü hücreler/enkaz kurtulmak için bir kanal aracılığıyla EC-SFM tam orta 40 mL sıvı için Tahlil adım çalıştırmak (silinerek geçiş cilt 40 µL, maksimum silinerek geçiş kesme = 40 dynes/cm2=).
8. akış yapışma tahlil ve görüntü edinme
- El ile ilgi bir pipet ile kanal giriş rezervuarı ortamından Aspire edin.
- Lökositlerin 100 µL adım 5.6 ilgi kanal giriş rezervuarı ekleyin.
Not: Hücreleri tek hücre süspansiyon yapmak karışımı yavaşça. - Hücre tahlil | Adım açıklama klasörü, Küme geçerli kanal/adım açıklamasını seçin ve, ilgi sadece geçerli kanal kanal listesinde seçin ve On (açık) ayarlayın ve tüm diğer yedi kanallar (kapalı) Off için ayarla.
- Hücre tahlil seçin | Adım açıklama ağıl ve tıkırtı Tahlil adım çalıştırın.
Not: Değişken akış hızı dağıtımı 5 min için kanal üzerinden giriş rezervuar lökosit süspansiyon çekmek için sürekli negatif basınç geçerli olduğunu emin olun (Shear kümesi = sabit, yamultma stres = -0,5 din/cm2, süre = 00:05:00, Gecikme inceden inceye gözden geçirmek = 00:00:00). Yamultma stresin negatif değer akışının doğru yönü sağlar. - Giriş rezervuar kalan lökosit Aspire edin.
- Tam RPMI orta 100 µL giriş havzanın ekleyin. Hücre tahlil/adım açıklama klasörü seçin ve tüm sigara yapışık lökosit yıkamak için kanal RPMI orta ile 5 min için sıvı için Tahlil adım çalıştırmak tıklayın (Shear kümesi = sabit, yamultma stres -0,5 din/cm2, süre = = 00: 05:00, tarama gecikme = 00:00:00).
- En az 3-4 farklı pozisyonlar (temsilcisi alanları yakalanır emin olmak için) yapıştırılır lökosit görüntüye kanalının görüntülerden elde etmek.
- 8.1-8.7 kanallar tüm kalan işlev değerlendirmesi için yineleyin.
Not: Aynı anda birden fazla kanal çalıştırmak mümkündür. Bunu yapmak için adım 8.3 sırasında ilgi tüm kanallarını açın. ve tüm yukarıda belirtilen adımları 8.4 –8.7 faiz birden fazla kanal için gerçekleştirin.
9. tahlil tamamlanıyor ve mikrosıvısal pompa temizleme
- Deneme işlemini tamamladıktan sonra verebilir ve tüm görüntüleri RAW formatta kaydedebilirsiniz.
- Sonuçları kaydedilirken, mikrosıvısal pompa ve protokol temizlik manifold çalıştırın.
- Mikrosıvısal pompa için koşmak Silinerek geçiş/pompa silinerek geçiş ağıl ilk hücre kültür sınıf su 4 mL ventriküler tarafından % 80'i 4 mL tarafından takip 6,6-6,7 adımlarda açıklandığı gibi etanol makinası pompa birkaç dakika hava çalıştırarak.
- Manifold temizlemek için şırınga ile Silinerek geçiş/Manifold yıkama adım çalıştırın. Şırınga ve manifold boru hattı betonarme donatı olarak açıklandığı adımlar 6.10-6.11 yıkama % 80 etanol ile ilk ve sonraki hücre kültür sınıf su ile açmak için adımları izleyin. Manifold hava yolu ile belgili tanımlık tenkıye iterek kuru. Şırınga Vana ve manifold vanalar adımları 6,10 ve 6.15 bölümünde açıklandığı gibi kapatın.
10. yapisan lökosit sayma
- Karşıdan yükleyip görüntü işleme yazılımı14 http://cellprofiler.org.
Not: Görüntü bu çalışmada işleme yazılımı sürüm 2.1.1 kullanılarak gerçekleştirildi. Daha yeni bir sürümü kullanıyorsanız, boru hattı küçük uyum gerektirebilir. - Boru hattı Count_leukocytes.cpipe. indir Dosyasını tıklatın | Alma | Boru hattı dosyasından ve boru hattı Count_leukocytes.cpipeseçmek için PC'de gidin.
- Sürükle ve bırak giriş modülleri dosya listesi penceresinde yapisan lökositlerin alınan ham görüntüleri ile bir klasör | Görüntüleri analiz için bölüm.
- Lökosit analiz modülleri ile tipik boyutunu belirtmek | IdentifyPrimaryObjects. Minimum ve maksimum çapı yapisan lökositlerin piksel olarak belirtin.
- Analiz modülleri ile filtre uygulama ölçütlerini seçin | FilterObjects. Nesnelerin en az kabul edilen alan piksel olarak belirtin.
- Analiz analiz görüntüleri düğmesine basarak başlatın.
Not: PİŞMEMİŞ imge işleme alınacaktır ve sonuçları bir varsayılan çıkış klasöründe kaydedilir. Image.txt çıkış dosyası (bir resim, yani, her alınan görüş alanı her sayı karşılık gelir) işlenmiş her görüntü yapisan lökosit sayıları içeren.
Representative Results
İlk olarak, hiPSC-ECs cevaben stimülasyon ile pro-inflamatuar Ajan TNFα incelenmesi gerekir, daha önce açıklandığı gibi7. TNFα tedavi için 12 h E-selektin, upregulation 6 h zirve ile tedavi başladıktan sonra tetikler. Ayrıca, ICAM-1 upregulated 6-12 h sonrası tedavi yöntemidir. Her ne kadar biz VCAM-1'in beklenen upregulation gözlemlemek değil, genellikle birincil insan göbek damar endotel hücrelerinde (HUVECs) görülmektedir. Lökosit yapışma tahlil için en uygun olması için gece (12 h) TNFα tedavi bulduk.
En iyi hiPSC-ECs ayrılma bir tek hücre süspansiyon hücre kümeleri ücretsiz sonuçlanmalıdır. Şekil 2C en iyi hiPSC-EC yoğunluğu şu enjeksiyon sonra göstermektedir. Tipik olarak, 15 dk sonra enjeksiyon hiPSC ECs kanal altına ekleyin ve (Şekil 2B) yayılmaya başlar. 1 h enjeksiyon sonra hiPSC-ECs kanal boyunca iyi yaymak monolayer formu ve akış tahlil (Şekil 2E) başlamak hazır olacak.
Daha kolay, özellikle lökosit ECs monolayer için uygun ve genellikle zordur çünkü hücre kimliği adım yapar gibi lökosit floresan kaydedici ve etiketleme için faz kontrast albümdeki resim miktar, otomatik faydalıdır farklı hücre tipleri ayırt etmek yazılım için.
Ücretsiz açık kaynak görüntü işleme yazılımı yapisan lökosit otomatik miktar için çok yararlıdır. Burada iletişim kuralında tanımlanan boru hattı lökositlerin (Şekil 4A) Floresan görüntülerin adaptif eşik kullanarak birincil nesne kimliği üzerinde temel alır. Filtreleme tanımlanan nesneleri Ayrıca en az bir alana dayalı hücre artıkları, autofluorescence veya herhangi bir diğer non-spesifik floresan sinyal (Şekil 4 C, D) gibi yanlış tanımlanan nesneleri filtreler.
Örneğin, sağlıklı bağış veya genetik bozukluğu olan hastalar gibi bağımsız hiPSCs üzerinden ECs farklılaşmış, iki bağımsız grup karşılaştırılması bir mikrosıvısal çip ile sekiz paralel kanal sağlar. Tedavi edilmemiş ECs veya bir ICAM-1 engelleme antikor ile ön arıtma gibi ek denetimler iyi10,11dahil edilebilir. İki ya da üç mikrosıvısal çip bir anda işlenebilir. Sonuçlar sağlamlık için en az üç bağımsız biyolojik deneyler bağımsız günlerde gerçekleştirilen önerilir.
Resim 1 : HiPSC-ECs ve lökosit hazırlanması akışı tahlil için. (A)hiPSC-ECs pro-inflamatuar uyarıcı (TNFα) ön arıtma. HiPSC-ECs enzimatik ayrılma, aralıklarla ve resuspension (B) şematik gösterimi. (C) şematik Gösterim kanallarını (C, sol), enjeksiyon hiPSC-EC süspansiyon (C, orta) kaplama ve hücre kültür orta eklenmesinden sonra hiPSC-ECs ek olarak mikrosıvısal çip. (D) floresan boya DiOC6 ve resuspension ile etiketleme lökosit çamaşır adım şematik gösterimi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : HiPSC-ECs mikrosıvısal çip. (A)mikrosıvısal çip bir Petri kabına 10 cm. (B) oksijen odası kuluçka için kullanılır. (C, D, E) HiPSC-ECs mikrosıvısal içinde temsilcisi görüntülerini 0 dk (C), 15 dk (D), (E) 1s sonra enjeksiyon kanal. Ölçek çubuğu 200 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Canlı hücre görüntüleme ve lökosit perfüzyon testin deneysel Kur. (A, B) Fotoğraf (A) ve şematik gösterimi (B) canlı hücre görüntüleme ve akış tahlil deneysel Kurulum: (1) - (%5 CO2, 37 ° C, nemlendirilmelidir) bağlı canlı görüntüleme odası, (2) ile ters floresan mikroskop - mikrosıvısal pompa, (3) - 8-Kanal Manifold, (4) - PC için mikroskop kontrol ve görüntü alma, (5) - PC mikrosıvısal pompa kumandası için. (C) mikrosıvısal çip bir plaka sahibi sabit ve mikroskop motorlu aşamasında monte 8-kanal manifold eklenen boru ile. (D) akış tahlil önemli adımlardan şematik gösterimi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Görüntü analiz ve otomatik algılama yapisan lökositlerin. (A) görüntü işleme yazılımı lökosit tanımlaması için belirtilen ayarları ile iletişim penceresi. En az temel tanımlanan nesneleri (B) belirtilen süzme ile görüntü işleme yazılımı iletişim penceresi kriterleri kabul yüzey alanı (SAdk = 70 piksel). (C) lökositlerin doğru kimlik ve küçük yüzey alanı (SA) belirsiz nesnelerin filtre uygulama örneği (piksel (MIN, Max) tipik çap = (9, 15); Süzme ölçütleri SAdk = 70 piksel). Kabul edilen nesneleri yeşille tasvir edilir ve atılan nesneleri mor tasvir edilir. (D) örnek bir yanlış kimlik tipik çap hatalı dizi nedeniyle lökositlerin (tipik çap için piksel (MIN, Max) = (3, 15); Süzme ölçütleri SAdk = 70 piksel). Kabul edilen nesneleri yeşille tasvir edilir ve atılan nesneleri mor tasvir edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Bu iletişim kuralı ile TNFα, lökosit yapışma hiPSC-ECs canlı görüntüleme ve otomatik yapisan lökosit sayma kullanarak akış tahlil için işlevsel değerlendirme gibi pro-inflamatuar uyaranlara hiPSC-EC tedavi karakterizasyonu açıklar.
HiPSC-ECs ile TNFα gecede uyarılması genellikle ECs içinde aktif bir pro-inflamatuar fenotip gösteren uzun sonuçlanır. En iyi duruma getirme aşamasında E-selektin, ICAM-1, VCAM-1 düzeyleri FACs7,8ve primer insan umbilikal ven ECs (HUVECs) tarafından doğrulanması gerekir ifade pozitif denetimler olarak eklenmek üzere tavsiye vardır.
En iyi hiPSC-ECs ayrılma ve yoğunluk tohum konfluent monolayer hücre kümeleri kurma olmadan ulaşmak için ve takunya kanal ulaşmış gerekir. Lökosit hemen perfüzyon hücre yağış önlemek ve her kanal raporlaması sürekli konsantrasyon korumak için önce yeniden askıya almak için önemlidir. İnsan periferik kan lökosit, nötrofil ve monosit gibi kullanılabilir veya Monositik hücre hatları, THP-1 veya HL-60 alternatif olarak kullanılabilir gibi kurulmuş.
Mikrosıvısal kurulum montaj ve akış tahlil sırasında hiPSC-ECs ve/veya yapıĢık lökosit dekolmanı oluşturacağından mikrosıvısal boru ve kanal hapsolmak üzerinden hava kabarcıklarını önlemek için önemlidir. Sıvı akışkan arabirimi veya ek yıkama adımları birleşme mikrosıvısal Kur hazırlanması sırasında hava kabarcıklarını önlemek için yardımcı olabilir.
Bu protokol nerede bir hücreleri hazırlar ve ikinci mikrosıvısal sistemi ve akış tahlil hazırlar iki operatörleri tarafından çalıştırılır tavsiye edilir. Bu ECs mikrosıvısal fiş içine işleme önce sabit bir zaman penceresi içinde kaplama ve hassasiyet ve tekrarlanabilirlik sonuçları geliştirir sağlar. Buna ek olarak, bu da kör deneyler ayarlama sonuçlar içinde önyargı önlemek sağlar.
Otomatik görüntü işleme boru hattı ile başarılı hücre algılama için görüntüleri yüksek sinyal gürültü oranı ile odak ve autofluorescence hücre kümeleri gibi spesifik olmayan nesnelerin önlemek için önemlidir. Çok önemli tanımlanması gerekir yapisan lökositlerin tipik boyutu minimum ve maksimum sınırlarını doğru belirlenmesi önemlidir. Bir ImageJ içinde bir satır ölçüm aracını kullanarak lökosit tipik boyutunu tahmin edebilirsiniz. Örneğin, bizim analizi, biz 10,3-17,1 µm (Şekil 4 c) fiziksel boyutuna karşılık gelen 9-15 piksel aralığı kullanılır. Yanlış bir Aralık, örneğin, 3-15 piksel (3,4-17,1 µm) kullanırken tek bir lökosit değil bir hücre tanımlanır, ama yerine onun subparts ayrı nesneler (Şekil 4 d) olarak tanımlanır. Bu tespit edilmesi için nesnelerinin sayısı yanlış yol açar.
Lökosit sağlanan adaptif eşik yöntemi kullanılarak algılanabilir daha düşük yoğunluklu ve daha küçük çok sayıda nesne yüzey alanı. Bu yer autofluorescence nedeniyle veya diğer non-spesifik floresan sinyallerini alır. Kendi alanında tek bir lökosit, tipik alandan daha düşükse yine de, bu belirsiz nesneler (Şekil 4 c) en az kabul edilen yüzey alanı tanımlayarak filtre uygulanabilir.
Burada anlatılan akış tahlil lökosit yapışma için bu iki hücre arasındaki etkileşimin elucidating bir EC monolayer doğrudan değerlendirme türleri, ama diğer hücre türleri, çoğu perisitlerden damar duvarındaki sunmak gibi ve de olabilir dikkate almaz sağlar lökosit ekstravazasyonu15Yönetmelikte katılmak. 3D kültür microenvironment diğer hücre tipleri ile entegre sistem fizyolojik uygunluğunu geliştirmek olabilir. Bu sınırlamaları rağmen akışı tahlil inflamatuar yanıt burada açıklanan değerlendirilmesi için değerli bir araç temel karakterizasyonu ve hastalık için hiPSC-ECs modelleme uygulamaları sağlar.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar aşağıdaki hibe kabul etmek istiyorum: Avrupa Araştırma Konseyi (ERCAdG 323182 STEMCARDIOVASC); Hollanda Organ-on-Chip girişim, Milli Eğitim Bakanlığı, kültür ve bilim (024.003.001) Hollanda hükümeti tarafından finanse edilen bir NWO yerçekimi projesi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vena8 Endothelial+ biochip | Cellix Ltd | V8EP-800-120-02P10 | |
| Mirus Evo Nanopump | Cellix Ltd | MIRUS-EVO-PUMP | 1 x syringe pump; 1 x VenaFluxAssay Software; 1 x tubing kit; power supply and cables. |
| 8-channel manifold MultiFlow8 | Cellix Ltd | MIRUS-MULTIFLOW8 | |
| Humidified box | Cellix Ltd | HUMID-BOX | |
| Fluorescence imaging system Leica AF6000 | Leica Microsystems | ||
| Electron-multiplying charge-coupled device camera | Hamamatsu | C9100 | |
| Biological safety cabinet/laminar flow-hood | Cleanair | ||
| CO2 cell-culture incubator | Panasonic | MCO-170AICUV | |
| Centrifuge | Hitachi | himac-CT6EL | |
| Handheld pipetman (P-10 (10 mL), P-200 (200 µL), P-1000 (1,000 µL) | Gilson international | 4807 (10µl), 4810 (200µl), 4809 (1000µl) | |
| Sterile plastic pipette | Greiner Bio-One | 606180 (5ml), 607180 (10ml) | |
| Petri dish | VWR/ Duran Group | 391-0860 | |
| Culture flasks (75 cm2) | CELLSTAR | 658,170 | |
| Centrifuge tube (15 mL) | CELLSTAR | 188271 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin from porcine skin, type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Fibronectin (Bovine plasma) | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-169 | |
| Human Endothelial-SFM | Life Technologies | 11111-044 | |
| Human VEGF 165 IS, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-109-386 | |
| Human FGF-2, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-093-842 | |
| Platelet-poor Plasma Derived Serum, bovine | Biomedical Technologies | BT-214 | |
| Recombinant Human TNF-α | Tebu-bio | 300-01A-A | |
| TrypLE Select | Life Technologies | 12563029 | |
| DiOC6(3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 21875-034 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Life Technologies | 31350010 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Life Technologies | 15070-063 | |
| Distilled water | Life Technologies | 15230-089 | |
| Ethanol absolute | Merck | 1.00983.2500 | |
| VCAM-1 | R&D systems | FAB5649P | |
| E-Selectin | R&D systems | BBA21 | |
| ICAM-1 | R&D systems | BBA20 | |
| Name | Company | Software version | Comments |
| Cellrofiler | CellProfiler | 2.1.1 | |
| VenaFluxAssay Software | Cellix Ltd | 2.3.a |
References
- Vestweber, D. How leukocytes cross the vascular endothelium. Nature Reviews Immunology. 15 (11), 692-704 (2015).
- Hajishengallis, G., Chavakis, T. Endogenous modulators of inflammatory cell recruitment. Trends in Immunology. 34 (1), 1-6 (2013).
- Molema, G. Heterogeneity in endothelial responsiveness to cytokines, molecular causes, and pharmacological consequences. Seminars in thrombosis and hemostasis. 36 (3), 246-264 (2010).
- Aird, W. C. Endothelial Cell Heterogeneity. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), a006429 (2012).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 1-16 (2016).
- Lin, Y., Gil, C. H., Yoder, M. C. Differentiation, Evaluation, and Application of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Endothelial Cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (11), 2014-2025 (2017).
- Halaidych, O. V., Freund, C., et al. Inflammatory Responses and Barrier Function of Endothelial Cells Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. , (2018).
- Orlova, V. V., vanden Hil, F. E., Petrus-Reurer, S., Drabsch, Y., ten Dijke, P., Mummery, C. L. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (6), 1514-1531 (2014).
- Orlova, V. V., Drabsch, Y., et al. Functionality of endothelial cells and pericytes from human pluripotent stem cells demonstrated in cultured vascular plexus and zebrafish xenografts. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (1), 177-186 (2014).
- Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress. Journal of Visualized Experiments. (85), 1-6 (2014).
- Muller, W. A., Luscinskas, F. W. Assays of transendothelial migration in vitro. Methods in enzymology. 443, 155-176 (2008).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions. Journal of Visualized Experiments. (66), 1-5 (2012).
- Vajen, T., Heinzmann, A. C. A., et al. Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets. Journal of Visualized Experiments. (134), (2018).
- Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte Migration into Inflamed Tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
