Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Samtidige kvantificering af anti-vektor og Anti-transgen-specifikke CD8+ T celler Via MHC Tetramer farvning efter Vaccination med en Viral vektor

Published: November 28, 2018 doi: 10.3791/58680

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for ex vivo kvalitativ påvisning af antigen-specifikke CD8+ T celler. Analyse er muligt med enkelt celle udvisninger fra organer eller fra små mængder af blod. En bred vifte af undersøgelser kræver analyse af cytotoksiske T-celle svar (vaccination og cancer immunterapi undersøgelser).

Abstract

Ved virusinfektion, antigen-specifikke CD8+ cytotoksiske T-celler (CTLs) opstår og bidrage til udryddelsen af inficerede celler til at forhindre spredning af patogener. Hyppigheden af antigen-specifikke CTLs er derfor udtryk for styrke af T-celle respons mod et specifikt antigen. En sådan analyse er vigtig i grundlæggende immunologi, vaccine udvikling, kræft immunobiology og den adaptive immunologi. I feltet vaccine bestemmer CTL svar rettet mod komponenter af en viral vektor Co hvor effektiv generation af antigen-specifikke celler mod antigen af interesse (dvs., transgen) er. Antigen-specifikke CTLs kan enten påvises ved stimulation med bestemte peptider efterfulgt af intracellulære cytokin farvning eller ved direkte farvning af antigen-specifikke T-cellereceptorer (TCRs) og analyse ved flowcytometri. Den første metode er temmelig tidskrævende, da det kræver, at ofre dyr at isolere cellerne fra organer. Det kræver også isolering af blod fra små dyr, som er vanskelig at udføre. Sidstnævnte metode er temmelig hurtigt, kan nemt gøres med små mængder af blod og er ikke afhængig af specifikke effektor funktioner, såsom cytolytisk aktivitet. MHC tetramers er et ideelt værktøj til at detektere antigen-specifikke TCRs.

Her, vi beskriver en protokol til samtidig påvisning af antigen-specifikke CTLs for immundominant peptider af den virale vektor VSV-GP (LCMV-GP, VSV-NP) og transgener (æg, HPV 16 E7, eGFP) af MHC jeg tetramer farvning og flow flowcytometri. Farvning er muligt enten direkte fra blod eller fra enkelt celle suspensioner af organer, såsom milt. Blod eller enkelt celle suspensioner af organer er inkuberes med tetramers. Efter farvning med antistoffer mod CD3 og CD8, er antigen-specifikke CTLs kvantificeret ved flowcytometri. Valgfrit, antistoffer mod CD43, CD44, CD62L eller andre kan være medtaget for at bestemme aktivisering statussen af antigen-specifikke CD8+T celler og til at skelne mellem naive og effektor celler.

Introduction

Formålet med denne metode er at vurdere hyppigheden af cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) svar til (flere) antigener i mus ved flow cytometric analyse uden behovet for tidskrævende peptid stimulation. Denne metode analyserer CTL delmængder, i en enkelt farvning fænotype og antigen specificitet. Vi optimeret Major Histocompatibility Complex jeg (MHC jeg) tetramer farvning protokol for at analysere effekten af nye vaccine tilgange, såsom VSV-GP, en ny variant af virussen vesikulær stomatitis (VSV), hvor glykoprotein G af VSV er blevet erstattet af den glycoprotein GP af lymfatisk choriomeningitis virus (LCMV)1,2. Ud over den humorale respons er en vigtig udlæsning af effektivisering af en vaccine induktion af en CTL reaktion mod en eller flere antigener. Som konsistens og holdbarhed af den cellulære reaktion er vigtigt i denne sammenhæng, er det gunstigt at overvåge kinetik af CTL svar fra de samme dyr. Dette vil også føre til en reduktion af animalske numre, et vigtigt aspekt med hensyn til principperne om "3R"3. Analyse fra så lidt som 20 µL af blod er derfor optimalt til dette formål.

Tetramers blev udviklet i slutningen af 90 ' erne4 og blev et vigtigt redskab inden for T-celle immunologi. Tetramers er fluorescently-mærket komplekser af fire MHC jeg / peptid molekyler, som binder sig til TCRs, bestemt for en enkelt peptid. I dag, de kan enten købes færdige5, custom-bestilt gratis på NIH Tetramer Core facilitet på Emory University6 eller produceret i lab7. MHC, I og II tetramers er tilgængelig, dvs for CD8+ og CD4+ T-celler, henholdsvis. Styrken af tetramer farvning ligger tid-opsparing, temmelig enkel og let at standardisere8 protokoller og følsomhed9. Også, hvis arbejder med blod, dyr behøver ikke at blive ofret og minimale mængder af prøven er påkrævet. Én måling er ikke begrænset til et enkelt antigen, men flere antigener kan analyseres i en farvning når kombinere tetramers konjugeret med forskellige fluorophores. Nyopdagede antigener, fx fra peptid skærme, kan nemt inkorporeres i tetramers og anvendes til kvantificering af T-celle delmængde.

Tetramer farvning vil ikke give oplysninger om CTL funktionalitet (dvs.., cytokin produktion, effektor funktion), men kun specificitet. At få oplysninger om T-celle funktionalitet, intracellulære cytokin farvning (ICS) eller enzym sammenkædede Immuno Spot (ELISpot) analysen skal være udført8,10. Tetramer farvning og ICS/ELISpot, men er ikke redundante men snarere supplerer hinanden. In vitro stimulation til at fremkalde cytokin produktion for ICS/ELISpot vil ændre den oprindelige T-celle fænotype. Tetramer farvning, derimod lader T-celle urørt; den oprindelige fænotype er bevaret og kan analyseres. En anden stor fordel ved tetramers er også at farvning kan kombineres med magnetisk sortering og berigelse af antigen-specifikke celler11. Dette giver mulighed for analyse af sjældne befolkninger, samt dyrkning af sorterede celler med definerede antigen-specifikke forhold — en funktion, der ikke er muligt med andre metoder.

Ved hjælp af den protokol, der er beskrevet her, tetramer farvning, samt ICS/ELISpot kan der udføres fra et organ, fordi kun meget lidt materiale (blod: 20 µL; milt: 1 x 106 celler) er påkrævet for tetramer farvning. Dog afhængig af frekvensen af antigen-specifikke celler i interesse, styrken af de respektive TCR og den eksperimentelle kontekst, mængden af celler kræves måske nødt til at være skaleres op eller magnetiske berigelse muligvis skal anvendes.

Tetramers er meget udbredt, for eksempel at vurdere effektivisering af (antitumor) vacciner12,13,14,15 eller immunterapi16,17, fænotypiske analyser og rumlige lokalisering af antigen-specifikke T-celle subsets18,19,20,21,22,23. Metoden beskrevet her er velegnet til studier, som har til formål at omfatte kvantificering og fænotypiske analyser af murine antigen-specifikke CD8+ T-celler i deres analyse i en hurtig og bekvem måde.

Protocol

Alle metoder beskrevet blev udført i overensstemmelse med den østrigske nationale Animal eksperimenter lovgivning ("Tierversuchsgesetz"), og dyr retssag tilladelse blev givet af østrigske nationale myndigheder.

1. buffer forberedelse og prøve indsamling

Bemærk: Musen stamme anvendes afhænger epitop analyseret. Vælg en passende tetramer, der binder sig til en MHC type udtrykt i mus, fx, H - 2Kb til C57BL/6 mus. Køn og alder af dyr, vil afhænge af den videnskabelige spørgsmål. For de fleste af de eksperimenter, der er beskrevet her, brug hunmus på 6-8 ugens i alder i begyndelsen af eksperimentet, dvs, første vaccination.

  1. Forberede FACS Buffer (fosfatbufferet saltopløsning (PBS) + 1% føtalt kalveserum (FCS) + 0,1% natriumazid + 2 mM ethylendiamintetra syre (EDTA) og FACS fastsættelse buffer (1,5% (v/v) formaldehyd i PBS).
    Bemærk: Det anbefales, at både buffere er forberedt på forhånd. Opbevares ved 4 ° C indtil brug.
  2. Blod: Indsamle 20 µL af blod per mus fra hale vene af musen i EDTA-beklædt rør, som tidligere beskrevet24.
    Bemærk: Blod kan også blive indsamlet af andre ruter, fx, vena facialis eller retro-orbital sinus. Metode til indsamling har dog i overensstemmelse med de nationale dyreforsøg lov og dyr retssag applikationer. Samling af blod fra hale vene er ideelt for studier hvor gentagne gange små mængder af blod er nødvendig. Supplerende materiale er nødvendig for kompensation kontrol og kontrolelementet ikke farves.
  3. Milt: Isolere orgel, og med hjælp fra stemplet af en sprøjte, tryk gennem en 70 nm og 40 µm celle si. Udføre lysering af erytrocytter, som beskrevet i trin 6 og tælle. Justere koncentrationen til 1 x 107 celler/mL i PBS. Per prøve er 1 x 106 celler påkrævet.
    Bemærk: Altid medtage nogle falsk immuniseret eller kontrollere vektor immuniseret dyr som negativ kontrol. For ægalbumin (æg)-tetramer, en prøve fra OT-1 mus kan bruges som positiv kontrol. Glem ikke unstained og kompensation kontrolelementer i beregningen. Om nødvendigt kan prøver fra forskellige dyr i forsøget samles til dette.
  4. Efter prøvetagning, direkte fortsætte med farvning.

2. farvning Set-up

  1. Forberede en FACS rør til hver prøve. Etiket rør ordentligt og overføre 100 μL af orgel suspension (1 x 106 celler) eller 20 μL blod ind i hvert rør.
  2. Milt: Centrifugeres i 5 min på 600 x g på 4-8 ° C, og supernatanten. Vortex til resuspenderes celle.
    Bemærk: Dette vil resultere i en resterende volumen af omkring 20 µL, lignende som lydstyrken for blodprøverne.
  3. For hver kanal anvendes også forberede en FACS tube for en kompensation prøve. Forberede en ekstra prøve som en unstained kontrol.

3. tetramer farvning

  1. For hver prøve, skal du bruge 50 μL af tetramer fortynding. For foreslåede tetramers og optimeret fortyndinger, henvises til tabel 1.
    Bemærk: Når du arbejder med tetramers eller antistoffer, slukke lys sikkerhed kabinet og beskytte prøver fra lys.
    1. Forberede en tube med FACS buffer (volumen = 50 μL × antallet af prøver, plus yderligere 10% af den samlede mængde til at kompensere for pipettering fejl).
    2. Tilføj tetramer(s) på optimal fortynding, som anført i tabel 1. Vortex løsningen.
      Bemærk: Når du bruger panelet hele antistof (CD3, CD8, CD43, CD44, CD62L) med børsnoterede fluorophores, medtages to tetramers (i PE og APC). Begge tetramers kan kombineres i en enkelt farvning, dvs, farvning af celler med begge tetramers kan udføres samtidigt.
Tetramer Peptid sekvens Allel Fluorophore Fortynding
MHC JEG / ÆG SIINFEKL H - 2Kb APC 1:25
MHC JEG/VSV-NP RGYVYQGL H - 2Kb PE 1:25
MHC JEG / EGFP HYLSTQSAL H-2Kd PE 1:25
MHC JEG/LCMV-GP KAVYNFATC H-2Db APC 1:25
MHC JEG / HPV 16 E7 RAHYNIVTF H-2Db APC 1:10

Tabel 1: foreslog tetramers og optimal fortyndinger. Anbefalede tetramers for nogle immundominant peptider model antigener (ægalbumin (æg) og øget grøn fluorescerende proteiner (eGFP)) eller patogen komponenter (vesikulær stomatitis-virus (VSV) nucleoprotein (NP), lymfatisk Choriomeningitis Virus (LCMV ) Glycoprotein (GP) og human papillomavirus (HPV) E7 oncoprotein (E7)). For hver, den peptid sekvens og tilsvarende allel, er så godt som anbefalede fluorophore og optimeret fortynding angivet.

  1. Tilsættes 50 μL af tetramer fortynding til hver prøve og vortex forsigtigt. Tilføje FACS buffer kun (uden tetramer), kontrol, kompensation og at den unstained prøve.
  2. Inkuber prøver i 20 min. ved 37 ° C, beskyttet mod lys. For at sikre en problemfri overgang fra tetramer til antistof farvning, forberede antistof mix som beskrevet i trin 4 under inkubationstiden.
    Bemærk: For hver enkelte tetramer skal optimale betingelser (fortynding, inkubationstiden og temperatur) justeres.

4. fremstilling af antistoffer

  1. For hver prøve, forberede 50 µL antistof mix.
    1. Forberede en tube med FACS buffer (volumen = 50 μL × antallet af prøver, plus yderligere 10% af den samlede mængde at kompensere pipettering fejl).
    2. Tilføje antistoffer i Fortyndingerne, der er anført i tabel 2.
      Bemærk: Afhængigt af det videnskabelige spørgsmål, vil kunne anvendes andre markør kombinationer bortset fra den, der er beskrevet her. Sørg for at altid medtage antistoffer mod CD3 og CD8 i panelet.
    3. Vortex løsningen.
Antistof Fluorophore Fortynding µg/prøve Markør
CD3 PE-Cy7 1:200 0,05 CTLs (CD3+CD8+)
CD8 Pacific Blue 1: 750 0,013
V450 1: 100 0,1
CD43 FITC 1: 100 0,25 Aktivering (CD43+)
CD44 PE-Cy5 1:250 0,04 Naive (CD44-CD62L+) & effektor (CD44+CD62L-)
CD62L APC-Cy7 1: 500 0.02

Tabel 2: antistoffer bruges i denne protokol og optimal fortyndinger. Anbefalede celleoverflademarkører (CD3, CD8, CD43, CD44 og CD62L) er anført i første kolonne. For hver, er anbefalede fluorophore, optimeret fortynding og mængden af antistof/prøve angivet. I den sidste kolonne, er celletype identificeret med hver markør angivet.

  1. Forberede kompensation kontrol antistoffer. For alle kompensationer, bruge et antistof mod CD8 i de respektive farve.
    1. For hver kanal, forberede en tube med 200 μl af FACS buffer og tilsæt 1 μL af en 1:200 fortynding antistof mod CD8 i de respektive farve.
    2. Vortex rør.
  2. Straks fortsætte med farvning.

5. farvning af prøver

  1. Vaske prøver en gang ved at tilføje ~ 1 mL af FACS buffer, og der centrifugeres i 5 min på 600 x g ved 4 – 8 ° C. Efter centrifugering, supernatanten fjernes og afløb ud resterende væske på en stak papir håndklæder.
    Bemærk: Når du arbejder med blod, være forsigtig, når bortledning af resterende væske. Før lysering af erytrocytter, vil blodet ikke holde sig til bunden af FACS tube. Alternativt, Aspirér supernatanten.
  2. Tilsættes 50 μl antistof mix til hver celle pellet og vortex forsigtigt.
  3. Tilsættes 50 μL af hver kompensation mix til celle pellet tilsvarende kompensation kontrol og vortex forsigtigt.
  4. Tilsæt 50 μL af FACS buffer til celle pellet unstained kontrol og vortex forsigtigt.
  5. Inkuber alle prøver i 30 min. ved 4 ° C, beskyttet mod lys.
  6. Når du arbejder med organer: springe trin 6. Vask en gang ved at tilføje ~ 1-2 mL af FACS buffer, og der centrifugeres i 5 min på 600 x g ved 4 – 8 ° C. Efter centrifugering, supernatanten fjernes og afløb ud resterende væske på en stak papir håndklæder.
  7. Når du arbejder med blod: Fortsæt til trin 6 (lysering af erytrocytter).

6. lysering af erytrocytter

  1. Tilsæt 500 μL af ACK (Ammonium-chlorid-kalium) buffer25 til hver prøve og forsigtigt vortex.
    Bemærk: ACK buffer vil føre til osmotisk hævelse og lysis, specielt af erytrocytter.
  2. Inkuber i 5 min. ved stuetemperatur i mørke.
  3. Der tilsættes 1 mL af FACS buffer, og der centrifugeres i 5 min på 600 x g ved 4 – 8 ° C. Efter centrifugering, supernatanten fjernes og afløb ud den resterende væske på en stak papir håndklæder.
    Bemærk: Når pelleten er snarere rød, Gentag lysering af erytrocytter.
  4. Vask en gang ved at tilføje ~ 1-2 mL FACS buffer, og der centrifugeres i 5 min på 600 x g ved 4 – 8 ° C. Efter centrifugering, supernatanten fjernes og afløb ud resterende væske på en stak papir håndklæder.

7. flow Cytometric måling og analyse

  1. Tilsæt 150-300 μL af FACS fastsættelse buffer til hver tube og blandes ved vortexing. For 20 µL af blod er 150 µL af buffer tilstrækkeligt.
    Bemærk: Før fiksering, Sørg for, at cellerne er godt igen suspenderet for at undgå dannelse af klumper. Fortsætte med flowmåling cytometric så hurtigt som muligt.
  2. Måle kompensation kontrol og korrigere spektrale overlapning.
  3. Opsætning af sekventielle gates, som afbilledet i figur 1 til at vælge for CD3+/CD8+ celler.
    1. Gate på lymfocytter bruger frem og sidelæns scatter (område) (ikke-logaritmisk skala).
    2. Inden for lymfocyt befolkningen, gate på enkelte celler ved hjælp af forward scatter bredde vs område (ikke-logaritmisk skala).
    3. Plot enkelt celle lymfocytter ved hjælp af CD3 og CD8 kanaler (logaritmisk skala). Identificere CD8+ T celler ved gating på CD3+/CD8+ celler.
    4. Plot CD8+ vs Tetramer+ celler og gate på CD8+ Tetramer+ celler, som afbilledet i figur 2.
  4. Hvis det er muligt, optage 20.000 celler (mindst 5.000 celler fra blod) i CD3+/CD8+ gate til hver prøve og gemme som en FCS.
    Bemærk: Mængde af celler til at optage skal måske justeres efter hyppigheden af antigen-specifikke celler af interesse.
  5. Analysere FCS filer med relevant analyse software. Bruge den gating strategi, som beskrevet ovenfor (afsnit 7.3) og kvantificere CD8+ Tetramer+ celler.

Representative Results

Figur 1 viser hvordan man gate korrekt på target-cellerne i denne protokol, nemlig CD3+/CD8+ celler. Det er at bemærke, at aktiveret celler ofte nedregulere T-celle receptoren26,27 , og CD3lav celler bør derfor også indgå i den gating. Efter gating CD3+/CD8+ celler, tetramer positive celler kan være identificeret (figur 2). Repræsentant blotting for en negativ kontrol (naivt) mus, som godt som dyr enten vaccineret med enten æg-secernerende Adenovirus 5 (Adeno-æg) eller æg-udtrykker VSV-GP (VSV-GP-æg) er vist. Som det ses i de lavere klatter, to forskellige kan tetramers kombineres i det samme rør til farvning. Dette giver mulighed for samtidige kvantificering af to forskellige CTL særtræk: virus-specifikke (VSV N) og transgen-specifikke (æg) CTLs. Vi bekræftede, at enkelt- og dobbeltværelser tetramer stainings give lignende procenter af positive celler for hver tetramer. Ved hjælp af denne protokol, andre virus-specifikke (e.g., LCMV GP, HPV 16 E7) eller transgen-specifikke (e.g., normal god landbrugspraksis) T-celle populationer kan være analyseret (supplerende figur 1). I supplerende tabel 1, vises resultaterne for fem dyr efter vaccination med VSV-GP-æg — der angiver robusthed tetramer farvning.

Figure 1
Figur 1: Repræsentant gating strategi til at analysere CD8+ T-celler i blodet. Skematisk fremstilling af den gating strategi, der anvendes til flow cytometric analyse. Efter tetramer farvning og flow cytometric måling, blev data analyseret. Lymfocytter blev identificeret med frem og sidelæns scatter (område) (ikke-logaritmisk skala). Fra dem, blev enkelt celler identificeret ved at anvende forward scatter bredde vs område (ikke-logaritmisk skala). CD8+ T celler blev identificeret ved gating på CD3+/CD8+ celler (logaritmisk skala). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Repræsentant gating strategi at kvantificere æg - og N-specifikke CD8+ T-celler i blodet. Skematisk fremstilling af den gating strategi, der anvendes til flow cytometric kvantificering af tetramer+ celler. CD3+/CD8+ celler blev brugt til tetramer analyse. Øverste og midterste panel: CD8 markør var plottes respektive tetramer (logaritmisk skala). Nederste panel: begge tetramers blev plottet mod hinanden (logaritmisk skala). Venstre: kontrol (naivt) mus; midterste: mus blev immuniseret med æg-secernerende Adenovirus 5 (Adeno-æg); højre: mus blev immuniseret med ægalbumin (æg)-at udtrykke VSV-GP (VSV-GP-æg). Blodet blev indsamlet fra hale vene på dag 7 efter immunisering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Supplerende figur 1: Repræsentant resultat af CD3+/CD8+ tetramer+ celler efter vaccination. Skematisk gengivelse af flow cytometric kvantificering af tetramer+ celler. CD3+/CD8+ celler blev brugt til tetramer analyse og CD8 markør var plottes respektive tetramer (logaritmisk skala). Venstre: mus var naive, højre: mus blev immuniseret med VSV-GP (øverste panel), forbedret grøn fluorescerende proteiner (eGFP)-at udtrykke VSV-GP (midterste panel) eller VSV-GP udtryk for human papillomavirus (HPV) E7 oncoprotein (E7) (nederste panel). Blodet blev indsamlet fra hale vene på dag 7 efter immunisering og farves med tetramers (LCMV-GP, eGFP og HPV E7). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

En stor fordel ved den protokol, der er beskrevet her er, at T-celle svar fra samme mus kan følges over tid, som er kun små mængder af blod er nødvendig for hver måling. Figur 3 viser eksemplarisk resultater for T-celle svar over tid. Ud over mængder af antigen-specifikke CTLs, kan deres fænotype også analyseres ved hjælp af denne protokol (figur 4).

Figure 3
Figur 3: Repræsentant resultat af CD8+ T celle kinetic i blodet efter vaccination. Skematisk fremstilling af den gating strategi, der anvendes til flow cytometric kvantificering af tetramer+ celler. CD3+/CD8+ celler blev brugt til tetramer analyse og begge tetramers blev plottet mod hinanden (logaritmisk skala). Øvre paneler: mus blev immuniseret med æg-secernerende Adenovirus 5 (Adeno-æg); sænke paneler: mus blev immuniseret med ægalbumin (æg)-at udtrykke VSV-GP (VSV-GP-æg). Blodet blev indsamlet fra hale vene på dag 3, 7, 10 og 14 efter immunisering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Repræsentant resultat af CD8+ T celle aktivering og differentiering i naiv og effektor celler efter vaccination. Skematisk fremstilling af den gating strategi, der anvendes til flow cytometric kvantificering af aktiveret (CD43+), naive (CD44-/CD62L+) og effektor (CD44+/CD62L-) CD3+/CD8+ celler () logaritmisk skala). Venstre: kontrol (naivt) mus; midterste: mus blev immuniseret med æg-secernerende Adenovirus 5 (Adeno-æg); højre: mus blev immuniseret med ægalbumin (æg)-at udtrykke VSV-GP (VSV-GP-æg). Blodet blev indsamlet fra hale vene på dag 7 efter immunisering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Mus # % CD43+ % VSV-N Tetramer+ % ÆG Tetramer+
mock 1 1.7 0,45 0,41
2 0,77 0,69 0,15
3 1.34 0,35 0.31
4 1,68 0,83 0,26
5 0,84 0,47 0,23
VSV-GP-ÆG 1 23 13.2 3.69
2 32.6 15,9 3,54
3 22,1 11.7 2.43
4 15.1 8.89 1,79
5 29.1 14,7 5.64

Supplerende tabel 1: Procenter af aktiverede og antigen-specifikke CD3+/CD8+ celler efter vaccination. Mus blev enten naiv eller immuniseret med ægalbumin (æg)-at udtrykke VSV-GP (VSV-GP-æg) (n = 5). Blodet blev indsamlet fra hale vene på dag 7 efter immunisering og farves med tetramers (VSV-N og æg). Aktiveret (CD43+) og antigen-specifikke (tetramer+) CD3+/CD8+ celler blev kvantificeres ved flowcytometri.

Discussion

Tetramer farvning er en temmelig ligetil og ukompliceret protokol til at analysere fænotype og peptid specificitet af en T-lymfocytter. Brugen af blod til analyse, som beskrevet her, er minimalt invasiv og giver mulighed for kontinuerlig overvågning, for eksempel i vaccination undersøgelser. Med hensyn til vaccination er kvantificering af vektor - og antigen-specifikke svar af interesse, som vektor-specifikke reaktioner kan hæmme en effektiv immunrespons mod vaccine antigen28. At bemærke er at med protokollen beskrevet her, begge befolkningsgrupper kan kvantificeres samtidigt i en enkelt tetramer farvning, hvorved farvning variation og prøve beløb. Et par skridt skal imidlertid gøres omhyggeligt for at sikre korrekt måling og pålidelige data. Hvis bruger blod fra hale vene til analyse, bør en Kontroller pre varm dyr for at fremkalde vasodilatation24. Dermed tilstrækkelige blod kan afhentes i kort tid, stress på dyrene er reduceret og analyse er meget bedre, i forhold til hvis blod er indsamlet langsomt. Også, efter prøvetagning (enten blod eller organer), direkte farvning anbefales at undgå falske negative resultater på grund af TCR downregulation. Det samme gælder for alle efterfølgende trin: proceduren bør ikke afbrydes og alle vask trin reduceret til minimal antallet (som anført i protokollen). For at sikre ordentlig farvning, pleje, bør tages til vortex alle løsninger og prøver før og efter inkubation. Dette er særlig vigtigt før fastsættelse af prøver for at undgå sammenklumpning af celler.

Med hensyn til ændring af protokollen, kan andre celleoverflademarkører og tetramers bruges, afhængigt af formålet med analysen. Alle reagenser skal dog derefter titreres, optimalt i kombination med hele farvning panel. For nogle af de tetramers, der er angivet her, optimering afslørede, at vi kan øge den af fabrikanten anbefalede fortynding (1:10 anbefales, optimeret 1:25) (tabel 1). For at kompensere spektrale overlapning, kan kompensation perler bruges i stedet for farvede celler. Med hensyn til valget af tetramer-kombineret fluorokrom, man bør overveje for at bruge lyse fluorokromer, som dette muliggør opdagelse - især når signalet er lav. Som Dolton og kolleger29, vi foretrækker at bruge PE - eller APC-koblet tetramers, som perfekt kan kombineres i en enkelt farvning og CD8+ T celler med en enkelt antigen specificitet kan være pænt opdaget (figur 2). Med hensyn til temperatur og inkubation times findes en række tetramer farvning betingelser. I vores optimeringsprocessen, vi behandlet dette spørgsmål og udført tetramer farvning på forskellige betingelser (f.eks. 4 ° C, stuetemperatur eller 37 ° C). Fra de opnåede resultater, anbefaler vi for at pletten i 20 min. ved 37 ° C, som er i overensstemmelse med litteraturen30,31. Længere tids inkubation bør undgås, da dette kan føre til internalisering af tetramer30 og falsk negative resultater.

Valget af den rigtige antistof til påvisning af CD8+ celler er et andet vigtigt spørgsmål, som skal velovervejet (og potentielt tilpasset). Dette skyldes, at visse anti-CD8 antistof kloner blokere bindingen af tetramers til TCR i menneskelige32 samt mus33 prøver. For vores tetramer farvning protokol, vi udvalgt klon 53 – 6.7 at pletten for murine CD8+ celler — en klon, der ikke blokerer, men snarere øger tetramer farvning.

Tetramer farvning er temmelig ukompliceret, når du analyserer fremtrædende immunrespons på toppen af T-celle respons, f.eks. Der kan dog være populationer, som er en smule mere 'problematisk'. Sådanne eksempler kan nævnes celler specifik for lav affinitet antigener (tumor, self), for nylig aktiveret celler der efterfølgende nedreguleret deres receptorer eller sjældne celle subsets (e.g. naive forløber eller hukommelse cellepopulationer). I disse tilfælde kan den klassiske tetramer farvning protokol skal forbedres eller kombineret med andre metoder. For eksempel, protein kinase inhibitor (PKI) dasatinib hæmmer TCR internalisering og kan medtages før tetramer farvning. Tetramers kan også blive stabiliseret af herunder anti-fluorokrom ukonjugeret primære Abs efter tetramer farvning. Derudover kan fluorescens intensitet øges ved tilsætning af en anden anti-Ab fluorokrom-konjugeret Ab29,34,35,36. Vi optimeret betingelserne selektivt for de tetramers, der er fastsat i denne protokol og omfatter ikke PKI eller yderligere Abs. Men, må de optimale betingelser for eventuelle andre tetramer, justeres individuelt. Med hensyn til sjældne populationer, tetramer farvning måske skal kombineres med magnetisk berigelse11.

For at lette og validere FACS analyse af tetramer farvning, medregnes negativ og positiv kontrol. Som en negativ kontrol pletten vi altid celler af en naiv mus af samme stamme med vores tetramer af interesse. Alternativt, prøver kan farves med tetramers med irrelevante peptider, men med den samme fluorokrom som tetramer af interesse. Denne kontrol er afgørende for at udelukke falsk positive signaler, fx., stammer fra døende celler. Ud over dette anbefales det at medtage en live/døde pletter, såsom propidium Iodid (PI). Dette er af særlig betydning, hvis celler ikke farves direkte efter isolation. En anden strategi til at fjerne autofluorescence baggrund kunne være at inddrage flere T-celle markører i én kanal. Ved at udelukke celler positive i denne kanal, kan T-celle populationer udelukkes. Som positiv kontrol, kan en prøve fra en OT-1 musen bruges til æg tetramer, f.eks. For andre tetramers, har dette vælges enkeltvis (fx., prøve fra en mus, som var immuniseret flere gange). Ens andre37, vi også observere en ned-regulering af CD8 receptor under CTL aktivering på dag 7 af effektor T-celle respons. Derfor, for at undgå tab af aktiverede tetramer+ effektor T celler, anbefaler vi for at medtagelav CD8-cellerne i analysen (i det mindste hvis måling i effektor fase).

Kvaliteten og mængden af oplysninger man kan hente fra denne protokol er afhængig af viden om antigen skal undersøges, tilgængelighed og specificitet tetramer og kvaliteten af FACS maskine (antal lasere og tilgængelige detektorer). Hvis arbejder med dyr prøver, er variation i immunrespons naturlige og uundgåelige. Derfor, for at få meningsfulde resultater fra tetramer farvning, mindst 3-5 dyr bør analyseres. Hvis gjort det, vil protokollen beskrevet her give pålidelige og reproducerbare resultater (eksemplarisk resultatet fra et eksperiment kan findes i Supplerende tabel 1). Som tidligere nævnt, denne metode er perfekt egnet til at kvantificere fænotype og antigen-specificitet af CD8+ T-celler (figur 3, 4; Supplerende figur 1), ikke kun i mus men også hos mennesker. Men for at analysere CD8+ T-celle effektor funktioner, såsom granzyme-induceret celledød, ICS og/eller ELISpot skal udføres. Men man burde holde inde indre at T-cellefunktioner, som målt ved in vitro stimulation ikke kan repræsentere den faktiske situation in vivo. In vivo, et undertrykkende miljø kan forhindre T-cellefunktioner, som er målt i vitro.

På sin egen, tetramer farvning ikke indeholder alle oplysninger, men det udviklede sig til at blive en vigtig metode til kendetegner T-celle svar og kvantificering af T celle subsets in vitro-i en meget følsom måde38. Tetramers kan ikke kun bruges til at kvantificere visse delmængder, men også for at isolere39, lokalisere dem af in situ hybridisering19,20 og studere lav-affinitet antigener, såsom tumor-associerede40, 41. siden opdagelsen af tetramer teknologi4, tetramer farvning er blevet et vigtigt redskab i T-celle analyse og vifte af applikationer.

Disclosures

Dorothee von Laer er en opfinder af VSV-GP og holder mindretal deler i biotekvirksomhed ViraTherapeutics GmbH, der besidder immaterielle rettigheder for VSV-GP. For de andre forfattere findes ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette projekt blev finansieret af FWF østrigske videnskab fond (projektnummer P 25499-B13) og EUs Horisont 2020 forskning og innovation program under tildele aftale nr. 681032. De følgende reagens blev opnået gennem NIH Tetramer Core facilitet: klasse I MHC Tetramer for vesikulær stomatitis-virus nucleoprotein (RGYVYQGL).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Safety cabinet class 2 VWR LBCP302411030
Flow cytometer (e.g. FACSCanto II) BD 338962
Analysis platform for flow cytometry analysis (e.g. FlowJo) Fisher Scientific Co. L.L.C. NC0887833
Binocular microscopes, VisiScope 100 VWR 630-1553
Vortex mixer Phoenix Instrument RS-VA 10
Centrifuge suitable for FACS tubes (e.g. Rotanta 460R) Hettich 5660
Sterile Scalpel Blades Nr. 10 Braun BB510
Cell strainer 40 µm Sigma CLS431750
Cell strainer 70 µm Sigma CLS431751
Neubauer counting chamber VWR 630-1506
Pipettes (20 μL, 200 µL and 1000 μL) Eppendorf 4924000037, 4924000061, 4924000088
Pipette tips, sterile (20 µL, 200 µL, 1,000 µL) Biozym 770050, 770200, 770400
Pipet Boy Integra 155 000
Sterile pipettes (5 mL, 10 mL, 25 mL) Sarstedt 86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001
Multistep Pipette, HandyStep S BRAND 705110
12.5 mL Combitips for Multistep Pipette BrandTech Scientific 702378
Microvette CB 300 K2E Sarstedt 16.444
Sterile reaction tubes (1.5 mL, 50 mL) Sarstedt 72.692.005, 62.547.254
FACS tubes (non-sterile) Szabo Scandic BDL352008
PBS Lonza LONBE17-516F
Heat-inactivated FCS ThermoFisher Scientific 10500064
Formaldehyde Roth 4979.1
Sodium azide Roth K305.1
PE-Cy7 Rat Anti-Mouse CD3 Molecular Complex BD 560591 Clone 17A2; Lot # 7235504
Pacific Blu Rat Anti-Mouse CD8a BD 558106 Clone 53-6.7; Lot # 5058904
V450 Rat anti-Mouse CD8a BD 560469 Clone 53-6.7; Lot # 5205945
FITC anti-mouse CD43 BioLegend 121206 Clone 1B11; Lot # B233778
PE-Cy5 Rat Anti-Mouse CD44 BD 553135 Clone IM7; Lot # 85660
APC-Cy7 Rat Anti-Mouse CD62L BD 560514 Clone MEL-14; Lot # 7215801
OVA-tetramer/APC MBL TB-5001-2 SIINFEKL, H-2Kb; Lot # T1702008
VSV NP-tetramer/PE MBL TS-M529-1 RGYVYQGL, H-2Kb; Lot # 007
EGFP-tetramer/PE MBL TS-M525-1 HYLSTQSAL, H-2Kd; Lot # 004
LCMV-GP-tetramer/APC MBL TB-5002-2 KAVYNFATC, H-2Db; Lot # T1412006
HPV 16 E7-tetramer/APC MBL TB-5008-2 RAHYNIVTF, H-2Db; Lot # T1804003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tober, R., et al. VSV-GP: a potent viral vaccine vector that boosts the immune response upon repeated applications. Journal of virology. 88 (9), 4897-4907 (2014).
  2. Muik, A., et al. Re-engineering vesicular stomatitis virus to abrogate neurotoxicity, circumvent humoral immunity, and enhance oncolytic potency. Cancer Reseaerch. 74 (13), 3567-3578 (2014).
  3. Eales, L. J., Farrant, J., Helbert, M., Pinching, A. J. Peripheral blood dendritic cells in persons with AIDS and AIDS related complex: loss of high intensity class II antigen expression and function. Clinical and Experimental Immunology. 71, 423-427 (1988).
  4. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
  5. Tetramers and Monomers. , Available from: https://www.mblintl.com/products/research/monomer-tetramers/filter/product_type/monomer,peptide,tetramer (2016).
  6. NIH Tetramer Core Facility. , Available from: http://tetramer.yerkes.emory.edu/ (2010).
  7. Class I MHC Tetramer Preparation: Overview. , Available from: http://tetramer.yerkes.emory.edu/support/protocols (2010).
  8. Wolfl, M., et al. Quantitation of MHC tetramer-positive cells from whole blood: evaluation of a single-platform, six-parameter flow cytometric method. Cytometry A. 57 (2), 120-130 (2004).
  9. Burrows, S. R., et al. Peptide-MHC class I tetrameric complexes display exquisite ligand specificity. The Journal of Immunology. 165 (11), 6229-6234 (2000).
  10. Sims, S., Willberg, C., Klenerman, P. MHC-peptide tetramers for the analysis of antigen-specific T cells. Expert Review of Vaccines. 9 (7), 765-774 (2010).
  11. Legoux, F. P., Moon, J. J. Peptide:MHC tetramer-based enrichment of epitope-specific T cells. The Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
  12. Xie, Y., et al. A novel T cell-based vaccine capable of stimulating long-term functional CTL memory against B16 melanoma via CD40L signaling. Cellular & Molecular Immunology. 10 (1), 72-77 (2013).
  13. Nanjundappa, R. H., Wang, R., Xie, Y., Umeshappa, C. S., Xiang, J. Novel CD8+ T cell-based vaccine stimulates Gp120-specific CTL responses leading to therapeutic and long-term immunity in transgenic HLA-A2 mice. Vaccine. 30 (24), 3519-3525 (2012).
  14. Bowers, E. V., Horvath, J. J., Bond, J. E., Cianciolo, G. J., Pizzo, S. V. Antigen delivery by alpha(2)-macroglobulin enhances the cytotoxic T lymphocyte response. Journal of Leukocyte Biology. 86 (2), 1259-1268 (2009).
  15. Guo, H., Baker, S. F., Martinez-Sobrido, L., Topham, D. J. Induction of CD8 T cell heterologous protection by a single dose of single-cycle infectious influenza virus. The Journal of Immunology. 88 (20), 12006-12016 (2014).
  16. Sakai, K., et al. Dendritic cell-based immunotherapy targeting Wilms' tumor 1 in patients with recurrent malignant glioma. Journal of Neurosurgery. 123 (4), 989-997 (2015).
  17. Rosaely, C. G., et al. Immune responses to WT1 in patients with AML or MDS after chemotherapy and allogeneic stem cell transplantation. International Journal of Cancer. 138 (7), 1792-1801 (2016).
  18. Shane, H. L., Reagin, K. L., Klonowski, K. D. The Respiratory Environment Diverts the Development of Antiviral Memory CD8 T Cells. The Journal of Immunology. , (2018).
  19. Li, S., Mwakalundwa, G., Skinner, P. J. In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues. The Journal of Visualized Experiments. (127), e56130 (2017).
  20. De Vries, I. J. M., et al. In situ detection of antigen-specific T cells in cryo-sections using MHC class I tetramers after dendritic cell vaccination of melanoma patients. Cancer Immunology Immunotherapy. 56 (10), 1667-1676 (2007).
  21. Tan, H. X., et al. Induction of vaginal-resident HIV-specific CD8 T cells with mucosal prime-boost immunization. Mucosal Immunology. , (2017).
  22. Huang, H., et al. CD8(+) T Cell Immune Response in Immunocompetent Mice during Zika Virus Infection. Journal of Virology. 91 (22), (2017).
  23. Hensel, M. T., et al. Selective Expression of CCR10 and CXCR3 by Circulating Human Herpes Simplex Virus-Specific CD8 T Cells. Journal of Virology. 91 (19), (2017).
  24. Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21 (1), 15-23 (2001).
  25. ACK Lysis Buffer. , Available from: http://www.cshprotocols.cshlp.org/content/2014/11/pdb.rec083295.short (2014).
  26. San Jose, E., Borroto, A., Niedergang, F., Alcover, A., Alarcon, B. Triggering the TCR complex causes the downregulation of nonengaged receptors by a signal transduction-dependent mechanism. Immunity. 12 (2), 161-170 (2000).
  27. Dietrich, J., Hou, X., Wegener, A. M., Geisler, C. CD3 gamma contains a phosphoserine-dependent di-leucine motif involved in down-regulation of the T cell receptor. EMBO Journal. 13 (9), 2156-2166 (1994).
  28. Schone, D., et al. Immunodominance of Adenovirus-Derived CD8(+) T Cell Epitopes Interferes with the Induction of Transgene-Specific Immunity in Adenovirus-Based Immunization. Journal of Virology. 91 (20), (2017).
  29. Dolton, G., et al. More tricks with tetramers: a practical guide to staining T cells with peptide–MHC multimers. Immunology. 146 (1), 11-22 (2015).
  30. Whelan, J. A., et al. Specificity of CTL Interactions with Peptide-MHC Class I Tetrameric Complexes Is Temperature Dependent. The Journal of Immunology. 163 (8), 4342-4348 (1999).
  31. Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide–MHC. Immunology. 126 (2), 147-164 (2009).
  32. Denkberg, G., Cohen, C. J., Reiter, Y. Critical role for CD8 in binding of MHC tetramers to TCR: CD8 antibodies block specific binding of human tumor-specific MHC-peptide tetramers to TCR. The Journal of Immunology. 167 (1), 270-276 (2001).
  33. Daniels, M. A., Jameson, S. C. Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers. The Journal of Experimental Medicine. 191 (2), 335-346 (2000).
  34. Tungatt, K., et al. Antibody stabilization of peptide-MHC multimers reveals functional T cells bearing extremely low-affinity TCRs. The Journal of Immunology. 194 (1), 463-474 (2015).
  35. Lissina, A., et al. Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers. Journal of Immunological Methods. 340 (1), 11-24 (2009).
  36. Rius, C., et al. Peptide-MHC Class I Tetramers Can Fail To Detect Relevant Functional T Cell Clonotypes and Underestimate Antigen-Reactive T Cell Populations. The Journal of Immunology. 200 (7), 2263-2279 (2018).
  37. Xiao, Z., Mescher, M. F., Jameson, S. C. Detuning CD8 T cells: down-regulation of CD8 expression, tetramer binding, and response during CTL activation. The Journal of Experimental Medicine. 204 (11), 2667-2677 (2007).
  38. McMichael, A. J., O'Callaghan, C. A. A New Look at T Cells. The Journal of Experimental Medicine. 187 (9), 1367-1371 (1998).
  39. Hunsucker, S. A., et al. Peptide/MHC tetramer-based sorting of CD8(+) T cells to a leukemia antigen yields clonotypes drawn nonspecifically from an underlying restricted repertoire. Cancer Immunology Research. 3 (3), 228-235 (2015).
  40. Pittet, M. J., et al. Ex vivo analysis of tumor antigen specific CD8+ T cell responses using MHC/peptide tetramers in cancer patients. International Immunopharmacology. 1 (7), 1235-1247 (2001).
  41. Cohen, C. J., et al. Isolation of neoantigen-specific T cells from tumor and peripheral lymphocytes. The Journal of Clinical Investigation. 125 (10), 3981-3991 (2015).

Tags

Immunologi og infektion sag 141 mus blod antigen-specifikke CTLs MHC jeg FACS tetramer fænotyper kvantificering immunisering
Samtidige kvantificering af anti-vektor og Anti-transgen-specifikke CD8<sup>+</sup> T celler Via MHC Tetramer farvning efter Vaccination med en Viral vektor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wilmschen, S., Banki, Z., von Laer,More

Wilmschen, S., Banki, Z., von Laer, D., Kimpel, J. Simultaneous Quantification of Anti-vector and Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I Tetramer Staining After Vaccination with a Viral Vector. J. Vis. Exp. (141), e58680, doi:10.3791/58680 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter