Summary
Hier beschrijven we een protocol voor efficiënte chromatine immunoprecipitation (ChIP), gevolgd door high-throughput DNA sequentiebepaling (ChIP-seq) van bruin vetweefsel (BAT) geïsoleerd van een muis. Dit protocol is geschikt voor zowel mapping histone modificaties en genoom-brede lokalisatie van niet-Histon proteïnen van belang in vivoonderzoeken.
Abstract
Meest cellulaire processen worden gereguleerd door transcriptionele modulatie van de specifiek gen programma's. Dergelijke modulatie wordt bereikt door de gecombineerde acties van een breed scala van transcriptiefactoren (TFs) en cofactoren bemiddelen transcriptionele activering of repressie via veranderingen in de structuur van de chromatine. Chromatine immunoprecipitation (ChIP) is een nuttige moleculaire biologie benadering van toewijzing histone modificaties en profiling transcriptie factoren/cofactoren binden aan DNA, waardoor een momentopname van de dynamische nucleaire veranderingen tijdens verschillende biologische processen.
Studeren transcriptionele verordening in adipeus weefsel, monsters die zijn afgeleid uit in vitro celculturen van vereeuwigd of primaire cellijnen zijn vaak favoriet in ChIP tests vanwege de overvloed van de grondstof en verminderde biologische variabiliteit. Deze modellen zijn echter een beperkte opname van de staat van de werkelijke chromatine in levende organismen. Dus, is er behoefte aan een kritische geoptimaliseerde protocollen op te voeren ChIP adipeus weefselmonsters afgeleid van diermodellen.
Hier beschrijven we een protocol voor efficiënte ChIP-seq van zowel histone modificaties en niet-Histon eiwitten in bruin vetweefsel (BAT) geïsoleerd van een muis. Het protocol is geoptimaliseerd voor het onderzoeken van genoom-brede lokalisatie van proteïnen van belang en epigenetische markers in de BAT, oftewel een morfologisch en fysiologisch verschillend weefsel onder vet depots.
Introduction
Terwijl het witte vetweefsel (WAT) is gespecialiseerd voor energieopslag, verdrijft bruin vetweefsel (BAT) energie in de vorm van warmte vanwege zijn vermogen om te zetten van koolhydraten en lipiden in thermische energie via mitochondriaal ontkoppelingseiwit1. Vanwege deze gespecialiseerde functie is het depot BAT vereist voor onderhoud van lichaamstemperatuur in fysiologische omstandigheden en in reactie op koude blootstelling. Terwijl gen expressie veranderingen tijdens BAT differentiatie en op thermogene stress zijn uitvoerig bestudeerd in vivo en in vitro, zijn de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze veranderingen meestal ontleed in vereeuwigd cellijnen en primaire pre-adipocytes, met uitzondering van verschillende in vivo onderzoek2,3,4,5.
Regulering van de specifiek gen expressie programma's via transcriptionele verordening wordt bereikt door gecoördineerde veranderingen in chromatine structuur via verschillende transcriptie factoren en factoren samen acties. Chromatine immunoprecipitation (ChIP) is een waardevolle moleculaire biologie-aanpak voor onderzoek naar de aanwerving van deze factoren tot DNA en profilering van de bijbehorende wijzigingen in de chromatine landschap. Sleutelfactoren voor het welslagen van ChIP experimenten omvatten optimalisaties van crosslinking voorwaarden en schuintrekken consistentie van de chromatine gedurende verschillende monsters, beschikbaarheid van voldoende grondstof, en, vooral, de kwaliteit van de antilichamen. Bij het uitvoeren van ChIP uit hele weefsels, het is ook belangrijk om te overwegen de heterogeniteit van de monsters en optimaliseren van het protocol ter verbetering van de efficiëntie van isolatie van de kernen, met de laatste wordt een bijzonder gevoelige stap bij het werken met vetweefsel moet het verhoogde vetgehalte. In feite, moleculaire isolatie technieken uit hele obesitas depots worden bemoeilijkt door de aanwezigheid van hoge niveaus van triglyceriden, en protocollen moeten worden geoptimaliseerd om de verhoging van het bedrag van de chromatine isolatie. Ten slotte, als high-throughput sequencing wordt uitgevoerd na ChIP-DNA isolatie, de sequencing diepte is van cruciaal belang voor het bepalen van het aantal pieken die vol vertrouwen worden gedetecteerd.
Hier verwijzen we naar de arbeidsvoorwaarden en de algemene richtsnoeren voor de ChIP-seq experimenten aanbevolen door de ENCODE en modENCODE consortia6 voor beste praktijken, en richten we ons op een stapsgewijze beschrijving van een protocol dat is geoptimaliseerd voor ChIP-seq van BAT. Het beschreven protocol zorgt voor efficiënte isolatie van de chromatine van vetweefsel sequentiebepaling van het genoom-brede uitvoeren voor DNA-bindende factoren met welomschreven pieken evenals Histon merken met meer diffuus signalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De stappen van de dierlijke behandeling van het protocol zijn door de Boston University's institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) goedgekeurd.
1. dag 1: Dissectie en voorbereiding van BBT chromatine Immunoprecipitation (ChIP)
- Euthanaseren van muizen met behulp van een kooldioxide (CO2) kamer, en het uitvoeren van de dissectie onmiddellijk daarna. Spray muis bont met 70% ethanol voordat de incisie. Plaatst u de muisaanwijzer met de rug naar boven, daarna opengesneden de huid langs de hals. Zoek de VLEERMUIS direct onder de huid tussen de schouders (interscapular; het wordt weergegeven als twee kwabben, vlinder-vormig, met een dun laagje witte vet dat moet zorgvuldig verwijderd7).
Opmerking: Voor een 3 maanden oude C57BL/6J muis die een regelmatige chow dieet (muis gewicht op deze leeftijd varieert tussen 27 en 30 g) wordt gevoed, is elke BAT kwab ongeveer 1 cm lang. Het totale gewicht van het depot BAT is ongeveer 0,15 g in zowel vrouwelijke als mannelijke muizen. - Gebruik 1 BAT pad voor 3 ChIPs. Meerdere BAT pads kunnen gelijktijdig worden verwerkt tot ultrasoonapparaat.
- Dwarslijn elke BAT zeem in 10 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 1% formaldehyde gedurende 15 minuten draaien op 150 toeren per minuut bij kamertemperatuur (RT).
- Doven crosslinking door toevoeging van 2,5 M glycine aan een eindconcentratie van 125 mM voor 5 min, ronddraaiende 150 rpm op RT.
- Overbrengen van de VLEERMUIS pad naar 500 µL van hypotone lysis buffer (10 mM HEPES, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0.5 mM DTT, 0,2 mM PMSF) en voeg 2 RVS kralen (grootte: 3.2 mm diameter, Zie Tabel of Materials) voor elke BAT-pad. Een weefsel kraal gebaseerde homogenizer gebruiken (Zie Tabel van materialen) aan het verscheuren van het weefsel.
- Begin met 5 min op max kracht. Indien nodig, uit te breiden van de tijd tot het weefsel wordt gehomogeniseerd en afzonderlijke cellen gescheiden. Breng de monsters in een nieuwe buis en centrifugeer bij 4 ° C bij 16.000 x g gedurende 10 minuten.
- Na het centrifugeren, breng de bovendrijvende substantie in een nieuwe buis en houd de cel pellet op ijs. Centrifugeer het supernatant bij 4 ° C bij 16.000 x g gedurende 10 minuten ter voorkoming van verlies van de zwevende cellen. Verwijder de laatste supernatant en resuspendeer de pellets van beide cel samen in 300 µL van SDS lysis buffer (SDS 1%; EDTA 10 mM; Tris-HCl pH 8, 50 mM) met 1 x proteaseinhibitor (Zie Tabel van materialen). Incubeer op ijs gedurende 10 minuten.
- Bewerk ultrasone trillingen ten de lysates voor het genereren van DNA fragmenten 200 – 500 basenparen lang. Na ultrasoonapparaat, verwijderen van puin door centrifugeren gedurende 10 minuten bij 16.000 x g bij 4 ° C en controleren van het succes van ultrasoonapparaat via de Elektroforese van het DNA op een 1% agarose gel. Voor een middelgroot gel, uitgevoerd op 120 V; een goede scheiding wordt bereikt na 45 min.
Opmerking: Ultrasoonapparaat optimalisatie mogelijk moet bereiken van de juiste grootte van fragmenten. Met de gekozen ultrasoonapparaat (Zie Tabel of Materials), hiervoor 2 keer op 320 W uitgangsvermogen en 20 KHz frequentie voor 10 min, met behulp van cycli van 30 s op/30 s af. - Verdun het supernatant breuk 10-fold (eindvolume is 3 mL voor elke BAT pad) in de ChIP verdunning buffer (SDS 0,01%; Triton 1,1%; EDTA 1.2 mM; Tris-HCl pH 8, 16.7 mM; NaCl 167 mM) met 1 x proteaseinhibitor. Houd opzij 1% van deze chromatine-oplossing (gelijk aan 30 µL voor 3 mL) als de input van de ChIP. Houd de ingangen 's nachts bij 4 ° C (tot stap 2.4).
Opmerking: De bovenbedoelde component zal voorzien in de input verwijzing relatieve kwantificering van materiaal van de immunoprecipitated in vergelijking met de hoeveelheid DNA aanwezig zijn in elk monster vóór immunoprecipitation. - Toevoegen van het antilichaam van de ChIP (Zie Tabel van materialen voor de antilichamen die gebruikt hier als voorbeeld) tot 1 mL van de oplossing van de chromatine en na een nacht bebroeden bij 4 ° C met rotatie. Uitvoeren van parallelle immunoprecipitation met bijbehorende pre immuun IgG, indien beschikbaar, of normale IgG van dezelfde soort (bijv., regelmatige konijn IgG als het antilichaam wordt geproduceerd in een konijn). U kunt ook opslaan 1 mL van chromatine oplossing voor een neen-antilichaam-besturingselement.
Opmerking: De optimale hoeveelheid antilichaam moet experimenteel worden bepaald voor elke nieuwe antilichamen tegen, als de concentratie van antilichaam is niet bekend. Anders, 2-5 µg antilichaam is een redelijke beginbedrag te gebruiken. Gebruik ChIP-grade antilichamen waar mogelijk, of antilichamen die zijn gevalideerd voor immunoprecipitation.
2. dag 2: Verzameling van de immuuncomplexen
- 50 µL van eiwit A Agarose 50% drijfmest toevoegen aan de immuuncomplexen en incubeer gedurende 1 uur bij 4 ° C met rotatie van 150 toeren per minuut.
-
Pellet de kralen door centrifugeren voor 1 min bij 100 x g bij 4 ° C. Uitvoeren van sequentiële wasbeurten van de parels met buffers striktheid te verhogen.
- Eerst wassen met lage-zout was buffer (150 mM NaCl; Tris-HCl pH 8, 20 mM; EDTA 2 mM; Triton-X 1%; SDS 0.1%), dan met hoge-zout was buffer (500 mM NaCl; Tris-HCl pH 8, 20 mM; EDTA 2 mM, Triton-X1%; SDS 0.1%), dan met LiCl wash (0,25 M LiCl; Tris-HCl pH 8, 10 mM; EDTA 1 mM; Igepal 1%; deoxicholate 1%), en ten slotte met 1 x TE (Tris-HCl pH 8, 10 mM; EDTA).
- Alle wast op 0,45 µm PVDF-centrifugaal filteren kolommen (Tabel van materialen) door de eerste overdracht van de kralen in de kolommen met behulp van 500 µL van lage-zout was buffer uitvoeren De parels in de kolommen voor de 3 min bij 2.500 x gpellet. Negeren de doorstroming en 1 keer voor alle de wash buffers vermeld in stap 2.2.1.
- Nadat de wast zijn voltooid, elueer de immuuncomplexen door toevoeging van 300 µL van elutie buffer 1% SDS, 0,1 M-NaHCO-3) aan de Ingehuld kralen in de kolommen. Incubeer bij RT gedurende 30 minuten in een roteerapparaat bij 400 t/min. Het verzamelen van het eluaat door spinnen kolommen voor 3 min bij 2.500 x g in een verse buis.
- Omgekeerde de crosslinks door het eluaat en ingangen aan het broeden verzameld in stap 1.9 bij 65 ° C's nachts.
3. dag 3: Herstel van DNA met fenol/Chloroform extractie
- Voeg 300 µL van fenol: chloroform: IAA, 1:1 met de eluaat en ingangen. Vortex voor 10 s.
- Spin bij 4 ° C gedurende 15 minuten staan bij 21.000 x g. Het supernatant overbrengen in een verse buis. Voeg 3 µL van glycogeen, 30 µL van 3 M natriumacetaat en 750 µL van koude 100% ethanol. Vortex voor 10 s. winkel bij-80 ° C gedurende 2 uur.
- Spin down bij 21.000 x g bij 4 ° C gedurende 20 minuten, houdt de pellet en verwijder het supernatant. Wash pellet met 1 mL koude 70% EtOH, dan draai naar beneden bij 21.000 x g bij 4 ° C gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en drogen van de pellet.
- Resuspendeer de pellet in 70 µL van DNAse-gratis water.
- Gaat u verder met stap 4 voor het testen van chromatine bezetting op specifieke regio genomic's door kwantitatieve polymerase-kettingreactie (qPCR) of met stap 5 voor te bereiden op monsters sequencing.
4. analyse van de ChIP met behulp van qPCR (Single/Multiple genen uitlezing)
- Verdun de ingang DNA voor stap 3.4 voor het genereren van een standaard referentie-curve. Seriële verdunningen van 1/10, 1/100, 1/1000 zijn meestal voldoende om vast te leggen van het lineaire bereik, maar verder verdunningen mogelijk vereist voor geconcentreerder monsters.
- Voor elk paar primer (hier, wij hebben gebruikte inleidingen gericht op NDUFV1 en TOMM20 initiatiefnemers), bereiden van twee sets van qPCR Reacties: met behulp van de verdunde input monsters van stap 4.1, en een tweede met de DNA-monsters geïsoleerd door immunoprecipitation uit stap 3.4. Elke reactie in drievoud uitvoeren.
Opmerking: Reacties kunnen worden ingesteld in parallel laten werken voor meerdere genen met behulp van 96 - of 384-Wells-platen. - Instelt op een volume van de reactie van 10 μL per putje met 5 μl van 2 x PCR mix (Tabel of Materials), 1 μL van primer mix (1 μM voorwaartse primer en omgekeerde primer 1 μM), en 4 μL van DNA van ChIP (of de invoercontrole).
- Kort draaien naar beneden van de plaat.
- Voer de qPCR reacties op een real-time PCR-systeem met behulp van het protocol door de fabrikant voor reagens detectie (Tabel of Materials) aanbevolen. Hier hebben we gebruik gemaakt van de volgende voorwaarden: 1) 1s bij 95 ° C gedurende 1 cyclus; 2) 1 s bij 95 ° C, gevolgd door 20 bij 60 ° C voor 45 cycles; s 3) 15 s bij 95 ° C, gevolgd door 60 bij 60 ° C s gevolgd door 15 s bij 95 ° C gedurende 1 cyclus.
Opmerking: Controleer de dissociatie curve: de aanwezigheid van een piek in de thermische dissociatie plot suggereert een één amplicon van de PCR reactie wordt gegenereerd. Als meer dan één piek is gevisualiseerd, is dit een potentieel indicatie van meerdere, niet-specifieke waarbij; in dat geval raden we het ontwerp van alternatieve primerparen. - Bepalen de lineaire fase van exponentiële versterking van de PCR reactie voor elke primer ingesteld door het berekenen van de standaard curve met behulp van de reeks van verdunde genomic DNA in stap 4.1. volgens de waarde van de Ct (cyclus drempel).
- Als de waarde van de Ct van DNA van ChIP en invoercontrole zich binnen de lineaire bereik van Ct-waarde, berekenen de verrijking van DNA van ChIP ten opzichte van de input, volgens de verdunningsfactor van DNA van ChIP en invoercontrole in stap 4.1.
5. versterking van DNA van ChIP voor High-throughput Sequencing (genoom-brede uitlezing)
Opmerking: Deze stap kan worden uitbesteed aan een academische kern faciliteit of commerciële sequencing bedrijf wanneer sequencing mogelijkheden niet beschikbaar in eigen huis zijn.
- Bereiden van een DNA-bibliotheek van de geëxtraheerde DNA met een passende ChIP bibliotheek voorbereiding kit (Zie Tabel van materialen) volgens de instructies van de fabrikant.
- Volgnummer van de bibliotheek op een high-throughput rangschikkend systeem, met behulp van 50 bp single-end als uitlezing (Zie Tabel van materialen).
Opmerking: Volgens de richtlijnen van de ChIP-seq ENCODE6voorstelde, wordt een minimum van 10 miljoen leest aanbevolen voor zoogdieren genomen.
6. rauwe Data-analyse
- Kwaliteitscontrole op ruwe sequencing leest met behulp van FastQC8uitvoeren.
Opmerking: Gemeenschappelijke sequencing kwaliteit statistieken omvatten per basis volgorde kwaliteit, per basis reeks inhoud, per reeks GC inhoud, volgorde lengte en volgorde dubbel niveaus. In het algemeen een lees kwaliteitsscore van Q > 30 over elke basis positie is indicatief van kwalitatief hoogwaardige rangschikkend resultaten. Distributie van GC content over alle leest moet ongeveer lijken op een normale verdeling, met een piek rond de soort werkelijke genomic GC inhoud percentage. - Verwijder eventuele sequencing adapter besmetting en lage kwaliteit leest via het trimmen van nut Trimmomatic9lezen.
Opmerking: De uitgevoerde standaardparameters opgeven de opheffing van platform afhankelijke adapters, verwijderen van toonaangevende en naloopspaties bases van lage kwaliteit, en het gebruik van een 4-base breed schuifraam aan trim leest wanneer de gemiddelde kwaliteit per base druppels dan een opgegeven drempelwaarde. - Verwerkte leest tot en met de muis MM10 referentie genoom10 uitlijnen met de Bowtie2 aligner11 met behulp van de standaardparameters.
- Uitgelijnde leest filteren verwijderen die met een Bowtie2 toewijzing kwaliteit score (MAPQ) van minder dan 10 met behulp van Samtools12.
- Bepalen verschillende na uitlijning kwaliteit statistieken zoals percentage leest toegewezen, strand cross-correlatie, cumulatieve lezen dekking, en monster repliceren reproduceerbaarheid.
Opmerking: Diverse pakketten met inbegrip van SPP13, ChIPqc14, en Deeptools15 zijn beschikbaar voor het berekenen van de statistieken van deze kwaliteit. - Piek aanroepende analyses uitvoeren met een besturingselement voor tekstinvoer of passende steekproef van de KO de MACS algoritme (MACS2)16 met standaardparameters.
- Verwijder eventuele genaamd bergtoppen die overlappen met bekende op de zwarte lijst regio's17 van de mm10 aantekening met Bedtools18.
Opmerking: Op de zwarte lijst gebieden zijn gebieden in het genoom van waaruit is gebleken dat hoog signaal of lees graven onafhankelijk van cellijn of sequencing techniek. Deze regio's weergeven kunstmatig hoog artefact signalen in bepaalde gebieden van het genoom die uit functionele genoom sequencing experimenten kunnen worden gefilterd. Alle replicatieonderzoeken onafhankelijk moeten worden verwerkt door de pipeline en kunnen vervolgens worden gebruikt voor irreproducibility ontdekking tarief (IDR). IDR wordt gebruikt voor het meten van de reproduceerbaarheid van de resultaten tussen de duplo's door middel van de methode, zoals beschreven door Li, Brown, Huang en Bickel19,20. De IDR-methode kwantitatief beoordeelt de samenhang tussen de duplo's en wordt aanbevolen door de CODEER- en modENCODE als onderdeel van hun ChIP-seq-richtlijnen. - Statistisch significant pieken gebruiken voor verschillende downstream analyses zoals gene ontologie21,22, verrijking of motief analyse23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1: ChIP validatie door qPCR. ChIP-qPCR analyse van vertegenwoordiger GPS2 target genen NDUFV1 (links) en TOMM20 (rechts) in de KNUPPEL van WT en GPS2-AKO muizen, relatieve veranderingen in het niveau van H3K9 methylation en GPS2 en Pol2 binding tonen. De staafdiagrammen vertegenwoordigen het steekproefgemiddelde van 3 replicatieonderzoeken met * p < 0,05 en ** p < 0,01 zoals berekend met de Student t-test. Dit cijfer is aangepast ten opzichte van Cardamone et al.2. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Voorbeelden van ChIP-qPCR met behulp van VLEERMUIS geïsoleerd van WT of GPS2-AKO muizen zijn afgebeeld in Figuur 12. Na te hebben vastgesteld dat GPS2 nodig voor de expressie van nucleaire-gecodeerd mitochondriale genen in verschillende cel lijnen2 was, testten we de aanwerving van GPS2 op twee specifieke nucleaire-gecodeerd mitochondriale genen, NDUFV1 en TOMM20, in BAT van muizen als een voorbeeld van een weefsel hoogverrijkt in de mitochondriën. We vergeleken eerst GPS2 promotor bezetting in GPS2-AKO muizen en wild-type nestgenoten, observeren van een verwachte afname van de GPS2 bindt selectief doelgenen in de KNUPPEL van GPS2-AKO muizen. Met het protocol beschreven hier, we ook meer binding van RNA-polymerase 2 (Pol2) en de repressieve Histon mark H3K9me3 opgenomen in de KNUPPEL van GPS2-AKO muizen in vergelijking met wild-type nestgenoten. Voor alle antilichamen was de binding significant in vergelijking met het signaal van de achtergrond in de IgG-controlemonster waargenomen. Deze resultaten bevestigen van de aanwerving van GPS2 op geselecteerde nucleaire-gecodeerd mitochondriale genen en Toon dat GPS2 is vereist voor het voorkomen van de accumulatie van H3K9me3, en zo nodig voor de stalling van transcriptionele activiteit van de Pol2 op doel initiatiefnemers. Zie de Tabel van materialen voor meer details over de antilichamen en de oorspronkelijke publicatie voor aanvullende gegevens en meer uitgebreide bespreking van deze resultaten2.
Figuur 2: Plot van kwaliteit scoort uit ruwe sequencing leest geïsoleerd van BAT. (A) kwaliteitsscores geven een voorspelling van de waarschijnlijkheid van een fout tijdens de base-roept. Het wordt meestal uitgedrukt als een geheel getal, Q = - 10log10(P), in welke P is de waarschijnlijkheid van een fout in de base-roept. Hierboven is een per basis volgorde kwaliteit plot gegenereerd door FastQC die gebaseerd is op de ruwe, onbewerkte sequencing leest gegenereerd op basis van BBT. (B) GC contentdistributie van luidt na verwijdering van de adapter en lezen trimmen van BAT monsters. GC-inhoud moet ongeveer lijken op een normale verdeling met een piek rond de soort werkelijke Fractie van GC genomic inhoud. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
In Figuur 2, sequencing kwaliteit scores worden vertoond op een per basisniveau, en leest verder kunnen worden verwerkt door trimmen van residuele adapter verontreiniging en het verwijderen van leest waar de gemiddelde kwaliteitsscore over een schuifraam valt onder een opgegeven drempelwaarde. Verder wordt getoond de GC contentdistributie over leest na verwijdering van de adapter en lees bijknippen. Reeks kwaliteits- en GC content distributie zijn twee grote schaal gebruikt statistieken volgende generatie rangschikken om gegevens te evalueren voordat computationele analyses worden uitgevoerd. Deze resultaten tonen aan dat het protocol produceert een voldoende hoeveelheid kwalitatief hoogwaardige chromatine geïsoleerd van VLEERMUIS die compatibel is met stroomafwaartse sequencing van de volgende generatie technologieën.
Figuur 3: kopstuk bestanden gegenereerd op basis van gegevens van de ChIP-seq van de KNUPPEL van WT en GPS2-AKO muizen genormaliseerd. Deze afbeelding laat de genormaliseerde Lees dekking langs de Slc25a25 gen locus met een aanzienlijk genaamd piek in de regio van de promotor. GPS2 werd aangetoond dat het reguleren van de expressie van mitochondriale genen nucleaire-gecodeerd door een wijziging van de chromatine staat voor doel gene initiatiefnemers. Deze resultaten tonen de visualisatie van een aanzienlijk genaamd piek op een representatieve nucleaire-gecodeerd mitochondriaal gen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
In Figuur 3 aangegeven zijn kopstuk tracks van de WT en GPS2-AKO uitgelijnd BAM bestanden genormaliseerd naar 1 x diepte (leest per genoom dekking), zoals geïmplementeerd in deepTools. De aanwezigheid van een statistisch significante piek ligt in de regio van de promotor van het mitochondriaal gen Slc25a25wordt getoond. De genormaliseerde tracks toestaan visualisatie van de verrijking van luidt overeenkomt met de naam piek en de vermindering van leest op deze locatie in de KNUPPEL van GPS2-AKO muizen ten opzichte van de wild-type nestgenoten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol beschreven hier vertegenwoordigt een waardevol instrument voor het uitvoeren van ChIP lymfkliertest weefsel, specifiek geoptimaliseerd voor bruin vetweefsel. Een van de grotere uitdagingen bij het uitvoeren van ChIP van weefsel is een voldoende aantal cellen herstellen tijdens de bereiding. Scheren van de VLEERMUIS met behulp van een weefsel homogenizer mixer in combinatie met RVS kralen in plaats van een canonieke glas stamper aanzienlijk vermindert het aantal cellen verloren wegens ongebroken weefsel. Bovendien, het weefsel direct in een hypotone buffer homogenisatie helpt de release van lipiden die kunnen vervolgens worden gemakkelijk gescheiden en verwijderd uit de kernen via high-speed centrifugeren.
Juiste ultrasoonapparaat is ook cruciaal voor het uitvoeren van consistente en reproduceerbare ChIP tests. Het gebruik van een water bad ultra-ultrasoonapparaat zorgt voor de gelijktijdige verwerking van meerdere monsters, dus betere reproduceerbaarheid van de chromatine scheren en het verminderen van het risico van kruisbesmetting van monster. Bovendien, gebruik van een temperatuurgevoelig ultrasoonapparaat systeem vermindert oververhitting van de monsters, die moeten worden vermeden om te voorkomen dat de aantasting van het monster en verlies van epitoop erkenning door het antilichaam (Zie Tabel van materialen voor details).
Een andere uitdagende stap is het herstel van immunoprecipitated complexen. Magnetische kralen hebben vaak de voorkeur voor deze stap omdat zij toestaan voor snellere en meer doeltreffende wast wanneer gebruikt in combinatie met een magnetische rek. Zij hebben echter een lager tarief van DNA-herstel in vergelijking met eiwit A Agarose, die kunnen een ernstige beperking bij het werken met kleine hoeveelheid grondstof. Wij vinden dat de combinatie van eiwit A Agarose drijfmest met PVDF 0,45 µm centrifugaal filteren kolommen een geweldige oplossing is voor het bereiken van maximale DNA opbrengst met minimale wassen tijd en hogere reproduceerbaarheid.
Met betrekking tot de isolatie van DNA, veel van kolommen gebaseerde DNA isolatie kits kan worden gebruikt. In onze ervaring is een beperking van deze aanpak de capaciteit van de kolommen te hebben een effect op de opbrengst van DNA herstel. Om te overwinnen van het probleem, liever we met een meer traditionele methode als fenol/chloroform om DNA-extractie.
De vermelde ChIP-seq-pijpleiding omvat een aantal algemeen aanvaarde hulpmiddelen en hulpprogramma's voor de volgende generatie sequencing experimenten. Kort, het leest zijn onderworpen aan de fundamentele kwaliteit controle met behulp van FastQC en Trimmomatic, dan uitgelijnd aan de muis MM10 genoom met behulp van Bowtie2. Overlevende leest worden gefilterd door kwaliteit toe te wijzen alvorens te worden gebruikt voor piek roepen via het MACS2-algoritme. Echter moet worden opgemerkt dat andere beschikbaar en gevalideerde tools ook afhankelijk van de aard van het experiment en de gegevens die worden gegenereerd kunnen worden gebruikt. Het gebruik van een aangepast parameters tijdens de voorbehandeling, uitlijning of piek bellen kan ook dienstig zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advence | BBX24 | |
| Stainless Steel Beads 3.2 mm Diameter | Next Advence | SSB32 | |
| Bioruptor Sonicator | Diagenode | ||
| 1.5 mL Micro Tube TPX Plastic | Diagenode | C30010010-5 | |
| Complete-Protease inhibitor | Roche | 11836145001 | |
| Protein A Agarose Slurry | Invitrogen | 101041 | |
| GPS2 antibody | In house | Rabbit polyclonal, Ct antibody (Cardamone et al., Mol Cell 2018) | |
| Pol2 antibody | Diagenode | C15100055 | |
| h3K9me3 antibody | Millipore | 05-1242 | |
| Fast Syber Green Master Mix | Aplied Biosytem | 4385612 | |
| ViiA7 | Aplied Biosytem | ||
| TruSeq ChIP Library Preparation Kit | Illumina | IP-202-1012 | |
| HiSeq 2000 | Illumina |
References
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. , (2004).
- Cardamone, M. D., et al. Mitochondrial Retrograde Signaling in Mammals Is Mediated by the Transcriptional Cofactor GPS2 via Direct Mitochondria-to-Nucleus Translocation. Molecular Cell. 69, (2018).
- Emmett, M. J., et al. Histone deacetylase 3 prepares brown adipose tissue for acute thermogenic challenge. Nature. , (2017).
- Harms, M. J., et al. PRDM16 binds MED1 and controls chromatin architecture to determine a brown fat transcriptional program. Genes & Development. , (2015).
- Shapira, S. N., et al. EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex. Genes & Development. , (2017).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22, 1813-1831 (2012).
- Liisberg Aune, U., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells. Journal of Visualized Experiments. , e50191 (2013).
- Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc (2010).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014).
- Genome Browser Gateway. , Available from: https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?db=mm10 (2018).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. , 357-359 (2012).
- Li, H., et al. The Sequence alignment/map (SAM) format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nature Biotechnology. 26, 1351-1359 (2008).
- Carroll, T. S., Liang, Z., Salama, R., Stark, R., de Santiago, I. Impact of artifact removal on ChIP quality metrics in ChIP-seq and ChIP-exo data. Frontiers in Genetics. 5, 75 (2014).
- Ramírez, F., et al. deepTools2: A next Generation Web Server for Deep-Sequencing Data Analysis. Nucleic Acids Research. , (2016).
- Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9, R137 (2008).
- ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
- Li, Q., Brown, J. B., Huang, H., Bickel, P. J. Measuring reproducibility of high-throughput experiments. Annals of Applied Statistics. 5 (3), 1752-1779 (2011).
- Irreproducible Discovery Rate (IDR). , Available from: https://github.com/nboley/idr (2018).
- The Gene Ontology Consortium. Expansion of the Gene Ontology Knowledgebase and Resources. Nucleic Acids Research. 45, D331-D338 (2017).
- Ashburner, M., et al. Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nature Genetics. 25, 25-29 (2000).
- Boeva, V. Analysis of Genomic Sequence Motifs for Deciphering Transcription Factor Binding and Transcriptional Regulation in Eukaryotic Cells. Frontiers in Genetics. 7, 24 (2016).
