Summary
Aquí se describe un protocolo para la inmunoprecipitación de cromatina eficiente (ChIP), seguido por secuenciación de ADN de alto rendimiento (ChIP-seq) de tejido adiposo marrón (BAT) aislado de un ratón. Este protocolo es conveniente para el mapeo de modificaciones de las histonas e investigar localización de genoma no histona proteínas de interés en vivo.
Abstract
Procesos más celulares son regulados por modulación transcripcional de programas gen específico. Dicha modulación se logra a través de la acción combinada de una amplia gama de factores de transcripción (TFs) y cofactores mediando la activación transcripcional o represión a través de cambios en la estructura de la cromatina. Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) es un método de biología molecular útiles para mapeo de modificaciones de las histonas y perfiles de transcripción factores/cofactores vinculante al ADN, proporcionando una instantánea de los cambios nucleares dinámicos que ocurren en diferentes procesos biológicos.
Para estudiar la regulación transcripcional en el tejido adiposo, muestras procedentes de cultivos en vitro de células de inmortalizaron o líneas de células primarias son favorecidas a menudo en los ensayos de ChIP debido a la abundancia de material de partida y reducción variabilidad biológica. Sin embargo, estos modelos representan una instantánea limitada del estado real de la cromatina en organismos vivos. Así, hay una necesidad crítica de protocolos optimizados realizar ChIP en muestras de tejido adiposo procedentes de modelos animales.
Aquí se describe un protocolo para eficiente ChIP-seq de modificaciones de las histonas y proteínas no histonas en el tejido adiposo marrón (BAT) aislado de un ratón. El protocolo está optimizado para la investigación de genoma localización de proteínas de interés y marcadores epigenéticos en el murciélago, que es un tejido morfológicamente y fisiológicamente distinto entre los depósitos de grasa.
Introduction
Mientras que el tejido adiposo blanco (WAT) es especializado para el almacenamiento de energía, el tejido adiposo marrón (BAT) se disipa energía en forma de calor debido a su capacidad de convertir energía térmica via mitocondrial desacoplar1hidratos de carbono y lípidos. Debido a esta función especializada, el depósito BAT es necesario para el mantenimiento de la temperatura corporal en condiciones fisiológicas y en respuesta a la exposición fría. Mientras que los cambios de expresión génica durante la diferenciación de BAT y sobre estrés termogénico han sido extensivamente estudiadas in vivo e in vitro, los mecanismos moleculares subyacentes a estos cambios han sido en su mayoría disecados en líneas celulares inmortalizadas y primaria pre-adipocitos, con la excepción de varios estudios in vivo2,3,4,5.
Reglamento de programas de expresión de genes específicos a través de la regulación transcripcional se logra por cambios coordinados en la cromatina estructura mediante transcripción de diversos factores y factores conjuntamente acciones. Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) es un enfoque valioso biología molecular para investigar la contratación de estos factores al ADN y para perfilar los cambios asociados en el paisaje de la cromatina. Factores clave para el éxito de los experimentos de ChIP incluyen optimizaciones de reticulación condiciones y consistencia corte de cromatina a lo largo de las diferentes muestras, la disponibilidad del material de partida adecuado y, en particular, la calidad de los anticuerpos. Cuando se realiza el ChIP de tejidos todo, también es importante considerar la heterogeneidad de las muestras y optimizar el protocolo para mejorar la eficiencia del aislamiento de los núcleos, el último siendo un paso particularmente sensible cuando se trabaja con el tejido adiposo debido a el contenido de lípidos elevados. De hecho, técnicas de aislamiento molecular de depósitos conjunto adiposos son complicadas por la presencia de niveles altos de triglicéridos, y protocolos deben ser optimizados para aumentar la cantidad de aislamiento de la cromatina. Finalmente, cuando se realiza la secuenciación de alto rendimiento después de ChIP de ADN, la profundidad de la secuencia es fundamental para determinar el número de picos que se detectan con confianza.
Aquí, nos referimos a las normas de trabajo y lineamientos generales para los experimentos de ChIP-seq recomendados por el consorcio ENCODE y modENCODE6 para las mejores prácticas, y nos centramos en una descripción paso a paso de un protocolo optimizado para el ChIP-seq de palo. El protocolo descrito permite eficiente aislamiento de cromatina del tejido adiposo para realizar la secuenciación del genoma para factores de unión al ADN con picos bien definidos así como marcas de histonas con las señales más difusas.
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Protocol
Las medidas de manejo de animales del protocolo han sido aprobadas por institucional Animal Care y Comité uso (IACUC) de la Universidad de Boston.
1. día 1: Disección y preparación de BAT para la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)
- Eutanasia a ratones utilizando una cámara de dióxido de carbono (CO2) y realizar la disección inmediatamente después. Rocío ratón piel con etanol al 70% antes de la incisión. Coloque el ratón con la espalda hacia arriba, luego corte la piel a lo largo del cuello. Ubicar el palo directamente debajo de la piel entre los hombros (Interescapular; aparece como dos lóbulos, en forma de mariposa, con una fina capa de grasa blanca que debe ser cuidadosamente removido7).
Nota: Para un 3 meses C57BL/6J ratón que es alimentados con una dieta chow regular (peso de ratón en este rangos de edad entre 27 y 30 g), cada lóbulo BAT es aproximadamente de 1 cm de largo. El peso total del depósito BAT es aproximadamente 0.15 g en ratones machos y hembras. - Utilice 1 pad BAT para 3 ChIPs. Varios cojines BAT se pueden procesar simultáneamente hasta sonicación.
- Reticulación cada murciélago pad en 10 mL de tampón fosfato salino (PBS) que contiene 1% formaldehído durante 15 min girando a 150 rpm a temperatura ambiente (RT).
- Quench reticulación mediante la adición de glicina de 2,5 M a una concentración final de 125 mM durante 5 minutos, girando a 150 rpm a TA.
- Transferencia de la almohadilla BAT a 500 μl de tampón de lisis hipotónica (10 mM HEPES, 1,5 mM de MgCl2, 10 mM KCl, 0,5 mM DTT, 0,2 mM PMSF) y añadir 2 bolas de acero inoxidable (tamaño: 3,2 mm de diámetro, véase Tabla de materiales) para cada cojín del murciélago. Uso de un homogeneizador de tejidos basados en grano (véase Tabla de materiales) para destruir el tejido.
- Empiece con 5 min a potencia máxima. Si es necesario, prolongar el tiempo hasta que el tejido se homogeneiza y se separan las células. Transferir las muestras a un nuevo tubo y centrifugar a 4 ° C a 16.000 x g por 10 min.
- Después de la centrifugación, transferir el sobrenadante a un tubo nuevo y guardar el precipitado de células en el hielo. Centrifugar el sobrenadante a 4 ° C a 16.000 x g por 10 min evitar la pérdida de células de flotación. Deseche el sobrenadante final y resuspender juntos ambos Pellet celular en 300 μL de tampón de lisis SDS (SDS 1%; EDTA 10 mM; PH de Tris-HCl 8, 50 mM) con 1 x inhibidor de la proteasa (véase Tabla de materiales). Incubar en hielo durante 10 minutos.
- Someter a ultrasonidos los lisados para generar DNA fragmentos 200 – 500 pares bajos largo. Después de la sonicación, eliminar los residuos por centrifugación 10 min a 16.000 x g a 4 ° C y comprobar el éxito de sonicación vía ADN electroforesis en gel de agarosa al 1%. Para un gel de tamaño mediano, a 120 V; una buena separación se obtiene después de 45 minutos.
Nota: Optimización de la sonicación se requiera para lograr el tamaño adecuado de los fragmentos. Con el sonicador solicitado (véase Tabla de materiales), esto requiere 2 veces a 320 W de potencia de salida y frecuencia 20 KHz durante 10 min, usando ciclos de 30 s a/30 s. - Diluir 10 veces la fracción sobrenadante (volumen final es de 3 mL para cada cojín del murciélago) en tampón de dilución de ChIP (SDS 0,01%; Triton 1,1%; EDTA 1.2 mM; Tris-HCl pH 8, 16,7 mM; NaCl 167 mM) con 1 x inhibidor de la proteasa. Mantener a un lado el 1% de esta solución de cromatina (igual a 30 μl de 3 mL) como la entrada de viruta. Mantener las entradas de la noche a 4 ° C (hasta el paso 2.4).
Nota: La fracción anterior proporcionará la referencia de entrada para la cuantificación relativa de immunoprecipitated material en comparación con la cantidad de ADN presente en cada muestra antes de inmunoprecipitación. - Añadir el anticuerpo de la viruta (véase Tabla de materiales para los anticuerpos utilizados aquí como un ejemplo) a 1 mL de solución de la cromatina e incubar durante la noche a 4 ° C con rotación. Realizar paralelo inmunoprecipitación con correspondiente previa inmune IgG, si está disponible, o IgG normal de la misma especie (por ej., regular IgG de conejo si el anticuerpo se produce en un conejo). Como alternativa, guardar 1 mL de solución de la cromatina de un control no-anticuerpo.
Nota: La cantidad óptima del anticuerpo debe determinarse experimentalmente para cada nuevo anticuerpo, si no se conoce la concentración de anticuerpo. De lo contrario, de 2 a 5 μg de anticuerpo es una cantidad razonable de la partida a utilizar. Anticuerpos de ChIP-grado de uso siempre que sea posible, o anticuerpos que han sido validados para la inmunoprecipitación.
2. día 2: Colección de los complejos inmunes
- Añadir 50 μl de mezcla de 50% de proteína A agarosa a los complejos inmunes e incubar 1 h a 4 ° C con rotación a 150 rpm.
-
Los granos de pellets por centrifugación durante 1 min a 100 x g a 4 ° C. Realizar lavados secuenciales de los granos con buffers de cada vez mayor rigor.
- En primer lugar, lavar con tampón de lavado de sal (150 mM de NaCl; Tris-HCl pH 8, 20 m m; EDTA 2 mM; Triton-X 1%; SDS 0.1%), luego con tampón de lavado de sal (500 mM de NaCl; Tris-HCl pH 8, 20 m m; EDTA 2 mM, Tritón-X1%; SDS 0.1%), luego con LiCl lavado (0.25 M LiCl; Tris-HCl pH 8, 10 mM; EDTA 1 mM; Igepal 1%; deoxicholate 1%) y finalmente con TE 1 x (Tris-HCl pH 8, 10 mM; EDTA).
- Realizar los lavados en columnas de filtro centrífugo de PVDF (Tabla de materiales) de 0,45 μm mediante la primera transferencia de los granos en las columnas con 500 μl de tampón de lavado de sal. Los granos en las columnas de 3 min a 2.500 x gde pellets. Deseche el flujo a través y repetir 1 vez para todos los buffers de lavado enumerados el paso 2.2.1.
- Finalizado el lavado, eluir los complejos inmunes al agregar 300 μL de elución tampón 1% SDS, 0.1 M NaHCO3) a los granos sedimentados en las columnas. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min en un agitador a 400 rpm. Recoger el eluido por giro abajo columnas por 3 min a 2.500 x g en un tubo nuevo.
- Invertir las reticulaciones incubando el efluente y la insumos recogidos en el paso 1.9 a 65 ° C durante la noche.
3. día 3: Recuperación de la DNA con la extracción de fenol/cloroformo
- Añadir 300 μL de fenol: cloroformo: IAA, 1:1 para el efluente y de la insumos. Vortex por 10 s.
- Vuelta a 4 ° C durante 15 min a 21.000 x g. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. Agregar 3 μl de glucógeno, 30 μl de acetato de sodio de 3 M y 750 μl de etanol al 100% frío. Vortex para 10 tienda s. a-80 ° C por 2 h.
- Desactivación a 21.000 x g a 4 ° C por 20 min, mantener el diábolo y descarte el sobrenadante. Pellets de lavado con 1 mL de frío 70% EtOH, luego giro a 21.000 x g a 4 ° C por 5 min, deseche el sobrenadante y secar el pellet.
- Resuspender el precipitado en 70 μl de agua libre de DNAsas.
- Proceda al paso 4 para las pruebas de ocupación de la cromatina en regiones genómicas específicas por reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) o al paso 5 para preparar muestras para la secuencia.
4. Análisis de viruta utilizando qPCR (lectura de Genes Single/Multiple)
- Diluir la entrada de ADN en el paso 3.4 para generar una curva de referencia. Diluciones seriadas de 1/10, 1/100, 1/1000 son generalmente suficientes para capturar el rango lineal, y otras diluciones pueden ser necesarias para las muestras más concentradas.
- Para cada par de la cartilla (aquí hemos utilizado cartillas dirigidas a promotores NDUFV1 y TOMM20), preparar dos series de reacciones de qPCR: uno usando las muestras diluidas de entrada de paso 4.1 y una segunda con las muestras de ADN aisladas por la inmunoprecipitación del paso 3.4. Realice cada reacción por triplicado.
Nota: Reacciones pueden configurarse en paralelo de múltiples genes usando placas de 96 o 384 pocillos. - Configurar un volumen de reacción de 10 μL por pozo con 5 μL de la mezcla de x PCR 2 (Tabla de materiales), 1 μL de primer mix (primer avance de 1 μM y 1 μM primer inversa) y 4 μL de DNA de ChIP (o el control de entrada).
- Girar brevemente por la placa.
- Ejecutar las reacciones de qPCR en un sistema PCR en tiempo real mediante el protocolo recomendado por el fabricante para la detección de reactivos (Tabla de materiales). Aquí hemos utilizado las siguientes condiciones: 1) 1s a 95 ° C para 1 ciclo; 2) 1 s a 95 ° C seguido de 20 s a 60 ° C por 45 ciclos; 3) 15 s a 95 ° C seguido por 60 s a 60 ° C seguido de 15 s a 95 ° C para 1 ciclo.
Nota: Compruebe la curva de disociación: la presencia de un pico en la trama de la disociación térmica sugiere un solo amplicon es generada por la reacción de PCR. Si se visualiza más de un pico, esto es potencialmente indicativo de múltiples, amplicones inespecífica; en cuyo caso, se recomienda el diseño de pares de la primer alternativa. - Determinar la fase lineal de amplificación exponencial de la reacción de PCR para cada cartilla de cálculo de la curva estándar utilizando la serie de la DNA genomic diluida en el paso 4.1. según el valor de Ct (ciclo umbral).
- Si el valor de Ct de la DNA de la viruta y el control de entrada está dentro del valor de la gama linear de Ct, calcular el enriquecimiento de la DNA de ChIP con respecto a la entrada, según el factor de dilución de ADN de ChIP y control de la entrada en el paso 4.1.
5. amplificación de DNA de ChIP de alto rendimiento de secuenciación (lectura de genoma)
Nota: Este paso puede contratará a una instalación base académica o secuenciación comercial empresa cuando las capacidades de la secuencia no están disponibles en la empresa.
- Preparar una biblioteca de DNA de la DNA extraída con una apropiada preparación de biblioteca ChIP kit (véase Tabla de materiales) siguiendo las instrucciones del fabricante.
- La biblioteca en un sistema de secuenciación de alto rendimiento, utilizando 50 bp solo extremo como lectura de la secuencia (véase Tabla de materiales).
Nota: Según ChIP-seq las pautas sugeridas por ENCODE6, se recomienda un mínimo de Lee 10 millones de genomas de mamíferos.
6. datos análisis
- Realizar control de calidad en secuencia cruda Lee con FastQC8.
Nota: Métricas comunes de calidad de la secuencia incluyen por calidad de la secuencia de bases, por base secuencia de contenidos, por niveles de duplicación secuencia, longitud de la secuencia y contenido secuencia GC. Por lo general, una puntuación de calidad leer de Q > 30 en cada posición de la base es indicativo de los resultados de secuenciación de alta calidad. La distribución de contenido de GC a través de todas las lecturas más o menos debería parecerse a una distribución normal, con un pico centrado alrededor de porcentaje contenido real del genomic GC de la especie. - Eliminar cualquier contaminación del adaptador de la secuencia y lecturas de baja calidad a través de la lectura ajuste utilidad Trimmomatic9.
Nota: Los parámetros implementados por defecto especifican la eliminación de adaptadores dependiente de plataforma, eliminación de líderes y al final bases de baja calidad y el uso de una ventana amplia corrediza 4-base a recortar cuando lee la calidad promedio por base cae por debajo de un umbral especificado. - Alinee lecturas procesadas para el ratón MM10 referencia genoma10 con la Bowtie2 alineador11 usando parámetros por defecto.
- Lee alineado del filtro quitando los que tienen una calidad de mapeo de Bowtie2 puntuación (MAPQ) de menos de 10 con Samtools12.
- Determinar diversas métricas de calidad de la alineación tales como Lee porcentaje asignado, correlación cruzada de strand, acumulativo Lee cobertura y muestra replican reproducibilidad.
Nota: Varios paquetes incluyendo SPP13, ChIPqc14y15 de Deeptools están disponibles para calcular estos indicadores de calidad. - Realizar el análisis de llamadas de pico con un control de entrada o apropiada muestra de KO con el Mac algoritmo (MACS2)16 parámetros por defecto.
- Eliminar los llamados picos que coinciden con regiones conocidas en la lista negra de17 desde la anotación de la mm10 usando Bedtools18.
Nota: En la lista negra las regiones son áreas del genoma que han demostrado tener alta señal o cuentas leer independiente de línea celular o técnica de secuenciación. Estas regiones mostrarán señales artefacto artificialmente altos en ciertas regiones del genoma que pueden filtrarse fuera de experimentos de secuenciación genómica funcional. Todas repeticiones deben ser procesados independientemente a través de la tubería y luego pueden ser usados para la tasa de descubrimiento de irreproducible (IDR). IDR se emplea para medir la reproducibilidad de los resultados entre repeticiones mediante el método descrito por Li, Huang, Brown y Bickel19,20. El método IDR cuantitativa evalúa la coherencia entre repeticiones y es recomendado por ENCODE y modENCODE como parte de sus directrices de ChIP-seq. - Utilizar picos estadísticamente significativos para varios análisis posteriores como gene ontology21,22, enriquecimiento o motivo de análisis23.
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Representative Results
Figura 1: validación de la viruta por qPCR. Análisis de qPCR chIP de representante GPS2 blanco genes NDUFV1 (izquierda) y TOMM20 (derecha) en el palo de los ratones WT y GPS2-AKO, mostrando los cambios relativos en el nivel de metilación de H3K9 y GPS2 y Pol2 vinculante. Los gráficos de barras representan la media de la muestra de 3 repeticiones con * p < 0.05 y ** p < 0.01 calculada con la prueba t de Student. Esta cifra se modifica Cardamone et al.2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Ejemplos de ChIP-qPCR utilizando BAT aislado de ratones WT o GPS2-AKO se muestran en figura 12. Habiendo encontrado que GPS2 fue requerido para la expresión de genes mitocondriales codificadas nuclear en células diferentes líneas2, probamos el reclutamiento de GPS2 en dos específicos nuclear-codificados genes mitocondriales, NDUFV1 y TOMM20, en BAT de ratones como un ejemplo de un tejido altamente enriquecido en mitocondrias. Primero comparamos GPS2 ocupación de promotor en ratones GPS2-AKO y hermanos de camada de tipo salvaje, observando una disminución esperada en GPS2 vinculante en genes de la blanco selectivo en el BAT de ratones GPS2-AKO. Utilizando el protocolo descrito aquí, también registramos mayor unión de la ARN polimerasa 2 (Pol2) y la histona represivo H3K9me3 en el BAT de ratones GPS2-AKO en comparación con los hermanos de camada de tipo salvaje. Para todos los anticuerpos, el enlace fue significativo en comparación con la señal de fondo observada en la muestra de control de IgG. Estos resultados confirman la contratación de GPS2 en genes mitocondriales nuclear-codificados seleccionados y mostrar que GPS2 es necesaria para prevenir la acumulación de H3K9me3 y necesitaban para el estancamiento de la actividad transcripcional Pol2 sobre promotores de destino. Vea la Tabla de materiales para más detalles sobre los anticuerpos y la publicación original para datos adicionales y la más amplia discusión de estos resultados2.
Figura 2: Diagrama de calidad puntuaciones Lee secuencia cruda de BAT. (A) partituras de calidad reflejan una predicción de la probabilidad de un error durante la llamada a base. Comúnmente se expresa como un valor entero, Q = - 10log10(P), en que P es la probabilidad de un error en la llamada base. Se muestra arriba es una por la calidad de la secuencia de bases trama generada por FastQC basada en lecturas de crudos, sin procesar de la secuencia generadas de palo. GC (B) distribución de Lee después del retiro del adaptador de contenido y leer el recorte de muestras de murciélagos. Contenido de GC debe parecerse más o menos una distribución normal con un pico centrado alrededor de fracción real de las especies de contenido genómico de GC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
En calidad de secuencia de la figura 2, se muestran puntuaciones en una por cada nivel de la base, y Lee puede procesarse más recorte cualquier contaminación residual adaptador y Lee donde la puntuación de calidad media a través de una ventana corredera cae por debajo de un umbral especificado. También se muestra es la distribución de contenido de GC a través de lecturas después de retiro del adaptador y el leer. Calidad de la secuencia y distribución son dos ampliamente contenido GC utilizan métricas para evaluar datos de secuenciación de próxima generación antes de que se llevan a cabo análisis computacionales. Estos resultados demuestran que el protocolo produce una cantidad suficiente de alta calidad cromatina aislada de murciélago que es compatible con tecnologías de secuenciación de próxima generación descendente.
Figura 3: normaliza archivos bigwig generados a partir de datos del ChIP-seq de palo de los ratones WT y GPS2-AKO. Esta figura muestra la cobertura de lectura normalizada por el lugar geométrico del gene de Slc25a25 con un pico llamado significativamente en la región del promotor. GPS2 fue demostrado para regular la expresión de genes mitocondriales nuclear codificado por alterar el estado de la cromatina de promotores de genes objetivo. Estos resultados muestran la visualización de un pico llamado significativamente en un gen mitocondrial nuclear codificado representante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
En la figura 3 se muestran pistas de pez gordo de la WT y GPS2-AKO alineados archivos BAM normalizados a profundidad de 1 x (Lee por cobertura del genoma), implementado en deepTools. Es la presencia de un pico estadísticamente significativo situado en la región promotora del gen mitocondrial Slc25a25. Las vías normalizadas permiten visualización del enriquecimiento de lecturas correspondiente al llamado pico y la reducción de Lee en esta localización en el bate de ratones GPS2-AKO en relación con los hermanos de camada de tipo salvaje.
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Discussion
El protocolo descrito aquí representa una herramienta valiosa para realizar ChIP de tejidos murinos, específicamente optimizados para el tejido adiposo marrón. Uno de los mayores desafíos en la realización de la viruta del tejido recupera una cantidad suficiente de células durante la preparación de la muestra. Corte el bate con una batidora de homogenizador de tejido juntada con granos de acero inoxidable en lugar de un mortero de vidrio canónico significativamente reduce el número de células perdidas debido al tejido intacto. Por otra parte, homogeneizar el tejido directamente en un tampón hipotónico ayuda a la liberación de los lípidos que luego pueden ser fácilmente separados y extraído lo núcleos mediante alta velocidad centrifugado.
Sonicación adecuado también es fundamental para la realización de ensayos de viruta constante y reproducibles. El uso de un baño de agua ultra-sonicador permite el procesamiento simultáneo de múltiples muestras, mejorando la reproducibilidad de la cromatina de corte y reducir el riesgo de contaminación de la muestra. Además, uso de un sistema de control de temperatura sonicación reduce el sobrecalentamiento de las muestras, que deben evitarse para evitar muestra degradación y pérdida de reconocimiento del epítopo del anticuerpo (para detalles, véase Tabla de materiales ).
Un paso más difícil es la recuperación de complejos immunoprecipitated. Granos magnéticos son a menudo preferidos para este paso porque permiten lavados más rápido y más eficaz cuando se utiliza junto con una rejilla magnética. Sin embargo, tienen una tasa menor de recuperación de ADN en comparación con agarosa de una proteína, que puede ser una seria limitación cuando se trabaja con pequeña cantidad de material de partida. Encontramos que la combinación de la mezcla de proteína A agarosa con columnas de centrífuga filtro de 0.45 μm PVDF es una gran solución para lograr el máximo rendimiento de ADN con tiempo de lavado mínimo y mayor reproducibilidad.
En relación con el aislamiento de ADN, se puede utilizar un montón de kits de aislamiento de ADN basada en columnas. En nuestra experiencia, una limitación de este enfoque es la capacidad de las columnas para tener un efecto sobre el rendimiento de recuperación de ADN. Para superar el problema, nosotros preferimos usar un método más tradicional como fenol/cloroformo para extraer ADN.
La tubería de ChIP-seq lista incorpora una serie de herramientas ampliamente aceptadas y utilidades para la próxima generación de experimentos de secuenciación. Brevemente, las lecturas son sometidas a control de calidad básico con FastQC y Trimmomatic, entonces alineadas con el genoma de ratón MM10 usando Bowtie2. Lee superviviente se filtra mediante la asignación de calidad antes de ser utilizado para llamadas de pico mediante el algoritmo de MACS2. Sin embargo, cabe señalar que también se pueden utilizar otras herramientas disponibles y validadas según la naturaleza del experimento y datos generados. El uso de modificado para requisitos particulares parámetros durante el preprocesamiento, alineación, o pico llamado también puede ser apropiado.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advence | BBX24 | |
| Stainless Steel Beads 3.2 mm Diameter | Next Advence | SSB32 | |
| Bioruptor Sonicator | Diagenode | ||
| 1.5 mL Micro Tube TPX Plastic | Diagenode | C30010010-5 | |
| Complete-Protease inhibitor | Roche | 11836145001 | |
| Protein A Agarose Slurry | Invitrogen | 101041 | |
| GPS2 antibody | In house | Rabbit polyclonal, Ct antibody (Cardamone et al., Mol Cell 2018) | |
| Pol2 antibody | Diagenode | C15100055 | |
| h3K9me3 antibody | Millipore | 05-1242 | |
| Fast Syber Green Master Mix | Aplied Biosytem | 4385612 | |
| ViiA7 | Aplied Biosytem | ||
| TruSeq ChIP Library Preparation Kit | Illumina | IP-202-1012 | |
| HiSeq 2000 | Illumina |
References
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