Summary
Dit protocol wordt beschreven hoe een verslaggever systeem dat kan worden gebruikt voor het identificeren en kwantificeren van receptor-ligand interacties te stellen.
Abstract
Interacties tussen receptoren en liganden vormen een fundamenteel biologisch proces. Echter directe experimenten met cellen die de inheemse receptor uitdrukken en de ligand zijn uitdagend omdat de ligand voor een specifieke receptor kan onbekende en experimentele procedures met de inheemse ligand kunnen technisch ingewikkeld. Om deze belemmeringen, beschrijven we een verslaggever systeem op te sporen van de bindende en activering van een specifieke receptor door een ligand van belang. In dit systeem verslaggever het extracellulaire domein van een specifieke receptor is geconjugeerd met muis CD3ζ en dit chimeer eiwit wordt vervolgens uitgedrukt in muis BW cellen. Deze transfected cellen BW kunnen vervolgens worden geïncubeerd met verschillende doelen (bijvoorbeeldcellen en antilichamen). Activering van een transfected receptor leidt tot de afscheiding van muis interleukin-2 (mIL-2), die kan worden gedetecteerd door de enzym-verbonden immunosorbent analyse (ELISA). Deze verslaggever systeem heeft de voordelen van het gevoelige en specifieke aan een enkele receptor. Bovendien, het Activeringsniveau van een specifieke receptor kan gemakkelijk worden gekwantificeerd en kan worden gebruikt, zelfs in gevallen waar de ligand van de receptor onbekend is. Dit systeem heeft in veel van onze studies te karakteriseren receptor-ligand interacties met succes geïmplementeerd. We hebben onlangs gebruikt dit systeem om te bestuderen van de activering van menselijke Fcγ receptoren (FcγRs) door verschillende monoklonaal anti-CD20 antistoffen bij klinisch gebruik.
Introduction
Het systeem van de verslaggever BW is een techniek voor het bestuderen van de receptor-ligand interacties1. Dit systeem is vooral voordelig als het ligand voor een specifieke receptor onbekend is of experimenten met de endogene ligand technisch moeilijk zijn. Het kan ook worden gebruikt voor het bestuderen van de binding van monoklonale antilichamen tegen menselijke FcγRs. De methode is gebaseerd op het uiten van een chimeer eiwit in muis BW cellen. Dit chimeer eiwit is samengesteld uit de extracellulaire domein van de receptor van belang gesmolten tot de transmembrane en intracellulaire domeinen van de muis ζ keten. Binding van passende liganden van de receptoren leidt tot afscheiding van muis IL-2, die gemakkelijk kan worden gedetecteerd door ELISA, zoals geïllustreerd in Figuur 1. Deze methode is de gevoelig en specifiek zijn voor een individuele receptor, eenvoudig te bedienen, en zeer reproduceerbaar. Het kan dus extra hulpprogramma's voor het bestuderen van de receptor-ligand interacties aanvullen. Bijvoorbeeld, kan het worden gebruikt om het scherm verschillende cellijnen voor de aanwezigheid van een ligand voor een specifieke receptor (zelfs als het ligand zelf niet is geïdentificeerd) of om te ontdekken de activering van menselijke FcγRs, door monoclonal antilichamen of door menselijk serum met anti-virale antilichamen. Hoewel de primaire immune cellen express endogene FcγRs, zijn ze over het algemeen moeilijk te hanteren en meestal express verschillende Fc receptoren.
We hebben dit systeem met succes gebruikt in veel van onze studies te karakteriseren receptor-ligand interacties. Deze omvatten hemagglutinine identificeren als het ligand van de NK-cel receptor NKp462, PVR en nectin-2 identificeren als liganden voor mens en muis TIGIT3,4, en waaruit blijkt dat de fusobacterium nucleatum bacterie bindt en Hiermee activeert u een menselijke TIGIT5. Daarnaast BW cellen die uitdrukking geven aan Fc receptoren hebben met succes gebruikt om anti-virale antilichamen in patiënten sera6,7,8. Specifiek, we onlangs opgericht BW cellen die uitdrukking geven aan menselijke FcγRs op te sporen gedifferentieerde FcR activering van anti-CD20 antilichamen gebruikt voor de behandeling van chronische lymfatische leukemie (CLL)9. Nog belangrijker is, zijn de resultaten van het BW verslaggever gevalideerd in complementaire experimenten.
Protocol
1. generatie van een plasmide die uitdrukt dat het chimeer bouwen
Opmerking: Het doel is het genereren van een plasmide die uitdrukt van de extracellulaire domein van de receptor van belang gesmolten tot de transmembrane en intracellulaire domeinen van de muis CD3ζ keten (figuur 2A).
- De volgorde van de extracellulaire domein van de receptor van belang, met inbegrip van de signaal-peptide ophalen. Verkrijgen van DNA-materiaal die verwachting uitspreken van deze receptor (bijvoorbeeld cDNA of een plasmide).
- Verkrijgen van DNA-materiaal dat de transmembrane spreekt en de intracellulaire domeinen van de muis CD3ζ keten (bv., cDNA of een plasmide).
- Het ontwerp van de volgorde van de fusieproteïne gebaseerd op de algemene structuur weergegeven in figuur 2A. Zorg ervoor dat de hele reeks binnen hetzelfde codon lezing frame. Deze reeks wordt gebruikt voor het ontwerpen van passende inleidingen en controleert u of het eindproduct.
- Ontwerpen van twee PCR reacties op elk van de fragmenten van de fusie-eiwitten apart versterken (figuur 2B, 2 C)10.
Opmerking: De specifieke voorwaarden voor de PCR reacties (bv., rek tijd en temperatuur gloeien) hangen af van de aard van de inleidingen, die zijn ontworpen voor een specifieke receptor.- Vergroot het extracellulaire segment van de receptor.
- Ontwerp een 5'-primer die omvat een deel van het signaal peptide van de receptor, een Kozak consensus sequentie, en een passende beperkingsplaats (figuur 2B).
- Het ontwerp van een primer 3' die flanks van beide delen van de fusieproteïne (figuur 2B). Voor het eerste ontwerp kan dit primer 3' bijvoorbeeld de laatste 20 baseparen van de extracellulaire segment van de receptor en de eerste 9 basenparen van CD3ζ segment.
Opmerking: Behoeft niet een beperkingsplaats toevoegen aan de 3'-primer aangezien dit primer worden gebruikt voor het genereren van de gesmolten volgorde, en niet voor afbinding gebruikt wordt.
- Versterken van de CD3ζ segment.
- Ontwerp een 5'-primer die beide delen van de fusieproteïne (figuur 2C) flanks. Voor het eerste ontwerp kan de primer 5' bijvoorbeeld de laatste 9 baseparen van de extracellulaire segment van de receptor en de eerste 20 basenparen van het segment van de CD3ζ.
Opmerking: Behoeft niet een beperkingsplaats toevoegen aan de primer 5', aangezien deze primer worden gebruikt voor het genereren van de gesmolten volgorde, en niet voor afbinding gebruikt wordt. - Ontwerp een 3'-primer die het eind van de reeks van CD3ζ evenals een passende beperkingsplaats (figuur 2C) omvat.
- Ontwerp een 5'-primer die beide delen van de fusieproteïne (figuur 2C) flanks. Voor het eerste ontwerp kan de primer 5' bijvoorbeeld de laatste 9 baseparen van de extracellulaire segment van de receptor en de eerste 20 basenparen van het segment van de CD3ζ.
- Corrigeer de primer sequenties in elk van deze twee reacties zodat de onthardende temperatuur vergelijkbaar in elk paar (merk op dat de primer, waaronder sequenties van de twee delen van de fusieproteïne is, alleen anneals met onderdeel van de sequentie in elke reactie).
- Vergroot het extracellulaire segment van de receptor.
- Uitvoeren van een extra PCR waarin een mengsel van de PCR-producten van de eerste twee reacties wordt gebruikt als de sjabloon van het DNA met de primer 5' van het extracellulaire receptor segment (stap 1.4.1.1) en de 3' van de CD3ζ segment (stap 1.4.2.2) (figuur 2D)10 . Deze reactie moet de laatste gesmolten volgorde genereren.
- Ga verder zoals gebruikelijk voor klonen.
- Afbinden van het eindproduct van de PCR naar het doel gesneden vector (de doel-vector is gewoonlijk pcDNA3 die spreekt van G418 en ampicilline-resistentie).
- Transformeer de ligaturen vector in bevoegde bacteriën11.
- Ontdooi 50 µL van de bevoegde bacteriën op ijs.
- Voeg de ligaturen vector voor de bacteriën en incubeer op ijs gedurende 20 minuten.
- Incubeer bij 42 ° C voor 45 s.
- Voeg 200 µL van LB zonder antibiotica.
- Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C met continue schudden.
- Zaad op een LB-plaat met de juiste antibiotica (b.v., ampicilline oplossing met een eindconcentratie van 0,1 mg/mL).
- Verzamelen en groeien verschillende bacteriële kolonies in 5 mL LB (15 mL in buizen in porties).
- De volgende dag, pak plasmiden met een mini prep kit.
- Analyseer de gene invoegen met enzymen van de beperking.
- Volgnummer van de relevante kolonies en controleer dat de volgorde en het leesraam (zoals aangegeven in stap 1.3).
- Transformeer de geverifieerde plasmide in bevoegde bacteriën11.
- Ontdooi 20 µL van de bevoegde bacteriën op ijs.
- Voeg 1 µL van de plasmide aan de bacteriën en incubeer op ijs gedurende 20 minuten.
- Incubeer bij 42 ° C voor 45 s.
- Voeg 200 µL van LB zonder antibiotica.
- Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C met continue schudden.
- Zaad op een plaat van de bacteriële groei met de juiste antibiotica (b.v., ampicilline oplossing met een eindconcentratie van 0,1 mg/mL).
- De volgende dag, groeien een bacteriële kolonie in een grote container LB met 0,1 mg/mL ampicilline (~ 250 mL).
- De volgende dag, uitvoeren maxi prep volgens de specifieke instructies van de kit.
Opmerking: Voor de electroporation procedure, een grote hoeveelheid plasmide is vereist, zoals hieronder beschreven.
2. de transfectie van het plasmide dat het chimeer eiwit in BW cellen uitdrukt
Opmerking: Verschillende methoden kunnen ook worden ingezet voor Transfectie (bv., door lentivirale infectie). Voorafgaand aan de electroporation, ethanol neerslag van DNA zoals hieronder beschreven uit te voeren. De volgende stappen moet steriele omstandigheden.
- De dag voordien voorbereiden electroporation de BW5147 cellen ("BW cellen"). 10 platen (van 10 cm) met 10 mL van 100.000 BW5147 cellen/mL (dat wil zeggen, een totaal van 10 x 10,6 cellen) plaat met RPMI aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (FCS), 1% natrium pyruvaat, 1 L-glutamine, 1% niet-essentiële aminozuren en 1% penicilline-streptomycine ("volledige medium").
- Plaats van 100 µg van de pcDNA3-plasmide dat brengt het fusie-eiwit in een tube van 1,5-2 mL en voeg 3 M Natriumacetaat bij pH 5.3-5.5 ernaar. Het volume van de Natriumacetaat moet overeenkomen met 0,1 (10%) van het volume van de 100 µg plasmide; de pH van de Natriumacetaat Titreer met een pH-meter door toevoeging van NaOH of HCl.
- 2.5 volumes van 100% ethanol toevoegen aan het mengsel van de plasmide en de Natriumacetaat, zoals beschreven in stap 2.2 (2.5 x het totale volume van de plasmide en natrium acetaat). Na een nacht bebroeden bij-20 ° C of gedurende 2 uur bij 70 ° C.
- 2.4. 24 h na de BW-cellen hebben zijn verguld, verzamelen alle BW cellen (~ 100 mL) in 2 50 mL tubes. De cellen gedurende 5 minuten bij 515 x g centrifugeren en verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de pellet van beide buizen in 25 mL RPMI - in een enkel 50 mL-buis. Bijvoorbeeld resuspendeer de pellet van één buis met 25 mL van RPMI - en vervolgens met behulp van deze vloeistof resuspendeer de vloeistof in de andere tube van 50 mL, zodat de totale pellet uit de BW-cellen opnieuw in 25 mL medium in een enkele buis is geschorst.
Opmerking: Het medium moet worden zonder toevoegingen, aangezien het serum met electroporation interfereren kan. - De cellen opnieuw gedurende 5 minuten bij 515 x gcentrifugeren. Resuspendeer de pellet in 1 mL van RPMI, en de inhoud overbrengen in een cuvet van 0,4 cm op ijs.
- Centrifugeer het plasmide dat ethanol neerslag (stap 2.3) onderging voor 30 min op 16.000 x g - en 4 ° C.
- Was eens met 1 mL 70% ethanol en centrifuge voor een ander 20 min op 16.000 x g - en 4 ° C (aan het wassen het zout).
- Verwijderen van alle de ethanol en laat de pellet lichtjes drogen (dat wil zeggen, in een open buis in de weefselkweek kap). Resuspendeer de pellet met 100 µL van RPMI-voorheen verwarmd tot 60 ° C.
- Het opnieuw gesuspendeerde plasmide (stap 2.8) toevoegen aan de cellen in de meetcel en incubeer gedurende 5 min op ijs.
- Electroporate de cellen op 0.23 kV, 250 rechtsbevoegdheid. Dit moet nemen ~ 4 ms.
- De electroporated cellen overbrengen in een tube van 50 mL en voeg 50 mL van volledige medium en Centrifugeer gedurende 5 min op 515 x g.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen met 50 mL volledige voedingsbodem.
- Plaat van de electroporated cellen in 24-well cultuur gerechten (1 mL per putje, voor een totaal van ~ 50 wells) en Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 48 uur.
- Selecteer de transfected cellen met antibiotica. Na 48u Voeg 1 mL van volledige medium aangevuld met 10 mg/mL G418 aan elk putje (in dit stadium is het eindvolume in elk goed 2 mL en de uiteindelijke concentratie van G418 in elk goed is 5 mg/mL).
Opmerking: Als het plasmide een verschillende antibiotica-resistentie bevat, bepaal de antibioticum concentratie nodig om te doden de untransfected cellen van het BW voor deze stap. - Elke 48 h, zorgvuldig werp 1 mL van het bovenste deel van elk putje zonder roeren van het medium in de put (de cellen BW doorgaans op de bodem van de put). Toevoegen volledige medium aangevuld met 5 mg/mL G418 aan elk putje, zodat het eindvolume in elk putje weer 2 mL is.
- De platen van de cultuur voor celgroei in alle putjes regelmatig onderzoeken.
Opmerking: Een verandering in de kleur van de middellange tot geel kan helpen identificeren van groeiende cellen; aan het begin het medium zal evenwel gele vanwege de G418 zelf. Identificeren van positieve putten (putten met groeiende cellen). Deze putjes zijn G418 bestendig en daarom naar verwachting zullen de fusieproteïne express. Dit proces duurt meestal ~ 3 weken.
3. verificatie van de uitdrukking van de Transfected Receptor in de cellen in de positieve Wells.
- Vlek transfected cellen BW met een specifiek antilichaam tegen de receptor die was transfected.
- Vergelijk het niveau van de expressie van de receptor door stroom cytometry op de expressie van de controle cellen (cellen zijn untransfected BW).
- Na verificatie van één of meer wells, onmiddellijk cellen gebruiken voor experimentele doeleinden, groeien in cultuur of bevriezen voor toekomstige toepassingen.
- Controleer of de expressie van de transfected receptor voordat u een nieuw experiment uitvoert. Na een paar weken van de groei, de cellen met G418 met een stabiele receptor expressie, kunnen de G418 van het kweekmedium worden weggelaten.
4. de incubatie van de cellen Transfected BW met doelen
Opmerking: Wanneer u transfected cellen BW voor de eerste keer, het is beter om ze te testen op doelen die uitdrukking geven aan een bekende ligand van de receptor van belang of op plaat-gebonden antilichamen specifiek gericht tegen de receptor van belang (dwarsbinding experimenten; Zie hieronder, punt 4.2.1.3).
- Bij voorkeur, de BW cellen 24 uur voordat het experiment te splitsen (bijvoorbeeld door het toevoegen van 10 mL volledige voedingsbodem aan 2 mL van cellen in de cultuur in een nieuwe cultuur-plaat van 10 cm).
- Incubeer de transfected cellen van het BW met hun doelstellingen. Het experiment tegelijkertijd uitvoeren op BW cellen die uitdrukking geven aan een lege vector (of ouderlijke BW cellen). 96F platen zijn te verkiezen boven (maar 96U platen kunnen ook worden gebruikt). Voer het experiment in drievoud. Het opschorten van alle cellen in het volledige medium.
- De doelstellingen voor te bereiden. Het soort doel varieert in functie van de doelstelling, en kan cellen, cellen die vooraf hebben zijn geïncubeerd met antistoffen of antilichamen alleen. Dit systeem is ook gebruikt met bacteriën als doelstellingen5.
- Als de doelstellingen delen cellen (dat wil zeggen, de cellijnen), bestralen hen op 6.000 rad voorafgaand aan de test. Plaats 50.000 van de doelcellen in een enkel putje van een 96 plaat (in een volume van 100 µL).
- Voor experimenten met antilichamen en BW cellen die uitdrukking geven aan menselijke FcγRs, Incubeer de doelcellen met een antilichaam op ijs in een 96 goed bord (bijvoorbeeld 50 µL van de doelcellen en 50 µL van het antilichaam; verschillende antilichaam doses kunnen worden getest).
- Als de antilichamen alleen als doelen (dwarsbinding experimenten) gebruikt, moet ze plaat-gebonden. Voor dit doel, incubeer eerst de antilichamen op een volledige drager in een plaat 96F gedurende 1-2 uur bij 37 ° C en 5% CO2 (een typische begindosis is 0.5 μg van een specifiek antilichaam in 50 μl). Wassen van de plaat om te verwijderen van niet-afhankelijke antistoffen.
Opmerking: In dit geval zal een plaat 96F binding van het antilichaam aan de plaat, die na toevoeging van transfected cellen BW tot activering van de transfected receptor leiden zal inschakelen.
- De BW-cellen (effector cellen) toevoegen. 50.000 BW cellen in een enkel putje van een 96 plaat (in een volume van 100 µL) plaatsen.
- Vul het volume in elk putje naar 200 µL indien nodig.
- Incubeer de platen bij 37 ° C en 5% CO2 voor 48 uur (deze periode kan worden gecalibreerd).
- De doelstellingen voor te bereiden. Het soort doel varieert in functie van de doelstelling, en kan cellen, cellen die vooraf hebben zijn geïncubeerd met antistoffen of antilichamen alleen. Dit systeem is ook gebruikt met bacteriën als doelstellingen5.
- Na 48u, bevriezen de platen bij-20 ° C en dooi voorafgaand aan ELISA, of direct te gebruiken voor ELISA (zie volgende stappen).
5. ELISA
- Jas een ELISA-plaat met een anti-muis IL-2 antilichaam (anti-mIL-2). 0,05 µg voor anti-mIL-2 in een volume van 1 x PBS per putje 50 µL plaatsen. Incubeer de gecoate ELISA-plaat met het antilichaam van de anti-mIL-2 bij 4 ° C's nachts of bij 37 ° C gedurende 2 uur.
Opmerking: Standaardinteracties ELISA direct na de incubatie stap, de ELISA-plaat moet worden gecoat 24 h vóór het eind van de incubatietijd van de cellen van het BW. - Gooi de vloeistof in de ELISA-plaat en voeg een blokkerende oplossing (200 µL per putje) die uit 1 x PBS en 1% bovien serumalbumine (BSA bestaat). De ELISA-plaat gedurende 2 uur bij kamertemperatuur incuberen.
- Wassen van de ELISA-plaat driemaal met 0,05% tween PBS-oplossing (dat wil zeggen, 0,5 mL in 1 liter 1 x PBS-Tween-20).
- Neem de 96 plaat die heeft de BW-cellen die werden geïncubeerd met hun doelen (4.3). Als de plaat was bevroren, volledig het ontdooien (bv. door korte incubatie bij 37 ° C). Centrifugeer de 96 plaat (5 min, 515 x g) en zorgvuldig Breng 100 µL van het supernatant in elk putje aan de voorbehandelde en gerolvormde geblokkeerde ELISA-plaat.
Opmerking: Het supernatant moet worden verzameld van de zijden van elk putje om te voorkomen dat de cellen nemen. - Indien gewenst, toevoegen recombinante mIL-2 met gedefinieerde concentraties aan een van de lege rijen van de gecoate ELISA-plaat voor het genereren van een standaard curve van mIL-2. Bijvoorbeeld vanaf een mIL-2 concentratie van 2.500 pg/mL en vervolgens verminderen met 50% in elke latere goed; Voeg geen mIL-2 naar de laatste goed.
- Incubeer de ELISA-plaat bij 4 ° C's nachts of bij 37 ° C gedurende 2 uur.
- Wassen van de ELISA-plaat vier keer met PBS-Tween.
- Biotine anti-muis IL-2 toevoegen aan de ELISA-plaat. Gebruik een concentratie van 1 µg antilichaam in 1 mL 1 x PBS met 1% BSA en verdelen in 100 µL per putje.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Wassen van de ELISA-plaat zes keer met PBS-Tween.
- HRP-geconjugeerde daar toevoegen. Gebruik een concentratie van 1 µL streptavidine in 1 mL PBSX1 met 1% BSA en verdelen in 100 µL per putje.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Wassen van de ELISA-plaat zes keer met PBS-Tween.
- Voeg 100 µL per putje van TMB substraat oplossing. Vul dit podium snel om te minimaliseren van de verschillen tussen de putten als gevolg van vertraging bij het toevoegen van de TMB.
- Lees de ELISA-plaat met een ELISA-afleesapparaat bij 650 nm (de lezing kan worden herhaald als het signaal zwak is).
Representative Results
Figuur 3 toont de resultaten van een experiment met een systeem van de verslaggever BW. In dit experiment, waren CLL cellen vooraf geïncubeerd met verschillende anti-CD20 antilichamen (rituximab en obinutuzumab) en vervolgens mede geïncubeerd met transfected cellen BW die uitdrukken van CD16a-CD3ζ. Soortgelijke experimenten werden uitgevoerd in onze studie9. Figuur 3A geeft een afbeelding van een ruwe ELISA-plaat, waar de kleurintensiteit komt met een concentratie van mIL-2 overeen. Het experiment werd uitgevoerd in drievoud. Dit experiment opgenomen diverse besturingselementen: CLL cellen geïncubeerd met ouderlijke untransfected BW cellen (bovenste rij) en CLL cellen geïncubeerd met BW cellen die uitdrukken van CD16a-CD3ζ, maar zonder een antilichaam of een besturingselement antilichaam (zes putten in de tweede rij aan de linkerkant) . De incubatie van BW cellen die uitgedrukt CD16 met CLL cellen die vooraf werden geïncubeerd met anti-CD20 antistoffen veroorzaakte een aanzienlijke secretie van mIL-2 in vergelijking met het niveau van de mIL-2 van de controleputjes. Belangrijker, pre-incubatie van de CLL-cellen met de anti-CD20 obinutuzumab geactiveerd CD16 sterker dan rituximab, een bekende vinden die was gerecapituleerd door ons systeem. De laatste rij toont aflopende vooraf gedefinieerde concentraties van recombinante mIL-2 (zonder de toevoeging van cellen). De juiste put in de laatste rij heeft geen mIL-2 en vertegenwoordigt de achtergrond lezing, die op de controleputjes lijkt. Figuur 3B presenteert de kwantificering van de resultaten van de ELISA-plaat weergegeven in figuur 3A. De optische dichtheid (OD) niveaus werden omgebouwd tot mIL-2 concentraties op basis van de standaard curve met recombinant mIL-2. Figuur 3 c presenteert een dosis reactie experiment waar verschillende doses van antistoffen waren vooraf geïncubeerd met CLL cellen en vervolgens geïncubeerd met BW cellen CD16 uitdrukken.
Figuur 1: schematische weergave van het systeem van de verslaggever BW. BW5147 cellen zijn stabiel transfected met het extracellulaire gedeelte van verschillende receptoren gesmolten tot de transmembrane en cytoplasmatische domeinen van de muis CD3ζ keten (chimeer recptor-CD3ζ). Activering van een specifieke receptor-CD3ζ door een ligand resulteert in een afscheiding van mIL-2, die kan worden gedetecteerd door ELISA. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: de structuur van het chimeer receptor-CD3ζ en het ontwerp van PCR inleidingen. (A) de algemene structuur van een extracellulaire receptor gesmolten tot de transmembrane en intracellulaire domeinen van muis CD3ζ. (B) het extracellulaire domein van de receptor werd versterkt met een 3'-primer die ook nucleotiden van CD3ζ opgenomen. (C) de intracellulaire en transmembraan domeinen van CD3ζ werden versterkt met een 5'-primer die ook receptor nucleotiden opgenomen. (D) in de uiteindelijke PCR reactie, werden beide segmenten, die overlappende sequenties hebben, gebruikt als de DNA-sjabloon. In alle panelen van de figuur, zijn verschillende eiwit domeinen vergelijkende en boxed in blauwe rechthoeken (CD3ζ reeks) en rode rechthoeken (de volgorde van de receptor). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: illustratie van het eindproduct van het systeem van de verslaggever BW. (A, B, C) CLL cellen waren vooraf bebroede met of zonder twee anti-CD20 antilichamen (rituximab en obinutuzumab) of een besturingselement antilichaam. Daarna werden de antilichaam-afhankelijke cellen geïncubeerd met ouderlijke BW cellen of BW-cellen die uitdrukken van CD16a-CD3ζ. Het niveau van mIL-2 in het supernatant werd bepaald door ELISA. (A) een beeld van een ruwe ELISA-plaat. Kleurintensiteit geeft aan de concentratie van mIL-2 in het supernatant. Het experiment werd uitgevoerd in drievoud. De onderste regel toont de ELISA-uitlezing in het verminderen van de concentraties van recombinante mIL-2 die werden geanalyseerd in de dezelfde plaat. (B) de kwantificering van de ELISA lezen weergegeven in (A). De mIL-2 niveaus werden berekend aan de hand van een standaard curve van mil-2. (C) een dosis reactie experiment waar verschillende doses van antistoffen waren vooraf geïncubeerd met CLL cellen en vervolgens geïncubeerd met BW cellen uiten van CD16a-CD3ζ. , P < 0.001; Van de student t -test (B) of ANOVA met meerdere vergelijkingen (C). De enige vergelijking in (C), die niet significant verschillend was was rituximab en het besturingselement Ab in de eerste concentratie (0.01 µg/mL). Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie van de triplicates. Soortgelijke experimenten werden uitgevoerd als onderdeel van een van onze recente studie9. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Hier presenteren we een protocol voor het genereren van een verslaggever systeem om te onderzoeken receptor-ligand interacties (zie een verkorte vorm van dit protocol in1). Het protocol bestaat uit drie hoofdonderdelen: klonen van een chimeer eiwitten, waaronder de extracellulaire domein van een specifieke receptor gesmolten tot het intracellulaire domein van CD3ζ, transfectie van een plasmide die het fusieproteïne naar BW cellen uitdrukt (bv , door electroporation), en kwantitatieve opsporing van muis IL-2 door ELISA. Het uiteindelijke product van elk van deze delen moet onafhankelijk worden gecontroleerd: het klonen proces dient te worden geverifieerd door volledige sequentiebepaling van het fusie-eiwit in de target-plasmide, de transfectie van de cellen BW dient te worden geverifieerd door het onderzoek van de uitdrukking van de receptor van belang in het BW cellen (bijvoorbeelddoor stroom cytometry) en de ELISA proces dient te worden geverifieerd door algemene positieve controles (b.v., recombinante mIL-2), alsook met de specifieke besturingselementen voor de transfected cellen BW; dat wil zeggen, doelstellingen die uitdrukking geven aan een bekende ligand van de receptor van belang (b.v., cellen dat uitdrukkelijke CD48 kan worden gebruikt als positieve controle voor BW-cellen die uitdrukking geven aan de NK cel receptor 2B4). Bijvoorbeeld, het klonen proces succesvol kan zijn, maar de fusieproteïne wordt niet uitgedrukt door de cellen van het BW. In dit geval moet de electroporation worden herhaald. Als alternatief, als er geen signaal boven het achtergrondniveau van de ELISA-plaat is (vooral voor de positieve controles) BW transfected cellen kunnen hebben gefaald wil de receptor (of de expressie verloren gegaan) of een technisch probleem mogelijk hebben voorgedaan tijdens de ELISA-proces.
Verschillende wijzigingen kunnen worden aangebracht bij dit protocol, met behoud van de algemene beginselen van de procedure. Deze wijzigingen omvatten de vector gebruikt om uit te drukken de fusieproteïne, de methode voor het transfecting van de plasmide BW cellen en specifieke parameters die betrekking hebben op de incubatie en ELISA zoals het soort doel (bijvoorbeeld cellen, antilichamen, enz.) , aantal doelcellen of de antilichaam-concentratie, indien van toepassing (wij gebruiken 50.000 cellen per well en een antilichaam startdosis van 0,5 µg per putje), incubatietijd (wij gebruiken een incubatietijd van 48 uur) en het supernatant volume dat wordt overgedragen aan de ELISA-plaat.
Deze methode is gevoelig, specifieke en gemakkelijk kunnen worden gekwantificeerd. Het is ideaal voor screening op de aanwezigheid van liganden voor specifieke receptoren (vooral als het ligand zelf is niet erkend). Na de voorbereiding van transfected cellen BW die uitdrukking geven aan een specifieke receptor, kunnen deze cellen worden bevroren en gebruikt wanneer nodig voor aanvullende experimenten. Wij en anderen hebben dit systeem met succes gebruikt in eerdere studies om te verkennen receptor-ligand interacties (bijvoorbeeld2,3,5,12,13,14 15,16) en de resultaten van dit systeem zijn geverifieerd door andere technieken. Deze methode kan ook worden gebruikt om te studeren van de activering van verschillende menselijke FcγR receptoren door antilichamen, zoals is gebeurd voor anti-virale antilichamen in serum6,7,8 of met monoklonale antilichamen tegen CD20 9.
Aangezien dit een verslaggever systeem waarin alleen de extracellulaire segment van de receptor wordt uitgedrukt, moeten de resultaten verkregen door dit systeem worden aangevuld met extra expermenteren de endogene receptor, zoals cytotoxiciteit testen met natuurlijke Killer (NK) cellen te bestuderen van interacties met NK cel receptoren. Bovendien bepaalde ligand/receptor interakties kunnen niet leiden tot een mIL-2 secretie door de verslaggever-systeem, en daarom zou kunnen worden over het hoofd gezien. Bovendien, zoals in enige experimentele opstelling, moeten de resultaten worden geverifieerd voor diverse parameters zoals hierboven beschreven. Dit is vooral belangrijk in gevallen waar een vergelijking van twee voorwaarden vereist (bijvoorbeeldde activering van de dezelfde Fc receptor door verschillende antilichamen is). Het is ook belangrijk om te controleren of de gevoeligheid van een specifieke ligand-receptor interactie binnen het lineaire bereik van het systeem. Anders kan dit leiden tot verzadiging waarden die een geldige vergelijking over voorwaarden beletten kunnen. Dit kan worden bereikt met behulp van een mIL-2 standaard curve alsmede door het genereren van een dosis-responscurve met de geteste ligand (in het geval van het verzadigen van waarden, de experimentele parameters moeten worden gewijzigd; bijvoorbeeld, een kleiner volume van het supernatans dat moet worden geanalyseerd door ELISA). Een andere mogelijke beperking van dit systeem is het gebruik van doelcellen met endogene afscheidingen van mIL-2 (bijvoorbeeldmuis T-cellen) die de IL-2 secretie van BW cellen zou maskeren. Om te overwinnen deze hoogst ongewone voorvallen die zijn beperkt tot de muis cellen, kan deze verslaggever systeem worden verbeterd met behulp van een verschillende verslaggever (bijvoorbeeldGFP) die niet wordt uitgedrukt door de doelcellen.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Esther Singer voor het bewerken van de taal. Deze studie werd ondersteund door de Europese Onderzoeksraad onder het zevende kaderprogramma van de Europese Unie (FP/2007-2013) / ERC subsidieovereenkomst nummer 320473-BacNK. Verdere steun werd voorzien door de kern programma van de Planning en budgettering Comité en de Israël Science Foundation en de ik-Core op de chromatine en RNA in genregulatie, de GIF-Stichting, de Lewis Family Foundation, de ICRF hoogleraarschap subsidie, de Helmholtz Israël grant en het vertrouwen van de Rosetrees (alle aan O.M.). Deze studie werd ook ondersteund door de Israël Science Foundation (grant 502/15), de Kass medische Research Award en een onderzoek subsidie van de Israël samenleving van hematologie en transfusiegeneeskunde (S.E). O.M is een kroon professor in moleculaire immunologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AccuPrep, Plasmid Mini Extraction Kit | Bioneer | K-3030 | |
| Anti-mouse IL-2 | BioLegend | 503702 | |
| Biotin anti-mouse IL-2 | BioLegend | 503804 | |
| ELISA plates | De-groot | 60-655061 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F7524-500ml | |
| G418 | Mercury | MBS3458105GM | |
| Gene Pulser II | Bio-Rad | 165-2105, 165-2106, 165-2107, 165-2108, 165-2109, 165-2110 | |
| L-Glutamine | Biological industry | 03-020-1B | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Biological industry | 01-340-1B | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biological industry | 03-031-1B | |
| peroxidase streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-030-084 | |
| PureLink HiPure Plasmid Filter Maxiprep Kit | ThermoFisher Scientific | K210016 | |
| RPMI-1640 Medium | Biological industry | 30-2001 | |
| Sodium Pyruvate | Biological industry | 03-042-1B | |
| TMB | SouthernBiothech | 0410-01 |
References
- Mandelboim, O., Lankry, D., Gazit, R. Natural Killer Cell Protocols. , Second edn, Humana Press. 258-262 (2010).
- Mandelboim, O., et al. Recognition of haemagglutinins on virus-infected cells by NKp46 activates lysis by human NK cells. Nature. 409 (6823), 1055-1060 (2001).
- Stanietsky, N., et al. The interaction of TIGIT with PVR and PVRL2 inhibits human NK cell cytotoxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17858-17863 (2009).
- Stanietsky, N., et al. Mouse TIGIT inhibits NK-cell cytotoxicity upon interaction with PVR. European Journal of Immunology. , (2013).
- Gur, C., et al. Binding of the Fap2 protein of Fusobacterium nucleatum to human inhibitory receptor TIGIT protects tumors from immune cell attack. Immunity. 42 (2), 344-355 (2015).
- Corrales-Aguilar, E., et al. A novel assay for detecting virus-specific antibodies triggering activation of Fcgamma receptors. Journal of Immunoogical Methods. 387 (1-2), 21-35 (2013).
- Corrales-Aguilar, E., et al. Highly individual patterns of virus-immune IgG effector responses in humans. Medical Microbiology and Immunology. 205 (5), 409-424 (2016).
- Radinsky, O., et al. Sudan ebolavirus long recovered survivors produce GP-specific Abs that are of the IgG1 subclass and preferentially bind FcgammaRI. Scientific Reports. 7 (1), 6054 (2017).
- Elias, S., Kahlon, S., Kotzur, R., Kaynan, N., Mandelboim, O. Obinutuzumab activates FcgammaRI more potently than other anti-CD20 antibodies in chronic lymphocytic leukemia (CLL). Oncoimmunology. 7 (6), e1428158 (2018).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), 253 (2007).
- Bar-On, Y., et al. NKp46 Recognizes the Sigma1 Protein of Reovirus: Implications for Reovirus-Based Cancer Therapy. Journal of Virology. 91 (19), (2017).
- Glasner, A., et al. Expression, Function, and Molecular Properties of the Killer Receptor Ncr1-Noe. Journal of Immunology. 195 (8), 3959-3969 (2015).
- Glatzer, T., et al. RORgammat(+) innate lymphoid cells acquire a proinflammatory program upon engagement of the activating receptor NKp44. Immunity. 38 (6), 1223-1235 (2013).
- Gur, C., et al. The activating receptor NKp46 is essential for the development of type 1 diabetes. Nature Immunology. 11 (2), 121-128 (2010).
- Markel, G., et al. Pivotal role of CEACAM1 protein in the inhibition of activated decidual lymphocyte functions. Journal of Clinical Investigation. 110 (7), 943-953 (2002).
