Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

En BW Reporter System for at studere Receptor-Ligand interaktioner

doi: 10.3791/58685 Published: January 7, 2019

Summary

Denne protokol beskriver, hvordan du opretter en reporter system, der kan bruges til at identificere og kvantificere receptor-ligand interaktioner.

Abstract

Interaktioner mellem receptorer og ligander udgør en grundlæggende biologiske proces. Men direkte forsøg med celler, der udtrykker den indfødte receptor og liganden er udfordrende da ligand på en bestemt receptor kan være ukendte og eksperimentelle procedurer med de indfødte ligand kan være teknisk kompliceret. For at løse disse hindringer, beskriver vi en reporter system for at opdage de bindende og aktivering af en bestemt receptor af en ligand interesse. I denne reporter system, det ekstracellulære domæne af en bestemt receptor er konjugeret med musen CD3ζ og denne kimære protein er så udtrykt i mus BW celler. Disse transfected BW cellerne kan derefter inkuberes med forskellige mål (fx, celler eller antistoffer). Aktivering af en transfected receptor fører til udskillelse af musen interleukin-2 (mIL-2), hvilket kan afsløres ved enzymmaerket assay (ELISA). Denne reporter system har fordelene ved at være følsom og specifik for en enkelt receptor. Derudover varslingsniveau i en bestemt receptor kan nemt kvantificeres og kan bruges selv i tilfælde, hvor ligand for receptor er ukendt. Dette system er implementeret med succes i mange af vores undersøgelser for at karakterisere receptor-ligand interaktioner. Vi har for nylig ansat dette system til at studere aktivering af menneskelige Fcγ receptorer (FcγRs) ved forskellige monoklonale anti-CD20 antistoffer i klinisk brug.

Introduction

BW reporter system er en teknik til at studere receptor-ligand interaktioner1. Dette system er særligt fordelagtige, når ligand på en bestemt receptor er ukendt eller eksperimenter med den endogene ligand er teknisk vanskeligt. Det kan også bruges til at studere bindingen af monoklonale antistoffer til menneskelige FcγRs. Metoden bygger på at udtrykke en kimære protein i mus BW celler. Denne kimære protein er sammensat af den ekstracellulære domæne af receptor af interesse smeltet til de transmembrane og intracellulære domæner af musen ζ kæde. Binding af passende ligander af receptor fører til udskillelse af musen IL-2, som let kan påvises ved ELISA, som illustreret i figur 1. Denne metode er følsom og specifik for en enkelt receptor, nem at betjene, og yderst reproducerbare. Det kan således supplere yderligere værktøjer til at studere receptor-ligand interaktioner. For eksempel, kan det bruges til at screene flere cellelinjer til tilstedeværelsen af en ligand for en bestemt receptor (selvom liganden, selv ikke er blevet identificeret) eller til at registrere aktivering af menneskelige FcγRs af monoklonale antistoffer eller humant serum indeholdende anti-virale antistoffer. Selvom primære immunceller express endogene FcγRs, er de generelt vanskeligt at håndtere og som regel udtryk for flere Fc-receptorer.

Vi har brugt dette system med succes i mange af vores undersøgelser for at karakterisere receptor-ligand interaktioner. Disse omfatter identifikation flerbasiske som NK celle receptoren NKp462, identificerer PVR og nectin-2 som ligander til mennesker og mus TIGIT3,4, ligand og viser, at fusobacterium nucleatum bakterie binder og aktiverer menneskelige TIGIT5. Derudover har BW celler, der udtrykker Fc-receptorer været brugt med held kan påvise anti-virale antistoffer i patienternes sera6,7,8. Specifikt, vi for nylig har etableret BW celler, der udtrykker menneskelige FcγRs for at registrere differential FcR aktivering af anti-CD20 antistoffer bruges til behandling af kronisk lymfatisk leukæmi (CLL)9. Vigtigere, er resultaterne af BW reporter system blevet valideret i supplerende forsøg.

Protocol

1. generation af et Plasmid, der udtrykker den kimære konstruere

Bemærk: Formålet er at generere et plasmid, der udtrykker den ekstracellulære domæne af receptor af interesse smeltet til de transmembrane og intracellulære domæner af mus CD3ζ kæde (figur 2A).

  1. Hente sekvensen af den ekstracellulære domæne af receptor af interesse herunder signal peptid. Få DNA-materiale, som forventes at udtrykke denne receptor (fx, cDNA eller et plasmid).
  2. Få DNA-materiale, der udtrykker den transmembrane og de intracellulære domæner af mus CD3ζ kæde (fx., cDNA eller et plasmid).
  3. Design sekvens af fusion protein baseret på den generelle struktur er vist i figur 2A. Sørg for at hele sekvensen er inden for samme codon læsning rammen. Denne sekvens er anvendt til at udforme passende primere og kontrollere det endelige produkt.
  4. Design to PCR reaktioner til at forstærke hver af fragmenter af fusion proteiner separat (figur 2B, 2 C)10.
    Bemærk: Specifikke betingelser for PCR reaktioner (fx., strækforlængelse tid og udglødning temperatur) afhænger af karakteren af primere, som er designet til en bestemt receptor.
    1. Forstærke det ekstracellulære segment af receptor.
      1. Designe en 5' primer, der omfatter en del af signal peptid af receptoren, en Kozak konsensus sekvens og en passende begrænsning websted (figur 2B).
      2. Designe en 3' primer, der ligger begge dele af fusion protein (figur 2B). For eksempel kan denne 3' primer for det oprindelige design omfatter de sidste 20 basepar af den ekstracellulære segment af receptor og de første 9 basepar af CD3ζ segment.
        Bemærk: Der er ingen grund til at tilføje en begrænsning websted til 3' primer, da denne primer vil blive brugt til at generere de sammenvoksede sekvens, og bruges ikke til ligatur.
    2. Forstærke CD3ζ segment.
      1. Designe en 5' primer, som ligger begge dele af fusion protein (figur 2 c). For eksempel, for det oprindelige design kan 5' primer omfatte de sidste 9 basepar af den ekstracellulære segment af receptor og de første 20 basepar af CD3ζ segment.
        Bemærk: Der er ingen grund til at tilføje en begrænsning websted til 5' primer, da denne primer vil blive brugt til at generere de sammenvoksede sekvens, og bruges ikke til ligatur.
      2. Designe en 3' primer, som indeholder slutningen af CD3ζ sekvensen samt en passende begrænsning websted (figur 2 c).
    3. Rette primer sekvenser i hver af disse to reaktioner, således at den udgloedning temperatur er den samme i hvert par (Bemærk, at primer, der omfatter sekvenser af de to dele af fusion protein, kun anneals med en del af sekvensen i hver reaktion).
  5. Udføre en yderligere PCR, hvor en blanding af PCR-produkter af de to første reaktioner er brugt som skabelonen DNA med 5' primer af ekstracellulære receptor segment (trin 1.4.1.1) og 3' CD3ζ-segmentet (trin 1.4.2.2) (figur 2D)10 . Denne reaktion skal generere den endelige sammenvoksede sekvens.
  6. Fortsætte som sædvanlig for kloning.
    1. Ligate den endelige PCR produkt til målet skære vektor (target vektor er normalt pcDNA3, som udtrykker G418 og ampicillin modstand).
    2. Omdanne den sammenskrevne vektor til kompetente bakterier11.
      1. Tø 50 µL af de kompetente bakterier på is.
      2. Tilføj den sammenskrevne vektor for bakterier og inkuberes i isbad i 20 min.
      3. Der inkuberes ved 42 ° C til 45 s.
      4. Tilføje 200 µL af LB uden antibiotika.
      5. Inkuber i 1 time ved 37 ° C med kontinuerlig ryster.
      6. Frø på en LB-plade med passende antibiotika (fx, ampicillin løsning med en endelig koncentration på 0,1 mg/mL).
    3. Indsamle og dyrke flere bakteriel kolonier i 5 mL af LB (i 15 mL rør).
    4. Den næste dag, udtrække plasmider med en mini prep kit.
    5. Analysere gen Indsæt med restriktionsenzymer.
    6. Sekvens af relevante kolonier og kontroller, at sekvensen og læsning rammen er korrekte (som angivet i trin 1.3).
  7. Omdanne kompetente bakterier11de verificerede plasmid.
    1. Tø 20 µL af de kompetente bakterier på is.
    2. Tilføj 1 µL af plasmidet for bakterier og inkuberes i isbad i 20 min.
    3. Der inkuberes ved 42 ° C til 45 s.
    4. Tilføje 200 µL af LB uden antibiotika.
    5. Inkuber i 1 time ved 37 ° C med kontinuerlig ryster.
    6. Frø på en bakteriel vækst plade med passende antibiotika (fx, ampicillin løsning med en endelig koncentration på 0,1 mg/mL).
  8. Den næste dag, dyrke en bakteriel koloni i en stor LB beholder med 0,1 mg/mL ampicillin (~ 250 mL).
  9. Den næste dag, udføre maxi prep efter specifikke instrukser fra sættet.
    Bemærk: For elektroporation procedure, en stor mængde af plasmid er nødvendig, som beskrevet nedenfor.

2. Transfektion af det Plasmid, der udtrykker den kimære Protein i BW celler

Bemærk: Forskellige metoder kan også være ansat for Transfektion (fx., af lentiviral infektion). Før elektroporation, udføre ethanol fældning af DNA som beskrevet nedenfor. De næste trin kræver sterile forhold.

  1. Dagen før, forberede elektroporation BW5147 celler ("BW celler"). Plade 10 plader (på 10 cm) med 10 mL af 100.000 BW5147 celler/mL (dvs. ialt 10 x 106 celler) med RPMI suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS), 1% natrium pyruvat, 1% L-glutamin, 1% ikke-essentielle aminosyrer og 1% penicillin-streptomycin ("komplet medium").
  2. Placere 100 µg for pcDNA3 plasmid, der udtrykker fusion protein i en 1,5-2 mL tube og tilføje 3 M natriumacetat ved pH 5.3-5.5 til det. Omfanget af natriumacetat bør svare til 0,1 (10%) af omfanget af de 100 µg plasmid; titreres natriumacetat pH med et pH-meter ved tilsætning af NaOH eller HCl.
  3. Tilføje 2,5 mængder af 100% ethanol til blandingen af plasmidet og til natriumacetat, som beskrevet i trin 2,2 (2,5 x det samlede volumen af plasmid og natrium acetat). Der inkuberes natten over ved-20 ° C eller i 2 timer ved 70 ° C.
  4. 2.4. 24 timer efter BW celler har været forgyldt, indsamle alle BW cellerne (~ 100 mL) i 2 50 mL rør. Centrifugeres celler i 5 min på 515 x g og supernatanten.
  5. Genopslæmmes pellet fra begge rør i 25 mL af RPMI - i et enkelt 50 mL tube. For eksempel genopslæmmes pellet af en tube med 25 mL af RPMI - og derefter bruge denne væske til genopslæmmes væsken i anden 50 mL tuben, således at den samlede pellet fra BW celler er igen suspenderet i 25 mL af medium i et enkelt rør.
    Bemærk: Medium bør være uden tilføjelser, da serum kan forstyrre elektroporation.
  6. Der centrifugeres cellerne igen for 5 min på 515 x g. Genopslæmmes pellet i 1 mL af RPMI, og overføre indholdet til en 0,4 cm kuvette på is.
  7. Der centrifugeres i plasmidet, som gennemgik ethanol nedbør (trin 2.3) for 30 min på 16.000 x g og 4 ° C.
  8. Vask en gang med 1 mL af 70% ethanol, og der centrifugeres for en anden 20 min på 16.000 x g og 4 ° C (til at vaske ud saltet).
  9. Fjern alle ethanol og lad pellet tørre lidt (dvs. i et åbent rør i vævskultur hood). Genopslæmmes pellet med 100 µL af RPMI-tidligere opvarmes til 60 ° C.
  10. Tilføje den igen suspenderede plasmid (trin 2,8) til cellerne i kuvette og Inkuber i 5 min på is.
  11. Electroporate celler på 0,23 kV, 250 retsevne. Dette bør tage ~ 4 ms.
  12. Overføre electroporated cellerne til en 50 mL tube, tilsættes 50 mL af komplette mellemstore og centrifugeres i 5 min på 515 x g.
  13. Supernatanten og genopslæmmes celler med 50 mL af komplet medium.
  14. Plade electroporated celler i 24-godt kultur retter (1 mL pr. brønd, for ~ 50 brønde i alt) og der inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 for 48 h.
  15. Vælg de transfected celler med antibiotika. Efter 48 timer tilsættes 1 mL af komplette mellemstore suppleret med 10 mg/mL G418 til hver brønd (på nuværende tidspunkt er den endelige mængden i hver godt 2 mL og den endelige koncentration af G418 i hver godt er 5 mg/mL).
    Bemærk: Hvis plasmidet indeholder en anden antibiotikaresistens, bestemme antibiotikum koncentration forpligtet til at dræbe de untransfected BW celler før dette trin.
  16. Hver 48 h, omhyggeligt kassere 1 mL af den øverste volumen af hver brønd uden omrøring medium i brønden (BW celler har tendens til at være i bunden af brønden). Tilføje komplet medium suppleret med 5 mg/mL G418 til hver brønd, så den endelige mængden i hver brønd er igen 2 mL.
  17. Undersøge kultur plader til cellevækst i alle pladens huller regelmæssigt.
    Bemærk: En ændring i farven på mellemlang og gul kan hjælpe med at identificere voksende celler; men i begyndelsen mediet bliver gule på grund af G418 sig selv. Identificere positive wells (brønde med voksende celler). Disse boringer er G418 resistente og derfor forventes at udtrykke fusion protein. Denne proces tager normalt ~ 3 uger.

3. kontrollen af udtryk for den Transfected Receptor i celler i de Positive brønde.

  1. Pletten transfected BW cellerne med et specifikt antistof mod den receptor, som var transfekteret.
  2. Sammenligne udtryk niveau af receptor ved flowcytometri til ekspression af kontrol celler (untransfected BW celler).
  3. Efter kontrol af en eller flere brønde, bruge celler straks til forsøgsformål, vokser i kultur eller fryse for fremtidige ansøgninger.
  4. Kontrollere udtryk for den transfected receptor før du udfører et nyt eksperiment. Efter et par ugers vækst, celler med G418 med en stabil receptor udtryk, kan G418 udelades fra næringssubstratet.

4. inkubation af transfekteret BW celler med mål

Bemærk: Når du bruger transfected BW cellerne for første gang, det er at foretrække at teste dem på mål, der udtrykker en kendt ligand på receptor af interesse eller på plade-bundet antistoffer specifikt rettet mod receptor af interesse (tværbinding eksperimenter; Se nedenfor, afsnit 4.2.1.3).

  1. Helst, Opdel BW celler 24 timer før forsøget (for eksempel ved tilsætning af 10 mL af komplette mellemstore til 2 mL af celler i kultur i en ny 10 cm kultur plade).
  2. Inkubér transfected BW celler med deres mål. Udføre forsøget samtidig på kontrol BW celler, der udtrykker en tom vektor (eller forældrenes BW celler). 96F plader foretrækkes (men 96U plader kan også bruges). Udføre forsøget i tre eksemplarer. Suspendere alle celler i det fuldstændige medium.
    1. Forberede mål. Målet type varierer som funktion af mål, og kan være celler, celler, der har været forud inkuberet med antistoffer, eller antistoffer alene. Dette system har også været anvendt med bakterier som mål5.
      1. Hvis målene dividere celler (dvs. cellelinjer), bestråle dem på 6.000 rad inden analysen. Sted 50.000 af target-cellerne i et enkelt godt af en 96 plade (i et volumen på 100 µL).
      2. For eksperimenter med antistoffer og BW celler, der udtrykker menneskelige FcγRs, inkuberes target-cellerne med et antistof på is i en 96 godt plade (for eksempel, 50 µL af målcellerne og 50 µL antistof; forskellige antistof doser kan testes).
      3. Hvis du bruger antistoffer alene som mål (cross-linking eksperimenter), bør de være plade-bundet. Til dette formål, først Inkuber antistoffer i en komplet medium i en 96F plade i 1-2 timer ved 37 ° C og 5% CO2 (en typisk startdosis er 0,5 μg af et specifikt antistof i 50 μl). Vask plade for at fjerne ubundne antistoffer.
        Bemærk: I dette tilfælde en 96F plade vil aktivere bindende antistof til den plade, som efter tilsætning af transfected BW celler vil føre til aktivering af den transfected receptor.
    2. Tilføje BW celler (effektor celler). Sted 50.000 BW celler i et enkelt godt af en 96 plade (i et volumen på 100 µL).
    3. Komplet volumen i hver brønd 200 µL hvis nødvendigt.
    4. Inkuber plader på 37 ° C og 5% CO2 for 48 h (denne periode kan kalibreres).
  3. Efter 48 h, fryse plader på-20 ° C og tø inden ELISA, eller bruge straks til ELISA (se næste trin).

5. ELISA

  1. Coat en ELISA-pladen med en anti-mus IL-2 antistoffer (anti-mIL-2). Placer 0,05 µg mIL-2 i et volumen på 50 µL 1 x PBS pr. brønd. Inkuber belagt ELISA-pladen med mIL-2 antistof ved 4 ° C natten over eller ved 37 ° C i 2 timer.
    Bemærk: For at udføre ELISA direkte efter inkubation skridt, ELISA-pladen skal være belagt 24 h inden udgangen af inkubationstiden for BW celler.
  2. Kassér væske i ELISA-pladen og tilføje en blokerende løsning (200 µL pr. brønd), som er sammensat af 1 x PBS og 1% bovint serumalbumin (BSA). Inkuber ELISA-pladen i 2 timer ved stuetemperatur.
  3. Vask ELISA-pladen tre gange med 0,05% PBS Tween løsning (dvs. 0,5 mL af Tween-20 i 1 liter 1 x PBS).
  4. Tage den 96 plade, som har de BW celler, der blev inkuberet med deres mål (4.3). Hvis pladen var frosset, helt tø det (fx. af korte inkubation ved 37 ° C). Centrifugeres 96 pladen (5 min, 515 x g) og omhyggeligt overføres 100 µL af supernatanten i hver brønd til præ-coatede og blokerede ELISA-pladen.
    Bemærk: Supernatanten bør indsamles fra siderne af hvert grundigt for at undgå at tage cellerne.
  5. Hvis det ønskes, tilføje rekombinant mIL-2 med definerede koncentrationer til en af de tomme rækker i coated ELISA-pladen til at generere en standardkurve for mIL-2. For eksempel, start fra en mIL-2 koncentration af 2.500 pg/mL og derefter falde med 50% i hver efterfølgende godt; Undlad at tilføje mIL-2 til de sidste godt.
  6. Inkuber ELISA-pladen ved 4 ° C natten over eller ved 37 ° C i 2 timer.
  7. Vask ELISA-pladen fire gange med PBS-Tween.
  8. Tilføje biotin anti-mus IL-2 til ELISA-pladen. Bruge en koncentration på 1 µg antistof i 1 mL af 1 x PBS med 1% BSA og opdele i 100 µL pr. brønd.
  9. Inkuber ved stuetemperatur i 1 time.
  10. Vask ELISA-pladen seks gange med PBS-Tween.
  11. Tilføje HRP konjugeret streptavidin. Bruge en koncentration af 1 µL streptavidin i 1 mL af PBSX1 med 1% BSA og opdele den i 100 µL pr. brønd.
  12. Inkuber ved stuetemperatur i 30 min.
  13. Vask ELISA-pladen seks gange med PBS-Tween.
  14. Tilsæt 100 µL pr. brønd TMB substrat opløsning. Fuldføre denne fase hurtigt for at minimere forskellene mellem brøndene som følge af tidsforskydninger når du tilføjer TMB.
  15. Læs ELISA-pladen med en ELISA-Pladelæser på 650 nm (læsning kan blive gentaget, hvis signalet er svagt).

Representative Results

Figur 3 illustrerer resultaterne af et eksperiment med en BW reporter system. I dette eksperiment var CLL celler pre inkuberes med forskellige anti-CD20 antistoffer (rituximab og obinutuzumab) og derefter Co inkuberes med transfekteret BW celler, der giver udtryk for CD16a-CD3ζ. Lignende forsøg blev udført i vores undersøgelse9. Figur 3A præsenterer et billede af en rå ELISA-pladen hvor farveintensiteten svarer til en koncentration af mIL-2. Eksperimentet blev udført i tre eksemplarer. Dette eksperiment inkluderet flere kontrolelementer: CLL cellerne inkuberes med forældrenes untransfected BW celler (øverste række) og CLL cellerne inkuberes med BW celler, der giver udtryk for CD16a-CD3ζ, men uden et antistof eller med en kontrol antistof (seks brønde i den anden række i venstre side) . Inkubation af BW celler, der udtrykte CD16 med CLL celler, der var forud inkuberet med anti-CD20 antistoffer fremkaldt en betydelig sekretion af mIL-2 i forhold til mIL-2 niveau af kontrol brønde. Vigtigere, aktiveret præ-inkubation af CLL celler med anti-CD20 obinutuzumab CD16 mere kraftigt end rituximab, en kendt at finde som blev sammenfattet af vores system. Den sidste række viser faldende foruddefinerede koncentrationer af rekombinant mIL-2 (uden tilsætning af celler). Rigtigt godt i den sidste række har ikke mIL-2 og repræsenterer baggrund læsning, som ligner kontrolhullerne. Figur 3B præsenterer kvantificeringen af resultater i ELISA-pladen vist i figur 3A. Optisk densitet (OD) niveauer blev omdannet til mIL-2 koncentrationer baseret på standardkurven med rekombinant mIL-2. Figur 3 c præsenterer en dosis svar eksperiment, hvor forskellige doser af antistoffer var forud inkuberet med CLL celler og derefter inkuberes med BW celler udtrykker CD16.

Figure 1
Figur 1: skematisk fremstilling af BW reporter system. BW5147 celler er stabilt transfekteret med den ekstracellulære del af forskellige receptorer smeltet til de transmembrane og cytoplasmatisk domæner af mus CD3ζ kæde (kimære recptor-CD3ζ). Aktivering af en bestemt receptor-CD3ζ af en ligand resulterer i en udskillelse af mIL-2, hvilket kan påvises ved ELISA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: strukturen af den kimære receptor-CD3ζ og design af PCR-primere. A generel struktur af en ekstracellulære receptor smeltet til de transmembrane og intracellulære domæner i mus CD3ζ. (B) den ekstracellulære domæne af receptor blev forstærket med en 3' primer, som også omfattede nukleotider i CD3ζ. (C) de intracellulære og transmembrane domæner af CD3ζ blev forstærket med en 5' primer, der også omfattede receptor nukleotider. (D) i den endelige PCR reaktion, blev begge segmenter, der har overlappende sekvenser, brugt som skabelonen DNA. I alle figur paneler, er forskellige protein domæner farvekodede og boxed i blå rektangler (CD3ζ sekvens) og Røde rektangler (receptor sekvens). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Illustration af det endelige produkt af BW reporter system. (A, B, C) CLL celler blev præ rugede, med eller uden to anti-CD20 antistoffer (rituximab og obinutuzumab) eller en kontrol antistof. Bagefter, blev antistof-bundet cellerne inkuberes med forældrenes BW celler eller BW celler, der giver udtryk for CD16a-CD3ζ. MIL-2 i supernatanten blev fastsat ved ELISA. (A) et billede af en rå ELISA-pladen. Farveintensiteten angiver en koncentration af mIL-2 i supernatanten. Eksperimentet blev udført i tre eksemplarer. Den nederste række viser ELISA udlæsning i faldende koncentrationer af rekombinant mIL-2, som blev analyseret i den samme plade. B kvantificering af ELISA læsning vist i (A). MIL-2 niveauer blev beregnet ved hjælp af en standardkurve for mil-2. (C) en dosis svar eksperiment hvor forskellige doser af antistoffer var forud inkuberet med CLL celler og derefter inkuberes med BW celler udtrykker CD16a-CD3ζ. , P < 0,001; Student's t -test (B) eller ANOVA med flere sammenligninger (C). Den eneste sammenligning i (C), som ikke var signifikant forskellig var for rituximab og kontrol Ab i den første koncentration (0,01 µg/mL). Fejllinjer udgør standardafvigelsen af tre. Lignende forsøg blev udført som en del af en af vores seneste undersøgelse9. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Her præsenterer vi en protokol til at generere en reporter system for at undersøge receptor-ligand interaktioner (se en forkortet form af denne protokol i1). Protokollen er sammensat af tre hoveddele: kloning af en kimære protein, som omfatter den ekstracellulære domæne af en bestemt receptor sammenvokset til CD3ζ, Transfektion af et plasmid, der udtrykker fusion protein til BW celler intracellulære domæne (f.eks. , af elektroporation), og kvantitativ påvisning af musen IL-2 ved ELISA. Det endelige produkt af hver af disse dele bør kontrolleres uafhængigt: kloningsprocessen bør kontrolleres af komplet sekventering af fusion protein i target plasmid, Transfektion af BW celler skal derfor bekræftes ved at undersøge et udtryk for den receptor interesse for BW celler (f.eks.ved flowcytometri) og ELISA proces bør kontrolleres af generelle positive kontroller (fx, rekombinant mIL-2) og med specifikke kontrolelementer for transfected BW celler; dvs., mål, der udtrykker en kendt ligand på receptor af interesse (f.eks., celler at udtrykke CD48 kan bruges som en positiv kontrol for BW celler, der udtrykker NK celle receptoren 2B4). For eksempel, kloning processen kan blive vellykket, men fusion protein er ikke udtrykt af BW celler. I dette tilfælde bør elektroporation gentages. Alternativt, hvis der ikke er noget signal over baggrundsniveauet i ELISA-pladen (især for den positive kontrol) transfected BW cellerne kan har undladt at udtrykke receptoren (eller udtrykket er gået tabt) eller et teknisk problem kan være opstået under ELISA-proces.

Denne protokol kan foretages flere ændringer samtidig med at de generelle principper for proceduren. Disse ændringer omfatter den vektor, der anvendes til at udtrykke fusion protein, metoden for transfecting plasmid til BW celler og specifikke parametre relateret til inkubation og ELISA som typen af mål (fx celler, antistoffer, osv.) , antal målceller eller antistof koncentration hvis relevante (vi bruger 50.000 celler pr. brønd og et antistof start dosis på 0,5 µg/brønd), Inkubationstiden (vi bruger en inkubationstiden for 48 h) og supernatanten volumen, der er overført til ELISA-pladen.

Denne metode er følsomme, specifikke og let kan kvantificeres. Den er ideel til screening for forekomst af ligander til specifikke receptorer (især hvis liganden, selv ikke er blevet anerkendt). Efter at forberede transfekteret BW celler, der udtrykker en bestemt receptor, kan disse celler frosne og bruges når der er behov for yderligere forsøg. Vi og andre har anvendt dette system med succes i tidligere undersøgelser for at udforske receptor-ligand interaktioner (for eksempel2,3,5,12,13,14 15,16) og resultaterne af dette system er blevet bekræftet af andre teknikker. Denne metode kan også bruges til at studere aktivering af forskellige menneskelige FcγR receptorer af antistoffer, som er sket for anti-virale antistoffer i serum6,7,8 eller med monoklonale antistoffer imod CD20 9.

Da dette er en reporter system, hvor kun den ekstracellulære segment af receptoren udtrykkes, bør resultaterne af dette system suppleres med yderligere eksperimenter med den endogene receptor, såsom cytotoksicitet assays med naturlige Killer (NK) celler til at undersøge interaktioner med NK celle receptorer. Endvidere, visse ligand/receptor interaktioner kan ikke resultere i en mIL-2 sekretion af reporter system, og derfor kan blive overset. Derudover som en eksperimentel opsætning, skal resultaterne kontrolleres for forskellige parametre som beskrevet ovenfor. Dette er især vigtigt i tilfælde, hvor en sammenligning af to betingelser er påkrævet (f.eks.aktivering af den samme Fc receptor af forskellige antistoffer). Det er også vigtigt at kontrollere, at følsomheden af en specifikke ligand-receptor interaktion er inden for det lineære område af systemet. Ellers kunne det føre til mætning værdier, som kan udelukke en gyldig sammenligning på tværs af betingelser. Dette kan opnås ved hjælp af en mIL-2 standardkurve samt ved at generere en dosis-respons kurve med den testede ligand (for mætte værdier, experimental parametre bør ændres; f.eks.en mindre mængde af supernatanten skal analyseres ved hjælp af ELISA). En anden mulig begrænsning af dette system er brug af target-cellerne med endogene sekreter af mIL-2 (f.eks.mus T celler), som ville maske IL-2 udskillelsen af BW celler. For at overvinde disse meget usædvanlige begivenheder, som er begrænset til musen celler, kan denne reporter system forbedres ved hjælp af forskellige reporter (f.eks.normal god landbrugspraksis) der ikke er udtrykt af target-cellerne.

Disclosures

Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatterne takke Esther Singer redigeringsværktøjer sprog. Denne undersøgelse blev støttet af det Europæiske Forskningsråd under EUs syvende rammeprogram (FP/2007-2013) / ERC tilskudsaftalens nummer 320473-BacNK. Yderligere støtte blev leveret af jeg-KERNEN programmet om planlægning og budgettering udvalget og Israel Science Foundation og af jeg-Core på kromatin og RNA i genregulering, GIF Foundation, Lewis Family Foundation, ICRF professorat grant, den Helmholtz Israel grant og Rosetrees Trust (alle til O.M.). Denne undersøgelse blev også støttet af Israel Science Foundation (grant 502/15), Kass Medical Research Award og forskning tilskud fra Israel samfund for Hematologi og blodtransfusion medicin (at Anja). O.M er Crown professor i molekylær immunologi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AccuPrep, Plasmid Mini Extraction Kit Bioneer K-3030
Anti-mouse IL-2 BioLegend 503702
Biotin anti-mouse IL-2 BioLegend 503804
ELISA plates De-groot 60-655061
Fetal Bovine Serum Sigma F7524-500ml
G418 Mercury MBS3458105GM
Gene Pulser II Bio-Rad 165-2105, 165-2106, 165-2107, 165-2108, 165-2109, 165-2110
L-Glutamine Biological industry 03-020-1B
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Biological industry 01-340-1B
Penicillin-Streptomycin Solution Biological industry 03-031-1B
peroxidase streptavidin Jackson ImmunoResearch 016-030-084
PureLink HiPure Plasmid Filter Maxiprep Kit ThermoFisher Scientific K210016
RPMI-1640 Medium Biological industry 30-2001
Sodium Pyruvate Biological industry 03-042-1B
TMB SouthernBiothech 0410-01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mandelboim, O., Lankry, D., Gazit, R. Natural Killer Cell Protocols. Second edn, Humana Press. 258-262 (2010).
  2. Mandelboim, O., et al. Recognition of haemagglutinins on virus-infected cells by NKp46 activates lysis by human NK cells. Nature. 409, (6823), 1055-1060 (2001).
  3. Stanietsky, N., et al. The interaction of TIGIT with PVR and PVRL2 inhibits human NK cell cytotoxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, (42), 17858-17863 (2009).
  4. Stanietsky, N., et al. Mouse TIGIT inhibits NK-cell cytotoxicity upon interaction with PVR. European Journal of Immunology. (2013).
  5. Gur, C., et al. Binding of the Fap2 protein of Fusobacterium nucleatum to human inhibitory receptor TIGIT protects tumors from immune cell attack. Immunity. 42, (2), 344-355 (2015).
  6. Corrales-Aguilar, E., et al. A novel assay for detecting virus-specific antibodies triggering activation of Fcgamma receptors. Journal of Immunoogical Methods. 387, (1-2), 21-35 (2013).
  7. Corrales-Aguilar, E., et al. Highly individual patterns of virus-immune IgG effector responses in humans. Medical Microbiology and Immunology. 205, (5), 409-424 (2016).
  8. Radinsky, O., et al. Sudan ebolavirus long recovered survivors produce GP-specific Abs that are of the IgG1 subclass and preferentially bind FcgammaRI. Scientific Reports. 7, (1), 6054 (2017).
  9. Elias, S., Kahlon, S., Kotzur, R., Kaynan, N., Mandelboim, O. Obinutuzumab activates FcgammaRI more potently than other anti-CD20 antibodies in chronic lymphocytic leukemia (CLL). Oncoimmunology. 7, (6), e1428158 (2018).
  10. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
  11. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), 253 (2007).
  12. Bar-On, Y., et al. NKp46 Recognizes the Sigma1 Protein of Reovirus: Implications for Reovirus-Based Cancer Therapy. Journal of Virology. 91, (19), (2017).
  13. Glasner, A., et al. Expression, Function, and Molecular Properties of the Killer Receptor Ncr1-Noe. Journal of Immunology. 195, (8), 3959-3969 (2015).
  14. Glatzer, T., et al. RORgammat(+) innate lymphoid cells acquire a proinflammatory program upon engagement of the activating receptor NKp44. Immunity. 38, (6), 1223-1235 (2013).
  15. Gur, C., et al. The activating receptor NKp46 is essential for the development of type 1 diabetes. Nature Immunology. 11, (2), 121-128 (2010).
  16. Markel, G., et al. Pivotal role of CEACAM1 protein in the inhibition of activated decidual lymphocyte functions. Journal of Clinical Investigation. 110, (7), 943-953 (2002).
En BW Reporter System for at studere Receptor-Ligand interaktioner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Elias, S., Kahlon, S., Duev-Cohen, A., Mandelboim, O. A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions. J. Vis. Exp. (143), e58685, doi:10.3791/58685 (2019).More

Elias, S., Kahlon, S., Duev-Cohen, A., Mandelboim, O. A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions. J. Vis. Exp. (143), e58685, doi:10.3791/58685 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter