Summary
هذا البروتوكول يصف كيفية إنشاء نظام مراسل التي يمكن استخدامها لتحديد وتقدير حجم التفاعلات مستقبلات-يجند.
Abstract
التفاعلات بين المستقبلات ويغاندس تشكل عملية بيولوجية أساسية. ومع ذلك، المباشر التجارب مع الخلايا التي تعبر عن مستقبلات الأصلية وتشكل تحديا يجند منذ يجند مستقبلات محددة قد تكون غير معروفة وإجراءات تجريبية مع يجند الأصلي يمكن أن يكون معقداً من الناحية الفنية. لتخطي هذه العقبات، يصف لنا نظام مراسل للكشف عن الملزمة والتنشيط مستقبلات محددة من يجند للفائدة. في هذا النظام مراسل، هو مترافق المجال خارج الخلية لمستقبلات محددة بالماوس CD3ζ وثم يتم التعبير عن هذا البروتين تشيميريك في خلايا الفأر الأسلحة البيولوجية. يمكن ثم تكون هذه الخلايا BW transfected المحتضنة مع أهداف مختلفة (مثلالخلايا أو الأجسام المضادة). التنشيط لمستقبل transfected يؤدي إلى إفراز interleukin-2 الماوس (mIL-2) التي يمكن الكشف عنها بواسطة المرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم (ELISA). وهذا النظام مراسل له مزايا حساسة ومحددة لمستقبل واحد. وبالإضافة إلى ذلك، مستوى التنشيط مستقبلات محددة يمكن قياسها كمياً بسهولة ويمكن استخدامها حتى في الحالات التي يكون فيها يجند المستقبلات غير معروف. وقد نفذت بنجاح هذا النظام في كثير من دراساتنا لوصف التفاعلات مستقبلات-يجند. وقد استخدمنا مؤخرا هذا النظام لدراسة تفعيل مستقبلات Fcγ البشرية (FcγRs) بالأجسام المضادة [مونوكلونل] مختلفة-CD20 في الاستخدام السريري.
Introduction
نظام مراسل الحرب البيولوجية تقنية لدراسة التفاعلات مستقبلات-يجند1. هذا النظام مفيد خصوصا عندما يجند لمستقبل محدد غير معروف أو تجارب مع يجند الذاتية ويصعب من الناحية الفنية. يمكن استخدامه أيضا لدراسة الربط من الأجسام المضادة للبشرية FcγRs. ويستند الأسلوب معربا عن بروتين تشيميريك في خلايا الفأر الأسلحة البيولوجية. ويتألف هذا البروتين تشيميريك من المجال خارج الخلية من المستقبلات للفائدة التي تنصهر فيها إلى المجالات داخل الخلايا وترانسميمبراني من سلسلة ζ الماوس. ملزمة يغاندس المناسبة للمستقبلات يؤدي إلى إفراز الماوس إيل-2، التي يمكن بسهولة الكشف عنها بواسطة أليسا، كما هو مبين في الشكل 1. هذا الأسلوب حساسة ومحددة لمستقبلات فردية، سهلة التشغيل، واستنساخه بدرجة عالية. وهكذا فإنه يمكن أن تكمل أدوات إضافية لدراسة التفاعلات مستقبلات-يجند. على سبيل المثال، يمكن استخدام الكشف عن تفعيل FcγRs البشرية بالأجسام المضادة أو بواسطة مصل الدم البشري التي تحتوي على الفيروسات أو الشاشة عدة خطوط الخلية لوجود يجند لمستقبل معين (حتى ولو لم يتم تحديد يجند نفسه) الأجسام المضادة. على الرغم من أن الخلايا المناعية الأولية إكسبريس FcγRs الذاتية، وهم عموما من الصعب التعامل معها وعادة التعبير عن مستقبلات Fc عدة.
أننا استخدمنا هذا النظام بنجاح في كثير من دراساتنا لوصف التفاعلات مستقبلات-يجند. وتشمل هذه تحديد ضرورة كما يجند مستقبلات الخلية ناغورني كاراباخ NKp462، تحديد PVR ونيكتين-2 يغاندس للإنسان والفأر3،تيجت4، وتبين أن fusobacterium nucleatum يربط بكتيريا و ينشط تيجت البشرية5. وبالإضافة إلى ذلك، استخدمت خلايا الأسلحة البيولوجية التي تعبر عن مستقبلات Fc بنجاح للكشف عن الأجسام المضادة للفيروسات في المرضى سيرا6،،من78. على وجه التحديد، أنشأنا مؤخرا الخلايا البيولوجية التي تعبر عن FcγRs البشرية للكشف عن التنشيط FcR التفاضلية للأجسام المضادة-CD20 المستخدمة لعلاج سرطان الدم الليمفاوي المزمن (CLL)9. الأهم من ذلك، وقد تم التحقق من صحة نتائج نظام مراسل الحرب البيولوجية في تجارب تكميلية.
Protocol
1-جيل بلازميد يعبر عن "بناء تشيميريك"
ملاحظة: الهدف هو توليد بلازميد يعبر عن المجال خارج الخلية من المستقبلات للفائدة التي تنصهر فيها إلى المجالات داخل الخلايا وترانسميمبراني من الماوس سلسلة CD3ζ (الشكل 2A).
- استرداد تسلسل المجال خارج الخلية من المستقبلات للاهتمام بما في ذلك إشارة الببتيد. الحصول على مواد الحمض النووي الذي يتوقع أن التعبير عن هذا المستقبلات (مثلاً، كدنا أو بلازميد).
- الحصول على مواد الحمض النووي الذي يعبر عن ترانسميمبراني والمجالات داخل الخلايا للماوس سلسلة CD3ζ (مثلاً.، كدنا أو بلازميد).
- تصميم تسلسل البروتين الانصهار استناداً إلى الهيكل العام هو مبين في الشكل 2 ألف. تأكد من أن تسلسل كامل داخل نفس الإطار قراءة كودون. يتم استخدام هذا التسلسل لتصميم أجهزة الإشعال المناسبة والتحقق من المنتج النهائي.
- تصميم اثنين من ردود الفعل PCR تضخيم كل أجزاء من البروتينات الانصهار على حدة (الشكل 2، ج 2)10.
ملاحظة: الشروط المحددة لردود فعل بكر (مثلاً.، وقت استطالة والصلب درجة الحرارة) تتوقف على طبيعة كبسولة تفجير، التي صممت لمستقبلات محددة.- تضخيم الجزء خارج الخلية للمستقبلات.
- تصميم تمهيدي 5 ' الذي يتضمن جزءا من الببتيد إشارة المستقبلات وتسلسل توافق كوزاك، وموقع تقييد ملائمة (الشكل 2).
- تصميم تمهيدي 3 ' للوقائ كلا أجزاء من البروتين الانصهار (الشكل 2). على سبيل المثال، يمكن أن تتضمن هذا الكتيب 3 ' للتصميم الأولى أزواج قاعدة آخر 20 من الجزء خارج الخلية للمستقبلات وأزواج قاعدة 9 أولاً الجزء CD3ζ.
ملاحظة: ليست هناك حاجة إضافة موقع تقييد التمهيدي 3 ' منذ هذا الكتيب سوف تستخدم لتوليد تسلسل تنصهر فيها، ولا يستخدم لربط.
- تضخيم الجزء CD3ζ.
- تصميم تمهيدي 5 ' التي للوقائ كلا أجزاء من البروتين الانصهار (الشكل 2). على سبيل المثال، يمكن أن تشمل التمهيدي 5 ' للتصميم الأولى أزواج قاعدة آخر 9 من الجزء خارج الخلية للمستقبلات وأزواج قاعدة 20 أولاً من الجزء CD3ζ.
ملاحظة: ليست هناك حاجة إضافة موقع تقييد التمهيدي 5 ' منذ هذا الكتيب سوف تستخدم لتوليد تسلسل تنصهر فيها، ولا يستخدم لربط. - تصميم تمهيدي 3 ' الذي يتضمن نهاية تسلسل CD3ζ فضلا عن موقع تقييد ملائمة (الشكل 2).
- تصميم تمهيدي 5 ' التي للوقائ كلا أجزاء من البروتين الانصهار (الشكل 2). على سبيل المثال، يمكن أن تشمل التمهيدي 5 ' للتصميم الأولى أزواج قاعدة آخر 9 من الجزء خارج الخلية للمستقبلات وأزواج قاعدة 20 أولاً من الجزء CD3ζ.
- تصحيح تسلسل التمهيدي في كل هذه التفاعلات اثنين حيث تكون درجة الحرارة انلينغ مماثلة في كل زوج (علما بأن الدليل التمهيدي، الذي يتضمن تسلسل الجزأين من البروتين الانصهار، أننيالس فقط مع جزء من التسلسل في كل رد فعل).
- تضخيم الجزء خارج الخلية للمستقبلات.
- القيام PCR إضافية الذي يستخدم مزيج من منتجات PCR ردود الفعل الأولى والثانية كقالب الحمض النووي مع التمهيدي 5 'الجزء مستقبلات خارج الخلية (الخطوة 1.4.1.1) و 3' الجزء CD3ζ (الخطوة 1.4.2.2) (الشكل 2D)10 . ينبغي أن تولد رد فعل هذا التسلسل تنصهر النهائي.
- المضي قدما كالمعتاد للاستنساخ.
- اضطر PCR المنتج النهائي بهدف قطع المتجهات (ناقلات الهدف هو عادة pcDNA3 التي تعبر عن المقاومة G418 والامبيسلين).
- تحويل ناقلات الواصلة إلى البكتيريا المختصة11.
- ذوبان الجليد 50 ميليلتر من البكتيريا المختصة على الجليد.
- إضافة ناقلات الواصلة للبكتيريا واحتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة.
- احتضان في 42 درجة مئوية ل 45 ثانية.
- إضافة 200 ميليلتر من رطل دون المضادات الحيوية.
- احتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية مع الرج المستمر.
- البذور على صفيحة رطل مع المضادات الحيوية المناسبة (مثلاً، حل الأمبيسلّين بتركيز نهائي من 0.1 مغ/مل).
- جمع، وينمو عدد المستعمرات البكتيرية في 5 مل رطل (في أنابيب 15 مل).
- وفي اليوم التالي استخراج والبلازميدات مع مجموعة مصغرة من الإعدادية.
- تحليل إدراج الجينات مع إنزيمات التقييد.
- تسلسل المستعمرات ذات الصلة، وتحقق من صحة التسلسل والإطار القراءة الصحيحة (كما هو موضح في الخطوة 1، 3).
- تحويل بلازميد التحقق من البكتيريا المختصة11.
- ذوبان الجليد 20 ميليلتر من البكتيريا المختصة على الجليد.
- إضافة 1 ميليلتر بلازميد البكتيريا واحتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة.
- احتضان في 42 درجة مئوية ل 45 ثانية.
- إضافة 200 ميليلتر من رطل دون المضادات الحيوية.
- احتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية مع الرج المستمر.
- البذور على صفيحة نمو البكتيري مع المضادات الحيوية المناسبة (مثلاً، حل الأمبيسلّين بتركيز نهائي من 0.1 مغ/مل).
- وفي اليوم التالي تنمو مستعمرة بكتيرية في حاوية كبيرة رطل مع الأمبيسلّين 0.1 مغ/مل (~ 250 مل).
- وفي اليوم التالي أداء ماكسي الإعدادية وفقا للتعليمات المحددة المقدمة من عدة.
ملاحظة: لإجراء انهانسر، كمية كبيرة من بلازميد المطلوب، كما هو مفصل أدناه.
2-تعداء بلازميد يعبر عن "البروتين تشيميريك" في "خلايا وزن الجسم"
ملاحظة: يمكن أيضا أن تستخدم أساليب مختلفة تعداء (على سبيل المثال-، بالعدوى لينتيفيرال). قبل انهانسر، تؤدي الأمطار الإيثانول من الحمض النووي كما هو موضح أدناه. الخطوات المقبلة التي تتطلب ظروف معقمة.
- اليوم السابق، إعداد الخلايا BW5147 ("خلايا وزن الجسم") انهانسر. لوحة لوحات 10 (من 10 سم) مع 10 مل من 100,000 BW5147 خلايا/مل (أي ما مجموعة 10 × 106 خلايا) مع ربمي تكملة مع مصل العجل الجنين 10% (FCS)، بيروفات صوديوم 1%، 1% ل الجلوتامين، الأحماض الأمينية غير الأساسية 1% و 1% البنسلين-ستربتوميسين ("المتوسطة كاملة").
- ضع 100 ميكروغرام من بلازميد pcDNA3 أن تعرب عن البروتين الانصهار في أنبوب 1.5-2 مل وإضافة خلات الصوديوم 3 م على درجة الحموضة 5.3-5.5 إليها. يجب أن يطابق حجم خلات الصوديوم 0.1 (10 في المائة) من حجم بلازميد ميكروغرام 100؛ تيتراتي درجة حموضة خلات الصوديوم مع مقياس الأس الهيدروجيني بإضافة هيدروكسيد الصوديوم أو HCl.
- إضافة مجلدات 2.5 من الإيثانول 100% إلى الخليط بلازميد وخلات الصوديوم كما هو موضح في "الخطوة 2، 2" (2.5 x الحجم الإجمالي من خلات بلازميد والصوديوم). تبني بين عشية وضحاها في-20 درجة مئوية أو ح 2 في 70 درجة مئوية.
- 2.4. 24 ساعة بعد قد تم مطلي بالخلايا البيولوجية، جمع جميع الأسلحة البيولوجية والخلايا (~ 100 مل) في أنابيب 2 50 مل. الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في 515 x ز وتجاهل المادة طافية.
- إعادة تعليق بيليه من كلا أنابيب في 25 مل من ربمي-في أنبوب واحد 50 مل. على سبيل المثال، إعادة تعليق بيليه أنبوب واحد مع 25 مل من ربمي-وثم استخدام هذا السائل لإعادة تعليق السائل في أنبوب 50 مل أخرى حتى أن بيليه مجموع من الخلايا BW إعادة مرحلياً في 25 مل متوسطة في أنبوب واحد.
ملاحظة: يجب أن يكون المتوسط دون إضافات، نظراً للمصل قد تتداخل مع انهانسر. - الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى لمدة 5 دقائق في 515 x ز. إعادة تعليق بيليه في 1 مل ربمي، ونقل المحتويات إلى ومبومو 0.4 سم على الجليد.
- الطرد المركزي بلازميد التي شهدت هطول الأمطار الإيثانول (الخطوة 2، 3) لمدة 30 دقيقة في 16,000 س ز و 4 درجة مئوية.
- أغسل مرة واحدة مع 1 مل إيثانول 70% والطرد المركزي لآخر 20 دقيقة في 16,000 س ز و 4 درجة مئوية (تغسل الملح).
- إزالة كافة الإيثانول واسمحوا بيليه الجاف قليلاً (أي، في أنبوب مفتوحة في هود زراعة الأنسجة). تعليق إعادة بيليه مع 100 ميليلتر من ربمي-سبق تسخينها إلى 60 درجة مئوية.
- إضافة بلازميد إعادة تعليق (2.8 خطوة) إلى الخلايا في ومبومو واحتضان لمدة 5 دقائق على الجليد.
- اليكتروبوراتي الخلايا في 0.23 كيلو فولت، 250 تأهيلية. وينبغي أن يستغرق هذا ~ 4 مللي ثانية.
- نقل الخلايا اليكتروبوراتيد إلى أنبوب 50 مل، إضافة 50 مل من المتوسطة كاملة والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 515 x غ.
- تجاهل المادة طافية وتعليق إعادة الخلايا مع 50 مل متوسطة كاملة.
- لوحة اليكتروبوراتيد الخلايا في أطباق الثقافة 24-جيدا (1 مل في البئر، لمجموعة آبار ~ 50) واحتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لح 48.
- حدد الخلايا transfected مع المضادات الحيوية. بعد 48 ساعة إضافة 1 مل من إكمال المتوسطة وتستكمل مع 10 ملغ/مل G418 لكل بئر (في هذه المرحلة وحدة التخزين النهائي في كل جيد 2 مل وكذلك تركيز G418 النهائي في كل 5 ملغ/مل).
ملاحظة: إذا كان يحتوي بلازميد على مقاومة المضادات الحيوية مختلفة، تحديد تركيز المضادات الحيوية اللازمة لقتل الخلايا BW أونترانسفيكتيد قبل هذه الخطوة. - تجاهل كل 48 ساعة، بعناية 1 مل الجزء العلوي لكل بئر دون إثارة المتوسطة في البئر (الخلايا البيولوجية تميل إلى أن تكون في أسفل البئر). إضافة كاملة المتوسطة وتستكمل مع 5 ملغ/مل G418 لكل بئر، حيث يكون الحجم النهائي في كل بئر مرة أخرى مل 2.
- دراسة لوحات الثقافة لنمو الخلايا في جميع الآبار بانتظام.
ملاحظة: تغيير لون المتوسط إلى اللون الأصفر قد يساعد تحديد الخلايا المتزايد؛ بيد في البداية المتوسط سوف يكون أصفر بسبب G418 نفسها. تحديد الآبار الإيجابية (الآبار مع تزايد الخلايا). هذه الآبار G418 مقاومة ولذلك من المتوقع أن يعرب عن البروتين الانصهار. وعادة ما تستغرق هذه العملية ~ 3 أسابيع.
3-تحقق التعبير عن مستقبلات ترانسفيكتيد في الخلايا في الآبار الإيجابية.
- وصمة عار الخلايا BW transfected مع جسم معين ضد مستقبلات الذي كان ترانسفيكتيد.
- مقارنة بين مستوى التعبير المستقبلات بالتدفق الخلوي للتعبير عن مراقبة الخلايا (خلايا وزن الجسم أونترانسفيكتيد).
- بعد تحقق آبار أو أكثر، استخدام الخلايا مباشرة لأغراض تجريبية، وتنمو في الثقافة، أو تجميد للتطبيقات المستقبلية.
- تحقق من التعبير عن مستقبلات transfected قبل القيام بتجربة جديدة. وبعد بضعة أسابيع من النمو، والخلايا مع G418 مع تعبير مستقبلات مستقرة، يمكن إهماله G418 من متوسطة الثقافة.
4-حضانة الخلايا Transfected BW مع الأهداف
ملاحظة: عند استخدام transfected الخلايا البيولوجية للمرة الأولى، من الأفضل لاختبار لهم على الأهداف التي تعبر عن يجند معروفة من المستقبلات للفائدة أو على لوحة زمنياً الأجسام المضادة الموجهة تحديداً ضد المستقبلات للفائدة (العابرة للربط التجارب؛ انظر أدناه، الفرع 4.2.1.3).
- ويفضل تقسيم الخلايا BW 24 ساعة قبل التجربة (على سبيل المثال، بإضافة 10 مل متوسطة كاملة إلى 2 مل خلايا في الثقافة في صفيحة ثقافة جديدة 10 سم).
- احتضان transfected الخلايا البيولوجية مع أهدافها. إجراء التجربة في نفس الوقت على خلايا مراقبة الأسلحة البيولوجية التي تعبر عن متجه فارغة (أو الأبوية BW الخلايا). لوحات 96F الأفضل (ولكن يمكن أيضا أن تستخدم لوحات 96U). إجراء التجربة في ثلاث نسخ. تعليق كافة الخلايا في الأجلين المتوسط والكامل.
- إعداد الأهداف. نوع الهدف يختلف كدالة للهدف، ويمكن أن تكون الخلايا، والخلايا التي قد تم مسبقاً المحتضنة مع الأجسام المضادة، أو الأجسام المضادة وحدها. كما يستخدم هذا النظام مع البكتيريا كأهداف5.
- إذا كانت الأهداف هي تقسيم الخلايا (أي خطوط الخلايا)، يتهددها لهم في راد 6,000 قبل المقايسة. مكان 50,000 الخلايا المستهدفة في بئر واحدة من صفيحة 96 (بحجم 100 ميليلتر).
- لاحتضان التجارب مع الأجسام المضادة والخلايا البيولوجية التي تعبر عن FcγRs البشرية، الخلايا المستهدفة مع جسم مضاد على الجليد في صفيحة جيدا 96 (على سبيل المثال، 50 ميليلتر من الخلايا الهدف و 50 ميليلتر من الأجسام المضادة؛ جرعات مختلفة من الأجسام المضادة يمكن اختبارها).
- في حالة استخدام الأجسام المضادة وحدها كأهداف (العابرة للربط التجارب)، تكون لوحة زمنياً. ولهذا الغرض، أولاً احتضان الأضداد في متوسط كاملة في لوحة 96F ح 1-2 في 37 درجة مئوية و 5% أول أكسيد الكربون2 (جرعة بداية نموذجي 0.5 ميكروغرام من جسم معين في 50 ميكروليتر). أغسل اللوحة إزالة الأجسام المضادة غير منضم.
ملاحظة: في هذه الحالة، لوحة 96F سيمكن ملزمة جسم إلى اللوحة، مما سيؤدي إلى تفعيل مستقبلات transfected بعد إضافة transfected الخلايا البيولوجية.
- إضافة خلايا وزن الجسم (خلايا المستجيب). ضع 50,000 BW الخلايا في بئر واحدة من صفيحة 96 (بحجم 100 ميليلتر).
- إكمال وحدة التخزين في كل بئر على 200 ميليلتر إذا لزم الأمر.
- احتضان اللوحات في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لح 48 (يمكن معايرة هذه الفترة الزمنية).
- إعداد الأهداف. نوع الهدف يختلف كدالة للهدف، ويمكن أن تكون الخلايا، والخلايا التي قد تم مسبقاً المحتضنة مع الأجسام المضادة، أو الأجسام المضادة وحدها. كما يستخدم هذا النظام مع البكتيريا كأهداف5.
- بعد 48 ساعة، تجميد الألواح في-20 درجة مئوية، وذوبان الجليد قبل أليسا، أو استخدامها على الفور لإليزا (انظر الخطوات التالية).
5-أليسا
- معطف صفيحة أليسا مع جسم إيل-2 المضادة ماوس (مكافحة ميل 2). ضع 0.05 ميكروغرام مكافحة ميل-2 في وحدة تخزين 50 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 1 x كل بئر. احتضان لوحة أليسا المغلفة بالأجسام المضادة بعد 2 ميل في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها أو في 37 درجة مئوية ح 2.
ملاحظة: لأداء أليسا مباشرة بعد الخطوة حضانة، لوحة أليسا ينبغي أن تكون مغلفة ح 24 قبل نهاية فترة الحضانة من الخلايا البيولوجية. - تجاهل السائل في لوحة أليسا وإضافة حل حظر (200 ميليلتر للبئر الواحد) الذي يتألف من برنامج تلفزيوني x 1 و 1% ألبومين المصل البقري (BSA). احتضان لوحة أليسا ح 2 في درجة حرارة الغرفة.
- أغسل لوحة أليسا ثلاث مرات مع الحل توين PBS 0.05% (أي 0.5 مل من توين-20 في 1 لتر من برنامج تلفزيوني س 1).
- أن لوحة 96 التي لها وزن الجسم الخلايا التي كانت المحتضنة مع أهدافها (4.3). إذا تم تجميد اللوحة، ذوبان الجليد تماما أنها (مثلاً.، اختصار الحضانة عند 37 درجة مئوية). الطرد المركزي لوحة 96 (5 دقائق، 515 س ز) ونقل 100 ميليلتر من المادة طافية في كل بئر بعناية إلى لوحة أليسا قبل المغلفة والمحظورة.
ملاحظة: ينبغي جمع المادة طافية من الجانبين من كل بئر تجنب أخذ الخلايا. - إذا رغبت في ذلك، إضافة 2 مل المؤتلف مع تركيزات محددة إلى أحد الصفوف الفارغة من لوحة أليسا المغلفة لإنشاء منحنى قياسي لشركة مالونغوشي-2. على سبيل المثال، بدء من تركيز شركة مالونغوشي-2 بيكوغرام/مل 2,500 وثم ينخفض بنسبة 50% في كل بئر اللاحقة؛ لا تقم بإضافة 2 مل إلى آخر أيضا.
- احتضان لوحة أليسا في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها أو في 37 درجة مئوية ح 2.
- أغسل لوحة أليسا أربع مرات مع توين PBS.
- إضافة إيل-2 المضادة الماوس البيوتين إلى لوحة أليسا. استخدام تركيز 1 ميكروغرام جسم في 1 مل من س 1 برنامج تلفزيوني مع جيش صرب البوسنة 1% وتقسم إلى 100 ميليلتر كل بئر.
- احتضان في درجة حرارة الغرفة ح 1.
- أغسل لوحة أليسا ست مرات مع توين PBS.
- إضافة streptavidin HRP مترافق. استخدام تركيز streptavidin 1 ميليلتر في 1 مل PBSX1 مع جيش صرب البوسنة 1% وتقسم إلى 100 ميليلتر كل بئر.
- احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- أغسل لوحة أليسا ست مرات مع توين PBS.
- إضافة 100 ميليلتر كل من حل الركيزة TMB جيدا. إتمام هذه المرحلة بسرعة لتقليل الخلافات بين الآبار بسبب تأخر الوقت عند إضافة TMB.
- قراءة لوحة أليسا مع قارئ لوحة أليسا في 650 نانومتر (القراءة يمكن أن تتكرر في حالة الإشارة ضعيفة).
Representative Results
ويوضح الشكل 3 نتائج التجربة مع نظام مراسل الحرب البيولوجية. في هذه التجربة، كانت الخلايا CLL المحتضنة مسبقاً مع الأجسام المضادة المختلفة-CD20 (rituximab وأوبينوتوزوماب) وثم شارك المحتضنة مع transfected الخلايا البيولوجية التي تعبر عن CD16a-CD3ζ. وأجريت تجارب مماثلة في الدراسة لدينا9. ويعرض الشكل 3 ألف صورة للوحة أليسا الخام حيث يناظر كثافة اللون بتركيز 2 مل. وأجريت التجربة في ثلاث نسخ. وشملت هذه التجربة عدة عناصر تحكم: CLL الخلايا المحتضنة مع خلايا وزن الجسم أونترانسفيكتيد الوالدين (الصف العلوي) وخلايا CLL المحتضنة مع الخلايا البيولوجية التي تعبر عن CD16a-CD3ζ ولكن دون جسم أو جسم تحكم (ستة آبار في الصف الثاني على اليسار) . الحضانة للخلايا البيولوجية التي أعرب عنها CD16 مع الخلايا CLL التي كانت مسبقاً المحتضنة مع الأجسام المضادة-CD20 الناجمين عن إفراز كبير شركة مالونغوشي-2 مقارنة بالمستوى 2 مل من آبار المراقبة. الأهم من ذلك، ما قبل الحضانة للخلايا CLL مع أوبينوتوزوماب CD20 مكافحة المنشط CD16 أكثر بقوة من rituximab، معروف الحقائق التي قد لخص بنظامنا. يظهر الصف الأخير تنازلي تركيزات محددة مسبقاً المؤتلف مل-2 (بدون إضافة الخلايا). ليس لديه ميل-2 كذلك الحق في الصف الأخير ويمثل قراءة الخلفية، التي تبدو مماثلة لمراقبة الآبار. ويعرض الشكل 3 (ب) التحديد الكمي لنتائج لوحة أليسا هو موضح في الشكل 3 ألف. مستويات الكثافة البصرية (OD) تم تحويلها إلى شركة مالونغوشي-2 التركيزات استناداً إلى المنحنى المعياري مع المؤتلف مل-2. ويعرض الشكل 3 تجربة استجابة جرعة حيث كانت قبل المحتضنة مع خلايا CLL جرعات مختلفة من الأجسام المضادة وثم المحتضنة مع خلايا BW معربا عن CD16.
رقم 1: التمثيل التخطيطي للنظام مراسل الحرب البيولوجية- ستابلي هي transfected الخلايا BW5147 مع الجزء خارج الخلية من مستقبلات مختلفة تنصهر إلى مجالات ترانسميمبراني وهيولي الماوس سلسلة CD3ζ (تشيميريك ريكتور-CD3ζ). تفعيل مستقبلات-CD3ζ محددة بما ينتج إفراز mIL-2 التي يمكن الكشف عنها بواسطة أليسا يجند. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: هيكل المستقبلات-CD3ζ تشيميريك، وتصميم كبسولة تفجير [بكر- (A) الهيكل العام لمستقبلات الخلية تنصهر فيها مجالات الماوس CD3ζ ترانسميمبراني وداخل الخلايا. (ب) المجال خارج الخلية للمستقبلات اتسع نطاق مع تمهيدي 3 ' التي شملت أيضا النيوكليوتيدات CD3ζ. (ج) المجالات داخل الخلايا وترانسميمبراني من CD3ζ تم تضخيمه مع تمهيدي 5 ' التي شملت أيضا مستقبلات النيوكليوتيدات. (د) في رد فعل PCR النهائي، استخدمت كلا الجزأين، التي قد تداخل متواليات، كقالب الحمض النووي. في كل اللوحات الشكل، مجالات مختلفة من البروتين هي مرمزة ومحاصر في المستطيلات الزرقاء (سلسلة CD3ζ) والمستطيلات الحمراء (تسلسل مستقبلات). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: رسم توضيحي للمنتج النهائي للنظام مراسل الحرب البيولوجية- (أ، ب، ج) وكانت الزنزانات CLL المحتضنة مسبقاً مع أو بدون الأجسام المضادة-CD20 اثنين (rituximab وأوبينوتوزوماب) أو جسم تحكم. وبعد ذلك كانت المحتضنة خلايا جسم زمنياً مع الوالدين BW الخلايا أو الخلايا البيولوجية التي تعبر عن CD16a-CD3ζ. وكان يحدد مستوى شركة مالونغوشي-2 في المادة طافية أليسا. (أ) صورة لوحة أليسا الخام. كثافة اللون يشير إلى تركيز شركة مالونغوشي-2 في المادة طافية. وأجريت التجربة في ثلاث نسخ. الصف السفلي يبين قراءات أليسا في خفض تركيزات المؤتلف مل-2 التي تم تحليلها في نفس اللوحة. (ب) التحديد الكمي لإليزا القراءة المبين في (أ). حسبت مستويات شركة مالونغوشي-2 استخدام منحنى قياسي لشركة مالونغوشي-2. (ج) ألف جرعة استجابة التجربة حيث كانت قبل المحتضنة مع خلايا CLL جرعات مختلفة من الأجسام المضادة وثم المحتضنة مع خلايا BW معربا عن CD16a-CD3ζ. ، ف < 0.001؛ اختبار t للطالب (ب) أو ANOVA مع مقارنات متعددة (ج). وكان المقارنة فقط في (ج) التي لم تكن تختلف اختلافاً كبيرا rituximab ومراقبة Ab في تركيز الأولى (0.01 ميكروغرام/مل). أشرطة الخطأ يمثل الانحراف المعياري تريبليكاتيس. وأجريت تجارب مماثلة كجزء من واحدة من لدينا الدراسة الأخيرة9. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
نقدم هنا بروتوكولا لإنشاء نظام مراسل للتحقيق في التفاعلات مستقبلات-يجند (انظر شكل مختصر لهذا البروتوكول1). البروتوكول ويتكون من ثلاثة أجزاء رئيسية: استنساخ بروتين تشيميريك، الذي يشمل المجال خارج الخلية لمستقبلات محددة تنصهر فيها المجال داخل الخلايا من CD3ζ، تعداء بلازميد يعبر عن البروتين الانصهار لخلايا وزن الجسم (مثلاً ، من انهانسر)، والكشف عن كمية من الماوس إيل-2 قبل أليسا. وينبغي التحقق من المنتج النهائي لكل من هذه الأجزاء بشكل مستقل: ينبغي التحقق من عملية الاستنساخ بالتسلسل الكامل للبروتين الانصهار في بلازميد الهدف، ينبغي التحقق من تعداء الخلايا البيولوجية عن طريق فحص التعبير عن وينبغي التحقق من مستقبلات للفائدة في الخلايا البيولوجية (مثلاً، بالتدفق الخلوي)، وعملية أليسا الضوابط الإيجابية العامة (مثلاً، المؤتلف مل-2) وكذلك مع الضوابط المحددة للخلايا ترانسفيكتيد الأسلحة البيولوجية؛ أي الأهداف التي تعبر عن يجند معروفة من المستقبلات للفائدة (مثلاً، أن CD48 صريحة يمكن أن تستخدم كعنصر إيجابي للخلايا البيولوجية التي تعبر عن ناغورني كاراباخ في الخلية 2B4 مستقبلات الخلايا). على سبيل المثال، قد تكون عملية استنساخ ناجحة، ولكن البروتين الانصهار لا يعبر عن الخلايا البيولوجية. في هذه الحالة، يجب تكرار انهانسر. وبدلاً من ذلك، إذا لم يكن هناك أي إشارة على مستوى الخلفية لوحة أليسا (خاصة بالنسبة لعناصر التحكم الإيجابي) قد فشل transfected الخلايا البيولوجية للتعبير عن المستقبلات (أو التعبير قد فقدت) أو مشكلة تقنية قد تكون حدثت أثناء عملية أليسا.
يمكن أن تكون تعديلات عدة على هذا البروتوكول مع الحفاظ على المبادئ العامة للإجراءات. وتشمل هذه التعديلات متجه المستخدمة للتعبير عن البروتين الانصهار، طريقة ترانسفيكتينج بلازميد الخلايا البيولوجية ومعلمات محددة تتصل بالحضانة وإليزا مثل نوع الهدف (مثل الخلايا، والأجسام المضادة، إلخ) ، عدد من الخلايا المستهدفة أو تركيز الأجسام المضادة إذا ذات الصلة (ونحن نستخدم خلايا 50,000 كل جسم ابتداء من جرعة مقدارها 0.5 ميكروغرام/جيدا وكذلك)، وقت الحضانة (ونحن نستخدم فترة حضانة 48 ساعة) وطاف وحدة التخزين التي يتم نقلها إلى لوحة أليسا.
هذا الأسلوب حساسة، محددة ويمكن قياسها كمياً بسهولة. أنها مثالية للفحص لوجود يغاندس لمستقبلات محددة (خاصة إذا لم يعترف يجند نفسه). بعد إعداد transfected الخلايا البيولوجية التي تعبر عن مستقبلات محددة، يمكن تجميد هذه الخلايا وتستخدم عند الحاجة للمزيد من التجارب. نحن وآخرون قد استخدمت هذا النظام بنجاح في الدراسات السابقة لاستكشاف التفاعلات مستقبلات-يجند (على سبيل المثال2،،من35،،من1213،14 ،،من1516)، وقد تم التحقق من النتائج التي توصلت إليها هذا النظام بأساليب أخرى. يمكن أيضا استخدام هذا الأسلوب لدراسة تفعيل مستقبلات FcγR البشرية المختلفة من الأجسام المضادة، كما حدث لأجسام مضادة الفيروس في مصل الدم6،،من78 أو مع الأجسام المضادة ضد CD20 9.
أن هذا هو نظام مراسل الذي أعرب فيه عن الجزء خارج الخلية فقط للمستقبلات، النتائج التي تم الحصول عليها من هذا النظام ينبغي أن تستكمل بالمزيد من التجارب مع مستقبلات الذاتية، مثل فحوصات سيتوتوكسيسيتي مع الطبيعية الخلايا القاتلة (NK) لدراسة التفاعلات مع ناغورني كاراباخ الخلايا مستقبلات. وعلاوة على ذلك، بعض التفاعلات يجند/مستقبلات لا ينتج في إفراز mIL-2 منظومة مراسل، ولذلك قد أغفلت. وباﻹضافة إلى ذلك، كما هو الحال في أي برنامج الإعداد التجريبية، النتائج وينبغي التحقق من معلمات مختلفة كما هو موضح أعلاه. وهذا مهم بشكل خاص في الحالات التي يكون فيها مقارنة بين اثنين الشروط المطلوبة (مثلاً، تفعيل مستقبلات Fc نفسه من الأجسام المضادة المختلفة). من المهم أيضا التحقق من أن حساسية تفاعل مستقبلات يجند محددة داخل نطاق النظام الخطي. وإلا قد يؤدي ذلك إلى قيم التشبع الذي قد يحول دون إجراء مقارنة صحيحة عبر الشروط. يمكن تحقيق ذلك باستخدام منحنى قياسي 2 مل وكذلك عن طريق توليد منحنى استجابة لجرعة مع يجند مختبرة (في حالة تشبع القيم، التجريبية ينبغي أن يتم تعديل المعلمات؛ مثلاً، حجم أصغر من المادة طافية ينبغي تحليله بإليزا). آخر إمكانية الحد من هذا النظام هو استخدام الخلايا المستهدفة مع الإفرازات الذاتية لشركة مالونغوشي-2 (مثلاً، خلايا الفأر T) التي يمكن أن يخفيها إفراز الخلايا BW إيل-2. للتغلب على هذه الأحداث عادية جداً التي تقتصر على خلايا الماوس، يمكن تحسين هذا النظام المراسل باستخدام مراسل مختلفة (مثلاً، التجارة والنقل) التي لا يعبر عنها بواسطة الخلايا الهدف.
Disclosures
الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون المغنية إستر لتحرير اللغة. هذه الدراسة وأيده "مجلس البحوث الأوروبية" ضمن "البرنامج الإطاري السابع" للاتحاد الأوروبي (FP/2007-2013)/"منسق المنحة" رقم 320473-باكنك. وقدم المزيد من الدعم البرنامج "لجنة الميزنة" والتخطيط و "مؤسسة العلوم إسرائيل" أنا--الأساسية، وأنا-الأساسية في الكروماتين، والجيش الملكي النيبالي في تنظيم الجينات، ومؤسسة GIF، مؤسسة الأسرة لويس، منحة الأستاذية إيكرف، منح إسرائيل هلمهولتز والثقة روسيتريس (وجميعها إلى أ). وأيد هذه الدراسة أيضا "مؤسسة العلوم إسرائيل" (منحة 502/15)، "جائزة كأس للبحوث الطبية" ومنحة بحثية من المجتمع الإسرائيلي من أمراض الدم وطب نقل الدم (إلى S.E). O.M أستاذ "علم المناعة الجزيئية" تاج.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AccuPrep, Plasmid Mini Extraction Kit | Bioneer | K-3030 | |
| Anti-mouse IL-2 | BioLegend | 503702 | |
| Biotin anti-mouse IL-2 | BioLegend | 503804 | |
| ELISA plates | De-groot | 60-655061 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F7524-500ml | |
| G418 | Mercury | MBS3458105GM | |
| Gene Pulser II | Bio-Rad | 165-2105, 165-2106, 165-2107, 165-2108, 165-2109, 165-2110 | |
| L-Glutamine | Biological industry | 03-020-1B | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Biological industry | 01-340-1B | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biological industry | 03-031-1B | |
| peroxidase streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-030-084 | |
| PureLink HiPure Plasmid Filter Maxiprep Kit | ThermoFisher Scientific | K210016 | |
| RPMI-1640 Medium | Biological industry | 30-2001 | |
| Sodium Pyruvate | Biological industry | 03-042-1B | |
| TMB | SouthernBiothech | 0410-01 |
References
- Mandelboim, O., Lankry, D., Gazit, R. Natural Killer Cell Protocols. , Second edn, Humana Press. 258-262 (2010).
- Mandelboim, O., et al. Recognition of haemagglutinins on virus-infected cells by NKp46 activates lysis by human NK cells. Nature. 409 (6823), 1055-1060 (2001).
- Stanietsky, N., et al. The interaction of TIGIT with PVR and PVRL2 inhibits human NK cell cytotoxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17858-17863 (2009).
- Stanietsky, N., et al. Mouse TIGIT inhibits NK-cell cytotoxicity upon interaction with PVR. European Journal of Immunology. , (2013).
- Gur, C., et al. Binding of the Fap2 protein of Fusobacterium nucleatum to human inhibitory receptor TIGIT protects tumors from immune cell attack. Immunity. 42 (2), 344-355 (2015).
- Corrales-Aguilar, E., et al. A novel assay for detecting virus-specific antibodies triggering activation of Fcgamma receptors. Journal of Immunoogical Methods. 387 (1-2), 21-35 (2013).
- Corrales-Aguilar, E., et al. Highly individual patterns of virus-immune IgG effector responses in humans. Medical Microbiology and Immunology. 205 (5), 409-424 (2016).
- Radinsky, O., et al. Sudan ebolavirus long recovered survivors produce GP-specific Abs that are of the IgG1 subclass and preferentially bind FcgammaRI. Scientific Reports. 7 (1), 6054 (2017).
- Elias, S., Kahlon, S., Kotzur, R., Kaynan, N., Mandelboim, O. Obinutuzumab activates FcgammaRI more potently than other anti-CD20 antibodies in chronic lymphocytic leukemia (CLL). Oncoimmunology. 7 (6), e1428158 (2018).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), 253 (2007).
- Bar-On, Y., et al. NKp46 Recognizes the Sigma1 Protein of Reovirus: Implications for Reovirus-Based Cancer Therapy. Journal of Virology. 91 (19), (2017).
- Glasner, A., et al. Expression, Function, and Molecular Properties of the Killer Receptor Ncr1-Noe. Journal of Immunology. 195 (8), 3959-3969 (2015).
- Glatzer, T., et al. RORgammat(+) innate lymphoid cells acquire a proinflammatory program upon engagement of the activating receptor NKp44. Immunity. 38 (6), 1223-1235 (2013).
- Gur, C., et al. The activating receptor NKp46 is essential for the development of type 1 diabetes. Nature Immunology. 11 (2), 121-128 (2010).
- Markel, G., et al. Pivotal role of CEACAM1 protein in the inhibition of activated decidual lymphocyte functions. Journal of Clinical Investigation. 110 (7), 943-953 (2002).
