Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Ett BW Reporter System för att studera Receptor-Ligand interaktioner

doi: 10.3791/58685 Published: January 7, 2019

Summary

Det här protokollet beskriver hur du upprättar en reporter system som kan användas för att identifiera och kvantifiera receptor-ligand interaktioner.

Abstract

Interaktioner mellan receptorer och ligander utgör en grundläggande biologisk process. Dock direkt experiment med celler som uttrycker den infödda receptorn och liganden är utmanande eftersom liganden av en specifik receptor kan vara okända och experimentella rutiner med infödda liganden kan vara tekniskt komplicerat. För att lösa dessa hinder, beskriver vi en reporter systemet för att upptäcka den bindning och aktivering av en specifik receptor av en ligand av intresse. I denna reporter systemet, det extracellulära området av en specifik receptor är konjugerat med musen CD3ζ och denna chimär proteinet uttrycks sedan i mus BW celler. Dessa transfekterade BW-celler kan sedan inkuberas med olika mål (t.ex., celler eller antikroppar). Aktivering av en transfekterade receptor leder till utsöndring av mus interleukin-2 (mIL-2) vilket kan upptäckas genom enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Denna reporter systemet har fördelarna med att vara känsliga och specifika till en enda receptor. Dessutom nivån aktiveringen av en specifik receptor kan enkelt kvantifieras och kan användas även i fall då liganden av receptorn är okänd. Detta system har genomförts framgångsrikt i många av våra studier att karakterisera receptor-ligand interaktioner. Vi har nyligen anställt detta system att studera aktivering av mänskliga Fcγ-receptorer (FcγRs) av olika monoklonala anti-CD20-antikroppar vid klinisk användning.

Introduction

BW reporter systemet är en teknik för att studera receptor-ligand interaktioner1. Detta system är speciellt fördelaktigt när liganden av en specifik receptor är okänd eller experiment med endogena liganden är tekniskt svårt. Det kan också användas för att studera bindningen av monoklonala antikroppar mot mänskliga FcγRs. Metoden bygger på att uttrycka en chimär protein i mus BW celler. Detta chimära protein består av det extracellulära området av receptorn sevärdheter smält till de transmembrana och intracellulära domänerna i kedjan mus ζ. Bindning av lämpliga ligander av receptorn leder till utsöndring av mus IL-2, som enkelt kan upptäckas av ELISA, som illustreras i figur 1. Denna metod är känsliga och specifika för en enskild receptorn, lätt att använda, och mycket reproducerbara. Det kan således komplettera ytterligare verktyg för att studera receptor-ligand interaktioner. Till exempel, kan det användas till skärmen flera cellinjer för förekomsten av en ligand för en specifik receptor (även om liganden själv inte har identifierats) eller till upptäcka aktiveringen av mänskliga FcγRs av monoklonala antikroppar eller humant serum som innehåller anti-virala antikroppar. Även primära immunceller express endogena FcγRs, är de generellt svåra att hantera och oftast uttrycka flera Fc receptorer.

Vi har använt detta system framgångsrikt i många av våra studier för att karakterisera receptor-ligand interaktioner. Dessa inkluderar att identifiera hemagglutinin som liganden av NK cell receptorn NKp462, identifiera PVR och nectin-2 som ligander för mänskliga och mus TIGIT3,4, och visar att den fusobacterium nucleatum bakterien binder och aktiverar mänskliga TIGIT5. BW-celler som uttrycker Fc receptorer har dessutom använts framgångsrikt att upptäcka antivirala antikroppar i patienternas sera6,7,8. Specifikt, etablerade vi nyligen BW celler som uttrycker människors FcγRs för att upptäcka differentiell FcR aktivering av anti-CD20-antikroppar som används för behandling av kronisk lymfatisk leukemi (KLL)9. Ännu viktigare, har resultaten av BW reporter systemet validerats i kompletterande experiment.

Protocol

1. generering av en Plasmid som uttrycker den chimära konstruera

Obs: Syftet är att generera en plasmid som uttrycker det extracellulära området av receptorn sevärdheter smält till de transmembrana och intracellulära domänerna av musen CD3ζ kedja (figur 2A).

  1. Hämta sekvensen av det extracellulära området av receptorn sevärdheter inklusive signal peptiden. Få DNA material som förväntas att uttrycka denna receptor (t.ex. cDNA eller en plasmid).
  2. Få DNA material som uttrycker de transmembrana och intracellulära domänerna av musen CD3ζ kedja (t.ex., cDNA eller en plasmid).
  3. Designa sekvensen av fusionsprotein baserat på den allmänna struktur visas i figur 2A. Kontrollera att hela sekvensen är inom samma kodon läsning ram. Denna sekvens används för att utforma lämpliga grundfärger och kontrollera den slutliga produkten.
  4. Utforma två PCR reaktioner att förstärka varje fragment av fusionsproteinerna separat (figur 2B, 2 C)10.
    Obs: Särskilda villkor för PCR-reaktioner (t.ex., töjning tid och glödgning temperatur) beror på vilken typ av primers, utformade för en specifik receptor.
    1. Förstärka den extracellulära delen av receptorn.
      1. Designa en 5'-primer som innehåller en del av signalen peptiden receptorn, en Kozak samförstånd sekvens och en lämplig begränsning webbplats (figur 2B).
      2. Designa en 3'-primer som flanker båda delarna av proteinet fusion (figur 2B). Exempelvis för den ursprungliga designen kan denna primer på 3' innehålla 20 senaste basparen extracellulära segmentet av receptorn och de första 9 baspar i CD3ζ segment.
        Obs: Det finns ingen anledning att lägga till en begränsning webbplats 3' primer sedan denna primer används för att generera smält sekvensen, och används inte för ligering.
    2. Förstärka segmentet CD3ζ.
      1. Designa en 5'-primer som flanker båda delarna av proteinet fusion (figur 2 c). Till exempel för den ursprungliga designen kan 5' primer inkludera senast 9 basparen extracellulära segmentet av receptorn och 20 första basparen för segmentet CD3ζ.
        Obs: Det finns ingen anledning att lägga till en begränsning webbplats 5' primer sedan denna primer används för att generera smält sekvensen, och används inte för ligering.
      2. Designa en 3'-primer som innehåller i slutet av sekvensen CD3ζ samt en lämplig begränsning webbplats (figur 2 c).
    3. Korrigera de primer sekvenserna i varje av dessa två reaktioner så att glödgning temperaturen är liknande i varje par (Observera att primern, som innehåller sekvenser av de två delarna av proteinet fusion, endast anneals med del av sekvensen i varje reaktion).
  5. Utföra en ytterligare PCR där en blandning av PCR produkter från de två första reaktionerna används som en DNA mall med 5' primer för segmentet extracellulära receptor (steg 1.4.1.1) och 3na ' för segmentet CD3ζ (steg 1.4.2.2) (figur 2D),10 . Denna reaktion bör generera den slutliga smält sekvensen.
  6. Fortsätt som vanligt för kloning.
    1. Ligera PCR slutprodukten till målet skär vektor (mål vektorn är oftast pcDNA3 som uttrycker G418 och ampicillin-resistens).
    2. Omvandla ligated vektorn till behöriga bakterier11.
      1. Tina 50 µL av de behöriga bakterierna på is.
      2. Tillsätt ligated vektorn för bakterierna och inkubera på is i 20 min.
      3. Inkubera vid 42 ° C för 45 s.
      4. Tillsätt 200 µL av LB utan antibiotika.
      5. Inkubera i 1 timme vid 37 ° C under ständig skakning.
      6. Utsäde på en LB tallrik med lämpliga antibiotika (t.ex., ampicillin lösning med en slutlig koncentration på 0,1 mg/mL).
    3. Samla och odla flera bakteriekolonier i 5 mL LB (i 15 mL rör).
    4. Nästa dag, extrahera plasmider med en mini prep kit.
    5. Analysera gen insatsen med restriktionsenzym.
    6. Sekvensera de relevanta kolonierna och kontrollera att sekvensen och läsning ramen är korrekta (som anges i steg 1.3).
  7. Omvandla verifierade plasmiden till behöriga bakterier11.
    1. Tina 20 µL av behöriga bakterier på is.
    2. Tillsätt 1 µL av Plasmiden till bakterierna och inkubera på is i 20 min.
    3. Inkubera vid 42 ° C för 45 s.
    4. Tillsätt 200 µL av LB utan antibiotika.
    5. Inkubera i 1 timme vid 37 ° C under ständig skakning.
    6. Utsäde på en bakteriell tillväxt tallrik med lämpliga antibiotika (t.ex., ampicillin lösning med en slutlig koncentration på 0,1 mg/mL).
  8. Nästa dag, växer en bakteriell koloni i en stor LB behållare med 0,1 mg/mL ampicillin (~ 250 mL).
  9. Nästa dag, utföra maxi prep enligt särskilda instruktioner som tillhandahålls av satsen.
    Obs: På elektroporation förfarandet, en stor mängd plasmid krävs, enligt nedan.

2. transfection av plasmiden som uttrycker proteinet chimär i BW celler

Obs: Olika metoder kan också användas för transfection (t.ex., av lentiviral infektion). Före elektroporation, utföra etanol utfällning av DNA som beskrivs nedan. Nästa steg kräver sterila förhållanden.

  1. Dagen innan, förbereda BW5147 celler (”BW celler”) för elektroporation. Platta 10 plattor (av 10 cm) med 10 mL 100.000 BW5147 celler/mL (dvs. totalt 10 x 106 celler) med RPMI kompletteras med 10% fetalt kalvserum (FCS), 1% natrium pyruvat, 1% L-glutamin, 1% icke-essentiella aminosyror och 1% penicillin-streptomycin (”komplett medium”).
  2. Placera 100 µg pcDNA3 plasmiden som uttrycker proteinet fusion i en 1,5-2 mL tub och tillsätt 3 M natriumacetat vid pH 5,3-5,5 till den. Volymen av natriumacetat bör motsvara 0,1 (10%) av volymen av 100 µg plasmiden; titrera natriumacetat pH med pH-mätare genom tillsats av NaOH eller HCl.
  3. Lägga till 2,5 volymer av 100% etanol i blandningen av Plasmiden och natriumacetat som beskrivs i steg 2,2 (2,5 x den totala volymen av plasmid och natrium acetat). Inkubera över natten vid-20 ° C eller för 2 h vid 70 ° C.
  4. 2.4. 24 h efter BW cellerna har varit klädd, samla alla BW celler (~ 100 mL) i 2 50 mL rör. Centrifugera cellerna för 5 min vid 515 x g och kasta bort supernatanten.
  5. Resuspendera pelleten från båda rören i 25 mL RPMI - i en enda 50 mL tub. Till exempel resuspendera pelleten i tuben med 25 mL av RPMI - och sedan använda denna vätska för återsuspendering vätskan i andra 50 mL röret så att den totala pelleten från BW cellerna är åter upphängd i 25 mL medium i ett enda rör.
    Obs: Medium bör vara utan tillägg, eftersom serumet kan störa elektroporation.
  6. Centrifugera cellerna igen för 5 min vid 515 x g. Resuspendera pelleten i 1 mL RPMI och överför innehållet till en 0,4 cm kyvetten på is.
  7. Centrifugera plasmiden som genomgick etanol nederbörd (steg 2,3) under 30 minuter vid 16 000 x g och 4 ° C.
  8. Tvätta en gång med 1 mL 70% etanol och Centrifugera i en annan 20 min på 16 000 x g och 4 ° C (att tvätta ur saltet).
  9. Ta bort alla etanol och låt pelleten torka något (dvs. i ett öppet rör i vävnadsodling huven). Resuspendera pelleten med 100 µL av RPMI-tidigare värmas till 60 ° C.
  10. Lägg åter svävande plasmiden (steg 2,8) till cellerna i kyvetten och inkubera i 5 min på is.
  11. Electroporate cellerna på 0,23 kV, 250 capacitation. Detta bör ta ~ 4 ms.
  12. Överföra de electroporated cellerna till en 50 mL tub, tillsätt 50 mL komplett medium och Centrifugera under 5 minuter i 515 x g.
  13. Avlägsna supernatanten och Slamma upp cellerna med 50 mL av komplett medium.
  14. Tallrik electroporated cellerna i 24-väl kultur rätter (1 mL per brunn, för sammanlagt ~ 50 brunnar) och inkubera vid 37 ° C och 5% CO2 för 48 h.
  15. Välj de transfekterade cellerna med antibiotika. Efter 48 h tillsätt 1 mL av komplett medium kompletteras med 10 mg/mL G418 till varje brunn (i detta skede den avslutande volymen i varje brunn är 2 mL och G418 slutliga koncentration i varje är väl 5 mg/mL).
    Obs: Om plasmiden innehåller en annan antibiotikaresistens, bestämma den antibiotiska koncentrationen som krävs för att döda untransfected BW cellerna innan detta steg.
  16. Varje 48 h, noggrant kasta 1 mL av den övre volymen av varje brunn utan omrörning mediet i brunnen (BW cellerna tenderar att vara på botten av brunnen). Lägg till komplett medium kompletteras med 5 mg/mL G418 i varje brunn, så att den avslutande volymen i varje brunn är igen 2 mL.
  17. Undersöka de kultur plattorna för celltillväxt i alla brunnar regelbundet.
    Obs: En förändring i färgen på medellång till gul kan hjälpa identifiera växande celler; dock i början och medlet blir gul på grund av G418 själv. Identifiera positiva brunnar (brunnar med växande celler). Dessa brunnar är G418 resistenta och därför förväntas express proteinet fusion. Denna process tar vanligtvis ~ 3 veckor.

3. kontroll av uttrycket av de transfekterade receptorn celler i de positiva brunnarna.

  1. Fläcken BW transfekterade cellerna med en specifik antikropp mot receptorn som var transfekterade.
  2. Jämför uttrycket nivån av receptorn av flödescytometri för kontroll cellerna (untransfected BW celler) uttryck.
  3. Efter kontroll av en eller flera brunnar, använda celler direkt i experimentsyfte, växa i kultur eller frysa för framtida tillämpningar.
  4. Verifiera uttrycket av transfekterade receptorn innan du utför ett nytt experiment. Efter några veckors tillväxt, cellerna med G418 med en stabil receptoruttryck, kan G418 utelämnas från odlingssubstratet.

4. inkubation av transfekterade BW cellerna med mål

Obs: När du använder transfekterade BW cellerna för första gången, det är bättre att testa dem på mål som uttrycker en känd ligand av receptorn sevärdheter eller på plattan-bundna antikroppar specifikt riktade mot receptorn sevärdheter (cross-linking experiment; Se nedan avsnitt 4.2.1.3).

  1. Helst, split BW cellerna 24 h innan experimentet (t.ex. genom att tillsätta 10 mL komplett medium till 2 mL av celler i kultur i en ny 10 cm kultur plattan).
  2. Inkubera BW transfekterade cellerna med sina mål. Utför experimentet samtidigt på kontroll BW celler som uttrycker en tom vektor (eller föräldrarnas BW celler). 96f plattorna är att föredra (men 96U plattor kan också användas). Utför experimentet i tre exemplar. Upphäva alla celler i det kompletta mediet.
    1. Förbereda målen. Vilken typ av mål varierar som en funktion av målet, och kan vara celler, celler som har funnits före inkuberas med antikroppar eller antikroppar ensam. Detta system har också använts med bakterier som mål5.
      1. Om målen delande celler (dvs cellinjer), bestråla dem på 6.000 rad före analysen. Plats 50 000 av målceller i en enda väl 96 platta (i en volym av 100 µL).
      2. För experiment med antikroppar och BW celler som uttrycker människans FcγRs, inkubera målceller med en antikropp på isen i en 96 väl platta (till exempel, 50 µL av målceller och 50 µL av antikropp; olika antikroppar doser kan testas).
      3. Om du använder antikroppar ensam som mål (cross-linking experiment), bör de plattan-bundna. För detta ändamål, först Inkubera antikroppar i ett komplett medium i en 96F tallrik för 1-2 h vid 37 ° C och 5% CO2 (en typisk startdos är 0,5 μg av en specifik antikropp i 50 μL). Tvätta plattan för att avlägsna obunden antikroppar.
        Obs: I det här fallet en 96F plattan kommer att aktivera bindning av antikroppen till plattan, som efter tillsats av BW transfekterade cellerna kommer att leda till aktivering av transfekterade receptorn.
    2. Lägg till BW cellerna (effektor celler). Placera 50.000 BW celler i en enda väl 96 platta (i en volym av 100 µL).
    3. Komplett volymen i varje brunn för att 200 µL vid behov.
    4. Inkubera plattorna vid 37 ° C och 5% CO2 för 48 h (denna tidsperiod kan kalibreras).
  3. Efter 48 h, frysa plattorna vid-20 ° C och Tina före ELISA, eller använda omedelbart för ELISA (se nästa steg).

5. ELISA

  1. Coat en ELISA-platta med en IL-2 antimus-antikropp (anti-mIL-2). Placera 0,05 µg för anti-mIL-2 i en volym på 50 µL 1 x PBS per brunn. Inkubera belagda ELISA-plattan med anti-mIL-2 antikroppen vid 4 ° C över natten eller vid 37 ° C i 2 h.
    Obs: För att utföra ELISA direkt efter inkubation steget, ELISA-plattan bör vara belagd 24 h före utgången av inkubationstiden för BW cellerna.
  2. Kassera vätskan i ELISA-plattan och tillsätt en blockerande lösning (200 µL per brunn) som består av 1 x PBS och 1% bovint serumalbumin (BSA). Inkubera i ELISA-plattan för 2 h i rumstemperatur.
  3. Tvätta ELISA-plattan tre gånger med 0,05% PBS Tween lösning (dvs 0,5 mL av Tween-20 i 1 liter 1 x PBS).
  4. Ta den 96 plattan som har BW cellerna som inkuberades med sina mål (4.3). Om plattan var frusen, helt Tina den (t.ex. genom kort inkubation vid 37 ° C). Centrifugera 96 plattan (5 min, 515 x g) och noggrant överföra 100 μl av supernatanten i varje brunn till pre bestruket och blockerade ELISA-plattan.
    Obs: Supernatanten bör samlas in från sidorna av varje brunn för att undvika att ta cellerna.
  5. Om så önskas, tillsätt rekombinant mIL-2 med definierade koncentrationer till en av de tomma raderna i belagda ELISA-plattan att generera en standardkurva av mIL-2. Exempelvis börjar från en mIL-2 koncentration av 2 500 pg/mL och sedan minska med 50% i varje efterföljande väl; Lägg inte till mIL-2 till sista väl.
  6. Inkubera i ELISA-plattan vid 4 ° C över natten eller vid 37 ° C i 2 h.
  7. Tvätta fyra gånger med PBS-Tween ELISA-plattan.
  8. Lägg till biotin antimus IL-2 i ELISA-plattan. Använd en koncentration av 1 µg antikropp i 1 mL 1 x PBS med 1% BSA och dela i 100 µL per brunn.
  9. Odla i rumstemperatur för 1 h.
  10. Tvätta ELISA-plattan sex gånger med PBS-Tween.
  11. Lägg till HRP konjugerat streptividin. Använd en koncentration av 1 µL streptividin i 1 mL PBSX1 med 1% BSA och dela upp det i 100 µL per brunn.
  12. Odla i rumstemperatur i 30 min.
  13. Tvätta ELISA-plattan sex gånger med PBS-Tween.
  14. Tillsätt 100 µL per brunn av TMB-substratlösningen. Slutföra detta steg snabbt för att minimera skillnaderna mellan brunnarna på grund av fördröjningar när du lägger till TMB.
  15. Läs ELISA-plattan med en ELISA-spektrofotometer vid 650 nm (behandlingen kan upprepas om signalen är svag).

Representative Results

Figur 3 illustrerar resultatet av ett experiment med en BW reporter systemet. I detta experiment, var KLL celler pre inkuberas med olika anti-CD20-antikroppar (rituximab och obinutuzumab) och sedan Co inkuberas med transfekterade BW-celler som uttrycker CD16a-CD3ζ. Liknande experiment genomfördes i vår studie9. Figur 3A presenterar en bild av en rå ELISA-plattan där färgens intensitet motsvarar en koncentration av mIL-2. Experimentet utfördes i tre exemplar. Detta experiment ingår flera kontroller: KLL cellerna inkuberas med föräldrarnas untransfected BW (övre raden) och KLL celler inkuberas med BW-celler som uttrycker CD16a-CD3ζ men utan en antikropp eller en kontroll antikropp (sex brunnarna i andra raden till vänster) . Inkubering av BW celler som uttryckte CD16 med KLL-celler som inkuberades pre med anti-CD20-antikroppar inducerade en betydande utsöndring av mIL-2 jämfört med mIL-2 nivån av kontrollbrunnarna. Allt aktiveras före inkubering av KLL cellerna med den anti-CD20 obinutuzumab CD16 starkare än rituximab, en känd att hitta som var återgetts av vårt system. Den sista raden visar fallande fördefinierade koncentrationer av rekombinant mIL-2 (utan tillsats av celler). Rätt väl i den sista raden har inte mIL-2 och representerar den bakgrund behandlingen som visas liknar kontrollbrunnarna. Figur 3B presenterar kvantifiering av resultaten av ELISA-plattan visas i figur 3A. Optisk densitet (OD) nivåerna omvandlades till mIL-2 koncentrationer baserad på standardkurvan med rekombinant mIL-2. Figur 3 c presenterar en dos svar experiment där olika doser av antikroppar var pre inkuberas med KLL-celler och sedan inkuberas med BW-celler som uttrycker CD16.

Figure 1
Figur 1: Schematisk bild av BW reporter systemet. BW5147 celler är stabilt transfekterade med den extracellulära delen av olika receptorer smält transmembrana och cytoplasmiska områden av musen CD3ζ kedja (chimära recptor-CD3ζ). Aktivering av en specifik receptor-CD3ζ av en ligand resulterar i en utsöndring av mIL-2 vilket kan upptäckas genom ELISA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: strukturera av den chimära receptor-CD3ζ och utformningen av PCR primers. (A) allmänna struktur av en extracellulär receptorn smält till de transmembrana och intracellulära domänerna av mus CD3ζ. (B) det extracellulära området av receptorn förstärktes med en 3'-primer som också omfattade nukleotider av CD3ζ. (C) de intracellulära och transmembrana domänerna i CD3ζ var förstärkt med en 5'-primer som också inkluderade receptor nukleotider. (D) i den slutliga PCR-reaktionen användes båda segmenterar, som har överlappande sekvenser, som DNA-mall. I alla figur paneler, är olika protein domäner färgkodade och förpackade i blå rektanglar (CD3ζ sekvens) och röda rektanglar (sekvensen receptor). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Illustration av den slutliga produkten av BW reporter systemet. (A, B, C) KLL-celler var pre ruvade med eller utan två anti-CD20-antikroppar (rituximab och obinutuzumab) eller en kontroll antikropp. Efteråt, antikropp-bundna cellerna inkuberades med föräldrarnas BW celler eller BW celler som uttrycker CD16a-CD3ζ. Nivån på mIL-2 i supernatanten bestämdes av ELISA. (A) en bild av en rå ELISA-plattan. Färgintensitet indikerar koncentrationen av mIL-2 i supernatanten. Experimentet utfördes i tre exemplar. Den nedre raden visar ELISA utslaget i minskande koncentrationer av rekombinant mIL-2 som analyserades i samma platta. (B) kvantifiering av ELISA läsning visas i (A). MIL-2 nivåer beräknades med hjälp en standardkurva av mil-2. C en dos svar experiment där olika doser av antikroppar var pre inkuberas med KLL-celler och sedan inkuberas med BW-celler som uttrycker CD16a-CD3ζ. , P < 0,001; Student's t -test (B) eller ANOVA med multipla jämförelser (C). Den enda jämförelse i (C) som inte var signifikant olika var för rituximab och kontrollen Ab i den första koncentrationen (0.01 µg/mL). Felstaplar representera standardavvikelsen för exemplar. Liknande experiment genomfördes som en del av en av våra senaste studie9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Här presenterar vi ett protokoll för att generera en reporter systemet för att undersöka receptor-ligand interaktioner (se en förkortad form av detta protokoll i1). Protokollet består av tre huvuddelar: kloning av en chimär protein, som innehåller det extracellulära området av en specifik receptor smält CD3ζ, transfection av en plasmid som uttrycker proteinet fusion till BW celler intracellulära domän (t.ex. , av elektroporation), och kvantitativa upptäckt av mus IL-2 med ELISA. Den slutliga produkten av varje av dessa delar bör kontrolleras oberoende av varandra: kloning processen bör kontrolleras av komplett sekvensering av proteinet fusion i målet plasmiden, transfection BW celler bör verifieras genom att undersöka uttrycket av den receptorn sevärdheter i BW cellerna (t.ex., av flödescytometri) och ELISA processen bör kontrolleras av allmänna positiva kontroller (t.ex., rekombinant mIL-2) samt med särskilda kontroller för BW transfekterade cellerna; d.v.s. mål som uttrycker en känd ligand av receptorn av intresse (t.ex., celler att uttryckliga CD48 kan användas som en positiv kontroll för BW celler som uttrycker NK cell receptor 2B4). Till exempel kloning processen kan vara framgångsrika, men fusion proteinet uttrycks inte av BW celler. I det här fallet bör elektroporation upprepas. Alternativt, om ingen signal över bakgrundsnivån i ELISA-plattan (särskilt för de positiva kontrollerna) BW transfekterade cellerna kan ha misslyckats att uttrycka receptorn (eller uttrycket har gått förlorad) eller ett tekniskt problem kan ha uppstått under ELISA processen.

Flera ändringar kan göras till detta protokoll samtidigt som de allmänna principerna i förfarandet. Dessa ändringar inkluderar den vektor som används för att uttrycka proteinet fusion, metoden för transfecting plasmiden BW celler och specifika parametrar relaterade till inkubation och ELISA såsom typ av mål (t.ex. celler, antikroppar, etc.) , antal målceller eller antikroppkoncentrationen om relevanta (vi använder 50.000 celler per brunn och en antikropp startdosen av 0,5 µg per brunn), inkubationstiden (vi använda en inkubationstid av 48 h) och volymen supernatant som överförs till ELISA-plattan.

Denna metod är känslig, specifika och enkelt kan kvantifieras. Den är idealisk för screening för förekomst av ligander för specifika receptorer (särskilt om liganden själv inte har erkänts). Efter beredning transfekterade BW-celler som uttrycker en specifik receptor, kan dessa celler frysas och användas när det behövs för ytterligare experiment. Vi och andra har använt detta system framgångsrikt i tidigare studier för att utforska receptor-ligand interaktioner (till exempel2,3,5,12,13,14 15,16) och resultaten av detta system har verifierats av andra tekniker. Denna metod kan också användas för att studera aktivering av olika mänskliga FcγR receptorer av antikroppar, som har gjorts för antivirala antikroppar i serum6,7,8 eller med monoklonala antikroppar mot CD20 9.

Eftersom detta är en reporter systemet där endast det extracellulära segmentet av receptorn uttrycks, bör resultaten erhållits genom detta system kompletteras med ytterligare experiment med endogena receptorn, såsom cytotoxicitet analyser med naturlig mördarceller (NK) att studera interaktioner med NK cell receptorer. Dessutom vissa ligand/receptor interaktioner kan inte resultera i en mIL-2 sekretion av reporter systemet, och därför kan förbises. Liksom alla experimentella setup, bör dessutom resultaten verifieras för olika parametrar som beskrivs ovan. Detta är särskilt viktigt i de fall en jämförelse av två villkor är nödvändiga (t.ex., aktivering av samma Fc receptor av olika antikroppar). Det är också viktigt att kontrollera att känsligheten hos en specifik ligand-receptor interaktionen är inom linjär spänna av systemet. Detta kan annars leda till mättnadsvärden vilket utesluter en giltig jämförelse över villkoren. Detta kan uppnås genom att använda en mIL-2 standardkurva samt genom att skapa en dos-respons kurva med testade liganden (när det gäller mättar värden, de experimentella parametrarna bör ändras. t.ex., en mindre volym av supernatanten bör analyseras med ELISA). En annan möjlig begränsning av detta system är användning av målceller med endogena sekret av mIL-2 (t.ex., mus T celler) som skulle dölja de IL-2 sekretionen av BW celler. För att övervinna dessa mycket ovanliga händelser som är begränsade till mus celler, kan reporter systemet förbättras genom att använda en annan reporter (t.ex., GFP) som inte uttrycks av målceller.

Disclosures

Författarna förklarar inget konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Esther Singer för språkgranskning. Denna studie stöddes av Europeiska forskningsrådet under EU: s sjunde ramprogram (FP/2007-2013) / ERC bidragsavtalet nummer 320473-BacNK. Ytterligare stöd tillhandahölls av jag-kärnan Program planering och budgetering kommittén och stiftelsen Israel vetenskap och jag-kärnan på kromatin och RNA i genreglering, Stiftelsen GIF, Stiftelsen familjen Lewis, föreståndare professur bidraget, det Helmholtz Israel grant och Rosetrees förtroende (alla O.M.). Denna studie stöddes också av Israel Science Foundation (grant 502/15), utmärkelsen Kass medicinsk forskning och ett forskningsanslag från Israel samhället för hematologi och transfusionsmedicin (till Birgitta). Olsson är Crown professor i molekylär immunologi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AccuPrep, Plasmid Mini Extraction Kit Bioneer K-3030
Anti-mouse IL-2 BioLegend 503702
Biotin anti-mouse IL-2 BioLegend 503804
ELISA plates De-groot 60-655061
Fetal Bovine Serum Sigma F7524-500ml
G418 Mercury MBS3458105GM
Gene Pulser II Bio-Rad 165-2105, 165-2106, 165-2107, 165-2108, 165-2109, 165-2110
L-Glutamine Biological industry 03-020-1B
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Biological industry 01-340-1B
Penicillin-Streptomycin Solution Biological industry 03-031-1B
peroxidase streptavidin Jackson ImmunoResearch 016-030-084
PureLink HiPure Plasmid Filter Maxiprep Kit ThermoFisher Scientific K210016
RPMI-1640 Medium Biological industry 30-2001
Sodium Pyruvate Biological industry 03-042-1B
TMB SouthernBiothech 0410-01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mandelboim, O., Lankry, D., Gazit, R. Natural Killer Cell Protocols. Second edn, Humana Press. 258-262 (2010).
  2. Mandelboim, O., et al. Recognition of haemagglutinins on virus-infected cells by NKp46 activates lysis by human NK cells. Nature. 409, (6823), 1055-1060 (2001).
  3. Stanietsky, N., et al. The interaction of TIGIT with PVR and PVRL2 inhibits human NK cell cytotoxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, (42), 17858-17863 (2009).
  4. Stanietsky, N., et al. Mouse TIGIT inhibits NK-cell cytotoxicity upon interaction with PVR. European Journal of Immunology. (2013).
  5. Gur, C., et al. Binding of the Fap2 protein of Fusobacterium nucleatum to human inhibitory receptor TIGIT protects tumors from immune cell attack. Immunity. 42, (2), 344-355 (2015).
  6. Corrales-Aguilar, E., et al. A novel assay for detecting virus-specific antibodies triggering activation of Fcgamma receptors. Journal of Immunoogical Methods. 387, (1-2), 21-35 (2013).
  7. Corrales-Aguilar, E., et al. Highly individual patterns of virus-immune IgG effector responses in humans. Medical Microbiology and Immunology. 205, (5), 409-424 (2016).
  8. Radinsky, O., et al. Sudan ebolavirus long recovered survivors produce GP-specific Abs that are of the IgG1 subclass and preferentially bind FcgammaRI. Scientific Reports. 7, (1), 6054 (2017).
  9. Elias, S., Kahlon, S., Kotzur, R., Kaynan, N., Mandelboim, O. Obinutuzumab activates FcgammaRI more potently than other anti-CD20 antibodies in chronic lymphocytic leukemia (CLL). Oncoimmunology. 7, (6), e1428158 (2018).
  10. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
  11. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), 253 (2007).
  12. Bar-On, Y., et al. NKp46 Recognizes the Sigma1 Protein of Reovirus: Implications for Reovirus-Based Cancer Therapy. Journal of Virology. 91, (19), (2017).
  13. Glasner, A., et al. Expression, Function, and Molecular Properties of the Killer Receptor Ncr1-Noe. Journal of Immunology. 195, (8), 3959-3969 (2015).
  14. Glatzer, T., et al. RORgammat(+) innate lymphoid cells acquire a proinflammatory program upon engagement of the activating receptor NKp44. Immunity. 38, (6), 1223-1235 (2013).
  15. Gur, C., et al. The activating receptor NKp46 is essential for the development of type 1 diabetes. Nature Immunology. 11, (2), 121-128 (2010).
  16. Markel, G., et al. Pivotal role of CEACAM1 protein in the inhibition of activated decidual lymphocyte functions. Journal of Clinical Investigation. 110, (7), 943-953 (2002).
Ett BW Reporter System för att studera Receptor-Ligand interaktioner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Elias, S., Kahlon, S., Duev-Cohen, A., Mandelboim, O. A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions. J. Vis. Exp. (143), e58685, doi:10.3791/58685 (2019).More

Elias, S., Kahlon, S., Duev-Cohen, A., Mandelboim, O. A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions. J. Vis. Exp. (143), e58685, doi:10.3791/58685 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter