Summary
פיתחנו שיטה רשומות בו-זמנית גם electrocorticography וגם שדה מקומי פוטנציאל בתגובה לגירויים לייזר nociceptive לנוע בחופשיות חולדות. טכניקה זו מסייעת ליצור מערכת יחסים ישירה של אותות electrocortical mesoscopic ואת רמות מאקרוסקופית, אשר מקלה על החקירה של nociceptive מידע לעיבוד במוח.
Abstract
תגובות Electrocortical, שהפיק פעימות החום לייזר שמפעילים באופן סלקטיבי nociceptive חינם עצביים, נמצאים בשימוש נרחב במחקרים רבים בעלי חיים ועל האדם לחקור עיבוד מידע nociceptive קורטיקלית. אלה פוטנציאל המוח עורר לייזר (LEPs) מורכב מספר תגובות ארעי, כי הם נעולים בזמן תחילתה של גירויים לייזר. עם זאת, המאפיינים הפונקציונליים של התגובות LEP הם עדיין אינו מודע לקיומם, עקב חוסר טכניקה דגימה בו-זמנית יכול להקליט את פעילות עצבית על פני השטח של קליפת המוח (קרי, electrocorticogram [ECoG], הקרקפת העוויתיים [הקרקפת EEG]) בתוך המוח (קרי, פוטנציאל שדה מקומי [LFP]). כדי לטפל בבעיה זו, אנו מציגים כאן פרוטוקול בבעלי חיים באמצעות חולדות נעה בחופשיות. פרוטוקול זה מורכב שלושה הליכים עיקריים: (1) בעלי חיים והכנה הליכים כירורגיים, (2) הקלטה בו זמנית של ECoG ו- LFP בתגובה לגירויים לייזר nociceptive ולאחר מיצוי כוללים, ניתוח נתונים (3). באופן ספציפי, עם העזרה של מעטפת הגנה מודפס 3D, אלקטרודות ECoG והן LFP מושתל על הגולגולת של החולדה בצורה מאובטחת התקיימו ביחד. בעת איסוף הנתונים, פעימות לייזר נמסרו על forepaws של החולדה דרך פערים בחלק התחתון של התא, כאשר החיה הייתה דממה ספונטנית. רעש לבן שוטף ניגן כדי למנוע את הפעלת מערכת השמיעה סאונד שנוצרו על-ידי לייזר. כתוצאה מכך, רק nociceptive תגובות נרשמו באופן סלקטיבי. באמצעות תהליכים אנליטיים תקן (למשל, הלהקה לעבור סינון, חילוץ אפוק, ותיקון בסיסית) כדי לחלץ תגובות הקשורות גירוי המוח, השגנו תוצאות מציג כי היו LEPs עם יחס אות לרעש גבוה במקביל הקליטה של אלקטרודות ECoG ו- LFP. מתודולוגיה זו מאפשרת הקלטה בו זמנית של ECoG ופעילויות LFP, אשר מספק גשר של אותות electrocortical mesoscopic ואת רמות מאקרוסקופית, ובכך להקל על החקירה של עיבוד מידע nociceptive במוח.
Introduction
EEG היא טכניקה כדי להקליט פוטנציאל חשמלי ופעילויות המוח מתנדנדות שנוצר על ידי פעילות מתואמת של אלפי נוירונים במוח. הוא משמש העממי רבים מחקרים בסיסיים, יישומים קליניים1,2. למשל, תגובות EEG לייזר אינטנסיבי חום פולסים (קרי, LEPs) הם אימצו אותו באופן נרחב כדי לחקור היקפיים ומרכזי העיבוד של4,nociceptive חושית קלט3,5. בבני אדם, LEPs בעיקר מורכב deflections שלושה ייחודי: הרכיב מוקדם (N1) זה somatotopically מאורגן, סביר להניח משקפים הפעילות של קליפת המגע העיקרית (S1)6, את הרכיבים מאוחר (N2 ו- P2) המהווים מרכזי מבוזרת, נוטים יותר משקפים הפעילות של קליפה המגע המשני, insula, cingulate cortex הקדמי7,8. 9,הקודם מחקרים10, להדגים את העכברוש הזה LEPs, שנדגמו באמצעות ECoG (סוג של תוך-גולגולתי EEG) של אלקטרודות וממוקם על פני השטח החשוף של המוח, מורכב גם שלושה ייחודי deflections ( כלומר, somatotopically מאורגן N1, N2 מרכזי מבוזרת, P2). הקוטביות סדר, הטופוגרפיה של רכיבי LEP עכברוש דומים LEPs האנושי11. עם זאת, בשל הרזולוציה המרחבית מוגבלת של הקרקפת EEG ו- ECoG לשטף הקלטות12, כמו גם הטבע לא מדויק של EEG מקור טכניקות ניתוח13, התרומה מפורט של הפעילות העצבית לרכיבים LEP הוא הרבה ויכוח. לדוגמה, זה לא ברור אם ואת המידה שבה S1 תורמת החלק המוקדם של התגובה בקליפת המוח (N1) שהפיק לייזר גירויים6.
שונה מן השיטה הקלטה ב מאקרוסקופית רמה, ישירה תוך-גולגולתי הקלטות באמצעות מערכי microwire סייעו על ידי מכשיר stereotaxic microdrives14,15 יכול למדוד פעילות עצבית (למשל, LFPs ) של אזורים מסוימים. LFPs משקפים בעיקר הסיכום של פוטנציאל postsynaptic מעכבות או סינאפסות של האוכלוסייה המקומית עצביים16. מאז שנדגמו LFP פעילות עצבית משקפים תהליכים עצביים המתרחשים בתוך מאות מיקרומטר סביב האלקטרודה הקלטה, טכניקה זו הקלטה משמש כדי לחקור את המידע לעיבוד במוח ברמת mesoscopic. עם זאת, זה רק מתמקד שינויים מקומיים מדויק של פעילות המוח, לא יכול לענות על השאלה של איך אותות אזורים מרובים משולבים (למשלאיך LEP רכיבים משולבים-אזורים במוח מרובים).
ראוי לציין כי ההקלטה סימולטני של ECoG ו LFPs קורטיקלית לנוע בחופשיות חולדות יכול להקל על החקירה של מידע קורטיקלית עיבוד בשני מאקרוסקופית ורמות mesoscopic. בנוסף, מתודולוגיה זו מהווה הזדמנות מצוינת ומדדים שאליה הפעילות העצבית של האזורים במוח מראש לתרום LEPs. ואכן, מחקרים קודמים מספר שהערכת ה קוהרנטיות בין קוצים, LFP בקליפת המוח, ואת ECoG אותות17,18 והפגינו LFP19,20 הסמוך האלקטרודה EEG תורמת צורה של תגובות הקשורות גירוי המוח. עם זאת, השיטה הקיימת משמש בדרך כלל כדי להקליט את המוח תגובות מחיות ומורדמת עקב חסר של מעטפת הגנה כדי למנוע את האלקטרודות להיות פגום על-ידי ההתנגשות. במילים אחרות, הטכניקה יכולה לבנות את הגשר של אותות electrocortical mesoscopic (LFP בקליפת המוח), מאקרוסקופית (EEG ו- ECoG) רמות בחופשיות העברת חולדות עדיין חסר.
כדי לטפל בבעיה זו, פיתחנו בטכניקה יכול להקליט ECoG ו- LFPs בקליפת המוח באזורים במוח מרובים בו זמנית מ בחופשיות העברת חולדות. טכניקה זו מסייעת ליצור את הקשר הישיר של אותות electrocortical mesoscopic ואת רמות מאקרוסקופית, ובכך להקל על החקירה של nociceptive מידע לעיבוד במוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
למבוגרים חולדות ספראג-Dawley זכר (שקילה 400-450 גרם) שימשו את הניסוי. כל הליכים כירורגיים וניסויים בעקבות המדריך לקבלת טיפול, שימוש של חיות מעבדה של מכוני הבריאות הלאומיים. ההליכים אושרו על ידי ועדת האתיקה מחקר-המכון לפסיכולוגיה, האקדמיה הסינית למדעים.
1. אלקטרודה השרשה
- עזים ומתנגד החולדה בחדר עם איזופלוריין 5%, שיעור זרימת האוויר של 1 ליטר/דקה לפני הניתוח.
- באמצעות מנגנון stereotaxic, לתקן את הראש. של העכברוש עם האף שלה להציב לתוך המסכה הרדמה. לנהל איזופלוריין דרך המסכה הרדמה-ריכוז של 2% עם שיעור זרימת האוויר של חצי ליטר/דקה כדי לשמור על העומק הרדמה במהלך הניתוח. שימו לב כי הסובלנות כירורגי מושגת כאשר העכברוש מצליח להגיב צובט את הבוהן.
- להחיל משחה אופטלמולוגיות בעיניים כדי למנוע ייבוש הקרנית.
- לגלח העליון של הקרקפת עכברים באמצעות מכונת הגילוח סטנדרטי.
- לעקר את הקרקפת באמצעות iodophor רפואי חיטוי פתרון ו- 75% האלכוהול כדי להסיר יוד.
- להזריק לידוקאין (2%) לתוך הקרקפת על שיכוך כאבים מקומיים. להזריק אטרופין (0.2 mL i.p.) כדי לעכב נשימה hypersecretion.
- עושים חתך קו האמצע של 2-3 ס מ על הקרקפת באמצעות אזמל. לחתוך להסיר את הקרקפת לאורך הקו האמצעי, לחשוף את הגולגולת. השתמש את המוסדי והחקלאי כדי לעצור את הדימום, בעת הצורך.
- סמן את המיקומים של אלקטרודות ECoG סמך הקואורדינטות stereotaxic מוגדרים מראש (ממוקם בהתאם למיקום של Bregma) ואת המיקומים של האלקטרודות הפניה ואת הקרקע בקו האמצע (ממוקם 2 ו 4 מ"מ. הקליפה עד למדא, בהתאמה).
- קודחים חורים (קוטר: 0.5 מ מ) עבור הברגים ECoG, באמצעות מקדחה חשמלית הגולגולת על הגולגולת באתרים מסומן, מבלי להרוס את השכבה הקשה של המוח.
- כונן בורג פלדה אל חלד (מחוץ קוטר: 0.6 מ"מ), אשר מתחבר מצופה בידוד? חוט הנחושת, לתוך החור כ- 1 מ מ לעומק מבלי לחדור את השכבה הקשה של המוח כבסיס. הברגים הללו לשמש ECoG הפניה, אלקטרודות הקרקע במהלך הניסוי.
- מניחים על בסיס מעטפת הגנה על הגולגולת. לתקן את הבסיס עם הברגים הסמוכים שלה על הגולגולת בעזרת שיניים אקרילי. השתמש צמר גפן רפואי יכול להסירו לאחר מכן כדי להגן על האזור המיועד לשמש להשתלה תיל עומק של להיות מכוסה.
הערה: מעטפת מגן הוא מוצר שעוצב polylactic מודפס 3D, אשר מורכב משלושה חלקים: בסיס, קיר, כובע. הקיר מכוסה על ידי נחושת מתחדד לבנות כלוב פאראדיי. - מסמנים את מיקומם של האלקטרודות תיל עומק על סמך הקואורדינטות stereotaxic מוגדרים מראש.
- לקדוח חורים קטנים (קוטר: 0.2 מ מ) על הגולגולת סביב האתרים המסומנים חוט ההשתלה, הסר בזהירות את מכסה העצם לחשוף השכבה הקשה של המוח. לשטוף את הניתוח בתדירות גבוהה, באמצעות תמיסת מלח. איור 1 מתאר את הסידור לפני ההשתלה של עומק תיל האלקטרודות.
- באמצעות מחט, הרם, חותכים את השכבה הקשה של המוח ללא פגיעה מאטר pia של ספינות, השטח של קליפת.
- להוריד את האלקטרודות תיל עומק השטח של קליפת והוא, ואז, לאט לאט לחדור למוח העומק היעד. לעתים קרובות עוצרים מתדרדרת האלקטרודות על חוסן נפשי קורטיקלית. במחקר הנוכחי, הוא העומק של קצה חוט 0.5 מ מ מתחת לפני השטח קורטיקלית.
- חותם את הניתוח עם תערובת של שעווה ושמן פרפין כדי להבטיח כי ניתן להעביר האלקטרודות תיל עומק על מניפולציות ניסיוני עוקבות.
- לתקן את המנגנון אלקטרודה באמצעות שיניים אקריליק על הגולגולת.
- לרתך כל חוטי נחושת המחבר הבורג ECoG לערוץ המתאים על המודול מחבר. מכסים את הנקודות ריתוך באמצעות חימר כדי להימנע מכל מגע אפשרי בין ערוצים שונים.
- להרכיב את הקיר שריון הגנה לבסיס, לרתך האלקטרודות הפניה ואת הקרקע לערוצים המתאימים.
- לתקן את המכסה מעטפת הגנה באמצעות הקלטות כדי למנוע זיהום.
- להחדיר את החולדה פניצילין (60,000 U, i.p.) מיד לאחר הניתוח כדי למנוע זיהומים postsurgical.
- יחיד-בית העכברוש ב ולחות-מבוקרי טמפרטורה בכלוב, לשמור את זה במחזור יום/לילה 12 שעות אחרי הניתוח, עם אוכל ומים ad libitum למשך לפחות שבוע לפני הניסוי LEP.
הערה: במקביל להקליט ECoG ופעילויות LFP קורטיקלית, מכשירים שימש כאן זה הורכב עם שני סוגים של אלקטרודות מקושר מודול מחבר, אשר הכיל מספר microdrives מחובר מערכי חוט של טונגסטן. סיכות זהב שימשו כדי לחבר את החוטים טונגסטן ללוח הממשק אלקטרודה (EIB) של המודול מחבר בלחיצה את החוטים לתוך חורים מתכת קטנים על EIB. שני חורים מתכת על EIB היו מולחם עם חוטי נחושת מצופה, הקצה הפתוח של כל חוט הנחושת היה מולחם עם חוט הנחושת המתאימים מחובר ECoG בורג. הפרטים של ייצור היה תיאר במקום אחר21.
2. איסוף נתונים
- לדגדג את החולדה לפחות 1 x יום שלוש או יותר ימים רצופים לפני הניסוי כדי להבטיח כי החולדה מקבל מוכר הנסיין22.
- מקם את החולדה בבית הבליעה התנהגות במשך לפחות שעה לפני הניסוי כדי להבטיח שהעכברוש acclimatizes אל סביבת הקלטה.
הערה: התא הוא קוביית פלסטיק באורך הצד של 30 ס מ. החלק התחתון של החדר מורכב של סורגים עם פערים ~ 8 מ מ. - לחבר את headstage הקלטה עם מודול אלקטרודה בעדינות, כדי להימנע מפחיד את החולדה ופגיעה המודול אלקטרודה.
- להגדיר את הגנרטור לייזר, לחבר סיבים אופטיים, להתאים את גודל ספוט הלייזר לפי המדריך של המפעיל ציוד. חבר את פלט דיגיטלי מן הגנרטור מפעיל יציאת קלט דיגיטלי של הלוח הקלטה.
הערה: הקפידו לא תלתל סיבים אופטיים יתר על המידה כדי למנוע שבירת הסיבים. לפני הקלטה, ודא האותות על ההדק התצוגה של נרשם על ידי תוכנת הצריבה. ב פרוטוקול זה, קורן-חום גירויים הנוצרים על-ידי פרוביסקיט אלומיניום איטריום ניאודימיום אינפרא-אדום (Nd: נובח) לייזר עם אורך גל של 1.34 μm. הקוטר של גודל נקודה בלייזר נקבע כ 5 מ מ על ידי התמקדות עדשות. לייזר הוא-Ne הצביע על האזור מגורה, אשר מוגדרת בהתאם מטרת הניסוי. כמו כן, אנרגית גירוי פעימות לייזר נקבע על-פי הנבחנים. משך הדופק לייזר הוא 4 ms. - הגדר את מצלמת הוידאו מתחת לפינת החדר ניסיוני ברציפות להקליט את התנהגויות nociceptive של העכברוש כאשר כף היד שלה מקבל גירויים לייזר nociceptive. להתאים את המיקום ואת הכיוון של המצלמה כדי לוודא שהתנהגויות nociceptive נרשמים לחלוטין לאורך כל הניסוי.
הערה: מצלמה מהיר תשלום מצמידים מכשיר (CCD) היא מאד מומלצת, כמו זה יכול לספק את אותות ההפעלה ללוח הראשי של מערכת הקלטה להקליט את תחילת הזמן ואת משך הפעולה nociceptive בדיוק. התנהגויות nociceptive הם מוערך על ידי הנסיין לאחר כל גירוי לייזר, בהתאם לקריטריונים שהוגדרו בעבר על סמך23,תנועה חיה24, כדלקמן: אין תנועה (ציון = 0), מושך (ובכלל זה טלטולים או היא מרוממת את הראש; ציון = 1), להירתע (קרי, גוף קטן פתאומי מקפיץ תנועה; ציון = 2), נסיגה (קרי, כפת נסיגה מן הגירוי לייזר; ציון = 3), התנועה מלקק ו לכל הגוף (ציון = 4). - לספק רעש לבן מתמשך (50 dB SPL) באמצעות רמקול בחלק העליון של התא.
הערה: כפי שמוצג מחקרים קודמים10,25, גירוי לייזר נמסר על העור מפיק סאונד שניתן לאתר על ידי מערכת השמיעה חולדה. מסיבה זו, רעש לבן מתמשך הוא שיחק לאורך כל הניסוי כדי למנוע את הפעלת מערכת השמיעה בתגובה סאונד שנוצרו על-ידי לייזר. הליך זה מאפשר את ההקלטה סלקטיבי של המוח תגובות הקשורות להפעלת מערכת nociceptive. - לאסוף את הנתונים אלקטרופיזיולוגיות את ECoG והן האלקטרודות תיל עומק, באמצעות מערכת הקלטה לפי המדריך של המפעיל ציוד.
הערה: אותות ההפעלה של המצלמה וההדק אותות פעימות לייזר הן לטעום בו זמנית עם הנתונים אלקטרופיזיולוגיות באותו קצב הדגימה (כל הנתונים הם מוגבר, דיגיטציה באמצעות קצב הדגימה של 20,000 הרץ), אשר מבטיח כי כל הנתונים נמצאים מסונכרן בזמן. - לספק את פעימות לייזר plantar של forepaw של החולדה דרך פרצות בחלק התחתון של החדר.
הערה: הגירוי לייזר רק מועבר כאשר העכברוש הוא ספונטני דממה עבור יותר מ 2 s המבוססת על ההתבוננות של הנסיין, כדי למזער את הזיהום אות של הממצאים הקשורות לתנועה. כדי למנוע עייפות קולטן אזעקה או רגישות עולה, המטרה של קרן הלייזר היא שנעקרו באופן ידני לאחר כל גירוי, המרווח interstimulus מעולם לא קצר יותר מאשר 40 ס ECoG ואת אותות LFP ניתן לצרוב מספר פעמים של כל עכברוש. העכברוש צריך לשים בבית הבליעה ניסיוני 1 h לפני כל הפעלה הקלטה. אחרי כל אולפן הקלטות, העכברוש היה עמוק מרדימים, perfused transcardially עם קרח באגירה פוספט תמיסת ואחריו 4% paraformaldehyde. המוח היה להסיר את הגולגולת, למחלקה לזהות את העמדות אלקטרודה.
3. ניתוח נתונים
- סנן את הנתונים רציפה עם מסנן הלהקה מעברים בין 1 ל- 30 הרץ.
- אפוק נתונים באמצעות חלון ניתוח של 3 s, מורחב 1 s לפני 2 s לאחר תחילתה של גירויים לייזר. תיקון בסיסית מתבצע על ידי הפחתה של משרעת רשע בתוך מרווח הזמן prestimulus.
- באופן ידני דוחים שהשרתים זה שזוהמו על ידי חפצים ברוטו.
- חשב את ואת LEP בממוצע כי הם נעולים בזמן תחילתה של גירויים לייזר עבור כל תנאי הניסוי.
- חשב שה קוהרנטיות המרה אדוה (WTC) של LEP ואת הקליט מ ECoGs ועומק תיל אלקטרודות.
הערה: WTC היא טכניקה לביצוע ה קוהרנטיות בין זוגות אלקטרודות כפונקציה של זמן ותדר. ניתן לחשב WTC בין שני אותות בכל נקודת זמן-תדר, אשר יש את היתרון של יצירת ערכים קוהרנטית כל קשת זמן-תדר. היה הפרטים של המתודולוגיה המתוארת במקום26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בניסוי נציג, נרשמו הנתונים אלקטרופיזיולוגיות מכל חמישה חולדות. הגירויים לייזר נמסרו את forepaw נכון של כל עכברוש בשביל 20 פעמים עם > 40 s במרווחים interstimulus. המוח לייזר-עורר תגובות נרשמו באמצעות ברגים ECoG ואת עומק חוטים וגם את החוטים עומק היו מושתלים דו צדדיים cortices המגע הראשי (S1), מנוע ראשי cortices (M1).
כפי שסוכם באיור1, שני ECoGs (מסומן בשחור) ועומק תיל אלקטרודות (מסומן בצבע, 5 חוטים עבור כל אחד לארבעה האזורים) הונחו על פי קואורדינטות stereotaxic את העמדות הבאות (בא לידי ביטוי בהקשר Bregma, מ מ; חיובי ערכי ציר X ו- Y מציינים נכון ומיקומי הקדמי, בהתאמה): ב- ECoG השמאלי, X =-1.5 ו- Y = 1.75; ב- ECoG נכון, X = 1.5 ו- Y = 1.75; ב, ו- S1 משמאל X =-4 ו- Y = 0.5; ב, ו- S1 נכון X = 4 ו- Y = 0.5; ב- M1 שמאל, X =-3 ו- Y = 3; ב- M1 נכון, X = 3 ו- Y = 3.
איור 2 מציג את הנתונים הגולמיים אלקטרופיזיולוגיות של אלקטרודות כל (שני הברגים ECoG פלוס ארבע מאת 5 חוטים טונגסטן, 5 חוטים טונגסטן בכל אזור המוח), עם תחילת גירוי לייזר מסומן על ידי קו אנכי נקודה. אנא שימו לב כי ברור LEP תגובות לזיהוי לאחר תחילתה של הגירוי לייזר.
איור 3 מראה את ואת LEP קבוצה-רמת-בממוצע מ- 6 אלקטרודות (שני הברגים ECoG פלוס טונגסטן ארבעה חוטים, חוט טונגסטן נציג בכל אזור במוח) של חולדות חמש. ללא קשר לאתר הקלטה, התגובות LEP מורכב אפשרות סטיה שלילית דומיננטי (N1 גל). השהיה של משרעת של הגל N1 הם כמפורט (זאת אומרת ± SEM): את ECoG השמאלי, 143 ± 9 ms ו-51 ± 4 µV; את ECoG נכון, 145 ± 9 ms ו-47 ± 4 µV; ו- S1 משמאל, 149 ± 9 ms ו-86 ± 7 µV; נכון ו- S1, 168 ± 10 ms ו-71 ± 6 µV; את M1 השמאלי, 179 ± 12 ms ו-74 ± 7 µV; את M1 נכון, 185 ± 11 ms ו-63 ± 6 µV. חשוב, N1 השהיות בין אותות ECoG ו- LFP הדו-צדדיים הקליט מ ו- S1 contralateral דומים, אשר הם בבירור קצרים יותר מאשר אלה נרשם מ חולשת S1 ודו צדדיים M1. לעומת זאת, N1 amplitudes הן בגודלו ב contralateral S1 הקטן ביותר ב- ECoGs דו צדדיים.
איור 4 מראה WTC בין LEPs שנדגמו באמצעות הברגים ECoG (האותות של שני הברגים ECoG היו בממוצע) עומק חוטים-אזורי מוח שונים (M1 נכון, S1 ימינה, שמאלה M1 ו- S1 משמאל). שימו לב כי contralateral S1 (שמאל) ו- M1 הראו עקביות גבוהה יותר מאשר חולשת S1 (מימין) ו- M1-הלהקה בתדרי גמא (50-100 Hz).
איור 1: הגדרת השרשה אלקטרודה. לפני ההשתלה של עומק תיל האלקטרודות, בסיס שריון הגנה מושם על הגולגולת, הברגים משמש ECoG אלקטרודות מונע לתוך החורים מוגדרים מראש, ע י שיניים אקרילי. ארבעה חורים הם קדחו עבור ההשתלה של אלקטרודות תיל עומק (למשל, מערכים תיל טונגסטן)-העמדות בראש ימין ועל שמאל S1 ו- M1, בהתאמה. הברגים משמש אלקטרודות הפניה ואת הקרקע למקם 2 ו 4 מ"מ. הקליפה עד למדא, קבוע עם קליפה המגנה הבסיס. הפאנל בצד השמאל מראה התמונה של הניתוח לאחר ההשתלה של מעטפת הגנה הבסיס. הפאנל בצד הימין מראה הדיאגרמה של הניתוח, אשר הראו את הצורה הכללית של הבסיס שריון הגנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: נתונים גולמיים אלקטרופיזיולוגיות של חולדה נציג. אותות המוצג נרשמים מעכברוש נציג עם שני ECoGs, עומק 20 תיל אלקטרודות (חמש אלקטרודות בכל אזור המוח), באמצעות האלקטרודה ממוקם 2 מ מ. הקליפה למדא כהפניה. תחילתה של הגירוי לייזר מסומנת באמצעות קו אנכי נקודה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: קבוצה-רמת-בממוצע LEP ואת. האותות בממוצע המוצג נרשמים של חולדות חמש שני ECoGs, עומק ארבע תיל אלקטרודות (האלקטרודה נציג אחד בכל אזור המוח), באמצעות האלקטרודה ממוקם 2 מ מ. הקליפה למדא כהפניה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: ה קוהרנטיות המרה אדוה. התוצאות המוצגות להראות ה קוהרנטיות המרה אדוה בין LEPs שנדגמו באמצעות ECoG ברגים וחוטים עומק על אזורים שונים במוח (M1 נכון, S1 ימינה, שמאלה M1 ו- S1 משמאל). ה קוהרנטיות היה מנורמל לקו הבסיס בהתאמה (0.5 s לפני תחילת גירוי לייזר). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במחקר הנוכחי, אנו המתואר טכניקה במקביל להקליט ECoGs ותגובות LFP קורטיקלית שהפיק לייזר nociceptive גירויים לנוע בחופשיות חולדות. התוצאות הראו כי LEP תגובות יכול להיות בבירור זוהה לאחר תחילתה של גירויים לייזר ב- ECoG והן LFP אותות. הקלטה בו זמנית של ECoG ואת אותות LFP קורטיקלית תאפשר למדענים לחקור את מערכת היחסים שלהם עבור יותר הבנת התרומה של הפעילות העצבית לרכיבים LEP.
ראוי לציין חמישה שלבים קריטיים בשיטה המוצעת. ראשית, חשוב לוודא כי המשטח של הגולגולת הוא נקי ויבש לפני תיקון המעטפת מגן הבסיס עליו, באמצעות אקריליק שיניים. שלב זה מאפשר כי הבסיס שריון הגנה stably קבוע. שנית, מאז הקוטר של הברגים ECoG היא קצת יותר גדולה כי מהבורות, הנהג בורג הראשונית תגדיל את החור כדי ליצור את-חריטה. במחקר הנוכחי, המרחק בין החור טונגסטן חוטים חורים הבורג ECoG הוא קטן מאוד (למשלפחות מ 0.3 מ מ). אם כל החורים הם קדחו לפני ECoG בורג נהיגה ואת עומק תיל הוספה, הגולגולת סביב החורים ECoG יהיה שברירי זה לא יישאו עומס מכני של הגדלת החור במהלך הבורג הנהיגה שלך. מסיבה זו, הברגים ECoG צריך להסיע לתוך החורים כדי ליצור את-חריטה לפני החור קידוח ההוספה תיל טונגסטן. אם הברגים ECoG שנוספו להכשיל את התצוגה כאשר קידוח החורים על החוטים טונגסטן, מומלץ שהם אמורים להיות הרחק והוא מונע שוב לאחר שלב 1.14 של הפרוטוקול. שלישית, בעת הוספת עומק תיל האלקטרודות, הנסיין אמורה לשלם תשומת לב ההתנגדות בקצה החוטים טונגסטן, אשר בדרך כלל מציינת כי החוטים עומק הנחסמים על-ידי קצה חור בגולגולת או השכבה הקשה של המוח כי כבר לא הוסרו לחלוטין. אם זה המצב, צריך להעלות את החוטים עומק, צריך לנקות את המכשולים אפשרי לפני reinserting אלקטרודות20. רביעית, בעת מילוי החורים גולגולת עם התערובת של שעווה ושמן פרפין לאחר ההשתלה אלקטרודה, החוטים מושתל נלחצים לא על ידי כוחות חיצוניים. לכן, עדיף להמיס את התערובת ממוקמים בקרבת מקום באמצעות המוסדי והחקלאי. חמישית, חשוב לוודא כי המרחק בין לייזר לסוף הקטע אתר היעד על החולדה נשמרת כ 1 ס מ כדי להבטיח כי האנרגיות לייזר נתפסת עקביים בין ניסויים שונים10,25.
אכן, כדי לוודא מעטפת מגן יכול לכסות ולהגן על המנגנון כל, הגודל של המעטפת נועדה להיות גדול יחסית (קוביה עם אורך הצד של 3.5 מ מ) לעומת הראש של החולדה. כדי למזער את ההשפעה של המכשיר over--הראש בתנועה של החולדה, אנו ממליצים להשתמש חולדות אשר שקלה יותר מ 400 גרם לניסוי. מסיבה זו, טכניקה זו אינה יכולה לשמש כדי לחקור התנהגויות מתוחכמים במודל חולדה, לא צריך להיות מאומץ במודלים אחרים של חיות קטנות יותר (למשל, עכברים). ראוי לציין, הטכניקה המוצע יכול לשמש כדי לשלב עם טכניקות טיפול נוספות ובכך הארכת ליישומים רבים אחרים. לדוגמה, טכניקה זו ניתן בקלות להחיל על המוח שיא התגובות עורר על ידי גירויים של תחושות שונות (למשל, שמיעתי, חזותי)27,28 ותכונות אשר מיושמים מזהים המוח של מחלות פסיכיאטריות ( למשל, מחלת הנפילה)29 ב בחופשיות העברת חולדות, אשר תקדם את החקירה של מנגנונים עצביים המתאימים שלהם. בנוסף, ההשתלה אלקטרודה יכול לעמוד במבחן במשך בערך חודש, אשר מספק את האפשרות לבצע מחקר בעתיד.
בסך הכל, אנו מספקים טכניקה חוקי ECoG במקביל להקליט ופעילויות LFP לנוע בחופשיות חולדות. טכניקה זו מאפשרת לנו לחקור את המידע לעיבוד במוח הן mesoscopic והן רמות מאקרוסקופית. . זה חשוב ללימודי translational לממצאי בעלי חיים ניסיוני המסמך עבור הבנה טובה יותר של הפיזיולוגיה האנושית ואת פתופסיולוגיה
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש ריהצהל.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי רשויות אישורים מפתח המעבדה לבריאות הנפש, המכון לפסיכולוגיה, הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (31671141 ו- 31822025), 13תאנון Informatization חמש שנים תוכנית של האקדמיה הסינית למדעים (XXH13506), הפרויקט הבסיס המדעי של המכון לפסיכולוגיה, האקדמיה הסינית למדעים (Y6CX021008).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Male Sprague-Drawley rats | Vital River | ||
| Isoflurane | RWD Life Science | ||
| Small animal isoflurane anaesthetic system | RWD Life Science | Including the anesthesia gas mask for rats | |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | ||
| The apparatus with combined ECoG and LFP electrodes | The apparatus is home-made, which assembles the ECoG and depth wire electrodes to a connector module | ||
| 3D-printed protective shell | The texture of shell is polylactic, and the shell is home-made and contains three parts: a base, a wall and a cap. The wall is covered by copper tapers to construct as a Faraday cage | ||
| Tungsten wires (diameter: 50 mm) | California Fine Wires Company | The electrodes for cortical LFP recording | |
| Stainless steel screws (diameter: 0.6 mm) |
The electrodes for ECoG recording | ||
| Electric cranial drill | RWD Life Science | ||
| Drill bit (diameter: 0.5 mm) | RWD Life Science | The drill is used for drilling the holes of ECoG screws | |
| Drill bit (diameter: 0.2 mm) | RWD Life Science | The drill is used for drilling the holes of depth wires | |
| Dental arylic powder | SNC dental | ||
| Dental arylic liquid | SNC dental | ||
| Paraffin | Fisher Scientific | The mixture is used for seal the craniotomy to ensure the following movement of micro-wire arrays | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | ||
| Electrocoagulator | Bovie medical Corporation | ||
| RHD2132 Amplifier Boards | Intan Technologies | A 32-channel headstage | |
| RHD2000 systerm | Intan Technologies | The data acquisition systerm | |
| Infrared neodymium yttrium aluminum perovskite (Nd:YAP) laser generator | Electronical Engineering | ||
| Matlab R2016b | The MathWorks |
References
- Klimesch, W., Doppelmayr, M., Schwaiger, J., Winkler, T., Gruber, W. Theta oscillations and the ERP old/new effect: independent phenomena? Clinical Neurophysiology. 111 (5), 781-793 (2000).
- Peng, W., et al. Brain oscillations reflecting pain-related behavior in freely moving rats. Pain. 159 (1), 106-118 (2018).
- Treede, R. D. Neurophysiological studies of pain pathways in peripheral and central nervous system disorders. Journal of Neurology. 250 (10), 1152-1161 (2003).
- Iannetti, G. D., et al. Evidence of a specific spinal pathway for the sense of warmth in humans. Journal of Neurophysiology. 89 (1), 562-570 (2003).
- Bromm, B., Treede, R. D. Nerve fibre discharges, cerebral potentials and sensations induced by CO2 laser stimulation. Human Neurobiology. 3 (1), 33-40 (1984).
- Valentini, E., et al. The primary somatosensory cortex largely contributes to the early part of the cortical response elicited by nociceptive stimuli. NeuroImage. 59 (2), 1571-1581 (2012).
- Valeriani, M., et al. Parallel spinal pathways generate the middle-latency N1 and the late P2 components of the laser evoked potentials. Clinical Neurophysiology. 118 (5), 1097-1104 (2007).
- Kuo, C. C., Yen, C. T. Comparison of anterior cingulate and primary somatosensory neuronal responses to noxious laser-heat stimuli in conscious, behaving rats. Journal of Neurophysiology. 94 (3), 1825-1836 (2005).
- Hu, L., et al. The primary somatosensory cortex and the insula contribute differently to the processing of transient and sustained nociceptive and non-nociceptive somatosensory inputs. Human Brain Mapping. 36 (11), 4346-4360 (2015).
- Xia, X. L., Peng, W. W., Iannetti, G. D., Hu, L. Laser-evoked cortical responses in freely-moving rats reflect the activation of C-fibre afferent pathways. NeuroImage. 128, 209-217 (2016).
- Jin, Q. Q., et al. Somatotopic Representation of Second Pain in the Primary Somatosensory Cortex of Humans and Rodents. The Journal of Neuroscience. 38 (24), 5538-5550 (2018).
- Lenkov, D. N., Volnova, A. B., Pope, A. R., Tsytsarev, V. Advantages and limitations of brain imaging methods in the research of absence epilepsy in humans and animal models. Journal of Neuroscience Methods. 212 (2), 195-202 (2013).
- Mouraux, A., Iannetti, G. D. Across-trial averaging of event-related EEG responses and beyond. Magnetic Resonance Imaging. 26 (7), 1041-1054 (2008).
- Li, X., et al. Extracting Neural Oscillation Signatures of Laser-Induced Nociception in Pain-Related Regions in Rats. Frontiers in Neural Circuits. 11, 71 (2017).
- Zhao, Z. F., Li, X. Z., Wan, Y. Mapping the Information Trace in Local Field Potentials by a Computational Method of Two-Dimensional Time-Shifting Synchronization Likelihood Based on Graphic Processing Unit Acceleration. Neuroscience Bulletin. 33 (6), 653-663 (2017).
- Buzsaki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature Reviews. Neuroscience. 13 (6), 407-420 (2012).
- Bimbi, M., et al. Simultaneous scalp recorded EEG and local field potentials from monkey ventral premotor cortex during action observation and execution reveals the contribution of mirror and motor neurons to the mu-rhythm. NeuroImage. 175, 22-31 (2018).
- Musall, S., von Pfostl, V., Rauch, A., Logothetis, N. K., Whittingstall, K. Effects of neural synchrony on surface EEG. Cerebral Cortex. 24 (4), 1045-1053 (2014).
- Bruyns-Haylett, M., et al. The neurogenesis of P1 and N1: A concurrent EEG/LFP study. NeuroImage. 146, 575-588 (2017).
- Kang, S., Bruyns-Haylett, M., Hayashi, Y., Zheng, Y. Concurrent Recording of Co-localized Electroencephalography and Local Field Potential in Rodent. Journal of Visualized Experiments. (129), e56447 (2017).
- Shikano, Y., Sasaki, T., Ikegaya, Y. Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials, Electrocardiogram, Electromyogram, and Breathing Rhythm from a Freely Moving Rat. Journal of Visualized Experiments. (134), e56980 (2018).
- Cloutier, S., LaFollette, M. R., Gaskill, B. N., Panksepp, J., Newberry, R. C. Tickling, a Technique for Inducing Positive Affect When Handling Rats. Journal of Visualized Experiments. (135), e57190 (2018).
- Fan, R. J., Kung, J. C., Olausson, B. A., Shyu, B. C. Nocifensive behaviors components evoked by brief laser pulses are mediated by C fibers. Physiology & Behavior. 98 (1-2), 108-117 (2009).
- Fan, R. J., Shyu, B. C., Hsiao, S. Analysis of nocifensive behavior induced in rats by CO2 laser pulse stimulation. Physiology & Behavior. 57 (6), 1131-1137 (1995).
- Hu, L., et al. Was it a pain or a sound? Across-species variability in sensory sensitivity. Pain. 156 (12), 2449-2457 (2015).
- Catarino, A., et al. Task-related functional connectivity in autism spectrum conditions: an EEG study using wavelet transform coherence. Molecular Autism. 4 (1), 1 (2013).
- Polterovich, A., Jankowski, M. M., Nelken, I. Deviance sensitivity in the auditory cortex of freely moving rats. PLoS One. 13 (6), e0197678 (2018).
- Li, G., Baker, C. L. Functional organization of envelope-responsive neurons in early visual cortex: organization of carrier tuning properties. The Journal of Neuroscience. 32 (22), 7538-7549 (2012).
- Fujita, S., Toyoda, I., Thamattoor, A. K., Buckmaster, P. S. Preictal activity of subicular, CA1, and dentate gyrus principal neurons in the dorsal hippocampus before spontaneous seizures in a rat model of temporal lobe epilepsy. The Journal of Neuroscience. 34 (50), 16671-16687 (2014).
