Summary
قمنا بتطوير تقنية أن السجلات في وقت واحد اليكتروكورتيكوجرافي والإمكانات الميدانية المحلية في الاستجابة للمحفزات الليزر nociceptive من الانتقال بحرية الفئران. هذه التقنية تساعد على إقامة علاقة مباشرة من إشارات اليكتروكورتيكال في mesoscopic ومستويات عيانية، مما يسهل التحقيق nociceptive معالجة المعلومات في الدماغ.
Abstract
ردود اليكتروكورتيكال، أثارت بنبضات الليزر الحرارة بشكل انتقائي تنشيط النهايات العصبية الحرة nociceptive، تستخدم على نطاق واسع في العديد من الدراسات الحيوانية والبشرية للتحقيق في تجهيز المعلومات nociceptive القشرية. هذه الإمكانات الدماغ أثارت الليزر (LEPs) تتكون من عدة ردود عابر أن يتم تأمين الوقت إلى ظهور المحفزات الليزر. ومع ذلك، الخصائص الوظيفية للردود ليب لا تزال غير معروفة إلى حد كبير، نظراً لعدم وجود تقنية أخذ العينات التي يمكن في نفس الوقت لتسجيل الأنشطة العصبية على سطح القشرة (أي، اليكتروكورتيكوجرام [اكوج] وفروة الرأس للالكهربائي [فروة الرأس EEG]) وداخل المخ (أي، الميدانية المحلية المحتملة [طابعات الحجم الكبير]). لمعالجة هذه المسألة، ونحن الحاضرين هنا بروتوكولا حيوان باستخدام الفئران تتحرك بحرية. ويتألف هذا البروتوكول من ثلاثة إجراءات رئيسية: إعداد الحيوانات (1)، والعمليات الجراحية، (2) تسجيل متزامنة اكوج وطابعات الحجم الكبير في الاستجابة للمحفزات الليزر nociceptive، واستخراج البيانات (3) تحليل وميزة. على وجه التحديد، مع المساعدة من قذيفة واقية طباعة 3D، أقطاب اكوج وطابعات الحجم الكبير مزروع في الجمجمة للفئران بشكل أمن وعقدت معا. أثناء جمع البيانات، وتم تسليم نبضات الليزر على فوريباوس في الفئران عن طريق الثغرات الموجودة في الجزء السفلي من الدائرة عندما كان الحيوان في سكون عفوية. لعبت الضوضاء البيضاء الجارية لتجنب تفعيل نظام سمعي بالموجات فوق الصوتية المولدة بواسطة الليزر. نتيجة لذلك، سجلت بشكل انتقائي nociceptive الاستجابات فقط. باستخدام الإجراءات التحليلية المعيارية (مثلاً، الفرقة-تمرير التصفية واستخراج العصر وتصحيح خط الأساس) لاستخراج الاستجابات المتعلقة بتحفيز الدماغ، حصلنا على النتائج تبين أن LEPs مع ارتفاع نسبة الإشارة إلى الضوضاء وسجلت في نفس الوقت من أقطاب اكوج وطابعات الحجم الكبير. هذه المنهجية يجعل تسجيل متزامنة اكوج وطابعات الحجم الكبير من الأنشطة الممكنة، الذي يوفر جسراً لإشارات اليكتروكورتيكال في mesoscopic ومستويات عيانية، وبالتالي تيسير التحقيق في تجهيز المعلومات nociceptive في الدماغ.
Introduction
التخطيط الدماغي تقنية لتسجيل الإمكانات الكهربائية وأنشطة الدماغ متذبذبة المتولدة عن الأنشطة المتزامنة الآلاف من الخلايا العصبية في الدماغ. ويستخدم شعبيا في العديد من الدراسات الأساسية والتطبيقات السريرية1،2. على سبيل المثال، الحرارة ردود EEG لليزر مكثفة البقول (أي، LEPs) التي اعتمدت على نطاق واسع للتحقيق في معالجة المدخلات الحسية nociceptive3،،من45المحيطية والمركزية. في البشر، LEPs تتكون أساسا من ثلاثة أو متميزة: المكون المبكر (N1) الذي سوماتوتوبيكالي المنظمة ومن المرجح أن تعكس نشاط القشرة الأولية somatosensory (S1)6، والمكونات الراحل (N2 و P2) التي يتم مركزياً الموزعة ومن المرجح أن تعكس نشاط قشرة somatosensory الثانوي و insula الأمامي cingulate قشرة7،8. في الدراسات السابقة9،10، أثبتنا أن الفئران LEPs، اكوج (وهو نوع من التخطيط الدماغي داخل الجمجمة) باستخدام عينات من أقطاب توضع مباشرة على سطح مكشوف من المخ، وتتألف أيضا من ثلاث أو متميزة ( أي، سوماتوتوبيكالي نظمت N1 و N2 الموزعة مركزياً و P2). قطبية، ترتيب، والطوبوغرافيا لمكونات ليب الفئران تتشابه البشرية LEPs11. ومع ذلك، سبب القرار المكانية المحدودة لفروة الرأس EEG و تسجيلات اكوج له12، فضلا عن الطبيعة غير دقيقة للتخطيط الدماغي المصدر تحليل التقنيات13، مساهمة مفصلة للأنشطة العصبية لمكونات ليب وتجري مناقشة الكثير. على سبيل المثال، أنها إذا كانت غير واضحة وإلى أي مدى تسهم فيه S1 للجزء الأول من الرد القشرية (N1) بالليزر المحفزات6.
تختلف عن تقنية تسجيل في العيانية التسجيلات داخل الجمجمة مباشرة، ومستوى استخدام صفائف ميكروويري بمساعدة جهاز ستيريوتاكسيك، و،ميكرودريفيس1415 يمكن قياس الأنشطة العصبية (مثلاً، لفبس ) من مناطق محددة. وتعكس لفبس أساسا مجموع إمكانات بوستسينابتيك المثبطة أو ضادات للسكان المحليين العصبية16. نظراً للأنشطة العصبية عينات من طابعات الحجم الكبير تعكس العمليات العصبية التي تحدث داخل مئات ميكرومتر حول مسرى التسجيل، يستخدم على نطاق واسع هذه التقنية تسجيل للتحقيق في معالجة المعلومات في الدماغ على مستوى mesoscopic. بيد أنها تركز على التغييرات المحلية دقيقة لأنشطة الدماغ فقط ولا يمكن الإجابة على السؤال كيف يتم دمج إشارات من مناطق متعددة (مثلاً، كيف تتكامل مكونات لب في مناطق متعددة في الدماغ).
تجدر الإشارة إلى أن تسجيل متزامنة اكوج ولفبس القشرية من الانتقال بحرية الفئران يمكن أن ييسر التحقيق في معلومات القشرية المعالجة على حد سواء العيانية ومستويات mesoscopic. وبالإضافة إلى ذلك، توفر هذه المنهجية فرصة ممتازة للتحقيق في مدى التي تسهم الأنشطة العصبية لمناطق الدماغ مسبقاً LEPs. والواقع أن العديد من الدراسات السابقة وقيمت التماسك بين المسامير، القشرية طابعات الحجم الكبير، واكوج إشارات17،18 وأظهرت أن طابعات الحجم الكبير19،20 المتاخمة للتخطيط الدماغي الكهربائي يساهم تشكيل الاستجابات المتعلقة بتحفيز الدماغ. ومع ذلك، هذه التقنية القائمة يستخدم عادة لتسجيل استجابات الدماغ من تخديره من الحيوانات بسبب الذي تفتقر إليه قذيفة الواقية لمنع أقطاب كهربائية من التلف بالتصادم. وبعبارة أخرى، لا تزال تفتقر إلى الأسلوب الذي يمكن بناء جسر إشارات اليكتروكورتيكال في mesoscopic (القشرية طابعات الحجم الكبير) ومستويات (EEG واكوج) العيانية في الانتقال بحرية الفئران.
ولمعالجة هذه المسألة، قمنا بتطوير تقنية التي يمكن أن تسجل اكوج ولفبس القشرية في مناطق الدماغ متعددة في وقت واحد من الانتقال بحرية الفئران. هذه التقنية تساعد على إقامة علاقة مباشرة إشارات اليكتروكورتيكال في mesoscopic والمستويات العيانية، ومن ثم تسهيل التحقيق في nociceptive معالجة المعلومات في الدماغ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
الكبار ذكور الفئران سبراغ داولي (وزنها 400-450 غ) استخدمت في التجربة. اتباع جميع الإجراءات الجراحية والتجريبية الدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية "المعاهد الوطنية للصحة". الإجراءات التي أقرتها "لجنة أخلاقيات البحوث" في معهد علم النفس بالأكاديمية الصينية للعلوم.
1. زرع قطب كهربائي
- تخدير الفئران في غرفة مع إيسوفلوراني 5% ومعدل تدفق هواء من 1 لتر في الدقيقة قبل الجراحة.
- استخدام جهاز ستيريوتاكسيك، إصلاح رئيس الفئران مع انفها وضعها في القناع مخدر. تول إيسوفلوراني عن طريق القناع مخدر بتركيز 2 ٪ بمعدل تدفق هواء من 0.5 لتر في الدقيقة للحفاظ على عمق التخدير أثناء الجراحة. ملاحظة تحقيق التسامح الجراحية عند الفئران لم تستجب إلى أخمص القدمين معسر.
- تطبيق مرهم العيون إلى العيون لتفادي جفاف القرنية.
- يحلق أعلى فروة الرأس الفئران باستخدام ماكينة حلاقة قياسية.
- تعقيم فروة الرأس باستخدام الكحول مطهر إيودوفور الطبية، الحل و 75% لإزالة اليود.
- حقن ليدوكائين (2 في المائة) في فروة الرأس لتسكين المحلية. إدارة الأتروبين (0.2 مل القائمة) تمنع هايبرسيكريشن الجهاز التنفسي.
- جعل شق خط الوسط لحوالي 2-3 سم في فروة الرأس باستخدام مشرط. قطع وإزالة جزء من فروة الرأس على طول خط الوسط وفضح في الجمجمة. استخدم في اليكتروكواجولاتور لوقف النزيف، عند الضرورة.
- وضع علامة على مواقع أقطاب اكوج استناداً إلى إحداثيات ستيريوتاكسيك معرف مسبقاً (توضع وفقا لموضع بريجما) ومواقع أقطاب المرجعية والأرض في خط الوسط (وضع 2 و 4 مم كودالي لامدا، على التوالي).
- حفر ثقوب (القطر: 0.5 مم) للمسامير اكوج، استخدام ثقب الجمجمة في الجمجمة في مواقع ملحوظة، ودون تدمير في بلده دوراً.
- محرك المسمار الفولاذ المقاوم للصدأ (خارج القطر: 0.6 مم)، الذي يتصل بالأسلاك النحاسية، المغلفة بالعزل في الحفرة لحوالي 1 مم عمق دون اختراق دوراً الكامنة. بمثابة هذه المسامير اكوج، والمراجع، واقطاب الأرض أثناء التجربة.
- مكان قذيفة حماية أساسية على الجمجمة. إصلاح القاعدة مع مسامير المتاخمة لها في الجمجمة استخدام اﻷكريليك الأسنان. استخدام القطن الطبي التي يمكن إزالتها بعد ذلك لحماية المنطقة التي يراد استخدامها لزرع أسلاك عمق من تغطيتها.
ملاحظة: شل الواقية هو منتج مصمم خصيصا polylactic طباعة 3D، الذي يتكون من ثلاثة أجزاء: قاعدة وجدار وسقف. الجدار مغطى بإضاءة النحاس لبناء كقفص فاراداي. - وضع علامة على مواقع أقطاب سلك عمق استناداً إلى إحداثيات ستيريوتاكسيك المعرفة مسبقاً.
- حفر ثقوب صغيرة (قطرها: 0.2 مم) في الجمجمة حول المواقع الملحوظة لغرس الأسلاك، وإزالة رفرف العظام للكشف في بلده دوراً بعناية. تغسل في اوديما بشكل متكرر استخدام المحلول الملحي العادي. يصف الشكل 1 الإعداد قبل غرس أقطاب سلك العمق.
- باستخدام إبرة، رفع وقطع دوراً دون إلحاق الضرر بماطر بيا وسفن السطح من اللحاء الجديد.
- أقل العمق سلك كهربائي على السطح اللحاء الجديد، وثم اختراق الدماغ بعمق الهدف ببطء. كثيرا ما تتوقف عن تحريك لأسفل أقطاب المرونة القشرية. في هذه الدراسة، عمق تلميح سلك 0.5 مم تحت السطح القشرية.
- ختم اوديما بخليط زيت البارافين وشمع التأكد من أنه يمكن نقل كهربائي سلك عمق للتلاعب التجريبية اللاحقة.
- إصلاح الجهاز الكهربائي باستخدام اﻷكريليك الأسنان في الجمجمة.
- لحام كل الأسلاك النحاسية التي تتصل بالمسمار اكوج للقناة المقابلة في الوحدة النمطية موصل. تغطية بقع اللحام باستخدام الطين لتجنب إمكانية الاتصال بين مختلف القنوات.
- تجميع الجدار شل واقية للقاعدة ولحام الأقطاب المرجعية والأرض إلى قنوات المقابلة.
- إصلاح الغطاء لشل الحماية باستخدام الأشرطة لتجنب التلوث.
- حقن الفئران بالبنسلين (60,000 يو، القائمة) فورا بعد الجراحة الوقاية من العدوى بوستسورجيكال.
- واحد-بيت الفئران في درجة الحرارة والرطوبة-تسيطر قفص والاحتفاظ به في دورة اليوم/الليل 12-ح بعد الجراحة، مع الغذاء والمياه libitum الإعلانية لمدة أسبوع واحد على الأقل قبل التجربة لب.
ملاحظة: لتسجيل في نفس الوقت اكوج والقشرية الأنشطة طابعات الحجم الكبير، وهو جهاز كان يستخدم هنا التي تم تجميعها مع نوعين من أقطاب مرتبطة بوحدة نمطية موصل، الذي تضمن عدة ميكرودريفيس يعلق على الصفائف سلك التنغستن. واستخدمت الدبابيس الذهبية لتوصيل الأسلاك التنغستن إلى المجلس واجهة القطب (بنك الاستثمار الأوروبي) الوحدة النمطية موصل بالضغط على الأسلاك في ثقوب معدنية صغيرة في بنك الاستثمار الأوروبي. كان ملحوم ثقبين معدنية في بنك الاستثمار الأوروبي مع الأسلاك النحاسية المغلفة، والنهاية المفتوحة لكل الأسلاك النحاسية وكان ملحوم مع الأسلاك النحاسية المقابلة متصلاً اكوج المسمار. وكانت تفاصيل تصنيع الوارد وصفها في أماكن أخرى من21.
2-جمع البيانات
- دغدغة الفئران على الأقل 1 × يوميا لثلاثة أو أكثر من أيام متتالية قبل التجربة التأكد من أن الفئران يحصل على دراية المجرب22.
- وضع الفئران في غرفة على الأقل 1 ح قبل التجربة التأكد من الفئران أككليماتيزيس على البيئة تسجيل السلوك.
ملاحظة: الدائرة مكعب بلاستيكية بطول جانب 30 سم. يتكون الجزء السفلي من الدائرة الحديد [غرتينغ] ~ 8 ملم بالثغرات. - الاتصال هيدستاجي التسجيل مع الوحدة النمطية القطب بلطف، تجنب إخافة الفئران وإلحاق الضرر بالوحدة النمطية القطب.
- إعداد مولد ليزر وتوصيل الألياف البصرية، وضبط حجم بقعة من الليزر وفقا لدليل المشغل المعدات. قم بتوصيل الإخراج الرقمي من مولد الزناد إلى منفذ الإدخال الرقمي للمجلس تسجيل.
ملاحظة: الحرص على عدم تجعيد الألياف البصرية مفرطة لتجنب قطع الألياف. قبل التسجيل، تأكد من عرض إشارات الزناد وسجلت ببرنامج التسجيل. في هذا البروتوكول، المنبهات مشع للحرارة يتم إنشاؤها بواسطة بيروفسكيتي ألومنيوم الإيتريوم نيوديميوم الأشعة تحت حمراء (Nd: ياب) ليزر مع طول موجه من 1.34 ميكرومتر. يتم تعيين قطر حجم بقعة الليزر في حوالي 5 ملم بعدسات التركيز. ليزر ني أنه أشار إلى منطقة حفز، والتي تتحدد تبعاً لهدف التجربة. أيضا، يتم تحديد الطاقة حافزا لنبضات الليزر وفقا للتصميم التجريبي. مدة نبض الليزر 4 مللي ثانية. - ضبط كاميرا فيديو تحت الركن الدائرة التجريبية لتسجيل السلوكيات nociceptive من الفئران باستمرار عندما يتلقى مخلب لها الليزر nociceptive المحفزات. ضبط الموضع واتجاه الكاميرا للتأكد من سلوكيات nociceptive تسجل تماما طوال التجربة.
ملاحظة: كاميرا عالية السرعة جهاز اقتران (CCD) ينصح بشدة، كما يمكنها أن تقدم إشارات التشغيل إلى المجلس الرئيسي لنظام التسجيل لتسجيل وقت بدء ومدة السلوك nociceptive تحديداً. يتم تقييم السلوكيات nociceptive بالمجرب بعد كل حافز الليزر، وفقا لمعايير محددة مسبقاً إلى23،حركة الحيوانات24، على النحو التالي: أي حركة (النتيجة = 0)، تطرق رئيس (بما في ذلك الهز أو رفع الرأس. نقاط = 1)، الجفل (أي، هيئة مفاجئة صغيرة الرجيج الحركة؛ ونقاط = 2)، سحب (أيتراجع مخلب من حافز الليزر؛ ونقاط = 3)، حركة الجسم كله ولعق (درجة = 4). - تسليم الجارية الضوضاء البيضاء (50 ديسيبل SPL) عبر مكبر لصوت في الجزء العلوي من الدائرة.
ملاحظة: كما هو مبين في الدراسات السابقة10،25، تحفيز الليزر على الجلد يولد الموجات فوق الصوتية التي يمكن الكشف عنها بواسطة النظام السمعي الفئران. ولهذا السبب، لعبت الضوضاء البيضاء الجارية في جميع أنحاء هذه التجربة لتجنب تفعيل نظام سمعي استجابة للموجات فوق الصوتية المولدة بواسطة الليزر. يسمح هذا الإجراء تسجيل استجابات الدماغ المتصلة بتفعيل نظام nociceptive انتقائية. - جمع البيانات الكهربية من اكوج واقطاب سلك العمق، باستخدام نظام التسجيل وفقا لدليل المشغل المعدات.
ملاحظة: إشارات تشغيل الكاميرا وعلى الزناد إشارات نبضات الليزر يتم أخذ عينات في وقت واحد مع البيانات الكهربية في نفس معدل أخذ العينات (جميع البيانات يتم تضخيمها ورقمية باستخدام معدل أخذ عينات من 20,000 هرتز)، الذي يضمن أن جميع البيانات يتم مزامنة الوقت. - توصيل نبضات الليزر إلى أخمص القدم من فوربو في الفئران عن طريق الثغرات الموجودة في الجزء السفلي من الدائرة.
ملاحظة: فقط يتم تسليم حافز ليزر عند الجرذان سكون العفوية لأكثر من 2 s استناداً إلى المجرب المراقبة، وتقليل تلوث إشارة من التحف ذات الصلة بحركة. لتجنب نوسيسيبتور التعب أو التوعية، هدفا لشعاع الليزر شرد يدوياً بعد كل الحوافز، والفاصل الزمني إينتيرستيمولوس أقصر من 40 س. اكوج وإشارات طابعات الحجم الكبير يمكن تسجيل عدة مرات من كل الفئران ابدأ. الفئران يتعين أن يوضع في قاعة التجريبية ح 1 قبل كل دورة تسجيل. بعد كل تسجيل الدورات، الفئران تم تخديره من عميق و perfused ترانسكارديالي مع المالحة المثلج مخزنة الفوسفات تليها بارافورمالدهيد 4%. كان الدماغ من الجمجمة ومقطوع لتحديد مواقف القطب.
3-بيانات التحليل
- تصفية البيانات المستمر مع مرشح تمرير نطاق بين 1 و 30 هرتز.
- عصر البيانات باستخدام إطار تحليل 3 s، تمتد من 1 s قبل 2 s بعد ظهور المحفزات الليزر. تصحيح خط الأساس تتم عن طريق طرح السعة يعني ضمن الفاصل الزمني بريستيمولوس.
- رفض العهود التي تعتبر ملوثة بالتحف الإجمالي يدوياً.
- يتم حساب متوسط الطول الموجي ليب أن يتم تأمين الوقت إلى ظهور المحفزات الليزر لكل حالة تجريبية.
- حساب التماسك تحويل المويجات (مركز التجارة العالمي) في الطول الموجي ليب مسجل من اكوجس وعمق سلك كهربائي.
ملاحظة: برجي مركز التجارة العالمي أسلوب لتنفيذ الترابط بين أزواج من أقطاب كدالة للزمن والتردد. يمكن حساب مركز التجارة العالمي بين اثنين من إشارات لأي نقطة وقت التردد، الذي يتميز بتوليد قيم التماسك لمجمل الوقت التردد. كانت تفاصيل المنهجية المذكورة في أماكن أخرى من26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وفي التجربة التمثيلية، سجلت البيانات الكهربية من الفئران الخمسة. المحفزات الليزر تم تسليمها إلى فوربو الحق لكل الفئران لعشرين مرة مع > 40 s فترات إينتيرستيمولوس. كانت مزروع الدماغ أثارت الليزر سجلت الاستجابات باستخدام مسامير اكوج وعمق الأسلاك، والأسلاك عمق الثنائية الأولية somatosensory كورتيسيس (S1) والابتدائي موتور كورتيسيس (M1).
كما هي ملخصة في الشكل 1، اثنين من اكوجس (علامة سوداء) وعمق سلك كهربائي (ملحوظ في اللون، أسلاك خمسة لكل منطقة من المناطق الأربع) وضعت وفقا للإحداثيات ستيريوتاكسيك في المواقف التالية (المعبر عنها في إشارة إلى بريجما، في مم؛ إيجابية تشير إلى قيم المحور X و Y المواقع الأمامية والحق، على التوالي): في اكوج غادر، X =-1.5 و Y = 1.75؛ في اكوج الحق، X = 1.5 و Y = 1.75؛ في S1 الأيسر، X =-4 و Y = 0.5؛ في S1 الحق، س = 4 و Y = 0.5؛ في M1 الأيسر، X =-3 و Y = 3؛ في M1 الحق، X = 3 و Y = 3.
ويبين الشكل 2 البيانات الخام من جميع الأقطاب الكهربية (اكوج المسمارين بالإضافة إلى أربعة من خمسة التنغستن الأسلاك، خمسة أسلاك التنغستن في كل منطقة الدماغ)، مع ظهور الليزر حافز تميز بخط عمودي دوت. يرجى ملاحظة أن الردود لب واضحة قابلة للاكتشاف بعد ظهور حافز الليزر.
ويبين الشكل 3 الطول الموجي ليب بلغ متوسط مستوى مجموعة من ستة أقطاب (اكوج المسمارين بالإضافة إلى التنغستن أربعة أسلاك، سلك تنغستن ممثل في كل منطقة الدماغ) من الفئران خمسة. بغض النظر عن الموقع، وتسجيل الاستجابات ليب تتألف من انحراف السلبية السائدة (N1 موجه). الكمون والسعة الموجه N1 كما يلي (يعني ± ووزارة شؤون المرأة): اكوج اليسرى و 143 ± 9 مللي-51 ± 4 µV؛ اكوج الحق، 145 ± 9 مللي و-47 ± 4 µV؛ S1 الأيسر، 149 ± 9 مللي و-86 ± 7 µV؛ S1 الحق، 168 ± 10 مللي ثانية و-71 ± 6 µV؛ M1 الأيسر، 179 ± 12 مللي ثانية و-74 ± 7 µV؛ M1 الحق، 185 ± 11 مرض التصلب العصبي المتعدد و-63 ± 6 µV. الأهم من ذلك الاختفاء N1 في الإشارات اكوج وطابعات الحجم الكبير الثنائية سجلت من contralateral S1 متشابهة، هي وضوح أقصر من تلك المسجلة من عن S1 و M1 الثنائية. وفي المقابل، ستريك N1 الأكبر في contralateral S1 وأصغر في اكوجس الثنائية.
ويبين الشكل 4 مركز التجارة العالمي بين LEPs عينات باستخدام مسامير اكوج (وقد بلغ متوسط الإشارات من المسمارين اكوج) وعمق الأسلاك في مناطق الدماغ المختلفة (M1 الحق والحق S1، M1 الأيسر و S1 الأيسر). علما أن كونترالاتيرال S1 (يسار) و M1 أظهر تماسك أعلى مما عن S1 (يمين) و M1 في غاما-الترددية (50-100 هرتز).
رقم 1: إنشاء زرع قطب كهربائي- قبل غرس أقطاب سلك العمق، يوضع قاعدة شل واقية على الجمجمة، ومسامير تستخدم كأقطاب اكوج مدفوعة في الثقوب مسبقاً وإصلاحها بواسطة اﻷكريليك الأسنان. يتم حفر أربع فتحات لغرس عمق سلك كهربائي (مثلاً، صفائف سلك التنغستن) في مواقف على الجزء العلوي الأيمن والأيسر S1 و M1، على التوالي. توضع 2 و 4 مم كودالي إلى لامدا مسامير تستخدم كأقطاب المرجعية والأرض والثابتة مع shell الحماية الأساسية. لوحة على اليسار يظهر صورة لجراحة بعد غرس قذيفة الحماية قاعدة. الفريق المعني بالحق يظهر الرسم التخطيطي للجراحة، والذي يبين الشكل العام لقاعدة شل الواقية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: البيانات الخام الكهربية من الفئران الممثل. وتسجل إشارات المعروضة من الفئران ممثل مع اثنين من اكوجس و 20 عمق سلك كهربائي (خمسة أقطاب في كل منطقة الدماغ)، استخدام مسرى يقع 2 مم كاودالي لامدا كمرجع. تم وضع علامة بداية حافز الليزر استخدام خط عمودي دوت. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الطول الموجي بلغ متوسط مستوى مجموعة ليب- وتسجل إشارات متوسط عرضها من خمس من الفئران في اكوجس اثنين وأربعة عمق سلك كهربائي (قطب ممثل واحد في كل منطقة الدماغ)، استخدام مسرى يقع 2 مم كودالي لامدا كمرجع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: تماسك تحويل المويجات. وتبين النتائج المعروضة تحويل المويجات التماسك بين LEPs عينات باستخدام مسامير اكوج وعمق الأسلاك في مناطق الدماغ المختلفة (M1 الحق والحق S1، M1 الأيسر و S1 الأيسر). كان تطبيع التماسك خط الأساس الخاصة بكل منها (0.5 s قبل ظهور حافز الليزر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه الدراسة، وصفت لنا تقنية لتسجيل في نفس الوقت اكوجس والقشرية الردود طابعات الحجم الكبير بالليزر nociceptive المنبهات من الانتقال بحرية الفئران. وأظهرت النتائج أن ليب الردود يمكن أن يتم الكشف عن وضوح بعد بداية المحفزات الليزر في إشارات اكوج وطابعات الحجم الكبير. وستمكن المتزامنة تسجيل اكوج والقشرية طابعات الحجم الكبير إشارات العلماء للتحقيق في العلاقة بينهما لتحسين فهم مساهمة أنشطة الخلايا العصبية لمكونات ليب.
وينبغي ملاحظة خمس خطوات حاسمة في هذه التقنية المقترحة. أولاً، من المهم للتأكد من أن سطح الجمجمة نظيفة وجافة قبل تحديد shell الحماية الأساسية، استخدام اﻷكريليك الأسنان. هذه الخطوة يمكن أن قاعدة شل الواقية هو ثابت ثابت. ثانيا، نظراً لقطر مسامير اكوج أكبر قليلاً من أن يقود المسمار الأولية سيوسع من الثقوب، حفرة لتشكل المسمار-مؤشر الترابط. في هذه الدراسة، المسافة بين الحفرة لاسلاك التنجستين والحفرة للمسمار اكوج صغيرة جداً (مثلاً، أقل من 0.3 مم). إذا كان يتم حفر ثقوب جميع قبل اكوج المسمار القيادة وعمق سلك الإدراج، الجمجمة حول الثقوب اكوج ستكون هشة، وأنها لا تتحمل الحمل الميكانيكي لتوسيع ثقب خلال المسمار القيادة. ولهذا السبب، يلزم مسامير اكوج تكون مدفوعة في الثقوب لتشكيل المسمار-مؤشر ترابط قبل ثقب الحفر للإدراج سلك التنغستن. إذا مسامير اكوج المدرج عرقلة الرأي عند حفر الثقوب للأسلاك التنغستن، فمن المستحسن أنهم أخرجوا وتحركها في مرة أخرى بعد الخطوة 1، 14 من البروتوكول. الثالث، عند إدراج أقطاب سلك العمق، من المفترض المجرب إيلاء اهتمام للمقاومة في غيض الأسلاك التنغستن، الذي عادة ما يشير إلى أن الأسلاك عمق يتم حظرها بواسطة حافة ثقب في الجمجمة أو دوراً أن لم يكن إزالتها بالكامل. إذا كان هذا هو الحال، يجب أن تثار الأسلاك العمق، والعقبات المحتملة التي ينبغي تنظيفها قبل إعادة إدراج أقطاب20. الرابع، عند ملء الثقوب اوديما بخليط زيت البارافين وشمع بعد زرع قطب كهربائي، ينبغي أن لا ضغط الأسلاك مزروع بالقوى الخارجية. ولذلك، من الأفضل أن يذوب الخليط توضع القريبة باستخدام اليكتروكواجولاتور. خامسا، من المهم ضمان أن تظل المسافة بين قطعة نهاية الليزر وموقع الهدف على الفئران في حوالي 1 سم لضمان أن تتسق طاقات الليزر المتصورة بين محاكمات مختلفة10،25.
في الواقع، للتأكد من أن شل الواقية يمكن تغطية وحماية الجهاز كله، وحجم القذيفة مصممة لتكون كبيرة نسبيا (مكعب بطول جانب 3.5 مم) مقارنة بالرأس في الفئران. لتقليل تأثير الجهاز فوق الرأس في الحركة للفئران، نوصي باستخدام الفئران الذي يزن أكثر من 400 غرام في التجربة. لهذا السبب، هذا الأسلوب لا يمكن استخدامه لدراسة السلوكيات المتطورة في نموذج الفئران ولا ينبغي اعتماده في نماذج أخرى من الحيوانات الصغيرة (مثلاً، الفئران). جدير بالذكر أن يمكن استخدام الأسلوب المقترح للجمع بين تقنيات أخرى ومن ثم تمتد إلى العديد من التطبيقات الأخرى. على سبيل المثال، يمكن بسهولة تطبيق هذا الأسلوب إلى استجابات الدماغ سجل أثارت بحافز أحاسيس مختلفة (مثلاً، السمعية والبصرية)27،28 والتطبيقية في الدماغ تحديد ملامح (الأمراض النفسية سبيل المثال، الصرع)29 في الانتقال بحرية الفئران، التي من شأنها تعزيز التحقيق في تلك الآليات العصبية الخاصة بكل منها. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تحمل زرع قطب كهربائي الاختبار لمدة شهر تقريبا، الذي ينص على إمكانية إجراء دراسة طولية في المستقبل.
بالإجمال، نحن نقدم تقنية صالحة للأنشطة في وقت واحد تسجيل اكوج وطابعات الحجم الكبير من التحرك بحرية الفئران. هذا الأسلوب يتيح لنا للتحقيق في معالجة المعلومات في الدماغ على الصعيدين mesoscopic والعيانية. هذا أمر مهم للدراسات متعدية لوثيقة النتائج الحيوانات التجريبية لفهم أفضل لعلم وظائف الأعضاء البشرية والفيزيولوجيا المرضية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بإعلان.
Acknowledgments
كان يؤيد هذا العمل بالمختبرات الرئيسية للصحة العقلية الأكاديمية الصينية للعلوم، معهد علم النفس، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31671141 و 31822025)، 13th خطة خمسية المعلوماتية من الأكاديمية الصينية للعلوم (XXH13506)، وهذا المشروع "مؤسسة علمية" في معهد علم النفس، الأكاديمية الصينية للعلوم (Y6CX021008).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Male Sprague-Drawley rats | Vital River | ||
| Isoflurane | RWD Life Science | ||
| Small animal isoflurane anaesthetic system | RWD Life Science | Including the anesthesia gas mask for rats | |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | ||
| The apparatus with combined ECoG and LFP electrodes | The apparatus is home-made, which assembles the ECoG and depth wire electrodes to a connector module | ||
| 3D-printed protective shell | The texture of shell is polylactic, and the shell is home-made and contains three parts: a base, a wall and a cap. The wall is covered by copper tapers to construct as a Faraday cage | ||
| Tungsten wires (diameter: 50 mm) | California Fine Wires Company | The electrodes for cortical LFP recording | |
| Stainless steel screws (diameter: 0.6 mm) |
The electrodes for ECoG recording | ||
| Electric cranial drill | RWD Life Science | ||
| Drill bit (diameter: 0.5 mm) | RWD Life Science | The drill is used for drilling the holes of ECoG screws | |
| Drill bit (diameter: 0.2 mm) | RWD Life Science | The drill is used for drilling the holes of depth wires | |
| Dental arylic powder | SNC dental | ||
| Dental arylic liquid | SNC dental | ||
| Paraffin | Fisher Scientific | The mixture is used for seal the craniotomy to ensure the following movement of micro-wire arrays | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | ||
| Electrocoagulator | Bovie medical Corporation | ||
| RHD2132 Amplifier Boards | Intan Technologies | A 32-channel headstage | |
| RHD2000 systerm | Intan Technologies | The data acquisition systerm | |
| Infrared neodymium yttrium aluminum perovskite (Nd:YAP) laser generator | Electronical Engineering | ||
| Matlab R2016b | The MathWorks |
References
- Klimesch, W., Doppelmayr, M., Schwaiger, J., Winkler, T., Gruber, W. Theta oscillations and the ERP old/new effect: independent phenomena? Clinical Neurophysiology. 111 (5), 781-793 (2000).
- Peng, W., et al. Brain oscillations reflecting pain-related behavior in freely moving rats. Pain. 159 (1), 106-118 (2018).
- Treede, R. D. Neurophysiological studies of pain pathways in peripheral and central nervous system disorders. Journal of Neurology. 250 (10), 1152-1161 (2003).
- Iannetti, G. D., et al. Evidence of a specific spinal pathway for the sense of warmth in humans. Journal of Neurophysiology. 89 (1), 562-570 (2003).
- Bromm, B., Treede, R. D. Nerve fibre discharges, cerebral potentials and sensations induced by CO2 laser stimulation. Human Neurobiology. 3 (1), 33-40 (1984).
- Valentini, E., et al. The primary somatosensory cortex largely contributes to the early part of the cortical response elicited by nociceptive stimuli. NeuroImage. 59 (2), 1571-1581 (2012).
- Valeriani, M., et al. Parallel spinal pathways generate the middle-latency N1 and the late P2 components of the laser evoked potentials. Clinical Neurophysiology. 118 (5), 1097-1104 (2007).
- Kuo, C. C., Yen, C. T. Comparison of anterior cingulate and primary somatosensory neuronal responses to noxious laser-heat stimuli in conscious, behaving rats. Journal of Neurophysiology. 94 (3), 1825-1836 (2005).
- Hu, L., et al. The primary somatosensory cortex and the insula contribute differently to the processing of transient and sustained nociceptive and non-nociceptive somatosensory inputs. Human Brain Mapping. 36 (11), 4346-4360 (2015).
- Xia, X. L., Peng, W. W., Iannetti, G. D., Hu, L. Laser-evoked cortical responses in freely-moving rats reflect the activation of C-fibre afferent pathways. NeuroImage. 128, 209-217 (2016).
- Jin, Q. Q., et al. Somatotopic Representation of Second Pain in the Primary Somatosensory Cortex of Humans and Rodents. The Journal of Neuroscience. 38 (24), 5538-5550 (2018).
- Lenkov, D. N., Volnova, A. B., Pope, A. R., Tsytsarev, V. Advantages and limitations of brain imaging methods in the research of absence epilepsy in humans and animal models. Journal of Neuroscience Methods. 212 (2), 195-202 (2013).
- Mouraux, A., Iannetti, G. D. Across-trial averaging of event-related EEG responses and beyond. Magnetic Resonance Imaging. 26 (7), 1041-1054 (2008).
- Li, X., et al. Extracting Neural Oscillation Signatures of Laser-Induced Nociception in Pain-Related Regions in Rats. Frontiers in Neural Circuits. 11, 71 (2017).
- Zhao, Z. F., Li, X. Z., Wan, Y. Mapping the Information Trace in Local Field Potentials by a Computational Method of Two-Dimensional Time-Shifting Synchronization Likelihood Based on Graphic Processing Unit Acceleration. Neuroscience Bulletin. 33 (6), 653-663 (2017).
- Buzsaki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature Reviews. Neuroscience. 13 (6), 407-420 (2012).
- Bimbi, M., et al. Simultaneous scalp recorded EEG and local field potentials from monkey ventral premotor cortex during action observation and execution reveals the contribution of mirror and motor neurons to the mu-rhythm. NeuroImage. 175, 22-31 (2018).
- Musall, S., von Pfostl, V., Rauch, A., Logothetis, N. K., Whittingstall, K. Effects of neural synchrony on surface EEG. Cerebral Cortex. 24 (4), 1045-1053 (2014).
- Bruyns-Haylett, M., et al. The neurogenesis of P1 and N1: A concurrent EEG/LFP study. NeuroImage. 146, 575-588 (2017).
- Kang, S., Bruyns-Haylett, M., Hayashi, Y., Zheng, Y. Concurrent Recording of Co-localized Electroencephalography and Local Field Potential in Rodent. Journal of Visualized Experiments. (129), e56447 (2017).
- Shikano, Y., Sasaki, T., Ikegaya, Y. Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials, Electrocardiogram, Electromyogram, and Breathing Rhythm from a Freely Moving Rat. Journal of Visualized Experiments. (134), e56980 (2018).
- Cloutier, S., LaFollette, M. R., Gaskill, B. N., Panksepp, J., Newberry, R. C. Tickling, a Technique for Inducing Positive Affect When Handling Rats. Journal of Visualized Experiments. (135), e57190 (2018).
- Fan, R. J., Kung, J. C., Olausson, B. A., Shyu, B. C. Nocifensive behaviors components evoked by brief laser pulses are mediated by C fibers. Physiology & Behavior. 98 (1-2), 108-117 (2009).
- Fan, R. J., Shyu, B. C., Hsiao, S. Analysis of nocifensive behavior induced in rats by CO2 laser pulse stimulation. Physiology & Behavior. 57 (6), 1131-1137 (1995).
- Hu, L., et al. Was it a pain or a sound? Across-species variability in sensory sensitivity. Pain. 156 (12), 2449-2457 (2015).
- Catarino, A., et al. Task-related functional connectivity in autism spectrum conditions: an EEG study using wavelet transform coherence. Molecular Autism. 4 (1), 1 (2013).
- Polterovich, A., Jankowski, M. M., Nelken, I. Deviance sensitivity in the auditory cortex of freely moving rats. PLoS One. 13 (6), e0197678 (2018).
- Li, G., Baker, C. L. Functional organization of envelope-responsive neurons in early visual cortex: organization of carrier tuning properties. The Journal of Neuroscience. 32 (22), 7538-7549 (2012).
- Fujita, S., Toyoda, I., Thamattoor, A. K., Buckmaster, P. S. Preictal activity of subicular, CA1, and dentate gyrus principal neurons in the dorsal hippocampus before spontaneous seizures in a rat model of temporal lobe epilepsy. The Journal of Neuroscience. 34 (50), 16671-16687 (2014).
