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Behavior

स्वतंत्र रूप से चलती चूहों से Nociceptive लेजर उत्तेजनाओं के जवाब में Cortical स्थानीय क्षेत्र क्षमता और Electrocorticograms के एक साथ रिकॉर्डिंग

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58686
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2, 4,5,6, 1,2,7
1CAS Key Laboratory of Mental Health, Institute of Psychology, 2Department of Psychology, University of Chinese Academy of Sciences, 3Research Center of Brain Cognitive Neuroscience, Liaoning Normal University, 4Neuroscience Research Institute, Peking University, 5Department of Neurobiology, School of Basic Medical Sciences, Peking University, 6Key Laboratory for Neuroscience, Ministry of Education/National Health and Family Planning Commission, Peking University, 7Department of Pain Management, State Key Clinical Specialty in Pain Medicine, Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University

Summary

हम एक तकनीक है कि एक साथ दोनों electrocorticography और स्थानीय क्षेत्र nociceptive लेजर उत्तेजनाओं के जवाब में स्वतंत्र रूप से चलती चूहों से क्षमता रिकॉर्ड विकसित की है । यह तकनीक mesoscopic और macroscopic स्तरों पर electrocortical संकेतों का सीधा संबंध स्थापित करने में मदद करती है, जो मस्तिष्क में nociceptive सूचना संसाधन की जांच की सुविधा देता है ।

Abstract

Electrocortical प्रतिक्रियाओं, लेजर गर्मी दालों कि चुनिंदा nociceptive मुक्त तंत्रिका अंत को सक्रिय द्वारा, विस्तृत रूप से कई पशु और मानव अध्ययन में nociceptive जानकारी के cortical प्रसंस्करण की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है । इन लेजर पैदा मस्तिष्क क्षमता (LEPs) कई परिवर्तनीय प्रतिक्रियाओं कि समय लेजर उत्तेजनाओं की शुरुआत के लिए बंद कर रहे है से मिलकर बनता है । हालांकि, एलईपी प्रतिक्रियाओं के कार्यात्मक गुण अभी भी मोटे तौर पर अज्ञात हैं, एक नमूना तकनीक है कि एक साथ प्रांतस्था की सतह पर तंत्रिका गतिविधियों को रिकॉर्ड कर सकते है की कमी के कारण (यानी, electrocorticogram [ECoG] और खोपड़ी इलॅक्ट्रोसेफेलॉग्राम [खोपड़ी ईईजी]) और मस्तिष्क के अंदर (यानी, स्थानीय क्षेत्र क्षमता [LFP]) । इस मुद्दे को संबोधित करने के लिए, हम यहां एक जानवर स्वतंत्र रूप से चलती चूहों का उपयोग प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इस प्रोटोकॉल तीन मुख्य प्रक्रियाओं से बना है: (1) पशु तैयारी और शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं, (2) nociceptive लेजर उत्तेजनाओं के जवाब में ECoG और LFP के एक साथ एक रिकॉर्डिंग, और (3) डेटा विश्लेषण और सुविधा निष्कर्षण । विशेष रूप से, एक 3 डी मुद्रित सुरक्षात्मक कवच की मदद से, दोनों ECoG और LFP है चूहे की खोपड़ी पर प्रत्यारोपित इलेक्ट्रोड सुरक्षित रूप से एक साथ आयोजित किया गया । डेटा संग्रह के दौरान, लेजर पल्स जब पशु सहज शांति में था चैंबर के तल में अंतराल के माध्यम से चूहे के forepaws पर वितरित किया गया । लेजर जनित अल्ट्रासाउंड द्वारा अनुश्रवण प्रणाली के सक्रियकरण से बचने के लिए चल रहे सफेद शोर खेला गया था । एक परिणाम के रूप में, केवल nociceptive प्रतिक्रियाओं चुनिंदा दर्ज किए गए । मानक विश्लेषणात्मक प्रक्रियाओं का उपयोग करना (जैसे, बैंड-फ़िल्टरिंग, युग निष्कर्षण, और आधारभूत सुधार पास) उत्तेजना से संबंधित मस्तिष्क प्रतिक्रियाओं को निकालने के लिए, हम एक उच्च संकेत के साथ LEPs दिखा परिणाम प्राप्त करने के लिए शोर अनुपात थे इसके साथ ही ECoG और LFP इलेक्ट्रोड से दर्ज की गई. यह पद्धति ECoG और LFP गतिविधियों की एक साथ रिकॉर्डिंग संभव बनाती है, जो mesoscopic और macroscopic स्तरों पर electrocortical संकेतों का एक पुल प्रदान करती है, जिससे nociceptive सूचना संसाधन की जांच की सुविधा मस्तिष्क में ।

Introduction

ईईजी मस्तिष्क में न्यूरॉन्स के हजारों की सिंक्रनाइज़ गतिविधियों द्वारा उत्पन्न विद्युत क्षमता और थरथरानवाला मस्तिष्क गतिविधियों को रिकॉर्ड करने के लिए एक तकनीक है. यह लोकप्रिय कई बुनियादी अध्ययन और नैदानिक अनुप्रयोगों1,2में प्रयोग किया जाता है । उदाहरण के लिए, तीव्र लेजर गर्मी दालों के लिए ईईजी प्रतिक्रियाओं (यानी, LEPs) व्यापक रूप से nociceptive संवेदी इनपुट3,4,5के परिधीय और केंद्रीय प्रसंस्करण की जांच करने के लिए अपनाया जाता है । मनुष्य में, LEPs मुख्य रूप से तीन अलग विक्षेपकों से मिलकर बनता है: प्रारंभिक घटक (N1) है कि somatotopically का आयोजन किया जाता है और प्राथमिक somatosensory प्रांतस्था (एस1) 6की गतिविधि को प्रतिबिंबित करने की संभावना है, और देर घटकों (N2 और P2) कि केंद्रीय रहे है वितरित और अधिक माध्यमिक somatosensory प्रांतस्था, insula, और पूर्वकाल सिंगुलेट प्रांतस्था7,8की गतिविधि को प्रतिबिंबित करने की संभावना है । पिछले अध्ययन में9,10, हम प्रदर्शन किया है कि चूहे LEPs, ECoG का उपयोग कर नमूना (intracranial ईईजी का एक प्रकार) इलेक्ट्रोड से सीधे मस्तिष्क के उजागर सतह पर रखा, यह भी तीन अलग विक्षेपों से मिलकर बनता है ( अर्थात, somatotopically का आयोजन N1 और केन्द्र द्वारा वितरित N2 और P2). ध्रुवीयता, आदेश, और चूहे एलईपी घटकों की स्थलाकृति मानव LEPs11के समान हैं । हालांकि, खोपड़ी ईईजी और अवदृढ़तानिकी ECoG रिकॉर्डिंग12के सीमित स्थानिक संकल्प के कारण, साथ ही साथ ईईजी स्रोत विश्लेषण तकनीक13के गलत प्रकृति, एलईपी घटकों के लिए तंत्रिका गतिविधियों का विस्तृत योगदान ज्यादा बहस होती है । उदाहरण के लिए, यह स्पष्ट नहीं है और अगर हद तक जो एस 1 cortical प्रतिक्रिया (N1) लेजर उत्तेजनाओं6से ऊपर के प्रारंभिक भाग के लिए योगदान देता है ।

macroscopic स्तर पर रिकॉर्डिंग तकनीक से अलग है, एक stereotaxic उपकरण और14microdrives द्वारा सहायता प्राप्त microwire arrays का उपयोग प्रत्यक्ष intracranial रिकॉर्डिंग,15 तंत्रिका गतिविधियों को मापने सकताहै (जैसे, LFPs ) विशिष्ट क्षेत्रों की । LFPs मुख्य रूप से निरोधात्मक या उत्तेजक postsynaptic स्थानीय न्यूरॉन आबादी16की क्षमता के योग को प्रतिबिंबित । के बाद से LFP-नमूना तंत्रिका गतिविधियों न्यूरॉन रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के आसपास micrometers के सैकड़ों के भीतर होने वाली प्रक्रियाओं को प्रतिबिंबित, इस रिकॉर्डिंग तकनीक व्यापक रूप से mesoscopic स्तर पर मस्तिष्क में जानकारी प्रसंस्करण की जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है. तथापि, यह केवल मस्तिष्क की गतिविधियों के सटीक स्थानीय परिवर्तन पर केंद्रित है और कैसे कई क्षेत्रों से संकेत एकीकृत कर रहे है के सवाल का जवाब नहीं कर सकते है (जैसे, कैसे एलईपी घटकों एकाधिक मस्तिष्क क्षेत्रों में एकीकृत कर रहे हैं) ।

यह ध्यान देने योग्य है कि एक ECoG और cortical LFPs के स्वतंत्र रूप से चलती चूहों से एक साथ रिकॉर्डिंग दोनों macroscopic और mesoscopic के स्तर पर cortical सूचना प्रसंस्करण की जांच की सुविधा हो सकती है लायक है । इसके अलावा, इस पद्धति एक उत्कृष्ट हद तक जो करने के लिए पूर्वनिर्धारित मस्तिष्क क्षेत्रों के तंत्रिका गतिविधियों LEPs में योगदान की जांच करने का अवसर प्रदान करता है । दरअसल, कई पिछले अध्ययनों के बीच जुटना मूल्यांकन किया है spikes, cortical LFP, और ECoG संकेत17,18 और दिखा दिया है कि LFP19,20 ईईजी इलेक्ट्रोड के निकट करने के लिए योगदान उत्तेजना से संबंधित मस्तिष्क प्रतिक्रियाओं का गठन । हालांकि, मौजूदा तकनीक आमतौर पर anesthetized जानवरों से इलेक्ट्रोड को टक्कर से क्षतिग्रस्त होने से रोकने के लिए एक सुरक्षात्मक कवच की कमी के कारण मस्तिष्क प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करने के लिए प्रयोग किया जाता है । दूसरे शब्दों में, तकनीक है कि mesoscopic (cortical LFP) में electrocortical संकेतों के पुल का निर्माण कर सकता है और स्वतंत्र रूप से चूहों में macroscopic (ईईजी और ECoG) स्तर अभी भी कमी है ।

इस मुद्दे को संबोधित करने के लिए, हम एक तकनीक है कि एक ECoG और cortical LFPs एकाधिक मस्तिष्क क्षेत्रों में एक साथ स्वतंत्र रूप से चलती चूहों से रिकॉर्ड कर सकता विकसित की है । इस तकनीक में मदद करता है mesoscopic और macroscopic स्तर पर electrocortical संकेतों का सीधा संबंध स्थापित करने, इस प्रकार मस्तिष्क में nociceptive सूचना प्रसंस्करण की जांच की सुविधा ।

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Protocol

प्रयोग में वयस्क पुरुष Sprague-Dawley चूहों (वजनी ४००-४५० ग्राम) का प्रयोग किया गया । सभी शल्य चिकित्सा और प्रायोगिक प्रक्रियाओं की देखभाल और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए गाइड का पालन किया । इस प्रक्रिया के मनोविज्ञान संस्थान, चीनी विज्ञान अकादमी में अनुसंधान नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. इलेक्ट्रोड आरोपण

  1. Anesthetize एक कक्ष में चूहा 5% isoflurane और सर्जरी से पहले 1 एल के एक हवा का प्रवाह दर के साथ/
  2. एक stereotaxic उपकरण का उपयोग कर, अपनी नाक संवेदनाहारी मुखौटा में रखा के साथ चूहे के सिर को ठीक । प्रबंधन 2% की एकाग्रता पर संवेदनाहारी मुखौटा के माध्यम से isoflurane ०.५ एल के एक हवा के प्रवाह की दर के साथ सर्जरी के दौरान संवेदनाहारी गहराई बनाए रखने के लिए/ ध्यान रहे कि शल्य सहिष्णुता तब हासिल होती है जब चूहा पाँव-चुटकी का जवाब देने में विफल हो जाता है.
  3. corneal सुखाने से बचने के लिए आंखों में नेत्र मरहम लागू करें ।
  4. चूहे की खोपड़ी के ऊपर एक मानक शेविंग का उपयोग कर दाढ़ी ।
  5. चिकित्सकीय iodophor संक्रमित समाधान और ७५% शराब आयोडीन को दूर करने के लिए का उपयोग कर खोपड़ी निष्फल ।
  6. स्थानीय analgesia के लिए खोपड़ी में lidocaine (2%) श्वसन hypersecretion को बाधित करने के लिए atropine (०.२ मिलीलीटर आईएफसआई) व्यवस्थापित ।
  7. एक स्केलपेल का उपयोग खोपड़ी पर लगभग 2-3 सेमी की एक midline चीरा बनाओ । कट और midline के साथ खोपड़ी का हिस्सा निकालें और cranium बेनकाब । रक्तस्राव को रोकने के लिए electrocoagulator का प्रयोग करें, जब आवश्यक हो ।
  8. ECoG इलेक्ट्रोड के स्थान पूर्वनिर्धारित stereotaxic निर्देशांकों के आधार पर चिह्नित करें (Bregma की स्थिति के अनुसार रखा) और midline पर संदर्भ और जमीन इलेक्ट्रोड के स्थानों (caudally करने के लिए 2 और 4 मिमी लैंब्डा, क्रमशः) रखा.
  9. ड्रिल छेद (व्यास: ०.५ mm) ECoG शिकंजा के लिए, चिह्नित स्थलों पर खोपड़ी पर एक बिजली के कपाल ड्रिल का उपयोग कर, बाडी को नष्ट करने के बिना ।
  10. ड्राइव एक स्टेनलेस स्टील स्क्रू (व्यास के बाहर: ०.६ mm), जो इंसुलेशन लेपित तांबे के तार को जोड़ता है, अंतर्निहित बाडी मर्मज्ञ बिना लगभग 1 मिमी गहराई के लिए छेद में । ये शिकंजा प्रयोग के दौरान ECoG, संदर्भ, और जमीन इलेक्ट्रोड के रूप में कार्य करते हैं ।
  11. cranium पर एक सुरक्षात्मक शेल बेस रखें । दंत एक्रिलिक का उपयोग कर cranium पर अपने आसंन शिकंजा के साथ आधार को ठीक करें । चिकित्सा कपास का उपयोग करें कि बाद में क्षेत्र है कि गहराई से तार आरोपण के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है कवर किया जा रहा है की रक्षा के लिए हटाया जा सकता है ।
    नोट: सुरक्षात्मक कवच एक कस्टम डिजाइन 3 डी-मुद्रित polylactic उत्पाद है, जो तीन भागों के होते हैं: एक आधार, एक दीवार, और एक टोपी । दीवार तांबे की शंकुओं द्वारा कवर के लिए एक फैराडे पिंजरे के रूप में निर्माण किया है ।
  12. मार्क पूर्वनिर्धारित stereotaxic निर्देशांक पर आधारित गहराई तार इलेक्ट्रोड के स्थानों.
  13. छोटे छेद ड्रिल (व्यास: ०.२ मिमी) तार आरोपण के लिए चिह्नित स्थलों के आसपास खोपड़ी पर, और ध्यान से हटाने के लिए बाडी को बेनकाब करने के लिए हड्डी प्रालंब । craniotomy को अक्सर धोकर, सामान्य खारा प्रयोग करें । चित्रा 1 गहराई तार इलेक्ट्रोड के आरोपण से पहले सेट-अप का वर्णन करता है.
  14. एक सुई का प्रयोग, लिफ्ट और पिया मेटर, जहाजों, और neocortex की सतह को नुकसान पहुँचाए बिना बाडी काट ।
  15. neocortex की सतह के लिए गहराई तार इलेक्ट्रोड कम और, फिर, धीरे लक्ष्य गहराई के लिए मस्तिष्क घुसना. अक्सर cortical लचीलापन के लिए इलेक्ट्रोड नीचे चलती बंद करो. वर्तमान अध्ययन में, तार टिप की गहराई cortical सतह के तहत ०.५ मिमी है ।
  16. सील मोम और तेल का एक मिश्रण के साथ craniotomy सुनिश्चित करें कि गहराई तार इलेक्ट्रोड बाद प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के लिए ले जाया जा सकता है ।
  17. इलेक्ट्रोड उपकरण खोपड़ी पर दंत एक्रिलिक का उपयोग कर ठीक करें ।
  18. वेल्ड प्रत्येक तांबे के तार कि कनेक्टर मॉड्यूल पर इसी चैनल के लिए ECoG पेंच को जोड़ता है । कवर वेल्डिंग मिट्टी का उपयोग कर विभिंन चैनलों के बीच संभावित संपर्क से बचने के धब्बे ।
  19. आधार करने के लिए सुरक्षात्मक खोल दीवार को इकट्ठा करने और इसी चैनल के लिए संदर्भ और जमीन इलेक्ट्रोड वेल्ड.
  20. संक्रमण से बचने के लिए टेप का उपयोग सुरक्षात्मक खोल करने के लिए टोपी को ठीक करें ।
  21. postsurgical संक्रमण को रोकने के लिए सर्जरी के तुरंत बाद पेनिसिलिन (६०,००० यू, आईएफसआई) के साथ चूहे को इंजेक्ट करें ।
  22. सिंगल-हाउस एक तापमान में चूहे और आर्द्रता नियंत्रित पिंजरे और यह एक 12-h दिन में रखने के लिए सर्जरी के बाद/रात चक्र, भोजन और पानी के साथ विज्ञापन libitum के लिए एलईपी प्रयोग करने से पहले कम से एक सप्ताह ।
    नोट: ECoG और cortical LFP गतिविधियों को एक साथ रिकॉर्ड करने के लिए, एक उपकरण यहां इस्तेमाल किया गया था कि एक संबंधक मॉड्यूल, जो टंगस्टन तार arrays से जुड़े कई microdrives शामिल इलेक्ट्रोड के दो प्रकार के साथ इकट्ठे हुए थे । गोल्ड पिंस ईआईबी पर छोटे धातु छेद में तारों दबाकर कनेक्टर मॉड्यूल के इलेक्ट्रोड अंतरफलक बोर्ड (ईआईबी) के लिए टंगस्टन तारों कनेक्ट करने के लिए इस्तेमाल किया गया । ईआईबी पर दो धातु छेद लेपित तांबे के तारों के साथ टांके लगा रहे थे, और प्रत्येक तांबे के तार के खुले अंत इसी तांबे तार ECoG पेंच से जुड़े के साथ मिलाप किया गया । निर्माण का ब्योरा21कहीं बताया गया है ।

2. डेटा संग्रह

  1. एक दिन के लिए तीन या अधिक लगातार दिनों के लिए चूहे के प्रयोग से परिचित हो जाता है कि यह सुनिश्चित करने से पहले कम 1x चूहा गुदगुदी22।
  2. प्रयोग से पहले चूहे acclimatizes रिकॉर्डिंग वातावरण को सुनिश्चित करने के लिए व्यवहार कक्ष में चूहे को कम से 1 ज के लिए रखें ।
    नोट: चैंबर 30 सेमी के एक पक्ष की लंबाई के साथ एक प्लास्टिक घन है । चैंबर के नीचे एक ~ 8 मिमी अंतराल के साथ कद्दूकस कर लोहे से बना है ।
  3. कनेक्ट करने के लिए इलेक्ट्रोड मॉड्यूल के साथ रिकॉर्डिंग headstage धीरे, चूहा डरा और इलेक्ट्रोड मॉड्यूल हानिकारक से बचने के लिए.
  4. ऊपर लेजर जनरेटर सेट, ऑप्टिक फाइबर कनेक्ट, और उपकरण ऑपरेटर मैनुअल के अनुसार लेजर के स्थान आकार समायोजित करें । डिजिटल आउटपुट को ट्रिगर जनरेटर से रिकॉर्डिंग बोर्ड के डिजिटल इनपुट पोर्ट से कनेक्ट करें ।
    नोट: ध्यान रखना नहीं ऑप्टिक फाइबर जरूरत से ज्यादा कर्ल करने के लिए बंद फाइबर तोड़ने से बचने के लिए । रिकॉर्डिंग से पहले, सुनिश्चित करें कि ट्रिगर संकेतों को प्रदर्शित कर रहे हैं और रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर द्वारा दर्ज की गई. इस प्रोटोकॉल में, दीप्तिमान गर्मी उत्तेजनाओं एक अवरक्त neodymium yttrium एल्यूमिनियम perovskite (एनडी: याप) लेजर १.३४ माइक्रोन की तरंग दैर्ध्य के साथ द्वारा उत्पंन कर रहे हैं । लेजर स्थान आकार के व्यास लेंस ध्यान केंद्रित करके लगभग 5 मिमी पर सेट है । एक वह-Ne लेजर प्रेरित क्षेत्र है, जो प्रयोग के उद्देश्य के आधार पर परिभाषित किया गया है की ओर इशारा किया । इसके अलावा, लेजर दालों की उत्तेजना ऊर्जा प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार निर्धारित किया जाता है । लेजर पल्स अवधि 4 ms है ।
  5. प्रयोगात्मक चैंबर के कोने के नीचे वीडियो कैमरा सेट करने के लिए लगातार जब इसके पंजा nociceptive लेजर उत्तेजनाओं प्राप्त चूहे के nociceptive व्यवहार रिकॉर्ड करने के लिए । nociceptive व्यवहार पूरी तरह से प्रयोग भर में दर्ज कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए कैमरे की स्थिति और दिशा को समायोजित करें ।
    नोट: एक उच्च गति चार्ज-युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरा अत्यधिक की सिफारिश की है, के रूप में यह रिकॉर्डिंग प्रणाली के मुख्य बोर्ड के लिए ऑपरेटिंग संकेतों को देने के लिए शुरुआत समय और nociceptive व्यवहार की अवधि ठीक रिकॉर्ड कर सकते हैं । Nociceptive व्यवहार प्रयोगकर्ता द्वारा प्रत्येक लेजर उत्तेजना के बाद मूल्यांकन कर रहे हैं, पहले से परिभाषित पशु आंदोलन23,24के आधार पर मानदंडों के अनुसार, इस प्रकार है: कोई आंदोलन (स्कोर = 0), सिर मोड़ (सहित मिलाते हुए या सिर तरक्की; स्कोर = 1), बच निकलने (यानी, एक छोटा सा अचानक आंदोलन मरोड़ते शरीर; स्कोर = 2), वापसी (यानी, लेजर उत्तेजना से पंजा कर्षण; स्कोर = 3), चाट और पूरे शरीर आंदोलन (स्कोर = 4) ।
  6. चैंबर के शीर्ष पर एक लाउडस्पीकर के माध्यम से चल रहे सफेद शोर (५० डीबी SPL) उद्धार ।
    नोट: के रूप में पिछले अध्ययन में दिखाया गया है10,25, लेजर त्वचा पर दिया उत्तेजना अल्ट्रासाउंड कि चूहे श्रवण प्रणाली द्वारा पता लगाया जा सकता है उत्पंन करता है । इस कारण से, चल रहे सफेद शोर प्रयोग भर में खेला जाता है लेजर जनित अल्ट्रासाउंड के जवाब में श्रवण प्रणाली के सक्रियकरण से बचने के लिए । यह प्रक्रिया मस्तिष्क प्रतिक्रियाओं के चयनात्मक रिकॉर्डिंग nociceptive प्रणाली के सक्रियण से संबंधित अनुमति देता है ।
  7. उपकरण ऑपरेटर के मैनुअल के अनुसार रिकॉर्डिंग प्रणाली का उपयोग कर, दोनों ECoG और गहराई तार इलेक्ट्रोड से electrophysiological डेटा ले लीजिए.
    नोट: कैमरा और लेजर दालों के ट्रिगर संकेतों के ऑपरेटिंग संकेतों को एक साथ एक ही नमूना दर पर electrophysiological डेटा के साथ नमूना हैं (सभी डेटा को परिलक्षित कर रहे हैं और २०,००० हर्ट्ज का एक नमूना दर का उपयोग कर डिजीटल), जो यह सुनिश्चित करता है कि सभी डेटा समय-सिंक्रनाइज़ किए जाते हैं ।
  8. चैंबर के तल में अंतराल के माध्यम से चूहे की forepaw के तल के लिए लेजर दालों उद्धार ।
    नोट: लेजर उत्तेजना ही दिया जब चूहे से अधिक 2 है प्रयोगकर्ता प्रेक्षण के आधार पर एस के लिए सहज शांति है, आंदोलन से संबंधित कलाकृतियों के संकेत संदूषण को कम करने के लिए । nociceptor थकान या संवेदीकरण से बचने के लिए, लेजर बीम के लक्ष्य को मैंयुअल रूप से प्रत्येक उत्तेजना के बाद विस्थापित है, और उत्तेजना अंतराल ४० एस से कम कभी नहीं है ECoG और LFP संकेतों प्रत्येक चूहे से कई बार दर्ज किया जा सकता है । चूहा प्रत्येक रिकॉर्डिंग सत्र से पहले प्रयोगात्मक चैंबर 1 एच में डाल दिया जाना चाहिए । सभी रिकॉर्डिंग सत्रों के बाद, चूहा गहरा anesthetized और perfused transcardially बर्फ ठंडा फॉस्फेट के साथ किया गया था-बफर खारा 4% paraformaldehyde के बाद । मस्तिष्क खोपड़ी से हटा दिया गया था और इलेक्ट्रोड पदों की पहचान करने के लिए खोदी ।

3. डेटा विश्लेषण

  1. 1 और 30 हर्ट्ज के बीच एक बैंड-पास फिल्टर के साथ सतत डेटा फ़िल्टर.
  2. 3 एस, लेजर उत्तेजनाओं की शुरुआत के बाद 2 एस से पहले 1 एस से विस्तारित की एक विश्लेषण खिड़की का उपयोग कर डेटा युग । आधारभूत सुधार का अर्थ आयाम के भीतर उत्तेजना अंतराल को घटाकर द्वारा किया जाता है ।
  3. स्वयं को अस्वीकार कछु कि सकल कलाकृतियों द्वारा प्रदूषित कर रहे हैं ।
  4. प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत के लिए लेजर उत्तेजनाओं की शुरुआत करने के लिए समय बंद कर रहे हैं कि औसत एलईपी waveforms की गणना.
  5. ECoGs और गहराई तार इलेक्ट्रोड से दर्ज एलईपी waveforms के तरंगिका रूपांतर जुटना (वर्ल्ड ट्रेड सेंटर) की गणना.
    नोट: वर्ल्ड ट्रेड सेंटर के लिए समय और आवृत्ति के एक समारोह के रूप में इलेक्ट्रोड के जोड़े के बीच जुटना प्रदर्शन तकनीक है । दो संकेतों के बीच वर्ल्ड ट्रेड सेंटर पर किसी भी समय आवृत्ति बिंदु है, जो पूरे समय आवृत्ति स्पेक्ट्रम के लिए जुटना मूल्यों पैदा करने का लाभ है के लिए गणना की जा सकती है । कार्यप्रणाली की जानकारी26को अन्यत्र बताई गई है ।

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Representative Results

प्रतिनिधि प्रयोग में पांच चूहों से electrophysiological डेटा दर्ज किया गया । लेजर उत्तेजनाओं > 40 एस उत्तेजना अंतराल के साथ 20 बार के लिए प्रत्येक चूहे के सही forepaw को दिया गया । लेजर पैदा मस्तिष्क प्रतिक्रियाओं दोनों ECoG शिकंजा और गहराई तारों का उपयोग कर दर्ज किया गया, और गहराई के तारों द्विपक्षीय प्राथमिक somatosensory cortices (एस 1) और प्राथमिक मोटर cortices (M1) में प्रत्यारोपित किया गया ।

के रूप में 1 चित्रा, दो ECoGs में संक्षेप (काले में चिह्नित) और गहराई तार इलेक्ट्रोड (रंग में चिह्नित, चार क्षेत्रों में से प्रत्येक के लिए पांच तारों) stereotaxic निर्देशांक के अनुसार निम्नलिखित पदों में रखा गया था (Bregma के संदर्भ में व्यक्त, में मिमी धनात्मक x और y अक्ष मानों का संकेत सही और पूर्वकाल स्थान, क्रमशः): बाएँ ECoG में, x =-१.५ और y = १.७५; सही ECoG में, X = १.५ और Y = १.७५; बाएं में एस 1, X =-4 और Y = ०.५; सही में एस 1, X = 4 और Y = ०.५; बाएँ M1 में, X =-3 और Y = 3; दाएं M1 में, X = 3 और Y = 3 ।

चित्रा 2 सभी इलेक्ट्रोड से कच्चे electrophysiological डेटा से पता चलता है (दो ECoG शिकंजा प्लस चार पांच टंगस्टन तारों से, प्रत्येक मस्तिष्क क्षेत्र में पांच टंगस्टन तारों), लेजर उत्तेजना की शुरुआत के साथ एक ऊर्ध्वाधर डॉट लाइन द्वारा चिह्नित । कृपया ध्यान दें कि स्पष्ट एलईपी प्रतिक्रियाओं लेजर उत्तेजना की शुरुआत के बाद detectable हैं ।

चित्रा 3 पांच चूहों के छह इलेक्ट्रोड (दो ECoG शिकंजा प्लस चार टंगस्टन तारों, प्रत्येक मस्तिष्क क्षेत्र में एक प्रतिनिधि टंगस्टन तार) से समूह स्तर औसत एलईपी waveforms से पता चलता है. रिकॉर्डिंग साइट के बावजूद, एलईपी प्रतिक्रियाओं एक प्रमुख नकारात्मक झुकाव (N1 वेव) से मिलकर बनता है । विलंबता और N1 लहर के आयाम निंनानुसार है (± SEM मतलब): वाम ECoG के लिए, १४३ ± 9 ms और-५१ ± 4 µV; सही ECoG के लिए, १४५ ± 9 ms और-४७ ± 4 µV; वाम एस 1, १४९ ± 9 एमएस और ८६ ± 7 µV के लिए; सही एस 1, १६८ ± 10 एमएस और ७१ ± 6 µV के लिए; वाम M1 के लिए, १७९ ± 12 ms और-७४ ± 7 µV; दाएं M1, १८५ ± 11 ms और-६३ ± 6 µV के लिए । महत्वपूर्ण बात, N1 विलंब में द्विपक्षीय ECoG और LFP contralateral से दर्ज संकेतों के समान हैं, जो स्पष्ट रूप से ipsilateral एस 1 और द्विपक्षीय M1 से दर्ज की तुलना में कम कर रहे हैं । इसके विपरीत, N1 आयाम contralateral एस में सबसे बड़ा है और द्विपक्षीय ECoGs में सबसे छोटी ।

चित्रा 4 LEPs ECoG शिकंजा का उपयोग कर नमूना के बीच वर्ल्ड ट्रेड सेंटर से पता चलता है (दो ECoG शिकंजा से संकेत औसत थे) और गहराई तार अलग मस्तिष्क क्षेत्रों में (सही एम 1, राइट एस 1, वाम M1, और बाएं एस 3) । ध्यान दें कि contralateral (बाएं) एस 1 और m1 ipsilateral (दाएं) एस 1 और m1 गामा आवृत्ति बैंड में (५०-१०० हर्ट्ज) से एक उच्च जुटना दिखाया ।

Figure 1
चित्र 1: इलेक्ट्रोड आरोपण सेट-अप । गहराई तार इलेक्ट्रोड के आरोपण से पहले, एक सुरक्षात्मक खोल आधार cranium पर रखा गया है, और ECoG इलेक्ट्रोड के रूप में इस्तेमाल किया शिकंजा पूर्वनिर्धारित छेद में संचालित कर रहे हैं और दंत एक्रिलिक द्वारा तय की. चार छेद गहराई तार इलेक्ट्रोड के आरोपण के लिए ड्रिल्ड कर रहे हैं (उदाहरणके लिए, टंगस्टन तार arrays) बाएँ और दाएँ एस 1 और M1, क्रमशः के शीर्ष पर पदों पर. संदर्भ और जमीन इलेक्ट्रोड के रूप में इस्तेमाल किया शिकंजा 2 और 4 मिमी लैंब्डा को caudally और सुरक्षात्मक खोल आधार के साथ तय रखा जाता है । बाईं तरफ पैनल एक सुरक्षात्मक शैल आधार के प्रत्यारोपण के बाद सर्जरी की तस्वीर से पता चलता है । सही पर पैनल सर्जरी के चित्र है, जो सुरक्षात्मक खोल आधार के सामांय आकार से पता चलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: एक प्रतिनिधि चूहे के कच्चे electrophysiological डेटा । प्रदर्शित संकेत दो ECoGs और 20 गहराई तार इलेक्ट्रोड के साथ एक प्रतिनिधि चूहे से दर्ज कर रहे हैं (प्रत्येक मस्तिष्क क्षेत्र में पांच इलेक्ट्रोड), 2 मिमी caudally स्थित इलेक्ट्रोड का उपयोग कर लैंब्डा संदर्भ के रूप में. लेजर उत्तेजना की शुरुआत एक ऊर्ध्वाधर डॉट लाइन का उपयोग कर चिह्नित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: समूह स्तर औसत एलईपी waveforms. प्रदर्शित औसत संकेत पांच चूहों से दो ECoGs और चार गहराई तार इलेक्ट्रोड पर (प्रत्येक मस्तिष्क क्षेत्र में एक प्रतिनिधि इलेक्ट्रोड), 2 मिमी caudally स्थित इलेक्ट्रोड का उपयोग कर लैंब्डा संदर्भ के रूप में दर्ज कर रहे हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: तरंगिका परिणत जुटना । प्रदर्शित परिणाम अलग मस्तिष्क क्षेत्रों में ECoG शिकंजा और गहराई तारों का उपयोग कर नमूना LEPs के बीच तरंगिका को बदलने के लिए प्रदर्शन दिखा (सही एम 1, राइट एस 1, वाम m1, और बाएं s). जुटना संबंधित आधारभूत करने के लिए सामान्यीकृत था (लेजर उत्तेजना शुरू करने से पहले ०.५ एस) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

वर्तमान अध्ययन में, हम समवर्ती रिकॉर्ड करने के लिए एक तकनीक का वर्णन किया ECoGs और स्वतंत्र रूप से चलती चूहों से nociceptive लेजर उत्तेजनाओं से cortical LFP प्रतिक्रियाओं । परिणाम से पता चला है कि एलईपी प्रतिक्रियाओं स्पष्ट रूप से दोनों ECoG और LFP संकेतों में लेजर उत्तेजनाओं की शुरुआत के बाद पता लगाया जा सकता है । ECoG और cortical LFP संकेतों की एक साथ रिकॉर्डिंग से वैज्ञानिकों को एलईपी घटकों के लिए ंयूरॉंस की गतिविधियों के योगदान को बेहतर ढंग से समझने के लिए उनके संबंध की जांच कर सकेंगे ।

प्रस्तावित तकनीक में पांच अहम कदमों पर ध्यान दिया जाना चाहिए । सबसे पहले, यह सुनिश्चित करें कि cranium की सतह साफ है और उस पर सुरक्षात्मक खोल आधार फिक्सिंग से पहले सूखी है बनाने के लिए महत्वपूर्ण है, दंत एक्रिलिक का उपयोग कर । सुरक्षात्मक शेल आधार छुरा निश्चित है कि यह चरण सक्षम करता है । दूसरा, ECoG शिकंजा के व्यास के बाद से थोड़ा छेद की तुलना में बड़ा है, प्रारंभिक पेंच ड्राइविंग पेंच धागा बनाने के लिए छेद में इजाफा होगा । वर्तमान अध्ययन में, टंगस्टन तारों और ECoG पेंच के लिए छेद के लिए छेद के बीच की दूरी बहुत छोटा है (जैसे, ०.३ मिमी से कम) । सभी छेद ECoG पेंच ड्राइविंग और गहराई तार प्रविष्टि से पहले ड्रिल्ड कर रहे हैं, ECoG छेद के आसपास खोपड़ी नाजुक हो जाएगा, और यह पेंच ड्राइविंग के दौरान छेद बढ़ने के यांत्रिक लोड सहन नहीं होगा । इस कारण से, ECoG शिकंजा टंगस्टन तार प्रविष्टि के लिए छेद ड्रिलिंग करने से पहले पेंच धागा फार्म करने के लिए छेद में संचालित होने की जरूरत है । जब टंगस्टन तारों के लिए छेद ड्रिलिंग दृश्य डाला ECoG शिकंजा बाधा, यह सिफारिश की है कि वे बाहर संचालित किया जा करने के लिए कर रहे हैं और प्रोटोकॉल के चरण १.१४ के बाद फिर से संचालित. तीसरा, जब गहराई तार इलेक्ट्रोड डालने, प्रयोगकर्ता टंगस्टन तारों की नोक पर प्रतिरोध करने के लिए ध्यान देने के लिए माना जाता है, जो आम तौर पर इंगित करता है कि गहराई तारों खोपड़ी या बाडी है कि नहीं किया गया है पर छेद किनारे से अवरुद्ध कर रहे हैं पूरी तरह से हटा दिया । यदि यह मामला है, गहराई तारों उठाया जाना चाहिए, और संभावित बाधाओं इलेक्ट्रोड20डालने से पहले साफ किया जाना चाहिए । चौथा, जब इलेक्ट्रोड आरोपण के बाद मोम और आयल तेल के मिश्रण के साथ craniotomy छेद भरने, प्रत्यारोपित तारों बाहरी ताकतों द्वारा दबाया नहीं किया जाना चाहिए. इसलिए, यह electrocoagulator का उपयोग कर पास रखा मिश्रण पिघल करने के लिए बेहतर है । पांचवां, यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि लेजर अंत टुकड़ा और चूहे पर लक्ष्य साइट के बीच की दूरी लगभग 1 सेमी पर रखा है गारंटी है कि कथित लेजर ऊर्जा विभिंन परीक्षणों के बीच संगत कर रहे है10,25।

वास्तव में, सुनिश्चित करें कि सुरक्षात्मक कवच को कवर और पूरे तंत्र की रक्षा कर सकते हैं बनाने के लिए, खोल के आकार को अपेक्षाकृत बड़े (३.५ मिमी के एक पक्ष की लंबाई के साथ एक घन) है चूहे के सिर की तुलना में बनाया गया है । चूहे के आंदोलन पर-the-सिर डिवाइस के प्रभाव को कम करने के लिए, हम प्रयोग में अधिक से अधिक ४०० जी तौला जो चूहों का उपयोग करने की सलाह देते हैं । इस कारण से, इस तकनीक को चूहे के मॉडल में परिष्कृत व्यवहार का अध्ययन नहीं किया जा सकता है और छोटे जानवरों (जैसे, चूहों) के अंय मॉडलों में नहीं अपनाया जाना चाहिए । विशेष रूप से, प्रस्तावित तकनीक को अंय तकनीकों इस प्रकार कई अंय अनुप्रयोगों के विस्तार के साथ गठबंधन किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, इस तकनीक को आसानी से विभिंन उत्तेजनाओं (जैसे, श्रवण और दृश्य)27,28 की उत्तेजनाओं द्वारा पैदा मस्तिष्क प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करने के लिए लागू किया जा सकता है और मनोरोग रोगों के मस्तिष्क सुविधाओं की पहचान करने में लागू ( जैसे, मिर्गी)29 आज़ादी से चलती चूहों, जो उनके संबंधित तंत्रिका तंत्र की जांच को बढ़ावा देने में होगा । इसके अलावा, इलेक्ट्रोड आरोपण के बारे में एक महीने के लिए परीक्षण का सामना कर सकते हैं, जो भविष्य में एक अनुदैर्ध्य अध्ययन करने की संभावना प्रदान करता है.

कुल मिलाकर, हम एक वैध तकनीक प्रदान करने के लिए एक साथ स्वतंत्र रूप से चलती चूहों से ECoG और LFP गतिविधियों रिकॉर्ड । यह तकनीक हमें mesoscopic और macroscopic दोनों स्तरों पर मस्तिष्क में सूचना संसाधन की जांच करने में सक्षम बनाती है । यह मानव शरीर क्रिया विज्ञान और pathophysiology की एक बेहतर समझ के लिए प्रयोगात्मक पशु निष्कर्षों दस्तावेज के लिए शोधों के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा करने के लिए कुछ नहीं है.

Acknowledgments

यह काम कैस कुंजी मानसिक स्वास्थ्य, मनोविज्ञान संस्थान, चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था (३१६७११४१ और ३१८२२०२५), 13वें पांच वर्षीय Informatization योजना के चीनी अकादमी ऑफ साइंसेज (XXH13506), और मनोविज्ञान संस्थान, चीनी विज्ञान अकादमी (Y6CX021008) के वैज्ञानिक फाउंडेशन परियोजना ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Male Sprague-Drawley rats Vital River
Isoflurane RWD Life Science
Small animal isoflurane anaesthetic system RWD Life Science Including the anesthesia gas mask for rats
Stereotaxic apparatus RWD Life Science
The apparatus with combined ECoG and LFP electrodes The apparatus is home-made, which assembles the ECoG and depth wire electrodes to a connector module
3D-printed protective shell The texture of shell is polylactic, and the shell is home-made and contains three parts: a base, a wall and a cap. The wall is covered by copper tapers to construct as a Faraday cage
Tungsten wires (diameter: 50 mm) California Fine Wires Company The electrodes for cortical LFP recording
 Stainless steel screws
(diameter: 0.6 mm)		 The electrodes for ECoG recording
Electric cranial drill RWD Life Science
 Drill bit (diameter: 0.5 mm) RWD Life Science The drill is used for drilling the holes of ECoG screws
 Drill bit (diameter: 0.2 mm) RWD Life Science The drill is used for drilling the holes of depth wires 
Dental arylic powder SNC dental
Dental arylic liquid SNC dental
Paraffin Fisher Scientific The mixture is used for seal the craniotomy to ensure the following movement of micro-wire arrays
Mineral Oil Fisher Scientific
Electrocoagulator  Bovie medical Corporation
RHD2132 Amplifier Boards  Intan Technologies A 32-channel headstage
RHD2000 systerm Intan Technologies The data acquisition systerm
Infrared neodymium yttrium aluminum perovskite (Nd:YAP) laser generator Electronical Engineering
Matlab R2016b The MathWorks 

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References

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व्यवहार समस्या १४३ इलॅक्ट्रोसेफेलॉग्राम (ईईजी) electrocorticogram (ECoG) स्थानीय क्षेत्र क्षमता (LFP) लेजर पैदा की क्षमता (एलईपी) दर्द पशु मॉडल एक साथ रिकॉर्डिंग
स्वतंत्र रूप से चलती चूहों से Nociceptive लेजर उत्तेजनाओं के जवाब में Cortical स्थानीय क्षेत्र क्षमता और Electrocorticograms के एक साथ रिकॉर्डिंग
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Yue, L., Zhang, F., Lu, X., Wan, Y., Hu, L. Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials and Electrocorticograms in Response to Nociceptive Laser Stimuli from Freely Moving Rats. J. Vis. Exp. (143), e58686, doi:10.3791/58686 (2019).

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