Summary
We ontwikkelden een techniek die gelijktijdig zowel electrocorticography als lokale veld potentieel in reactie op Nociceptieve laser stimuli vrij bewegen ratten vastgelegd. Deze techniek helpt een directe relatie van electrocortical signalen op de mesoscopische en macroscopische niveau, dat vergemakkelijkt het onderzoek van Nociceptieve informatieverwerking in de hersenen.
Abstract
Electrocortical reacties, ontlokte door warmte laserpulsen die selectief Nociceptieve vrije zenuwuiteinden activeren, worden veel gebruikt in veel dierlijke en menselijke studies te onderzoeken van de corticale verwerking van Nociceptieve informatie. De mogelijkheden van deze laser-opgeroepen hersenen (LEPs) bestaan uit verschillende tijdelijke reacties, die tijd-vergrendeld aan het begin van laser stimuli zijn. De functionele eigenschappen van de LEP reacties zijn echter nog steeds grotendeels onbekend, vanwege het ontbreken van een bemonstering techniek die gelijktijdig van neurale activiteiten aan het oppervlak van de cortex (dat wil zeggen, electrocorticogram [ECoG] en hoofdhuid opnemen kan electroencephalogram [hoofdhuid EEG]) en in het brein (d.w.z., lokale veld potentiële [LFP]). Om dit probleem te verhelpen, presenteren we hier een dierlijke protocol met vrij bewegende ratten. Dit protocol is samengesteld uit drie belangrijkste procedures: (1) de dierlijke voorbereiding en chirurgische ingrepen, (2) een gelijktijdige opname van ECoG en LFP in antwoord op stimuli van Nociceptieve laser, en (3) gegevensextractie analyse en functie. In het bijzonder met de hulp van een 3D-gedrukte beschermende shell, werden ECoG zowel LFP elektroden geïmplanteerd op de rat's schedel veilig samengehouden. Tijdens het verzamelen van gegevens, werden laserpulsen uitgebracht op de rat forepaws door gaten in de bodem van de kamer toen het dier in spontane stilte. Lopende witte ruis werd gespeeld om te voorkomen dat de activering van het auditieve systeem door de laser-geproduceerde ultrasone klanken. Dientengevolge, werden alleen Nociceptieve antwoorden selectief opgenomen. Met behulp van de analytische standaardprocedures (b.v., band pass filter epoch extractie en correctie van de basislijn) uitpakken van stimulus-gerelateerde hersenen reacties, verkregen we resultaten liet zien dat LEPs met een hoge signaal-ruisverhouding tegelijkertijd opgenomen van de ECoG en LFP elektroden. Deze methodiek maakt het gelijktijdig opnemen van ECoG en LFP activiteiten mogelijk, die voorziet in een brug van signalen van de electrocortical op de mesoscopische en macroscopische niveau, teneinde het onderzoek van Nociceptieve informatieverwerking in de hersenen.
Introduction
EEG is een techniek om elektrische potentialen en oscillerende hersenen activiteiten gegenereerd door de gesynchroniseerde activiteiten van duizenden van neuronen in de hersenen te registreren. Volksmond wordt gebruikt in veel basisonderzoek en klinische toepassingen1,2. Bijvoorbeeld, EEG reacties op intense laser warmte pulsen (d.w.z., LEPs) zijn alom aangenomen om te onderzoeken van de perifere en centrale verwerking van Nociceptieve sensorische input3,4,5. Bij de mens, LEPs voornamelijk bestaan uit drie verschillende verlegging: de vroege component (N1) thats somatotopically georganiseerd en waarschijnlijk aan de activiteit van de primaire Somatosensorische cortex (S1)6en de late onderdelen (N2 en P2) die centraal gedistribueerde en meer kans om na te denken van de activiteit van de secundaire Somatosensorische cortex, insula en anterior cingularis cortex7,8. In vorige studies9,10, we toonden aan dat rat LEPs, bemonsterd met behulp van de ECoG (een soort intracraniële EEG) van elektroden direct op het blootgestelde oppervlak van de hersenen geplaatst, ook bestaan uit drie verschillende verlegging ( dat wil zeggen, somatotopically georganiseerd N1 en de Centraal gedistribueerde N2 en P2). De polariteit, de volgorde en de topografie van de rat LEP componenten zijn vergelijkbaar met menselijke LEPs11. Echter, als gevolg van de beperkte ruimtelijke resolutie van de hoofdhuid EEG en subduraal ECoG opnames12, evenals het onjuiste karakter van de EEG source analyse technieken13, de gedetailleerde bijdrage van de neurale activiteiten aan het LEP-componenten veel is besproken. Het is bijvoorbeeld onduidelijk wanneer en de mate waarin S1 tot het eerste deel van de corticale reactie (N1 bijdraagt) ontlokte door laser stimuli6.
Anders dan de opname-techniek in de macroscopische niveau, directe intracraniële opnamen met behulp van microwire arrays geholpen door een stereotaxic apparaat en microdrives14,15 kon meten neurale activiteiten (b.v.LFPs ) voor specifieke regio's. LFPs weerspiegelen voornamelijk de sommatie van remmende of excitatory postsynaptisch potentieel van neuronale bevolking16. Aangezien LFP-bemonsterd neurale activiteiten neuronale processen die zich voordoen binnen honderden van micrometers rond de opname-elektrode weerspiegelen, wordt deze opname-techniek veel gebruikt om te onderzoeken van de informatieverwerking in de hersenen op het niveau van de mesoscopische. Echter alleen richt zich op precieze lokale wijzigingen van de activiteiten van de hersenen en kan niet antwoord op de vraag hoe de signalen van meerdere regio's worden geïntegreerd (bijvoorbeeldhoe LEP componenten zijn geïntegreerd op meerdere hersengebieden).
Het is vermeldenswaard dat de gelijktijdige opname van een ECoG en corticale LFPs vrij bewegen ratten het onderzoek van corticale informatieverwerking bij beide macroscopische zou kunnen vergemakkelijken en mesoscopische niveaus. Bovendien, biedt deze methode een uitstekende gelegenheid om te onderzoeken van de mate waarin de neurale activiteiten van de vooraf gedefinieerde hersengebieden tot de LEPs bijdragen. Inderdaad, verscheidene vorige studies hebben de samenhang tussen spikes, corticale LFP, beoordeeld en ECoG signalen17,18 en aangetoond dat de LFP19,20 grenzend aan de EEG-elektrode tot bijdraagt de vorming van de hersenen van de stimulus-gerelateerde reacties. De bestaande techniek wordt echter meestal gebruikt om vast te leggen van de hersenen antwoorden van narcose dieren als gevolg van het ontbreken van een beschermende shell om te voorkomen dat de elektroden wordt beschadigd door de botsing. Met andere woorden, ontbreekt de techniek die konden bouwen de brug van electrocortical signalen op de mesoscopische (corticale LFP) en macroscopische (EEG en ECoG) niveau in vrij verplaatsen ratten nog.
Om dit probleem te verhelpen, ontwikkelden we een techniek die een ECoG en corticale LFPs in meerdere hersengebieden gelijktijdig van de vrij bewegende ratten kan vastleggen. Deze techniek helpt de directe relatie van signalen van de electrocortical op de mesoscopische en macroscopische niveau, waardoor het onderzoek van Nociceptieve informatieverwerking in de hersenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Volwassen mannelijke Sprague-Dawley ratten (gewicht 400-450 g) werden gebruikt in het experiment. Alle chirurgische en experimentele procedures gevolgd de gids voor de zorg en het gebruik van de dieren van het laboratorium van het National Institutes of Health. De procedures werden goedgekeurd door de ethische commissie van onderzoek bij het Institute of Psychology, Chinese Academie van Wetenschappen.
1. elektrode implantatie
- Anesthetize de rat in een kamer met 5% Isofluraan en een lucht debiet van 1 L/min vóór de operatie.
- Met behulp van een stereotaxic apparaat, het herstellen van de kop van de rat met zijn neus in de verdoving masker geplaatst. Beheren Isofluraan via de verdoving masker bij een concentratie van 2% met een debiet van de lucht van 0.5 L/min om de diepte van de verdoving tijdens de operatie. Merk op dat de chirurgische tolerantie wordt bereikt wanneer de rat niet reageert op de teen-knijpen.
- Ophthalmic zalf toepassen in de ogen te voorkomen dat het drogen van het hoornvlies.
- De bovenkant van de hoofdhuid van de rat met behulp van een standaard scheerapparaat te scheren.
- Het steriliseren van de hoofdhuid met de medische iodophor desinfecterende oplossing en 75% alcohol te verwijderen van de jodium.
- Lidocaïne (2%) injecteren op de hoofdhuid voor lokale analgesie. Beheren van atropine (0,2 mL i.p.) om te remmen van de respiratoire hypersecretion.
- Maak een incisie middellijn van ongeveer 2-3 cm op de hoofdhuid met behulp van een scalpel. Een deel van de hoofdhuid langs de middellijn verwijderen, knippen en bloot de schedel. Gebruik de electrocoagulator om te stoppen met het bloeden, wanneer dat nodig is.
- Mark de locaties van de ECoG elektroden op basis van de vooraf gedefinieerde stereotaxic coördinaten (geplaatst volgens de positie van Bregma) en de locaties van de referentie- en grond elektroden op de middellijn (geplaatst 2 en 4 mm caudally tot de Lambda, respectievelijk).
- Gaten boren (diameter: 0,5 mm) voor de ECoG schroeven, met behulp van een elektrische craniale boor op de schedel op de gemarkeerde plaatsen, zonder vernietiging van de dura.
- Rijden van een roestvrij stalen schroef (buitendiameter: 0.6 mm), die verbinding maakt met de isolatie-gecoat koperdraad, in het gat voor ongeveer 1 mm diepte zonder het penetreren van de onderliggende dura. Deze schroeven fungeren als ECoG, verwijzing en grond elektroden tijdens het experiment.
- Plaats een beschermende shell baseren op de schedel. Fix de base met de aangrenzende schroeven op de schedel met behulp van tandheelkundige acryl. Gebruik medische katoen die daarna ter bescherming van het gebied dat is bedoeld om te worden gebruikt voor diepte draad implantatie van worden gedekt kan worden verwijderd.
Opmerking: De beschermende shell is een product speciaal ontworpen 3D-gedrukte polylactic, die uit drie delen bestaat: een base, een muur en een cap. De muur is bedekt door koper taps toelopende delen te bouwen als een kooi van Faraday. - De locaties van de diepte draad elektroden op basis van de vooraf gedefinieerde stereotaxic coördinaten te markeren.
- Kleine gaatjes te boren (diameter: 0.2 mm) op de schedel rond de gemarkeerde locaties voor de inplanting van de draad, en verwijder voorzichtig de bot klep om de dura bloot te stellen. Wassen de craniotomy vaak met behulp van normale zout. Figuur 1 beschrijft de set-up voor de inplanting van de diepte draad elektroden.
- Met behulp van een naald, heffen en snijd de dura zonder beschadiging van de pia mater, schepen en het oppervlak van de neocortex.
- Lager de diepte draad elektroden aan het oppervlak van de neocortex en, vervolgens, in de hersenen tot de doeldiepte langzaam binnendringen. Vaak stoppen met bewegen naar beneden de elektroden voor corticale veerkracht. In de huidige studie is de diepte van het uiteinde van de draad 0,5 mm onder de corticale oppervlakte.
- Het zegel van de craniotomy met een mengsel van wax en paraffine olie om ervoor te zorgen dat de diepte draad elektroden voor latere experimentele manipulaties kunnen worden verplaatst.
- Vaststellen van de elektrode-apparaat met behulp van tandheelkundige acryl op de schedel.
- Lassen van elke koperen draad die verbinding met de ECoG schroef naar de bijbehorende zender op de connector-module maakt. Betrekking hebben op de lassen plekken met klei om te voorkomen dat potentiële contact tussen verschillende kanalen.
- De beschermende shell-muur te monteren aan de base en lassen van de referentie- en grond elektroden naar de corresponderende kanalen.
- Vaststellen van het GLB naar de beschermende shell met behulp van tapes om verontreiniging te voorkomen.
- Injecteer de rat met penicilline (60.000 U, i.p.) onmiddellijk na de operatie ter voorkoming van postoperatieve infecties.
- Single-huis de rat in een temperatuur en vochtigheid-gestuurde cage en bewaar het op een dag/nacht-cyclus van 12 uur na de operatie, met voedsel en water ad libitum voor ten minste een week voorafgaand aan het LEP-experiment.
Opmerking: Als u wilt tegelijkertijd opnemen ECoG en corticale LFP activiteiten, een apparaat werd hier gebruikt die was gemonteerd met twee soorten gekoppeld aan een verbindingslijn-module, die verschillende microdrives gekoppeld aan de draad-arrays van wolfraam elektroden. De gouden pennen werden gebruikt om de wolfraam draden verbinden met de elektrode-interfacekaart (EIB) van de connector-module door de draden in kleine metalen gaten op de EIB te drukken. Twee metalen gaatjes aan de EIB werden gesoldeerd met gecoate koperen draden en het open uiteinde van elke draad van koper was gesoldeerd met de overeenkomstige koperdraad verbonden met ECoG schroef. De details van de fabricage geweest21elders beschreven.
2. de gegevensverzameling
- Prikkelen de rat minstens 1 x per dag gedurende drie of meer opeenvolgende dagen voordat het experiment om ervoor te zorgen dat de rat vertrouwd met de experimentator22krijgt.
- Plaats de rat in de zaal gedrag gedurende ten minste 1 uur voordat het experiment om dat de rat acclimatizes op de opnameomgeving.
Opmerking: De zaal is een kunststof kubus met een lengte van de zijde van 30 cm. De bodem van de kamer bestaat uit een ijzeren rooster met ~ 8 mm gaten. - Sluit de opname headstage met de elektrode-module zachtjes, om te voorkomen dat de rat schrikken en beschadiging van de elektrode-module.
- Instellen van de laser-generator, sluit de optische vezel en aanpassen van de plek grootte van de laser volgens de gebruiksaanwijzing van de apparatuur. Sluit de digitale uitgang van de generator van de trigger aan op de digitale ingang poort van de opname van bestuur.
Opmerking: Wees voorzichtig niet te krullen van de optische vezel overdreven om te voorkomen dat de vezel te verbreken. Voordat u gaat opnemen, ervoor te zorgen de trigger-signalen worden weergegeven en vastgelegd door de opnamesoftware. In dit protocol, stralende-warmte prikkels worden gegenereerd door een infrarood neodymium-yttrium aluminium perovskiet (Nd: YAP) laser met een golflengte van 1,34 μm. De diameter van de laser ter plaatse grootte ligt op ongeveer 5 mm door focus lenzen. Een hij-Ne laser waarnaar het gestimuleerd gebied, die gedefinieerd is afhankelijk van het doel van het experiment. Ook wordt de energie van de stimulans van de laserpulsen bepaald volgens de proefopzet. De laser impulstijd is 4 ms. - Stel de videocamera onder de hoek van de experimentele kamer voortdurend de Nociceptieve gedrag van de rat opnemen wanneer haar poot Nociceptieve laser prikkels ontvangt. Pas de positie en de richting van de camera om te controleren of dat de Nociceptieve gedragingen worden volledig opgenomen gedurende het gehele experiment.
Opmerking: Een snelle charge - coupled apparaat (CCD) camera is sterk aanbevolen, omdat het de operationele signalen aan het moederbord van het opnamesysteem leveren kan te registreren de tijd van het begin en de duur van de Nociceptieve gedrag juist. Nociceptieve gedragingen worden beoordeeld door de experimentator na elke laser stimulus, volgens eerder gedefinieerde criteria die zijn gebaseerd op de dierlijke verkeer23,24, als volgt: geen beweging (score = 0), hoofd-keerpunt (met inbegrip van schudden of verheffen van het hoofd; Score = 1), spier (dat wil zeggen, een klein abrupte lichaam schokken verkeer; score = 2), terugtrekking (d.w.z., paw retractie van de laser stimulus; score = 3), likken en hele lichaam beweging (score = 4). - Leveren lopende witte ruis (50 dB SPL) via een luidspreker aan de bovenkant van de kamer.
Opmerking: Zoals aangegeven in eerdere studies10,25, laser stimulatie uitgebracht op de huid genereert ultrasone klanken die kunnen worden gedetecteerd door de rat auditieve systeem. Om deze reden wordt lopende witte ruis gespeeld gedurende het gehele experiment ter voorkoming van de activering van het auditieve systeem in reactie op laser-geproduceerde ultrasone klanken. Deze procedure laat het selectief opnemen van reacties van de hersenen aan de activering van de Nociceptieve systeem gerelateerde. - Het elektrofysiologische gegevens verzamelen van de ECoG zowel de diepte draad elektroden, met behulp van het registratiesysteem volgens de gebruiksaanwijzing van de apparatuur.
Opmerking: De operationele signalen van de camera en de signalen van de laserpulsen worden tegelijkertijd bemonsterd met het elektrofysiologische gegevens tegelijkertijd trigger Samplingsnelheid (alle gegevens worden versterkt en gedigitaliseerd met behulp van een sampling rate van 20.000 Hz), die zorgt ervoor dat alle gegevens zijn tijd-gesynchroniseerd. - De laserpulsen te leveren aan de plantaire van de rat forepaw door de gaten in de bodem van de kamer.
Opmerking: De laser prikkel wordt alleen geleverd wanneer de rat spontane stilte voor meer dan 2 is s op basis van de de experimentator waarneming, om te minimaliseren van de signaal-besmetting van de beweging-gerelateerde artefacten. Om te voorkomen dat nociceptor vermoeidheid of sensibilisatie, het doel van de laserstraal wordt handmatig verplaatst na elke stimulans, en het interstimulus-interval is nooit korter is dan 40 s. ECoG en LFP signalen kunnen meerdere malen worden opgenomen van elke rat. De rat dient te worden gelegd in de experimentele zaal 1 h voor elke opnamesessie. Immers opnamesessies, de rat diep was verdoofd en geperfundeerd transcardially met ijskoude-fosfaatgebufferde zoutoplossing gevolgd door 4% paraformaldehyde. De hersenen was van de schedel verwijderd en gesegmenteerd ter identificatie van de elektrode posities.
3. de gegevensanalyse
- De continue gegevens filteren met een band-pass-filter tussen 1 en 30 Hz.
- Epoch de gegevens met behulp van een venster van de analyse van 3 s, verlengd van 1 s voordat tot 2 s na het begin van laser stimuli. Correctie van de basislijn wordt uitgevoerd door de gemiddelde amplitude binnen het prestimulus interval af te trekken.
- Handmatig verwerpen de tijdperken die zijn aangetast door bruto artefacten.
- Berekenen van de gemiddelde LEP golfvormen die tijd-vergrendeld aan het begin van de laser stimuli voor elke experimentele voorwaarde zijn.
- Berekenen de wavelet transformatie samenhang (WTC) van LEP golfvormen die vanuit ECoGs en diepte draad elektroden.
Opmerking: WTC is een techniek voor het uitvoeren van de samenhang tussen paren van elektroden als functie van de tijd en frequentie. Het WTC tussen twee signalen kan worden berekend voor elk punt van de tijd-frequentie, die het voordeel heeft van het genereren van samenhang waarden voor de hele tijd-frequentie spectrum. De bijzonderheden omtrent de methode geweest26elders beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In de representatieve experiment, werden het elektrofysiologische gegevens uit het vijf ratten geregistreerd. De laser stimuli werden geleverd aan de juiste forepaw voor elke rat voor 20 keer met > 40 s interstimulus intervallen. De laser-opgeroepen hersenen reacties werden opgenomen met behulp van de ECoG schroeven en diepte draden, zowel de diepte draden werden geïmplanteerd in bilaterale primaire somatosensorische cortices (S1) en primaire motor cortices (M1).
Zoals samengevat in Figuur 1, draad twee ECoGs (gemarkeerd in zwart) en diepte elektroden (gemarkeerd in kleur, vijf draden voor elk van de vier regio's) werden geplaatst volgens stereotaxic coördinaten in de volgende standen (uitgedrukt met betrekking tot de Bregma, in mm; positieve waarden van X en Y-as rechts en anterior locaties, respectievelijk aangeven): in de linker ECoG, X =-1.5 en Y = 1,75; in de juiste ECoG, X = 1.5 en Y = 1,75; in de linker S1, X = -4 en Y = 0,5; in de juiste S1, X = 4 en Y = 0,5; in de linker M1, X = -3 en Y = 3; in de juiste M1, X = 3 en Y = 3.
Figuur 2 toont de ruwe elektrofysiologische gegevens uit alle elektroden (vier door vijf wolfraam draden, plus twee schroeven van de ECoG vijf wolfraam draden in elke regio van de hersenen), met het begin van laser stimulus gemarkeerd met een verticale dot-lijn. Houd er rekening mee dat duidelijk LEP reacties na het begin van de laser stimulus waarneembaar zijn.
Figuur 3 toont de groep-niveau-gemiddeld LEP golfvormen van zes elektroden (twee schroeven van de ECoG plus vier wolfraam wires, een representatieve wolfraam draad in elke regio van de hersenen) van vijf ratten. Ongeacht de site van de opname bestaat de reacties van de LEP uit een dominante negatieve doorbuiging (N1 Golf). De latentie en de amplitude van de Golf van N1 zijn als volgt (gemiddelde ± SEM): voor de linker ECoG, 143 ± 9 ms en-51 ± 4 µV; voor de juiste ECoG, 145 ± 9 ms en-47 ± 4 µV; voor de linker S1, 149 ± 9 ms en-86 ± 7 µV; voor de juiste S1, 168 ± 10 ms en-71 ± 6 µV; voor de linker M1, 179 ± 12 ms en-74 ± 7 µV; voor de juiste M1, 185 ± 11 ms en-63 ± 6 µV. bovenal zijn N1 latencies in de bilaterale ECoG en LFP signalen opgenomen van de contralaterale S1 vergelijkbaar, die duidelijk korter dan degenen die vanuit de ipsilaterale S1 en bilaterale M1. N1 amplitudes zijn daarentegen in de contralaterale S1 grootste en kleinste in bilaterale ECoGs.
Figuur 4 ziet u het WTC tussen LEPs bemonsterd met behulp van de ECoG schroeven (de signalen van twee schroeven van de ECoG waren gemiddeld) en diepte draden in verschillende hersengebieden (juiste M1, juiste S1 links M1 en linker S1). Merk op dat de contralaterale (links) S1 en M1 een hogere samenhang dan de ipsilaterale (rechts) S1 en M1 op de gamma-frequentieband (50-100 Hz toonde).
Figuur 1: elektrode implantatie set-up. Voordat de inplanting van de diepte draad elektroden, een beschermende shell base wordt geplaatst op de schedel, en de schroeven gebruikt als ECoG elektroden zijn gedreven in de vooraf gedefinieerde gaten en vastgesteld door tandheelkundige acryl. Vier gaten worden geboord voor de inplanting van diepte draad elektroden (b.v., wolfraam draad matrices) op de posities op de bovenkant van de linker- en S1 en M1, respectievelijk. De schroeven gebruikt als referentie- en grond elektroden zijn geplaatst van 2 en 4 mm caudally tot de Lambda en vastgesteld met de beschermende shell basis. Het deelvenster aan de linkerkant toont de foto van chirurgie na de implantatie van een beschermende shell basis. Het paneel aan de rechterkant ziet u het diagram van de operatie, die de algemene vorm van de beschermende shell base toonde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: ruwe elektrofysiologische gegevens voor een representatieve rat. Weergegeven signalen zijn opgenomen van een representatieve rat met twee ECoGs en 20 diepte draad elektroden (vijf elektroden in elke regio van de hersenen), met behulp van de elektrode gelegen 2 mm caudally tot de Lambda als referentie. Het begin van de laser stimulus is gemarkeerd met behulp van een verticale dot-lijn. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: groep-niveau-gemiddeld LEP golfvormen. De weergegeven gemiddelde signalen zijn opgenomen uit vijf ratten op twee ECoGs en vier diepte draad elektroden (één vertegenwoordiger elektrode in elke regio van de hersenen), met behulp van de elektrode gelegen 2 mm caudally tot de Lambda als referentie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: de wavelet transformatie samenhang. De weergegeven resultaten tonen de wavelet transformatie samenhang tussen LEPs bemonsterd met ECoG schroeven en diepte draden bij verschillende hersengebieden (juiste M1, juiste S1 links M1 en linker S1). De coherentie was genormaliseerd naar de respectieve basislijn (0,5 s vóór het intreden van de stimulus laser). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In de huidige studie beschreven we een techniek om gelijktijdig opnemen van ECoGs en corticale LFP reacties ontlokte door Nociceptieve laser stimuli ratten vrij te bewegen. De resultaten toonden aan dat LEP reacties na het begin van laser stimuli in zowel de ECoG en de LFP signalen duidelijk kon worden opgespoord. De gelijktijdige opname van ECoG en corticale LFP signalen kunnen wetenschappers te onderzoeken hun relatie om beter inzicht te krijgen in de bijdrage van neuronale activiteiten aan het LEP-componenten.
Vijf kritische stappen in de voorgestelde techniek dient te worden opgemerkt. Ten eerste is het belangrijk om ervoor te zorgen dat het oppervlak van de schedel schoon en droog is voordat het verlijmen van de beschermende shell basis op het, met behulp van tandheelkundige acryl. Deze stap maakt het mogelijk dat de beschermende shell base stabiel wordt bevestigd. Ten tweede, omdat de diameter van de ECoG schroeven iets groter dan is dat van de gaten, de eerste schroef rijden zal vergroten het gat om te vormen van de schroefdraad. In de huidige studie, de afstand tussen het gat voor wolfraam draden en het gat voor de ECoG schroef is erg klein (b.v., minder dan 0,3 mm). Als alle gaten worden geboord voor de ECoG schroef rijden en diepte draad inbrengen, de schedel rond de ECoG gaten zou komen te staan, en het zou niet de mechanische belasting van de uitbreiding van het gat te dragen tijdens de schroef rijden. Om deze reden moeten de ECoG schroeven worden gereden in de gaten om te vormen van de schroefdraad vóór het gat boren voor het inbrengen van de draad wolfraam. Als de ingevoegde ECoG schroeven de weergave belemmeren bij het boren van de gaten voor de wolfraam draden, is het raadzaam dat ze moeten worden verdreven en gedreven opnieuw na stap 1.14 van het protocol. Ten derde, bij het invoegen van de elektroden van de draad van de diepte, de experimentator wordt verondersteld aandacht te besteden aan de weerstand aan het uiteinde van de draden van wolfraam, die meestal wordt aangegeven dat de diepte draden zijn geblokkeerd door de rand van het gat op de schedel of de dura die niet is volledig verwijderd. Als dit het geval is, de diepte-draden moeten worden verhoogd, en de mogelijke obstakels moeten worden gereinigd voordat de elektroden20plaats. Ten vierde, wanneer de craniotomy gaten vullen met het mengsel van wax en paraffine olie na de inplanting van de elektrode, de geïmplanteerde draden moeten niet worden ingedrukt door externe krachten. Daarom is het beter om te smelten van het nabijgelegen geplaatste mengsel met behulp van electrocoagulator. Ten vijfde, is het belangrijk ervoor te zorgen dat de afstand tussen de laser-eindstuk en de doelsite op de rat op ongeveer 1 cm om te garanderen dat de waargenomen laser energieën onder verschillende proeven10,25 strokenwordt gehouden.
Inderdaad, om ervoor te zorgen dat de beschermende shell kan dekken en beschermen het hele apparaat, de grootte van de shell is ontworpen als relatief grote (een kubus met een lengte van de zijde van 3,5 mm) in vergelijking met de rat's hoofd. Om te minimaliseren van de invloed van de over-the-head-apparaat op de rat's verkeer, is het raadzaam de ratten die woog meer dan 400 gram in het experiment te gebruiken. Om deze reden, deze techniek kan niet worden gebruikt om te studeren van geavanceerde gedrag in het rat model en niet in andere modellen van kleinere dieren (bijvoorbeeld, muizen) worden vastgesteld. Met name kan de voorgestelde techniek worden gebruikt om te combineren met andere technieken dus uit te breiden tot vele andere toepassingen. Bijvoorbeeld, deze techniek gemakkelijk kan worden toegepast op record hersenen reacties opgeroepen door stimuli van verschillende sensaties (bijv, auditieve en visuele)27,28 en toegepaste in identificeren functies van de hersenen van psychiatrische ziekten ( bijvoorbeeld, epilepsie)29 in vrij bewegende ratten, die bevorderlijk is voor het onderzoek van hun respectieve neurale mechanismen. Bovendien, kan de elektrode-implantatie weerstaan de test voor ongeveer een maand, waarin de mogelijkheid voor het uitvoeren van een longitudinaal onderzoek naar in de toekomst.
Wij bieden over het geheel genomen een geldige techniek om gelijktijdig record ECoG en LFP activiteiten vrij bewegen ratten. Deze techniek maakt het mogelijk om te onderzoeken van de informatieverwerking in de hersenen op zowel mesoscopische en macroscopische niveau. Dit is belangrijk voor translationeel onderzoek document experimentele dierlijke bevindingen voor een beter begrip van de menselijke fysiologie en pathofysiologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te verklaren.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door CAS sleutel laboratorium of Mental Health, Instituut voor psychologie, de nationale stichting van de natuurwetenschappen van China (31671141 en 31822025), de 13th vijfjarige informatisering Plan van de Chinese Academie van Wetenschappen (XXH13506), en het project van de wetenschappelijke onderbouwing van het Institute of Psychology, Chinese Academie van Wetenschappen (Y6CX021008).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Male Sprague-Drawley rats | Vital River | ||
| Isoflurane | RWD Life Science | ||
| Small animal isoflurane anaesthetic system | RWD Life Science | Including the anesthesia gas mask for rats | |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | ||
| The apparatus with combined ECoG and LFP electrodes | The apparatus is home-made, which assembles the ECoG and depth wire electrodes to a connector module | ||
| 3D-printed protective shell | The texture of shell is polylactic, and the shell is home-made and contains three parts: a base, a wall and a cap. The wall is covered by copper tapers to construct as a Faraday cage | ||
| Tungsten wires (diameter: 50 mm) | California Fine Wires Company | The electrodes for cortical LFP recording | |
| Stainless steel screws (diameter: 0.6 mm) |
The electrodes for ECoG recording | ||
| Electric cranial drill | RWD Life Science | ||
| Drill bit (diameter: 0.5 mm) | RWD Life Science | The drill is used for drilling the holes of ECoG screws | |
| Drill bit (diameter: 0.2 mm) | RWD Life Science | The drill is used for drilling the holes of depth wires | |
| Dental arylic powder | SNC dental | ||
| Dental arylic liquid | SNC dental | ||
| Paraffin | Fisher Scientific | The mixture is used for seal the craniotomy to ensure the following movement of micro-wire arrays | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | ||
| Electrocoagulator | Bovie medical Corporation | ||
| RHD2132 Amplifier Boards | Intan Technologies | A 32-channel headstage | |
| RHD2000 systerm | Intan Technologies | The data acquisition systerm | |
| Infrared neodymium yttrium aluminum perovskite (Nd:YAP) laser generator | Electronical Engineering | ||
| Matlab R2016b | The MathWorks |
References
- Klimesch, W., Doppelmayr, M., Schwaiger, J., Winkler, T., Gruber, W. Theta oscillations and the ERP old/new effect: independent phenomena? Clinical Neurophysiology. 111 (5), 781-793 (2000).
- Peng, W., et al. Brain oscillations reflecting pain-related behavior in freely moving rats. Pain. 159 (1), 106-118 (2018).
- Treede, R. D. Neurophysiological studies of pain pathways in peripheral and central nervous system disorders. Journal of Neurology. 250 (10), 1152-1161 (2003).
- Iannetti, G. D., et al. Evidence of a specific spinal pathway for the sense of warmth in humans. Journal of Neurophysiology. 89 (1), 562-570 (2003).
- Bromm, B., Treede, R. D. Nerve fibre discharges, cerebral potentials and sensations induced by CO2 laser stimulation. Human Neurobiology. 3 (1), 33-40 (1984).
- Valentini, E., et al. The primary somatosensory cortex largely contributes to the early part of the cortical response elicited by nociceptive stimuli. NeuroImage. 59 (2), 1571-1581 (2012).
- Valeriani, M., et al. Parallel spinal pathways generate the middle-latency N1 and the late P2 components of the laser evoked potentials. Clinical Neurophysiology. 118 (5), 1097-1104 (2007).
- Kuo, C. C., Yen, C. T. Comparison of anterior cingulate and primary somatosensory neuronal responses to noxious laser-heat stimuli in conscious, behaving rats. Journal of Neurophysiology. 94 (3), 1825-1836 (2005).
- Hu, L., et al. The primary somatosensory cortex and the insula contribute differently to the processing of transient and sustained nociceptive and non-nociceptive somatosensory inputs. Human Brain Mapping. 36 (11), 4346-4360 (2015).
- Xia, X. L., Peng, W. W., Iannetti, G. D., Hu, L. Laser-evoked cortical responses in freely-moving rats reflect the activation of C-fibre afferent pathways. NeuroImage. 128, 209-217 (2016).
- Jin, Q. Q., et al. Somatotopic Representation of Second Pain in the Primary Somatosensory Cortex of Humans and Rodents. The Journal of Neuroscience. 38 (24), 5538-5550 (2018).
- Lenkov, D. N., Volnova, A. B., Pope, A. R., Tsytsarev, V. Advantages and limitations of brain imaging methods in the research of absence epilepsy in humans and animal models. Journal of Neuroscience Methods. 212 (2), 195-202 (2013).
- Mouraux, A., Iannetti, G. D. Across-trial averaging of event-related EEG responses and beyond. Magnetic Resonance Imaging. 26 (7), 1041-1054 (2008).
- Li, X., et al. Extracting Neural Oscillation Signatures of Laser-Induced Nociception in Pain-Related Regions in Rats. Frontiers in Neural Circuits. 11, 71 (2017).
- Zhao, Z. F., Li, X. Z., Wan, Y. Mapping the Information Trace in Local Field Potentials by a Computational Method of Two-Dimensional Time-Shifting Synchronization Likelihood Based on Graphic Processing Unit Acceleration. Neuroscience Bulletin. 33 (6), 653-663 (2017).
- Buzsaki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature Reviews. Neuroscience. 13 (6), 407-420 (2012).
- Bimbi, M., et al. Simultaneous scalp recorded EEG and local field potentials from monkey ventral premotor cortex during action observation and execution reveals the contribution of mirror and motor neurons to the mu-rhythm. NeuroImage. 175, 22-31 (2018).
- Musall, S., von Pfostl, V., Rauch, A., Logothetis, N. K., Whittingstall, K. Effects of neural synchrony on surface EEG. Cerebral Cortex. 24 (4), 1045-1053 (2014).
- Bruyns-Haylett, M., et al. The neurogenesis of P1 and N1: A concurrent EEG/LFP study. NeuroImage. 146, 575-588 (2017).
- Kang, S., Bruyns-Haylett, M., Hayashi, Y., Zheng, Y. Concurrent Recording of Co-localized Electroencephalography and Local Field Potential in Rodent. Journal of Visualized Experiments. (129), e56447 (2017).
- Shikano, Y., Sasaki, T., Ikegaya, Y. Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials, Electrocardiogram, Electromyogram, and Breathing Rhythm from a Freely Moving Rat. Journal of Visualized Experiments. (134), e56980 (2018).
- Cloutier, S., LaFollette, M. R., Gaskill, B. N., Panksepp, J., Newberry, R. C. Tickling, a Technique for Inducing Positive Affect When Handling Rats. Journal of Visualized Experiments. (135), e57190 (2018).
- Fan, R. J., Kung, J. C., Olausson, B. A., Shyu, B. C. Nocifensive behaviors components evoked by brief laser pulses are mediated by C fibers. Physiology & Behavior. 98 (1-2), 108-117 (2009).
- Fan, R. J., Shyu, B. C., Hsiao, S. Analysis of nocifensive behavior induced in rats by CO2 laser pulse stimulation. Physiology & Behavior. 57 (6), 1131-1137 (1995).
- Hu, L., et al. Was it a pain or a sound? Across-species variability in sensory sensitivity. Pain. 156 (12), 2449-2457 (2015).
- Catarino, A., et al. Task-related functional connectivity in autism spectrum conditions: an EEG study using wavelet transform coherence. Molecular Autism. 4 (1), 1 (2013).
- Polterovich, A., Jankowski, M. M., Nelken, I. Deviance sensitivity in the auditory cortex of freely moving rats. PLoS One. 13 (6), e0197678 (2018).
- Li, G., Baker, C. L. Functional organization of envelope-responsive neurons in early visual cortex: organization of carrier tuning properties. The Journal of Neuroscience. 32 (22), 7538-7549 (2012).
- Fujita, S., Toyoda, I., Thamattoor, A. K., Buckmaster, P. S. Preictal activity of subicular, CA1, and dentate gyrus principal neurons in the dorsal hippocampus before spontaneous seizures in a rat model of temporal lobe epilepsy. The Journal of Neuroscience. 34 (50), 16671-16687 (2014).
