Summary
Wir entwickelten eine Technik, die gleichzeitig Electrocorticography und lokales Feld Potentiale in Reaktion auf Reize der nozizeptiven Laser von frei beweglichen Ratten aufzeichnet. Diese Technik hilft, eine direkte Verbindung von Electrocortical Signalen auf mesoskopischen und makroskopischen Ebene aufzubauen, die erleichtert die Untersuchung der nozizeptiven Informationsverarbeitung im Gehirn.
Abstract
Electrocortical Antworten, hervorgerufen durch Hitze Laserpulse, die selektiv nozizeptiven freie Nervenendigungen aktivieren, sind in vielen Tier- und Humanstudien verbreitet, um die kortikale Verarbeitung von nozizeptiven Informationen zu untersuchen. Diese Gehirn Laser-evozierten Potentiale (LEPs) bestehen mehrere vorübergehende Reaktionen, die zum Ausbruch von Laser Reize mal gesperrt sind. Die funktionellen Eigenschaften der LEP Antworten sind jedoch noch weitgehend unbekannt, aufgrund des Fehlens einer Sampling-Technik, die neuronalen Aktivitäten an der Oberfläche des Kortex (d.h., Electrocorticogram [ECoG] und Kopfhaut gleichzeitig aufnehmen kann Elektroenzephalogramm [Scalp EEG]) und im Inneren des Gehirns (d. h.lokale Feld möglicher [LFP]). Um dieses Problem zu beheben, stellen wir hier eine Tiere Protokoll mit frei beweglichen Ratten. Dieses Protokoll setzt sich aus drei wichtigsten Verfahren: (1) tierische Vorbereitung und chirurgische Eingriffe, (2) eine gleichzeitige Aufnahme von ECoG und LFP nozizeptiven Laser Reize und (3) Analyse und KE Datenextraktion. Insbesondere wurden mit Hilfe einer 3D-gedruckten schützende Schale, ECoG und LFP Elektroden implantiert auf die Ratte Schädel sicher zusammengehalten. Während der Datenerfassung wurden Laserpulse auf die Ratte in den Vorderpfoten durch Lücken in der Unterseite der Kammer geliefert, wenn das Tier in spontanen Stille war. Laufende weißes Rauschen wurde gespielt, um die Aktivierung des auditorischen Systems vermeiden durch Laser erzeugt Ultraschall. Infolgedessen wurden selektiv nur nozizeptiven Antworten aufgezeichnet. Verwenden die standard-analytische Verfahren (z.B., Bandpass-filtern, Epoche Extraktion und Basislinienkorrektur), Stimulus-bezogene Gehirn Antworten zu extrahieren, erhalten wir Ergebnisse zeigen, dass LEPs mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis waren gleichzeitig von ECoG und LFP Elektroden aufgezeichnet. Diese Methodik ermöglicht die gleichzeitige Aufnahme von ECoG und LFP-Aktivitäten, die schlägt eine Brücke von Electrocortical Signalen auf mesoskopischen und makroskopischen Ebene, wodurch die Untersuchung der nozizeptiven Informationsverarbeitung im Gehirn.
Introduction
EEG ist eine Technik zum Aufzeichnen von elektrischen Potentiale und oszillierenden Hirnaktivitäten durch die synchronisierten Aktivitäten von Tausenden von Nervenzellen im Gehirn erzeugt. Hiermit wird im Volksmund in vielen grundlegenden Studien und klinischen Anwendungen1,2. Zum Beispiel Wärme EEG Antworten zu intensiven Laser Impulse (d.h.LEPs) werden weit angenommen, um die periphere und zentrale Verarbeitung von nozizeptiven sensorischen input3,4,5zu untersuchen. Beim Menschen, LEPs bestehen hauptsächlich aus drei unterschiedliche Durchbiegungen: die frühen Komponente (N1), somatotop organisiert und wahrscheinlich um die Aktivität der primären somatosensorischen Cortex (S1)6widerzuspiegeln und die späten Komponenten (N2 und P2), die zentral sind verteilt und eher um die Aktivität der sekundären somatosensorischen Cortex, Insula und anterioren cingulären Cortex7,8widerzuspiegeln. In früheren Studien9,10wir bewiesen, dass Ratte LEPs, abgetastet mit ECoG (eine Art von intrakraniellen EEG) von Elektroden direkt auf der sichtbaren Oberfläche des Gehirns, auch bestehen aus drei unterschiedlichen Verformungen ( d. h., somatotop organisierte N1 und die zentral verteilte N2 und P2). Die Polarität, die Ordnung und die Topographie der Ratte LEP Komponenten ähneln menschlichen LEPs11. Jedoch aufgrund der begrenzten räumlichen Auflösung des Scalp EEG und subdurale ECoG Aufnahmen12sowie die ungenaue Natur des EEG Quelle Analyse Techniken13, der ausführliche Beitrag der neuronalen Aktivitäten auf die LEP-Komponenten viel wird diskutiert. Es ist beispielsweise unklar, ob und inwieweit die S1 zu den frühen Teil der kortikalen Antwort (N1) hervorgerufen durch Laser Reize6beiträgt.
Anders als die Aufnahmetechnik auf der makroskopischen Ebenen, direkte intrakraniellen Aufnahmen mit Microwire Arrays unterstützt von einer stereotaktischen Apparat und Microdrives14,15 konnten neuronale Aktivitäten (z.B.drängendere messen ) der einzelnen Regionen. Drängendere spiegeln vor allem die Summierung der inhibitorischen und exzitatorischen postsynaptischen Potenziale der neuronalen Bevölkerungen16. Da LFP in die Stichprobe einbezogenen neuronale Aktivitäten neuronaler Prozesse, die in Hunderten von Mikrometern rund um die Aufnahme-Elektrode widerspiegeln, ist dieser Aufnahmetechnik verbreitet, die Informationsverarbeitung im Gehirn auf der mesoskopischen Ebene zu untersuchen. Allerdings nur konzentriert sich auf präzise lokale Veränderungen der Gehirnaktivität und nicht beantworten die Frage, wie Signale aus mehreren Regionen integriert sind (z. B., wie bei mehreren Hirnregionen LEP Komponenten integriert sind).
Es ist erwähnenswert, dass die gleichzeitige Aufnahme von einem ECoG und kortikalen drängendere von frei beweglichen Ratten die Untersuchung der kortikale Informationsverarbeitung sowohl makroskopischen erleichtern könnte und mesoskopischen Ebenen. Darüber hinaus bietet diese Methode eine ausgezeichnete Gelegenheit zu untersuchen, inwieweit die neuronalen Aktivitäten der vordefinierten Hirnregionen zur die LEPs beitragen. In der Tat mehrere frühere Studien beurteilten die Kohärenz zwischen Spikes, kortikale LFP und ECoG signalisiert17,18 und gezeigt, dass die LFP19,20 angrenzend an die EEG-Elektroden, trägt die Bildung von Stimulus-bezogene Gehirn Antworten. Jedoch wird die vorhandene Technik in der Regel verwendet, um Gehirn Antworten von narkotisierten Tieren durch das Fehlen von eine schützende Hülle zu verhindern, dass die Elektroden durch die Kollision beschädigt aufzeichnen. Das heißt, fehlt die Technik, die den Bau der Brücke von Electrocortical Signalen auf mesoskopischen (kortikale LFP) und makroskopischen (EEG und ECoG) Ebene in konnte frei beweglichen Ratten noch.
Um dieses Problem zu beheben, entwickelten wir eine Technik, die eine ECoG und kortikalen drängendere in mehreren Gehirnregionen gleichzeitig von frei beweglichen Ratten aufnehmen konnte. Diese Technik hilft, die direkte Beziehung von Electrocortical Signalen auf mesoskopischen und makroskopischen Ebene und erleichtert so die Untersuchung von nozizeptiven Informationsverarbeitung im Gehirn zu schaffen.
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Protocol
Erwachsene männlichen Sprague-Dawley Ratten (mit einem Gewicht von 400-450 g) wurden in das Experiment verwendet. Alle chirurgischen und experimentelle Verfahren folgte dem Führer zur Pflege und Verwendung von Labortieren von den National Institutes of Health. Die Verfahren wurden von der Ethikkommission der Forschung am Institut für Psychologie, Chinese Academy of Sciences genehmigt.
1. Elektrode Implantation
- Die Ratte in eine Kammer mit 5 % Isofluran und einen Luftdurchsatz von 1 L/min vor der Operation zu betäuben.
- Befestigen Sie mit einem stereotaktischen Apparat der Kopf der Ratte mit seiner Nase in die Narkose Maske gelegt. Verwalten Sie Isofluran über die Narkose Maske in einer Konzentration von 2 % mit einer Luftmenge von 0,5 L/min, die Narkose Tiefe während der Operation beizubehalten. Beachten Sie, dass die chirurgische Toleranz erreicht wird, wenn die Ratte reagiert nicht auf Zeh kneifen.
- Gelten Sie ophthalmologische Salbe für die Augen, Hornhaut trocknen zu vermeiden.
- Die Spitze der Ratte Kopfhaut mit einem standard Rasierer zu rasieren.
- Sterilisieren Sie die Kopfhaut mit der medizinischen Jodophor desinfizierende Lösung und 75 % Alkohol um das Jod zu entfernen.
- Injizieren Sie Lidocain (2 %) in der Kopfhaut für lokale Analgesie. Verwalten von Atropin (0,2 mL i.p) um Atemwege Hyperëkretion hemmen.
- Machen Sie einen Mittellinie Schnitt von ca. 2-3 cm auf der Kopfhaut mit einem Skalpell. Schneiden Sie und nehmen Sie Teil an der Kopfhaut entlang der Mittellinie und setzen Sie die Schädel. Verwenden Sie die Elektrokoagulator zu stoppen die Blutung, wenn nötig.
- Markieren Sie die Positionen der ECoG Elektroden basierend auf vordefinierten stereotaktischen Koordinaten (entsprechend der Position des Bregma platziert) und die Standorte der Referenz und Boden Elektroden auf der Mittellinie (2 und 4 mm kaudal an den Lambda-Ausdruck bzw. platziert).
- Bohren Sie Löcher (Durchmesser: 0,5 mm) für die ECoG-Schrauben verwenden eine kraniale Bohrmaschine auf den Schädel an den markierten Standorten ohne Zerstörung der Dura.
- Fahren Sie eine Edelstahl-Schraube (außen-ø: 0,6 mm), die verbindet sich mit der Isolierung beschichtet Kupferdraht in das Loch ca. 1 mm Tiefe ohne die zugrunde liegenden Dura einzudringen. Diese Schrauben dienen als ECoG, Referenz und Masseelektroden während des Experiments.
- Stellen Sie eine schützende Hülle auf den Schädel. Befestigen Sie den Sockel mit seinen angrenzenden Schrauben auf den Schädel mit dental Acryl. Verwenden Sie medizinische Baumwolle, die später entfernt werden könnte, um das Gebiet zu schützen, das für die Tiefe Draht Implantation verdeckt wird verwendet werden soll.
Hinweis: Die schützende Hülle ist ein speziell angefertigte 3D-gedruckten Polymilchsäure-Produkt, das aus drei Teilen besteht: eine Basis, eine Wand und eine Mütze. Die Wand wird durch Kupfer verjüngt sich auf wie ein Faradayscher Käfig bauen abgedeckt. - Markieren Sie die Positionen der Tiefe Draht Elektroden basierend auf vordefinierten stereotaktischen Koordinaten.
- Bohren Sie kleine Löcher (Durchmesser: 0,2 mm) auf den Schädel um die markierten Seiten für die Draht-Implantation, und entfernen Sie vorsichtig die Knochen Klappe um die Dura verfügbar zu machen. Waschen Sie die Kraniotomie häufig, mit normalen Kochsalzlösung. Abbildung 1 beschreibt den Aufbau vor der Implantation der Elektroden Tiefe Draht.
- Mit Hilfe einer Nadel, heben Sie und senken Sie die Dura ohne Beschädigung der Pia Mater, Schiffe und die Oberfläche des Neocortex.
- Senken Sie die Tiefe Draht Elektroden auf die Oberfläche des Neocortex und dann dringen Sie langsam das Gehirn die Solltiefe ein. Häufig nicht mehr bewegen sich die Elektroden für die kortikalen Ausfallsicherheit. In der vorliegenden Studie ist die Schärfentiefe die Drahtspitze 0,5 mm unter der kortikalen Oberfläche.
- Versiegeln Sie die Kraniotomie mit einer Mischung aus Wachs und Paraffin-Öl, um sicherzustellen, dass die Tiefe Draht Elektroden für nachfolgende experimentelle Manipulationen bewegt werden können.
- Befestigen Sie die Elektrode Apparat mit dental Acryl auf den Schädel.
- Schweißen Sie jeden Kupferdraht, der mit der ECoG-Schraube auf den entsprechenden Kanal auf dem Connector-Modul verbindet. Decken Sie die Schweißpunkte mit Lehm, um potentiellen Kontakt zwischen verschiedenen Kanälen zu vermeiden.
- Montieren Sie die schützende Hülle-Wand an der Basis und Schweißen Sie die Referenz und Boden Elektroden, um die entsprechenden Kanäle.
- Befestigen Sie die Kappe, um die schützende Hülle, die Verwendung von Bändern zur Vermeidung von Kontaminationen.
- Die Ratte mit Penicillin zu injizieren (60.000 U, i.p.) unmittelbar nach der Operation zur Vermeidung von postoperativen Infektionen.
- Single-Haus die Ratte in eine Temperatur und Luftfeuchtigkeit-gesteuerte Käfig und halten Sie es in einem 12-h-Tag/Nacht-Zyklus nach der Operation, mit Essen und Wasser Ad Libitum für mindestens eine Woche vor dem LEP-Experiment.
Hinweis: Um gleichzeitig aufzuzeichnen, ECoG und kortikalen LFP-Aktivitäten, eine Vorrichtung wurde hier verwendet, die zusammengestellt wurde, mit zwei Arten von Elektroden verbunden mit einem Anschlussmodul, die mehrere Microdrives befestigt, die Wolfram-Draht-Arrays enthalten. Die gold Pins dienten die Elektrode Schnittstellenkarte (EIB) die Wolframdrähte herstellen des Moduls Stecker durch Drücken der Drähte in kleinen Metall-Löcher auf der EIB. Zwei Metall-Löcher auf der EIB mit beschichteten Kupferdrähten verlötet wurden, und das offene Ende des jede kupfernen Drahtes wurde mit den entsprechenden Kupferdraht an ECoG Schraube angeschlossen verlötet. Die Details der Herstellung wurden21an anderer Stelle beschrieben.
2. Datenerhebung
- Kitzeln Sie die Ratte mindestens 1 x pro Tag für mindestens drei aufeinander folgenden Tagen vor dem Test, um sicherzustellen, dass die Ratte mit dem Experimentator22vertraut wird.
- Legen Sie die Ratte in der Kammer Verhalten für mindestens 1 h vor dem Experiment um sicherzustellen, dass die Ratte, der Aufnahmeumgebung akklimatisiert.
Hinweis: Die Kammer ist ein Kunststoff Würfel mit einer Seitenlänge von 30 cm. Der Boden der Kammer besteht aus einem Eisengitter mit ~ 8 mm Lücken. - Verbinden Sie die Aufnahme Headstage mit das Elektrodenmodul sanft, um erschrecken die Ratte und das Elektrodenmodul zu beschädigen zu vermeiden.
- Richten Sie den Laser-Generator, verbinden Sie die Glasfaser und passen Sie die Punktgröße des Lasers je nach Ausrüstung der Bedienungsanleitung. Verbinden Sie den digitalen Ausgang aus dem Trigger-Generator an den digitalen Eingang Aufnahme Board.
Hinweis: Achten Sie darauf nicht um der Glasfaser zu stark, um zu vermeiden, Abbruch der Faser zu locken. Achten Sie vor der Aufnahme die Triggersignale werden angezeigt und von der Aufnahmesoftware aufgenommen. In diesem Protokoll Radiant Hitzereize entstehen durch eine Infrarot-Neodym-Yttrium-Aluminium-Perowskit (Nd: YAP) Laser mit einer Wellenlänge von 1,34 μm. Der Durchmesser des Laser-spot-Größe liegt bei ca. 5 mm durch Fokussierung Linsen. Ein He-Ne Laser wies zum Bereich stimuliert, die je nach Zielsetzung des Experiments definiert ist. Auch wird der Reizenergie der Laserpulse nach das experimentelle Design bestimmt. Die Laser-Impulsdauer beträgt 4 ms. - Legen Sie die Videokamera unter der Ecke der experimentellen Kammer kontinuierlich aufzeichnen nozizeptiven Verhalten der Ratte, wenn seine Pfote nozizeptiven Laser Impulse erhält. Passen Sie die Position und Richtung der Kamera, um sicherzustellen, dass die nozizeptiven Verhaltensweisen sind vollständig in das Experiment erfasst.
Hinweis: Eine High-Speed – Coupled Ladegerät (CCD) Kamera wird dringend empfohlen, wie es auf der Hauptplatine des Systems der Aufnahme zu Beginn Zeit und Dauer der nozizeptiven Verhalten exakt zu erfassen die operative Signale liefern kann. Nozizeptiven Verhaltensweisen werden von der Experimentator nach jeder Laser-Impulse, nach zuvor definierten Kriterien anhand der Tierbewegung23,24, wie folgt bewertet: keine Bewegung (Score = 0), Kopf-drehen (einschließlich schütteln oder heben den Kopf; Partitur = 1), zucken (d. h., ein kleiner abrupte Körper Bewegung Rucken; Score = 2), Rückzug (d.h.Pfote Rückzug aus der Laser-Impulse; Score = 3), lecken und Ganzkörper-Bewegung (Partitur = 4). - Liefern Sie laufende weißes Rauschen (50 dB SPL) über einen Lautsprecher an der Spitze der Kammer.
Hinweis: Wie in früheren Studien10,25, Laseranregung geliefert auf der Haut erzeugt Ultraschall, die von der Ratte auditorischen System erkannt werden können. Aus diesem Grund spielt laufenden weißes Rauschen während der Versuch, die Aktivierung des auditorischen Systems als Reaktion auf Laser erzeugt Ultraschall zu vermeiden. Dieses Verfahren ermöglicht die selektive Aufnahme von Gehirn Antworten in Bezug auf die Aktivierung des nozizeptiven Systems. - Sammeln Sie die elektrophysiologischen Daten aus der ECOG durchgeführt und die Tiefe Draht Elektroden, mit dem Aufnahmesystem entsprechend der Ausrüstung in der Bedienungsanleitung.
Hinweis: Die operative Signale der Kamera und den Auslöser, die Signale der Laserpulse gleichzeitig mit den elektrophysiologischen Daten gleichzeitig abgetastet werden Abtastrate (alle Daten werden verstärkt und digitalisiert, mit einer Abtastrate von 20 000 Hz), die sicherstellt, dass alle Daten sind Mal synchronisiert. - Liefern Sie die Laserpulse in der plantar die Ratte Vorderpfote durch die Lücken in der Unterseite der Kammer.
Hinweis: Die Laser-Impulse wird nur geliefert, wenn die Ratte spontane Stille für mehr als 2 ist s auf der Grundlage der Experimentator Beobachtung, um die Signal-Kontamination der bewegungsbezogene Artefakte zu minimieren. Um Nociceptor Müdigkeit oder Sensibilisierung zu vermeiden, ist das Ziel des Laserstrahls manuell nach jedem Impuls verdrängt, und interstimulus Intervall ist nie kürzer als 40 s. ECoG und LFP Signale mehrmals aus jede Ratte aufgezeichnet werden können. Die Ratte muss in der experimentellen Kammer 1 h vor jeder Aufnahme-Session gesetzt werden. Nachdem alle Aufnahme-Sessions, die Ratte war tief betäubt und Transcardially mit eiskalten Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung gefolgt von 4 % Paraformaldehyd durchblutet. Das Gehirn wurde entfernt aus dem Schädel und Ermittlung der Elektrodenpositionen geschnitten.
(3) Datenanalyse
- Filtern Sie die kontinuierlichen Daten mit einem Bandpass-Filter zwischen 1 und 30 Hz.
- Epoche die Daten mit Hilfe einer Analyse-Fenster von 3 s, erstreckte sich von 1 s bis 2 s nach Beginn der Laser Reize. Basislinienkorrektur erfolgt durch Subtraktion die durchschnittliche Amplitude innerhalb des prestimulus Intervalls.
- Manuell ablehnen der Epochen, die durch grobe Artefakte kontaminiert sind.
- Berechnen Sie die gemittelten LEP-Wellenformen, die zum Ausbruch von Laser-Impulse für jede Versuchsbedingung mal gesperrt sind.
- Compute-die Wavelet-Transformation Kohärenz (WTC) der LEP Wellenformen von ECoGs und Tiefe Draht Elektroden aufgezeichnet.
Hinweis: WTC ist eine Technik, um die Kohärenz zwischen Paaren von Elektroden als Funktion der Zeit und Frequenz durchführen. Das WTC zwischen zwei Signalen kann für jeden Zeit-Frequenz berechnet werden, die hat den Vorteil der Erzeugung von Kohärenz-Werte für die gesamte Zeit-Frequenz-Spektrum. Die Details der Methodik wurden26an anderer Stelle beschrieben.
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Representative Results
Im repräsentativen Experiment wurden die elektrophysiologischen Daten aus fünf Ratten aufgezeichnet. Laser-Impulse wurden geliefert an der rechten Vorderpfote jede Ratte für 20 Mal mit > 40 s interstimulus Abstand. Das Laser-evozierten Gehirn, die Antworten aufgezeichnet wurden, mit sowohl ECoG Schrauben und Tiefe Drähte und die Tiefe Drähte wurden in bilateralen primären somatosensorischen Cortex (S1) und primäre Motor Cortex (M1) implantiert.
Wie in Abbildung 1zusammengefasst, überweist, zwei ECoGs (schwarz markiert) und Tiefe (Farbe, fünf Drähte für jede der vier Regionen markiert) nach stereotaktischen Koordinaten in den folgenden Positionen (ausgedrückt in Bezug auf die Bregma Elektroden wurden mm; positive Werte für X und Y Achse anzugeben bzw. Rechte und vordere Positionen): in der linken ECoG, X = -1,5 und Y = 1,75; in der richtigen ECoG X = 1,5 und Y = 1,75; in der linken S1 X =-4 und Y = 0,5; in der rechten S1 X = 4 und Y = 0,5; in der linken M1 X =-3 und Y = 3; in der richtigen M1 X = 3 und Y = 3.
Abbildung 2 zeigt die elektrophysiologischen Rohdaten aus alle Elektroden (ECoG-Schrauben plus vier von fünf Wolframdrähte fünf Wolframdrähte in jeder Region des Gehirns), mit dem Beginn der Laser-Impulse durch eine vertikale Punkt Linie markiert. Bitte beachten Sie, dass klare LEP Antworten nach dem Einsetzen des Laser Stimulus nachweisbar sind.
Abbildung 3 zeigt die Gruppe-Ebene-im Durchschnitt LEP Wellenformen von sechs Elektroden (ECoG-Schrauben plus vier Wolfram Drähte, eine repräsentative Wolframdraht in jeder Region des Gehirns) von fünf Ratten. Unabhängig von der Aufnahme-Website bestehen die LEP Antworten aus eine dominierende negative Auslenkung (N1-Welle). Die Latenz und Amplitude der Welle N1 sind wie folgt (Mittelwert ± SEM): für die linken ECoG, 143 ± 9 ms und-51 ± 4 µV; für die richtige ECoG, 145 ± 9 ms und-47 ± 4 µV; für den linken S1, 149 ± 9 ms und-86 ± 7 µV; für die richtige S1, 168 ± 10 ms und-71 ± 6 µV; für die linke M1, 179 ± 12 ms und-74 ± 7 µV; für die richtige M1, 185 ± 11 ms und-63 ± 6 µV. ähneln wichtiger ist, N1 Latenzen in der bilateralen ECoG und LFP-Signale aufgezeichnet von der kontralateralen S1, die sind deutlich kürzer als diejenigen aus der ipsilateralen S1 und bilateralen M1 aufgezeichnet. Im Gegensatz dazu sind N1 Amplituden im kontralateralen S1 größten und kleinsten in bilateralen ECoGs.
Abbildung 4 zeigt das WTC zwischen LEPs Stichprobe mit den ECoG-Schrauben (die Signale von zwei ECoG Schrauben wurden gemittelt) und Tiefe Signale an verschiedenen Gehirnregionen (richtige M1, richtige S1 links M1 und linken S1). Beachten Sie, dass der kontralateralen (links) S1 und M1 eine höhere Kohärenz als ipsilateral (rechts) S1 und M1 auf die Gamma-Frequenzband (50-100 Hz zeigte).
Abbildung 1: Elektrode Implantation Aufbau. Vor der Implantation der Elektroden Tiefe Draht eine schützende Hülle Basis befindet sich auf dem Schädel, und die Schrauben als ECoG-Elektroden sind in die vorgegebenen Löcher getrieben und durch zahnärztliche Acryl fixiert. Vier Löcher sind für die Implantation der Tiefe Draht Elektroden (z.B. Wolfram-Draht-Arrays) an den Positionen auf der Oberseite des linken und rechten S1 und M1, gebohrt. Als Referenz und Boden Elektroden verwendeten Schrauben sind 2 und 4 mm kaudal an den Lambda-Ausdruck platziert und mit der Schutzhülle Basis fixiert. Das Panel auf der linken Seite zeigt das Foto der Chirurgie nach der Implantation eine schützende Hülle Basis. Das Panel auf der rechten Seite zeigt das Diagramm der Chirurgie, die die allgemeine Form der Schutzhülle Basis zeigte. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: elektrophysiologische Rohdaten einer repräsentativen Ratte. Angezeigten Signale aufgezeichnet von einer repräsentativen Ratte mit zwei ECoGs und 20 Tiefe Draht Elektroden (fünf Elektroden in jeder Region des Gehirns), die Elektrode befinden sich 2 mm kaudal an den Lambda-Ausdruck als Referenz. Beginn der Laser-Impulse zeichnet sich durch eine vertikale Punkt-Linie. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Gruppe-Ebene-im Durchschnitt LEP Wellenformen. Die angezeigten gemittelten Signale aufgezeichnet von fünf Ratten bei zwei ECoGs und vier Tiefe Draht Elektroden (eine repräsentative Elektrode in jeder Region des Gehirns), die Elektrode befinden sich 2 mm kaudal an den Lambda-Ausdruck als Referenz. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: die Wavelet-Transformation Kohärenz. Die angezeigten Ergebnisse zeigen die Wavelet-Transformation Kohärenz zwischen LEPs abgetastet mit ECoG Schrauben und Tiefe Drähte in verschiedenen Gehirnregionen (richtige M1, richtige S1 links M1 und linken S1). Die Kohärenz der jeweiligen Grundlinie normalisiert wurde (0,5 s vor dem Laser Impulse auftreten). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
In der vorliegenden Studie beschrieben, eine Technik, um ECoGs und kortikale LFP Reaktionen hervorgerufen durch nozizeptiven Laser Impulse aus frei beweglichen Ratten gleichzeitig aufzeichnen. Die Ergebnisse zeigten, dass LEP Antworten nach dem Einsetzen der Laser Reize in ECoG und LFP-Signale eindeutig nachgewiesen werden konnte. Die gleichzeitige Aufzeichnung von ECoG und kortikalen LFP-Signale ermöglichen Wissenschaftlern, ihre Beziehung für ein besseres Verständnis des Beitrags der neuronalen Aktivitäten auf die LEP-Komponenten zu untersuchen.
Fünf wichtige Schritte in die vorgeschlagene Technik sollte beachtet werden. Erstens ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Oberfläche des Schädels sauber und trocken ist, vor der Befestigung der Schutzhülle base drauf, mit dental Acryl. Dieser Schritt ermöglicht es, dass die schützende Hülle Basis stabil befestigt ist. Zweitens, da der Durchmesser der ECoG Schrauben etwas größer als der Löcher, die erste Schraube fahren das Loch um das Schraubengewinde bilden vergrößern wird. In der vorliegenden Studie ist die Entfernung zwischen dem Loch für Wolframdrähte und das Loch für die Schraube ECoG sehr klein (z.B.weniger als 0,3 mm). Wenn alle Löcher gebohrt sind vor der ECoG Schrauben Sie fahren und Tiefe Draht einfügen, der Schädel um die ECoG Löcher zerbrechlich wäre, und es würde es nicht ertragen die mechanische Belastung der Loch-Erweiterung während der Schrauben. Aus diesem Grund müssen die ECoG-Schrauben in die Löcher getrieben werden, um das Schraubengewinde vor das Loch bohren für das Wolfram Draht einfügen zu bilden. Wenn die eingefügten ECoG-Schrauben die Sicht beim Bohren von Löchern für die Wolframdrähte versperren, empfiehlt es sind sie, vertrieben und wieder nach Schritt 1.14 des Protokolls vertrieben. Drittens: beim Einfügen der Tiefe Draht Elektroden der Experimentator soll den Widerstand an der Spitze der Wolframdrähte achten in der Regel gibt an, dass die Tiefe Kabel durch das Loch am Rande der Schädel oder die Dura, die bisher nicht blockiert werden vollständig entfernt. Wenn dies der Fall ist, die Tiefe Drähte angehoben werden und mögliche Hindernisse vor dem Wiedereinsetzen der Elektroden20gereinigt werden. Viertens: Wenn die Kraniotomie Löcher mit einer Mischung aus Wachs und Paraffin-Öl nach der Implantation der Elektroden zu füllen, sollte die implantierten Drähte nicht durch äußere Kräfte gedrückt werden. Daher ist es vorzuziehen, die in der Nähe platziert Mischung mit Elektrokoagulator schmelzen. Fünftens ist es wichtig, sicherzustellen, dass der Abstand zwischen den Laser-Endstück und der Ziel-Site auf die Ratte, etwa 1 cm gehalten wird zu gewährleisten, dass die wahrgenommene Laser Energien unter verschiedenen Studien10,25im Einklang stehen.
In der Tat, um sicherzustellen, dass die schützende Hülle bedecken und schützen der ganze Apparat, die Größe der Schale soll relativ groß sein (eine Würfel mit einer Seitenlänge von 3,5 mm) gegenüber der Ratte in den Kopf. Um den Einfluss des über-Kopf-Geräts auf die Ratte Bewegung zu minimieren, empfehlen wir, mit Ratten, die mehr als 400 g im Experiment gewogen. Aus diesem Grund diese Technik kann nicht verwendet werden, um anspruchsvolle Verhaltensweisen in der Rattenmodell zu studieren und sollte nicht in anderen Modellen von kleineren Tieren (z.B. Mäuse) angenommen werden. Insbesondere kann die vorgeschlagene Technik verbinden wir mit anderen Techniken erweitern somit für viele andere Anwendungen verwendet werden. Beispielsweise kann diese Technik leicht Rekord Gehirn Reaktionen hervorgerufen durch Reize von verschiedenen Empfindungen (z.B.auditive und visuelle) angewendet werden27,28 und angewandte im Gehirn Erkennungsmerkmale der psychiatrischen Erkrankungen ( z.B. Epilepsie)29 in frei beweglichen Ratten, welche die Untersuchung ihrer jeweiligen neuronale Mechanismen fördern würde. Darüber hinaus kann die Implantation der Elektroden den Test für etwa einen Monat überstehen bietet die Möglichkeit, eine Langzeitstudie in der Zukunft durchzuführen.
Insgesamt bieten wir eine gültige Technik gleichzeitig aufzeichnen ECoG und LFP-Aktivitäten von frei beweglichen Ratten. Diese Technik ermöglicht es uns, die Informationsverarbeitung im Gehirn auf mesoskopischen und makroskopischen Ebene zu untersuchen. Dies ist wichtig für Translationale Studien Dokument experimentelle tierische Erkenntnisse für ein besseres Verständnis der menschlichen Physiologie und Pathophysiologie.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verzollen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch CAS Key Laboratory of Mental Health, Institut für Psychologie, der National Natural Science Foundation von China (31671141 und 31822025), der 13th Fünfjahres-Informatisierung planen der chinesischen Akademie der Wissenschaften (XXH13506), und die wissenschaftliche Fundierung-Projekt des Instituts für Psychologie, Chinese Academy of Sciences (Y6CX021008).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Male Sprague-Drawley rats | Vital River | ||
| Isoflurane | RWD Life Science | ||
| Small animal isoflurane anaesthetic system | RWD Life Science | Including the anesthesia gas mask for rats | |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | ||
| The apparatus with combined ECoG and LFP electrodes | The apparatus is home-made, which assembles the ECoG and depth wire electrodes to a connector module | ||
| 3D-printed protective shell | The texture of shell is polylactic, and the shell is home-made and contains three parts: a base, a wall and a cap. The wall is covered by copper tapers to construct as a Faraday cage | ||
| Tungsten wires (diameter: 50 mm) | California Fine Wires Company | The electrodes for cortical LFP recording | |
| Stainless steel screws (diameter: 0.6 mm) |
The electrodes for ECoG recording | ||
| Electric cranial drill | RWD Life Science | ||
| Drill bit (diameter: 0.5 mm) | RWD Life Science | The drill is used for drilling the holes of ECoG screws | |
| Drill bit (diameter: 0.2 mm) | RWD Life Science | The drill is used for drilling the holes of depth wires | |
| Dental arylic powder | SNC dental | ||
| Dental arylic liquid | SNC dental | ||
| Paraffin | Fisher Scientific | The mixture is used for seal the craniotomy to ensure the following movement of micro-wire arrays | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | ||
| Electrocoagulator | Bovie medical Corporation | ||
| RHD2132 Amplifier Boards | Intan Technologies | A 32-channel headstage | |
| RHD2000 systerm | Intan Technologies | The data acquisition systerm | |
| Infrared neodymium yttrium aluminum perovskite (Nd:YAP) laser generator | Electronical Engineering | ||
| Matlab R2016b | The MathWorks |
References
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