Summary
补体组分C1q是一种在组织微环境中高度表达的亲炎分子,可与细胞外基质相互作用。在这里,我们描述了一种测试C1q与透明质酸结合如何影响细胞粘附的方法。
Abstract
肿瘤微环境在肿瘤生长和转移中起着积极的作用。通过不同的途径,肿瘤细胞可以通过分泌刺激因子、化学因子和细胞因子来有效地招募基质细胞、免疫细胞和内皮细胞。反过来,这些细胞可以通过释放促进生长的信号、代谢物和细胞外基质成分来改变微环境的信号特性,以维持高增殖和转移能力。在此背景下,我们确定,补充组分 C1q,由一系列人类恶性肿瘤在局部高度表达,在与细胞外基质透明质酸相互作用时,强烈影响从人类肿瘤中分离的初级细胞的行为标本。在这里,我们描述了一种测试C1q与透明质酸(HA)结合如何影响肿瘤细胞粘附的方法,其基础是细胞外基质的关键成分(在本例中为HA)的生物特性可以通过对肿瘤的生物活性信号来塑造进展。
Introduction
肿瘤微环境(TME)影响癌症的发展和进展,因为它可以为细胞生存、生长和入侵提供一个宽松的利基。TME 中新关键参与者的识别可能有助于发现用于靶向治疗的新分子工具。TME 包括一个复杂且动态的非恶性细胞网络,如内皮细胞、成纤维细胞和免疫系统的细胞,嵌入周围的细胞外基质 (ECM) 组件中,包括胶原蛋白、层压、纤维蛋白、孕激素和透明质。肿瘤和非肿瘤细胞合成和分泌ECM成分,以及细胞因子、化学因子、生长因子和炎症和基质重塑酶,这些酶整体上改变了TME的物理、化学和信号特性。在这些成分中,透明质酸(HA)在肿瘤生物学中起着至关重要的作用。尽管HA的化学成分简单,但连同其HA结合分子(透明环酸),可以调节血管生成、免疫系统反应和ECM重塑,其大小和浓度依赖性1。
补充(C)系统也是当地TME的一部分,最近受到越来越多的关注。C 系统包括一组可溶性和膜结合蛋白,这些蛋白质涉及对非自细胞、不需要的宿主元素和病原体的第一道防线。在功能上,C连接与生俱来和自适应系统的双效应臂,以促进直接细胞杀死或安装炎症反应2。C活化可以通过破坏癌细胞或抑制其外生长来抑制肿瘤生长,但越来越明显的是,它可以通过维持慢性炎症,促进建立一个促进肿瘤的活动免疫抑制环境,诱导血管生成,并激活癌症相关信号通路3。在此背景下,C1q是C系统经典通路的第一个识别分子,它独立于C活化4在肿瘤微环境中发挥着重要的作用。C1q已被证明由一系列人类恶性肿瘤在当地表达,除了血管生成和转移5外,它还能有利于癌细胞的粘附、迁移和增殖。有趣的是,C1q 与 ECM 的主要组成部分(如 HA)交互。
我们开发了一种从肿瘤质量中分离原发癌细胞的技术。此外,我们创建了能刺激肿瘤微环境的基质,特别是C1q与高分子量透明质酸之间的相互作用。与HA结合的C1q能够诱导肿瘤细胞的粘附。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
意大利里雅斯特大学医院机构委员会经道德考虑后,经知情同意后采集了患者的组织样本。
1. 肿瘤细胞分离与培养(第1天)
- 从MPM固体标本中分离出人类中皮瘤细胞。用切割机精细切碎组织,获得约2-3 mm2大小的片段,并在由汉克斯平衡盐溶液(HBSS)组成的5 mL消化溶液中孵育,辅以0.5 mM Ca 2+/Mg2+,0.5%胰蛋白酶和50μg/mLDNase I,在4°C过夜。
- 肿瘤细胞分离与培养(第2天)
- 在一夜孵育后,将消化的组织置于37°C的培养箱中30分钟,轻轻摇动。
- 用HBSS在199中度5mL中溶解3mg/mL胶原酶1型,在离心时(250 x g)替换消化溶液,并在37°C下通过温和摇动进一步孵育30分钟。
- 加入10%热灭活的胎儿牛血清(FBS),阻断酶反应。用5mL移液非常仔细地重新悬浮细胞,以确保大部分细胞从组织中释放出来。然后,通过100μm孔隙过滤器过滤细胞悬浮液。
- 将细胞播种在12.5厘米2瓶中,在37°C下培养,使用人类内皮细胞无血清培养基(HESF),用10%FBS,并辅以EGF(10纳克/mL)、基本FGF(20纳克/mL)和1%青霉素-链霉素。
注:每 2-3 天更换一次新鲜介质。
2. HA 涂层(第 1 天)
- 在浓度为1mg/mL6的双倍蒸馏水中重新悬浮高分子量HA(1.5 kDa)。
- 在碳酸盐/碳酸盐缓冲液(0.1 M,pH 9.6)中稀释HA库存溶液至50μg/mL,带温和移液。
- 在4°C下每孔过夜,涂覆96孔板100μL的稀HA库存溶液。
注:透明质酸是里雅斯特大学第7分校生命科学系伊万·多纳蒂教授赠送的一份好礼物。
3. C1q 涂层(第 2 天)
- 经过一夜孵育后,真空吸气处理孔,用每孔100μL的Dulbeco PBS(dPBS)清洗96孔板。
- 允许C1q(25μg/mL或剂量反应实验的不同浓度)或BSA(作为阴性对照)结合到塑料固定-HA,在100μl的dPBS = 0.5%BSA和0.7 mM Ca2+/Mg2* 中孵育这些蛋白质,浓度为25微克/mL.然后在4°C孵育过夜。
- 真空吸孔,用 100 μL/孔 dPBS 清洗 96 孔板。
4. 带 FAST DiI 的细胞标签
- 在含有10μg/mL的荧光染料FAST DiI的500μLdPBS中重新悬浮1 x105肿瘤细胞。在5%v/v CO2培养箱中孵育15分钟,在5%的co2培养箱中进行贴标,5分钟间隔后手动混合。
- 要去除多余的FAST DiI,加入10 mL的dPBS,移液器轻轻上下,并在250 x g下离心7分钟。
5. HA/C1q基质的细胞粘附(第1天)
- 真空吸气涂上不同基质的井(在步骤 3.2 中涂覆了水井)。
- 将100 μL的标记细胞悬浮液分配到涂布孔中,在37°C下在5%v/v CO2培养箱中孵育板35分钟。
- 通过吸附上清液来去除非粘附细胞。用含有 0.5% BSA、0.7 mM Ca2+和 0.7 mM Mg2+的 dPBS 清洗一次。
- 通过添加 200 μL/孔的 10 mM Tris-HCl,pH 7.4 = 0.1% v/v SDS,并立即读取 96 孔板与荧光读器 (544 nm, 发射 590 nm) 使用校准曲线生成的越来越多的标签细胞。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HA是一种带负电荷的高分子量多糖,由重复(β,1-4)-D-葡萄糖酸-(β,1-3)-N-乙酰-D-葡萄糖胺脱糖单位(图1B)7组成。利用生物仿薄HA(生物-HA)对96孔板的HA结合的发生及其固定效率进行了测试。生物HA的不同浓度,从10微克/mL到1mg/mL,在100mM碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液pH9.6中重新悬浮,并在4°C下孵育过夜。
经过广泛处理后,使用链球菌与碱性磷酸酶结合的链球菌,检测出与96孔板结合的生物HA,而链球菌的存在则以pNPP(1mg/mL)为基质进行定量。使用 ELISA 读取器在 405 nm 的波长下执行读取。Bio-HA能够以剂量反应方式与96孔板结合(未显示数据);50 μg/mL 被选为饱和高原,因此用于我们的测定。
我们之前的数据表明,C1q能够绑定到ECM8中本地化的多种目标配体。这种结合与医管局9特别强。微晶板的孔部涂有50μg/mL HMW-HA,孵化后C1q浓度增加。C1q能够以剂量依赖方式与高分子量HA结合(图1A),在50μg/mL浓度下达到最大结合水平。在确定C1q可以结合到HA后,我们研究了这种相互作用在修改ECM信号特性方面的含义及其对肿瘤发展的影响。为此,我们建立了从受影响患者获得的双光标本中分离肿瘤细胞的协议。原发性肿瘤细胞从组织活检中分离出来,如图2所示。肿瘤细胞与C1q相互作用的能力是通过使用不同的基质组合进行细胞粘附测定来评估的,如图3所示。肿瘤细胞被荧光探针FAST DiI染色,并播种到固定HA,HA绑定到C1q或BSA(用作阴性对照),35分钟。如果与HA相比,HA边界-C1q的涂层能够增加附着原细胞的量,但不能刺激我们测试的肿瘤细胞系的附着力,如图3所示。
图 1.C1q与透明质酸的相互作用。(A) 以剂量依赖方式在HMW HA上结合C1q。这些数据以三联体和S.E.M.(B)中三个独立实验的平均值表示,即C1q分子和重组单链球状区域的原理表示。C1q由三个多肽链(A、B、C)组装而成,每个链体均含有N端胶原蛋白样序列和C端球状gC1q头。(C) 透明质酸的化学配方,一种高聚合链的葡萄糖酸和 N-乙酰葡萄糖胺。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2.肿瘤细胞分离和形态的综述方案。肿瘤细胞从胸膜活检标本中分离出来。这些细胞被播种在12.5厘米2瓶中,并在人类内皮细胞血清自由培养基中培养+10%FBS。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3.C1q对肿瘤细胞粘附性的影响。肿瘤细胞(MES)或原发性异位皮瘤细胞系(MSTO-211H)被播种到预涂有透明质酸(HA)、HA与C1q或牛血清白蛋白(BSA)的微粒井中。在图的上半部分,显示了一个代表性的初级细胞系附着在HA、HA与C1q或BSA结合的形态方面。图像是通过相光显微镜获取的,原始放大倍数:200倍。FAST DiI标记的原发性皮瘤细胞或同皮瘤细胞系(MSTO-211H)被允许粘附在预涂有HA、HA与C1q或BSA结合的微蒂剂孔上。数据以三次独立实验的平均值表示为三次独立实验的平均值 = S.E.M. = p < 0.01 vs HA。请点击此处查看此图的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
我们描述了一种简单的方法来研究补充组分C1q如何与透明质酸相互作用,如何调节从人类肿瘤组织分离的初级细胞的行为。HA 和 C1q 在生理和病理条件下在组织微环境中均大量存在,参与多个细胞生物过程。例如,C1q已被证明存在于胎盘的微环境中,它有利于在胎盘8期间对母体脱胎酶的外型营养器入侵。C1q也沉积在伤口愈合的皮肤,它促进组织再生和修复10所需的血管遗传过程。最后,C1q在几个不同的肿瘤组织中被鉴定。高分子量HA是血管生成和增殖的天然屏障,最近的证据表明,C1q除了在补活化中具有经典作用外,还能够作为ECM分子发挥作用,有利于细胞迁移。
这项工作的新颖性在于发现C1q与HA结合会强烈地改变肿瘤细胞与HA的相互作用。为了设置此方法,已考虑了几个检查点。首先,我们确保有足够的HA与使用生物仿当HA的培养和ELISA井的塑料结合。油井的Alcian蓝色染色证实了这些结果(未显示数据)。孵育已在碳酸氢盐缓冲液 pH 9.6 中一夜之间进行,此过程可确保 HA 完全饱和油井(未显示数据)。
第二步是将 C1q 绑定到 HA。C1q与HA的结合已在生理pH(7.4)和Ca2+的存在下进行。因此,我们使用具有双价离子的dPBS-BSA缓冲液。我们最初进行了剂量反应实验,以识别和选择可发现附着在 HA 上的最佳 C1q 量。虽然在剂量反应曲线中,我们并没有完全到达高原,但考虑到血清中通常存在的C1q的量是75-150微克/mL,我们使用25μg/mL的浓度更接近游离无量C1q的生理浓度。据计算,血清C1q不含C1r和C1s约为C1复合11的10%-20%。C1q以其结合聚氨酯的能力而闻名,它被定义为电荷模式识别分子,HA是重复单位的负电荷线性聚合物(β,1-4)-D-葡萄糖酸-(β,1-3)-N-乙酰-D-葡萄糖胺12,13.出于这个原因,我们调查了这种强烈的非共价相互作用。我们的观察表明,肿瘤细胞感觉到HA和HA与C1q结合的差异。如果与单独粘附 HA 的细胞相比,细胞似乎更分散。我们观察到,这种效应不是由可溶性C1q介导的,这表明细胞粘附的这种修饰取决于C1q与HA的相互作用,这可能是由于结合的结果,补体分子的构象变化。
我们想强调使用原发细胞作为肿瘤行为体外模型作为粘附实验的重要性,因为我们注意到,与多细胞系相比,原细胞之间的粘附能力存在显著差异,如图3.评估HA生物特性的另一种模型是使用HA水凝胶支架的三维模型。这种结合生物分子的脚手架可用于生物活性信号的评估,并可用于再生医学的多种应用14。我们在这项研究中提出的模型是评估细胞对刺激组合反应的一种更简单、更快、更便宜的方法,可以看作是理解这种刺激的分子机制的第一步。互动。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者宣布,这项研究是在没有任何商业或财务关系可解释为潜在的利益冲突的情况下进行的。
Acknowledgments
我们感谢伊万·多纳蒂提供HA、莱昂纳多·阿马迪奥、加布里埃拉·齐托(IRCCS"Burlo Garofolo"妇科,意大利里雅斯特)和安德里亚·罗曼诺(意大利里雅斯特卡蒂纳医院解剖和病理组织学临床科) 用于组织样本收集。我们也感谢尼科洛·莫罗西尼在视频准备和亚历克斯·科波拉的声音帮助。这项工作得到了妇幼保健研究所、IRCCS"Burlo Garofolo"、意大利里雅斯特(RC20/16)和R.Bulla的丰达齐奥内·卡萨迪·里萨米奥·里雅斯特的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm pore filter | BD Falcon | 352360 | |
| Amphotericin B solution (fungizone) | Sigma-Aldrich | 1397-89-3 | |
| basic FGF | Immunological Sciences | GRF-15595 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C-4901 | |
| Collagenase type I | Worthington Biochemical Corporation, DBA | MX1D12644 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| DNase I | Roche | 10 104 159 001 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | |
| EGF | Immunological Sciences | GRF-10544 | |
| FAST DiI | Molecular probes, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | D7756 | |
| Fetal bovine serum | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Fibronectin | Roche | 11051407001 | |
| Flask for cell culture | Corning | 430639 | Sterile, vented |
| Gentamicin solution | Sigma-Aldrich | G1397-10ML | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBBS) | Sigma-Aldrich | H6648 | Supplemented with EDTA, Glucose, penicillin-streptamicin, gentamicin and fungizone |
| High molecular weight hyaluronic acid | Kind gift by Prof. Ivan Donati | ||
| Human endothelial serum free medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11111-044 | Supplemented with EGF (5 ng/mL), basic FGF (10 ng/mL), and 1% penicillin–streptomycin (Sigma-Aldrich) |
| Magnesium Chloride | Carlo Erba | 13446-18-9 | |
| Medium 199 with Hank’s salt | Sigma-Aldrich | M7653 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Time-lapse microscopy | Nikon | Imaging System BioStation IM-Q | |
| Titertek Multiskan ELISA Reader | Flow Labs | ||
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4674 |
References
- Zamboni, F., Vieira, S., Reis, R. L., Oliveira, J. M., Collins, M. N. The potential of hyaluronic acid in immunoprotection and immunomodulation: Chemistry, processing and function. Progress in Materials Science. 97, 97-122 (2018).
- Lorusso, G., Ruegg, C. The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).
- Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. D. Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis. Nature Immunology. 11 (9), 785-797 (2010).
- Bulla, R., et al. C1q acts in the tumour microenvironment as a cancer-promoting factor independently of complement activation. Nature Communications. 7, 10346 (2016).
- Winslow, S., Leandersson, K., Edsjo, A., Larsson, C. Prognostic stromal gene signatures in breast cancer. Breast Cancer Research. 17, 23 (2015).
- Collins, M. N., Birkinshaw, C. Hyaluronic acid solutions: A processing method for efficient chemical modification. Journal of Applied Polymer Science. 130 (1), 145-152 (2013).
- Itano, N. Simple primary structure, complex turnover regulation and multiple roles of hyaluronan. Journal of Biochemistry. 144 (2), 131-137 (2008).
- Agostinis, C., et al. An alternative role of C1q in cell migration and tissue remodeling: contribution to trophoblast invasion and placental development. Journal of Immunology. 185 (7), 4420-4429 (2010).
- Agostinis, C., et al. Complement Protein C1q Binds to Hyaluronic Acid in the Malignant Pleural Mesothelioma Microenvironment and Promotes Tumor Growth. Frontiers in Immunology. 8, 1559 (2017).
- Bossi, F., et al. C1q as a unique player in angiogenesis with therapeutic implication in wound healing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4209-4214 (2014).
- Hosszu, K. K., et al. Cell surface expression and function of the macromolecular c1 complex on the surface of human monocytes. Frontiers in Immunology. 3, 38 (2012).
- Laurent, T. C., Fraser, J. R. Hyaluronan. Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 6 (7), 2397-2404 (1992).
- Gaboriaud, C., et al. The crystal structure of the globular head of complement protein C1q provides a basis for its versatile recognition properties. Journal of Biological Chemistry. 278 (47), 46974-46982 (2003).
- Lam, J., Truong, N. F., Segura, T. Design of cell-matrix interactions in hyaluronic acid hydrogel scaffolds. Acta Biomaterialia. 10 (4), 1571-1580 (2014).
