Summary
De aanvulling component C1q is een pro-inflammatoire molecuul sterk uitgedrukt in het weefsel microomgeving die kunnen interageren met de extracellulaire matrix. Hier beschrijven we een methode om te testen hoe C1q gebonden aan hyaluronzuur effecten cel adhesie.
Abstract
Het is meer en meer aangetoond dat de tumor microenvironment een actieve rol speelt in neoplasie groei en metastase. Door verschillende wegen, kunnen de tumorcellen stromale, immune en endothelial cellen efficiënt aanwerven door stimulerend factoren, chemokines en cytokines af te scheiden. Op zijn beurt kunnen deze cellen veranderen de signalering eigenschappen van de micromilieu door het vrijgeven van groei-bevorderende signalen, metabolieten en extracellulaire matrix componenten om hoge proliferatie en gemetastaseerde competentie te ondersteunen. In deze context, identificeren we dat de aanvulling component C1q, sterk uitgedrukt lokaal door een reeks van menselijke kwaadaardige tumoren, op de interactie met de extracellulaire matrix hyaluronzuur, sterk van invloed op het gedrag van primaire cellen geïsoleerd van de menselijke tumor Specimens. Hier beschrijven we een methode om te testen hoe C1q gebonden aan hyaluronzuur (HA) effecten tumor cel adhesie, ten grondslag liggen aan het feit dat de biologische eigenschappen van de belangrijkste componenten van de extracellulaire matrix (in dit geval HA) kan worden gevormd door bioactieve signalen in de richting van tumor Progressie.
Introduction
De tumor microenvironment (TME) beïnvloedt de ontwikkeling van kanker en progressie, omdat het kan een tolerante niche voor cel overleving, groei en invasie te bieden. De identificatie van nieuwe belangrijke spelers in TME kan nuttig zijn voor de ontdekking van nieuwe moleculaire hulpmiddelen voor doel therapie. TME omvat een complex en dynamisch netwerk van niet-kwaadaardige cellen, zoals endothelial cellen, fibroblasten en cellen van het immuunsysteem, ingebed in de omliggende extracellulaire matrix (ECM) componenten, waaronder collageen, laminins, fibronectins, proteoglycanen en hyaluronans. Zowel de tumor en niet-tumorcellen synthetiseren en scheiden ECM componenten samen met cytokines, chemokines, groeifactoren en inflammatoire en matrix remodeling enzymen die de algehele verandering van de fysieke, chemische en signalering eigenschappen van TME. Onder deze bestanddelen, hyaluronzuur (HA) is ontstaan om een cruciale rol in de Tumorbiologie uit te oefenen. Ondanks de eenvoudige chemische samenstelling, HA, samen met zijn HA-bindende moleculen (hyaladherins), kan moduleren bloedvat, immuunsysteem responsiviteit en ECM remodeling in een grootte en concentratieafhankelijke wijze1.
Het complement (C) systeem maakt ook deel uit van de lokale TME, die recentelijk steeds meer aandacht heeft gekregen. Het C-systeem omvat een set van oplosbare en membraan-gebonden eiwitten die betrokken zijn bij de eerste verdedigingslinie tegen niet-zelf-cellen, ongewenste host-elementen en pathogenen. Functioneel, verbindt C de twee-effect wapens van ingeboren en aanpassingssystemen om of directe cel het doden of montage van een ontstekingsreactie2te bevorderen. C de activering kan de tumorgroei onderdrukken, door kankercellen te vernietigen of hun uitgroei te remmen, maar het is steeds duidelijker geworden dat het een tumor-bevorderende activiteit kan bezitten door chronische ontsteking te ondersteunen, bevorderend de totstandbrenging van een immunosuppressieve milieu, inducerende bloedvat, en het activeren van kanker-gerelateerde signalering trajecten3. In deze context, C1q, de eerste erkenning molecuul van de klassieke route van het C-systeem is ontstaan om belangrijke functies uit te oefenen in de tumor microomgeving onafhankelijk van C activering4. C1q is aangetoond dat lokaal worden uitgedrukt door een reeks van menselijke kwaadaardige tumoren, waar het kan voorstander van kanker cel adhesie, migratie en proliferatie in aanvulling op bloedvat en metastasen5. Interessant C1q wisselwerking met een belangrijk bestanddeel van ECM zoals HA.
We ontwikkelden een techniek om de primaire kankercellen te isoleren van de tumormassa. Verder creëerden we de matrix, die kan stimuleren tumor microenvironment, met name de interactie tussen C1q en hoge moleculair gewicht hyaluronzuur. C1q gebonden aan HA was in staat om de adhesie van de tumorcellen te induceren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De weefselsteekproeven van patiënten werden verzameld na geïnformeerde toestemming na goedkeuring van de ethische overwegingen door de institutionele Raad van het universitaire ziekenhuis van Triëst, Italië.
1. tumor cel isolatie en cultuur (dag 1)
- Isoleer menselijke mesothelioom cellen van MPM Solid specimens. Fijn gehakt het weefsel met een cutter om fragmenten van ongeveer 2-3 mm2 in omvang te verkrijgen en in te broeden in 5 ml van de spijsvertering oplossing samengesteld uit Hanks ' evenwichtige zoutoplossing (Peeters) aangevuld met 0,5 mm ca2 +/Mg2 +, 0,5% trypsine en 50 µ g/ml DNase I, overnachting bij 4 °C.
- Tumor cel isolatie en cultuur (dag 2)
- Na nachtelijke incubatie, plaats de verteerd weefsel voor 30 min in een incubator van 37 °C met zacht schudden.
- Vervang de spijsverterings oplossing bij centrifugeren (250 x g) met 3 mg/ml Collagenase type 1 opgelost in 5 mL medium 199 met Peeters en verder Incubeer gedurende 30 min bij 37 °c met zacht schudden.
- Blokkeer de enzymatische reactie door toevoeging van 10% warmte-geïnactiveerd foetale boviene serum (FBS). Hersuspendeer de cellen zeer zorgvuldig met een 5 mL pipet om ervoor te zorgen dat de meeste van de cellen worden vrijgelaten uit het weefsel. Dan, filter de cel schorsing door middel van een 100 µm porie filter.
- Zaai de cellen in een kolf van 12,5 cm2 en kweek ze bij 37 °c met humaan endothelial cellen serum-vrij medium (HESF), met 10% FBS en aangevuld met EFG (10 ng/ml), basis FGF (20 ng/ml), en 1% penicilline-streptomycine.
Opmerking: Vervang met vers medium om de 2-3 dagen.
2. HA coating (dag 1)
- Hersuspendeer hoog moleculair gewicht HA (1,5 kDa) in dubbel gedistilleerd water bij de concentratie van 1 mg/mL6.
- Verdunde HA stockoplossing voor 50 µ g/mL in carbonaat/bicarbonaat buffer (0,1 M, pH 9,6) met zacht pipetten.
- Bedek de 96-well plaat met 100 µ L van verdunde HA stockoplossing per nacht bij 4 °C.
Nota: het hyaluronzuur was een vriendelijke gift van Professor Ivan Donati, afdeling van de wetenschappen van het leven, Universiteit van Triëst7.
3. C1q coating (dag 2)
- Na nachtelijke incubatie, vacuüm aspireren de behandelde putten en was de 96-goed plaat met 100 µ L van Dulbecco PBS (dPBS) per put.
- Laat C1q (25 µ g/mL of verschillende concentraties voor dosis Response experimenten) of BSA (als een negatieve controle) te binden aan plastic immobiled-HA door het incuberen van deze eiwitten bij een concentratie van 25 µ g/mL in 100 µ L van dPBS + 0,5% BSA en 0,7 mM CA2 +/mg2 + . Dan uitbroeden overnachting bij 4 °C.
- Vacuüm aspireren de putten en was de 96-well plaat met 100 µ L/put van dPBS.
4. Cell labeling met snelle DiI
- Hersuspendeer 1 x 105 tumorcellen in 500 µ l van dPBS met 10 µ g/ml van de fluorescente kleurstof Fast DiI. Incubeer voor 15 min bij 37 °C in een incubator van 5% v/v CO2 voor de etikettering, die manueel na 5 min. intervallen mengt.
- Voor het verwijderen van overtollige snelle DiI, voeg 10 mL dPBS, pipet voorzichtig omhoog en omlaag, en centrifugeer bij 250 x g voor 7 min. hersuspendeer de cel pellet in 1 ml van de menselijke endothelial serum vrije medium met 0,1% BSA (HESF + 0,1% BSA).
5. de adhesie van de cel op HA/C1q matrices (dag 1)
- Vacuüm aspireren de putten bekleed met de verschillende matrices (putten werden bekleed in stap 3,2).
- Distribueer 100 µ L van de gelabelde cel schorsing aan de gecoate putten en Incubeer de plaat voor 35 min bij 37 °C in 5% v/v CO2 incubator.
- Verwijder de niet-klevende cellen door opzuigen de bovendrijvende. Was een keer met dPBS bevattende 0,5% BSA, 0,7 mM CA2 + en 0,7 mm mg2 +.
- Lyse de aanhangende cellen door toevoeging van 200 µ L/put van 10 mM tris-HCl, pH 7,4 + 0,1% v/v SDS en lees onmiddellijk de 96-goed plaat met een fluorescentie lezer (544 nm, emissie 590 nm) gebruikend een kaliberbepalingskromme die door de lysis van een stijgend aantal Geëtiketteerdt wordt geproduceerd Cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HA is een negatief geladen High-Molecular-gewicht polysaccharide, die bestaat uit het herhalen van (β, 1-4)-D-glucuronzuur zuur-(β, 1-3)-N-acetyl-D-glucosamine disacharide eenheden (Figuur 1b)7. Het voorkomen van de binding van HA op de 96-well plaat, alsmede de efficiëntie van de immobilisatie werden getest te profiteren van biotinylated HA (bio-HA). Verschillende concentraties van bio-HA, variërend van 10 µ g/mL tot 1 mg/mL, werden opnieuw opgeschort in 100 mM carbonaat/bicarbonaat-buffer pH 9,6 en uitgebroed overnachting bij 4 °C.
Na uitgebreide wasbeurten, bio-HA gebonden aan 96-wells plaat werd gedetecteerd met behulp van streptavidin geconjugeerd met alkalische fosfatase, terwijl de aanwezigheid van streptavidin werd gekwantificeerd met behulp van pNPP (1 mg/mL) als een substraat. De lezing werd uitgevoerd bij de golflengte van 405 nm gebruikend een lezer ELISA. Bio-HA was in staat om te binden aan een 96-well plaat in een dosis reactie manier (gegevens niet getoond); 50 µ g/mL werd gekozen als een verzadigings plateau en daarom gebruikt in onze analyses.
Onze vorige gegevens toonden aan dat C1q in staat is om te binden aan een breed scala van target liganden gelokaliseerd in de ECM8. Deze band is bijzonder sterk met HA9. De putten van een microtiterplaat werden bekleed met 50 µ g/mL HMW-HA en bebroed met toenemende concentratie van C1q. Bound C1q werd gevisualiseerd op incubatie met anti-C1q Polyclonal antilichamen. C1q is in staat om te binden aan hoog moleculair gewicht HA in een dosisafhankelijke wijze (Figuur 1a), het bereiken van het maximale niveau van de binding bij de concentratie van 50 µ g/ml. Na vast te stellen dat C1q kan binden aan HA, onderzochten we de implicatie van deze interactie in het wijzigen van de signalering eigenschappen van de ECM en hun implicaties in de ontwikkeling van tumoren. Hiertoe hebben we een protocol ingesteld op geïsoleerde tumorcellen van Bioptisch specimens die bij betrokken patiënten zijn verkregen. Primaire tumorcellen werden geïsoleerd uit weefsel biopsie, zoals samengevat in Figuur 2. Het vermogen van tumorcellen om te interageren met C1q werd geëvalueerd door het uitvoeren van een cel adhesie assay met behulp van verschillende matrix combinaties, zoals weergegeven in Figuur 3. De cellen van de tumor werden bevlekt met de fluorescente sonde snelle DiI en werden gezaaid op immobild HA, HA verbindend aan C1q of aan BSA (die als negatieve controle wordt gebruikt), voor 35 min. In vergelijking met HA, de coating met HA-Bound-C1q was in staat om het bedrag van de aanhechting primaire cellen te verhogen, maar is niet in staat om de adhesie van tumorcellen lijnen die we getest te stimuleren, zoals weergegeven in de representatieve grafiek in Figuur 3.
Figuur 1 . Interactie van C1q met hyaluronzuur. Ahet binden van C1Q op HMW ha op een dosisafhankelijke wijze. De gegevens worden uitgedrukt als het gemiddelde van drie onafhankelijke experimenten in drievoud ± SEM (B) Schematische weergave van het C1q molecuul en van de recombinante enkelvoudige keten bolvormige regio. C1q is samengesteld uit drie polypeptide ketens (a, B, C): elk met een N-Terminal collageen-achtige sequentie en een C-Terminal bolvormige gC1q hoofd. (C) chemische formule van hyaluronzuur, een zeer polymere keten van glucuronzuur zuur en N-acetylglucosamine. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 . Samenvatting van de isolatie en de morfologie van tumorcellen. Tumor cellen werden geïsoleerd van Pleurale biopsie specimens. De cellen werden gezaaid in een 12,5 cm2 kolf en gekweekt in humaan endothelial cell serum vrije medium + 10% FBS. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 . Effect van C1q op de adhesie van tumorcellen. Tumor cellen (MES) of primaire mesothelioom Cell line (MSTO-211H) werden gezaaid naar micro titer Wells pre-Coated met hyaluronzuur (HA), HA gebonden aan C1q of aan boviene serum albumine (BSA). In het bovenste deel van de figuur, de morfologische aspect van een representatieve primaire cel lijn gerespecteerd HA, HA gebonden aan C1q of aan BSA werd getoond. De beelden werden verworven via fase-contrast Microscoop, originele vergroting: 200 x. SNELLE DiI geëtiketteerde primaire mesothelioom cellen of een mesothelioom Cell line (MSTO-211H) mochten zich te houden aan micro titer Wells pre-Coated met HA, HA gebonden aan C1q of aan BSA. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde van drie onafhankelijke experimenten gedaan in triplo ± SEM * p < 0,01 VS HA. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We beschrijven een eenvoudige methode om te onderzoeken hoe de aanvulling component C1q, interactie met hyaluronzuur, in staat is om het gedrag van de primaire cellen geïsoleerd van menselijke tumor weefsels moduleren. Zowel HA als C1q zijn overvloedig aanwezig in het weefsel micromilieu, zowel onder fysiologische en pathologische omstandigheden, die deelnemen aan verschillende cellen biologische processen. Bijvoorbeeld, C1q is aangetoond aanwezig te zijn in de microomgeving van de placenta waar het gunsten extravillous trofoblastinvasie van de moeder decidua tijdens placentatie8. C1q is ook neergelegd in wond-helende huid waar het bevordert de angiogenetic proces dat nodig is voor Weefselregeneratie en reparatie10. Tot slot, C1q is geïdentificeerd in verschillende tumor weefsels4. Het hoge moleculaire gewicht HA is een natuurlijke barrière voor bloedvat en proliferatie en recent bewijsmateriaal toonde aan dat C1q, naast zijn klassieke rol in aanvullingsactivering, in staat is om als ECM molecule op te treden, die cel migratie goedkeurt.
De nieuwigheid van dit werk bestaat in de vaststelling dat de binding van C1q tot HA sterk wijzigen van de interactie van tumorcellen met HA. Om deze methode in te stellen zijn verschillende controlepunten overwogen. Eerst en vooral, zorgden wij ervoor dat een voldoende hoeveelheid van HA aan het plastiek van cultuur en ELISA putten gebruikend biotinylated HA werd gebonden. De Alcian blauwe kleuring van de putten bevestigde deze resultaten (gegevens niet getoond). De incubatie is uitgevoerd 's nachts in bicarbonaat buffer, pH 9,6, en deze procedure zorgen voor de volledige verzadiging van de putten door HA (gegevens niet getoond).
De tweede stap was om C1q te binden aan HA. De binding van C1q tot HA is uitgevoerd bij een fysiologische pH (7,4) en in aanwezigheid van CA2 +. Om deze reden gebruikten we een dPBS-BSA buffer met bivalente ionen. We hebben in eerste instantie uitgevoerd een dosis Response experiment om te identificeren en de optimale hoeveelheid C1q die gevonden kunnen worden gehecht aan HA te kiezen. Hoewel we in onze dosis-Response curve niet precies het plateau bereikten, gebruikten we de concentratie van 25 µ g/mL om dichter bij de fysiologische concentratie van vrije C1q te zijn, gezien het feit dat de hoeveelheid C1q die normaal in het serum aanwezig is 75-150 µ g/mL is. Het is berekend dat serum C1q vrij van C1r en C1s is ongeveer 10%-20% van C1 complex11. C1q staat bekend om zijn vermogen om polyanionen te binden, het is gedefinieerd als een charge patroonherkenning molecuul en HA is een negatief geladen lineair polymeer van herhalende eenheden van (β, 1-4)-D-glucuronzuur zuur-(β, 1-3)-N-acetyl-D-glucosamine12, 13. om deze reden hebben we deze sterke niet-codominante interactie onderzocht. Onze waarnemingen wezen erop dat tumorcellen het verschil tussen HA en HA gebonden aan C1q gevoel. De cellen lijken meer verspreid-out in vergelijking met de cel te houden aan HA alleen. We hebben opgemerkt dat dit effect niet wordt bemiddeld door oplosbare C1q, wat aangeeft dat deze wijziging in de cel adhesie is afhankelijk van de interactie van C1q met HA, waarschijnlijk te wijten aan een conformationele verandering van het complement molecuul als gevolg van de binding.
We willen het belang benadrukken van het gebruik van primaire cellen als in vitro modellen van tumor gedrag voor de adhesie experimenten, omdat we merken een sterk verschil in de adhesie capaciteit tussen primaire cellen in vergelijking met verschillende cellen lijnen, zoals weergegeven in Figuur 3. Een alternatief en zeer interessant model om de biologische eigenschappen van HA te evalueren is het gebruik van 3D-modellen van HA hydrogel steiger. Deze steiger met de integratie van biologische moleculen kan worden gebruikt voor de evaluatie van bioactieve signalen en voor verschillende toepassingen in de regeneratieve geneeskunde14. Het model dat wij voorstellen in deze studie is een eenvoudiger, sneller en goedkopere methode voor de evaluatie van cellulaire reacties op een combinatie van stimuli, en het kan worden beschouwd als een eerste stap voor het begrijpen van de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij dit soort Interactie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat het onderzoek werd uitgevoerd bij het ontbreken van een commerciële of financiële verhoudingen die kunnen worden opgevat als een potentieel conflict van belang.
Acknowledgments
Wij danken Ivan Donati voor het verstrekken van HA, Leonardo Amadio, Gabriella Zito (afdeling gynaecologie van IRCCS "Burlo Garofolo", Trieste, Italië) en Andrea Romano (operatieve klinische eenheid van anatomie en pathologische histologie, Cattinara ziekenhuis, Trieste, Italië ) voor de weefselsteekproef inzameling. Wij danken ook Nicolò Morosini voor de hulp in de video voorbereiding en Alex Coppola, de stem. Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Instituut voor gezondheid van moeder en kind, IRCCS "Burlo Garofolo", Trieste, Italië (RC20/16) en Fondazione Cassa di Risparmio trieste aan R. bulla.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm pore filter | BD Falcon | 352360 | |
| Amphotericin B solution (fungizone) | Sigma-Aldrich | 1397-89-3 | |
| basic FGF | Immunological Sciences | GRF-15595 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C-4901 | |
| Collagenase type I | Worthington Biochemical Corporation, DBA | MX1D12644 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| DNase I | Roche | 10 104 159 001 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | |
| EGF | Immunological Sciences | GRF-10544 | |
| FAST DiI | Molecular probes, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | D7756 | |
| Fetal bovine serum | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Fibronectin | Roche | 11051407001 | |
| Flask for cell culture | Corning | 430639 | Sterile, vented |
| Gentamicin solution | Sigma-Aldrich | G1397-10ML | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBBS) | Sigma-Aldrich | H6648 | Supplemented with EDTA, Glucose, penicillin-streptamicin, gentamicin and fungizone |
| High molecular weight hyaluronic acid | Kind gift by Prof. Ivan Donati | ||
| Human endothelial serum free medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11111-044 | Supplemented with EGF (5 ng/mL), basic FGF (10 ng/mL), and 1% penicillin–streptomycin (Sigma-Aldrich) |
| Magnesium Chloride | Carlo Erba | 13446-18-9 | |
| Medium 199 with Hank’s salt | Sigma-Aldrich | M7653 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Time-lapse microscopy | Nikon | Imaging System BioStation IM-Q | |
| Titertek Multiskan ELISA Reader | Flow Labs | ||
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4674 |
References
- Zamboni, F., Vieira, S., Reis, R. L., Oliveira, J. M., Collins, M. N. The potential of hyaluronic acid in immunoprotection and immunomodulation: Chemistry, processing and function. Progress in Materials Science. 97, 97-122 (2018).
- Lorusso, G., Ruegg, C. The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).
- Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. D. Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis. Nature Immunology. 11 (9), 785-797 (2010).
- Bulla, R., et al. C1q acts in the tumour microenvironment as a cancer-promoting factor independently of complement activation. Nature Communications. 7, 10346 (2016).
- Winslow, S., Leandersson, K., Edsjo, A., Larsson, C. Prognostic stromal gene signatures in breast cancer. Breast Cancer Research. 17, 23 (2015).
- Collins, M. N., Birkinshaw, C. Hyaluronic acid solutions: A processing method for efficient chemical modification. Journal of Applied Polymer Science. 130 (1), 145-152 (2013).
- Itano, N. Simple primary structure, complex turnover regulation and multiple roles of hyaluronan. Journal of Biochemistry. 144 (2), 131-137 (2008).
- Agostinis, C., et al. An alternative role of C1q in cell migration and tissue remodeling: contribution to trophoblast invasion and placental development. Journal of Immunology. 185 (7), 4420-4429 (2010).
- Agostinis, C., et al. Complement Protein C1q Binds to Hyaluronic Acid in the Malignant Pleural Mesothelioma Microenvironment and Promotes Tumor Growth. Frontiers in Immunology. 8, 1559 (2017).
- Bossi, F., et al. C1q as a unique player in angiogenesis with therapeutic implication in wound healing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4209-4214 (2014).
- Hosszu, K. K., et al. Cell surface expression and function of the macromolecular c1 complex on the surface of human monocytes. Frontiers in Immunology. 3, 38 (2012).
- Laurent, T. C., Fraser, J. R. Hyaluronan. Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 6 (7), 2397-2404 (1992).
- Gaboriaud, C., et al. The crystal structure of the globular head of complement protein C1q provides a basis for its versatile recognition properties. Journal of Biological Chemistry. 278 (47), 46974-46982 (2003).
- Lam, J., Truong, N. F., Segura, T. Design of cell-matrix interactions in hyaluronic acid hydrogel scaffolds. Acta Biomaterialia. 10 (4), 1571-1580 (2014).
