Summary
Il componente complementare C1q è una molecola pro-infiammatoria altamente espressa nel microambiente tissutale che può interagire con la matrice extracellulare. Qui, descriviamo un metodo per testare come C1q legato all'acido ialuronico influisce sull'adesione cellulare.
Abstract
È stato sempre più dimostrato che il microambiente tumorale svolge un ruolo attivo nella crescita della neoplasia e nella metastasi. Attraverso diversi percorsi, le cellule tumorali possono reclutare in modo efficiente le cellule stromali, immunitarie ed endoteliali secernendo fattori stimolatori, chemiochine e citochine. A loro volta, queste cellule possono alterare le proprietà di segnalazione del microambiente rilasciando segnali di promozione della crescita, metaboliti e componenti di matrice extracellulare per sostenere l'elevata proliferazione e la competenza metastatica. In questo contesto, identifichiamo che il componente complementare C1q, altamente espresso localmente da una serie di tumori maligni umani, interagendo con l'acido ialuronico della matrice extracellulare, influenza fortemente il comportamento delle cellule primarie isolate dal tumore umano Esemplari. Qui, descriviamo un metodo per testare come C1q legato all'acido ialuronico (HA) influisce sull'adesione delle cellule tumorali, il cui fatto è il fatto che le proprietà biologiche dei componenti chiave della matrice extracellulare (in questo caso ha) possono essere modellate da segnali bioattivi verso il tumore progresso.
Introduction
Il microambiente tumorale (TME) influenza lo sviluppo e la progressione del cancro poiché può fornire una nicchia permissiva per la sopravvivenza cellulare, la crescita e l'invasione. L'identificazione di nuovi attori chiave nel TME può essere utile per la scoperta di nuovi strumenti molecolari per la terapia mirata. Il TME comprende una rete complessa e dinamica di cellule non maligne, come cellule endoteliali, fibroblaste e cellule del sistema immunitario, incorporate nei componenti della matrice extracellulare circostante (ECM), tra cui collageni, laminoin, fibronectine, proteoglicani e ialuronani. Sia le cellule tumorali che non tumorali sintetizzano e secernonno componenti ECM insieme a citochine, chemiochine, fattori di crescita ed enzimi di rimodellamento infiammatorio e a matrice che nel complesso alterano le proprietà fisiche, chimiche e di segnalazione di TME. Tra questi costituenti, l'acido ialuronico (HA) è emerso per esercitare un ruolo cruciale nella biologia del tumore. Nonostante la sua semplice composizione chimica, HA, insieme alle sue molecole leganti HA (ialadherine), può modulare l'angiogenesi, la reattività del sistema immunitario e il rimodellamento ECM in modo di dimensioni e concentrazionedipendente 1.
Il sistema di complemento a complemento (C) fa anche parte del TME locale, che ha recentemente ricevuto una crescente attenzione. Il sistema C comprende una serie di proteine solubili e legate alla membrana coinvolte nella prima linea di difesa contro non autocellule, elementi ospiti indesiderati e agenti patogeni. Funzionalmente, la C collega i bracci a due etsuori dei sistemi innati e adattativi per promuovere l'uccisione diretta delle cellule o il montaggio di una risposta infiammatoria2. L'attivazione del tumore può sopprimere la crescita del tumore, distruggendo le cellule tumorali o inibendo la loro escrescenza, ma è diventato sempre più chiaro che può possedere un'attività di promozione del tumore sostenendo l'infiammazione cronica, promuovendo l'istituzione di un milieu immunosoppressivo, inducendo l'angiogenesi e attivando le vie di segnalazione legate al cancro3. In questo contesto, C1q, la prima molecola di riconoscimento del percorso classico del sistema C è emersa per esercitare importanti funzioni nel microambiente tumorale indipendentemente dall'attivazione C4. C1q è stato dimostrato di essere espresso localmente da una serie di tumori maligni umani, dove può favorire l'adesione delle cellule tumorali, la migrazione e la proliferazione oltre all'angiogenesi e metastasi5. È interessante notare che C1q interagisce con un importante costituente dell'ECM come l'HA.
Abbiamo sviluppato una tecnica per isolare le cellule tumorali primarie dalla massa tumorale. Inoltre, abbiamo creato la matrice, che può stimolare il microambiente tumorale, in particolare l'interazione tra C1q e acido ialuronico ad alto peso molecolare. C1q legato all'HA è stato in grado di indurre l'adesione delle cellule tumorali.
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Protocol
Campioni di tessuti da pazienti sono stati raccolti dopo il consenso informato dopo l'approvazione delle considerazioni etiche da parte del Consiglio Istituzionale dell'Ospedale Universitario di Trieste, Italia.
1. Isolamento e coltura delle cellule tumorali (giorno 1)
- Isolare le cellule del mesotelioma umano da campioni solidi MPM. Tritare finemente il tessuto con una fresa per ottenere frammenti di circa 2-3 mm2 di dimensioni e incubare in 5 mL di soluzione di digestione composta da Soluzione di sale equilibrato di Hanks (HBSS) integrata con 0,5 mM Ca2 '/Mg2, 0,5% trypsin e 50 g/mL DNase I, pernottamento a 4 gradi centigradi.
- Isolamento e coltura delle cellule tumorali (Giorno 2)
- Dopo una notte di incubazione, mettere il tessuto digerito per 30 min in un'incubatrice a 37 gradi con agitazione delicata.
- Sostituire la soluzione di digestione alla centrifugazione (250 x g) con 3 mg/mL di collagenae di tipo 1 disciolta in 5 mL di Medium 199 con HBSS e incubare ulteriormente per 30 min a 37 sfaldamenti con agitazione delicata.
- Bloccare la reazione ezimatica aggiungendo il 10% di siero bovino fetale inattivato dal calore (FBS). Risospendere le cellule con molta attenzione con un pipet da 5 mL per garantire che la maggior parte delle cellule venga rilasciata dal tessuto. Quindi, filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro porosdi 100 m.
- Semina le cellule in un pallone da 12,5 cme le promulga a 37 gradi centigradi con cellule endoteliali medie umane prive di siero (HESF), con 10% FBS e completate con EGF (10 ng/mL), FGF di base (20 ng/mL) e 1% penicillina- streptomica.
NOTA: Sostituire con un supporto fresco ogni 2-3 giorni.
2. Rivestimento HA (giorno 1)
- Risospendere l'HA ad alto peso molecolare (1,5 kDa) in acqua a doppia distillazione alla concentrazione di 1 mg/mL6.
- Soluzione di stock HA diluita a 50 g/mL nel tampone di carbonato/bicarbonato (0,1 M, pH 9,6) con tubi delicati.
- Coprire la piastra di 96 pozzetti con 100 litri di soluzione diluita per brodo HA per una notte a 4 gradi centigradi.
NOTA: L'acido ialuronico era un dono gentile del professor Ivan Donati, Dipartimento di Scienze della Vita, Università di Trieste7.
3. Rivestimento C1q (giorno 2)
- Dopo una notte di incubazione, aspirare il vuoto ai pozzi trattati e lavare la piastra da 96 pozzetti con 100 Gradi l di PBS (dPBS) di Dulbecco per pozzo.
- Lasciare che C1q (25 g/mL o concentrazioni diverse per gli esperimenti di risposta alla dose) o BSA (come controllo negativo) si leghino alla plastica immobilizzata-HA incubando queste proteine ad una concentrazione di 25 g/mL in 100 gradi l di dPBS - 0,5% BSA e 0,7 mM Ca2 . Quindi incubare per una notte a 4 gradi centigradi.
- Aspirare i pozzi e lavare la piastra da 96 pozzetti con 100 gradi/pozzetto di dPBS.
4. Etichettatura delle celle con FAST DiI
- Risospendere 1 x 105 cellule tumorali in 500 - L di dPBS contenenti 10 g/mL del tintura fluorescente FAST DiI. Incubare per 15 min a 37 s in un'incubatrice 5% v/v CO2 per l'etichettatura, mescolando manualmente dopo intervalli di 5 min.
- Per rimuovere l'eccesso di FAST DiI, aggiungere 10 mL di dPBS, pipette delicatamente su e giù, e centrifugare a 250 x g per 7 min. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di mezzo libero di siero endoteliale umano contenente 0.1% BSA (HESF - 0.1% BSA).
5. Adezione cellulare su matrici HA/C1q (Giorno 1)
- I pozzi a vuoto aspirano i pozzi rivestiti con le diverse matrici (i pozzi sono stati rivestiti al punto 3.2).
- Distribuire 100 l delle sospensioni per celle etichettate nei pozze rivestite e incubare la piastra per 35 min a 37 gradi centigradi nell'incubatore 5% v/v CO 2.
- Rimuovere le cellule non aderenti aspirando il super-aderente. Lavare una volta con dPBS contenente lo 0,5% di BSA, 0,7 mM Ca2 e 0,7 mM Mg2.
- Eseguire il lyse le celle aderenti aggiungendo 200 l/podi di 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 x 0,1% v/v SDS e leggere immediatamente la piastra di 96 pozzeconto con un lettore di fluorescenza (544 nm, emissione 590 nm) utilizzando una curva di calibrazione generata attraverso la lisi di un numero crescente di etichette etichettate Cellule.
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Representative Results
L'HA è un polisaccago ad alto peso molecolare caricato negativamente, costituito da unità ripetute (1-4)-D-glucuronic acid-((1-3)-N-acetyl-D-glucosamine disaccharide units (1B)7. Il verificarsi del legame di HA sulla piastra 96-well così come l'efficienza della sua immobilizzazione sono stati testati sfruttando ha biotinylated (bio-HA). Diverse concentrazioni di Bio-HA, che vanno da 10 g/mL a 1 mg/mL, sono state ri-sospese in 100 mM di pH carbonato/bicarbonato da 9,6 e incubate durante la notte a 4 gradi centigradi.
Dopo lunghi fustigiti, bio-HA legato alla piastra di 96 pozzi è stato rilevato utilizzando streptavidina coniugata al fosforatro alcalina, mentre la presenza di streptavidina è stata quantificata utilizzando pNPP (1 mg/mL) come substrato. La lettura è stata eseguita alla lunghezza d'onda di 405 nm utilizzando un lettore ELISA. Bio-HA è stato in grado di legarsi a una piastra di 96 pozze in modo di risposta alla dose (dati non mostrati); 50 g/mL è stato scelto come altopiano di saturazione e quindi utilizzato nei nostri saggi.
I nostri dati precedenti hanno dimostrato che C1q è in grado di legarsi a una vasta gamma di ligandi di destinazione localizzati nell'ECM8. Questa associazione è particolarmente forte con HA9. I pozzetti di una piastra di microtitro sono stati rivestiti con 50 g/mL HMW-HA e incubati con crescente concentrazione di C1q. C1q è in grado di legarsi all'HA ad alto peso molecolare in modo dipendente dalla dose (Figura 1A), raggiungendo il massimo livello di legame alla concentrazione di 50 g/mL. Avendo stabilito che C1q può legarsi all'HA, abbiamo studiato l'implicazione di questa interazione nella modifica delle proprietà di segnalazione dell'ECM e delle loro implicazioni nello sviluppo tumorale. A questo scopo, abbiamo stabilito un protocollo per isolare le cellule tumorali da campioni binoti ottenuti da pazienti affetti. Le cellule tumorali primarie sono state isolate dalla biopsia tissutale, come sinteta nella Figura 2. La capacità delle cellule tumorali di interagire con C1q è stata valutata eseguendo un saggio di adesione cellulare utilizzando diverse combinazioni di matrici, come illustrato nella Figura 3. Le cellule tumorali sono state macchiate con la sonda fluorescente FAST DiI e semied su HA immobilizzato, HA legato a C1q o a BSA (utilizzato come controllo negativo), per 35 min. Rispetto all'HA, il rivestimento con HA-bound-C1q è stato in grado di aumentare la quantità di cellule primarie aderenti, ma non è in grado di stimolare l'adesione delle linee cellulari tumorali che abbiamo testato, come mostrato nel grafico rappresentativo in Figura 3.
Figura 1 . Interazione di C1q con acido ialuronico. (A) Associazione di C1q su HMW HA in modo dipendente dalla dose. I dati sono espressi come la media di tre esperimenti indipendenti nel triplice (E.M. (B) Rappresentazione schematica della molecola C1q e della regione globulare a catena singola ricombinante. C1q è assemblato da tre catene di polipeptidi (A, B, C): ognuna contenente una sequenza n-terminale simile al collagene e una testa gLobulare gLobulbul del terminale C. (C) Formula chimica di acido ialuronico, una catena altamente polimerizzata di acido glucuronico e N-acetyilglucosamina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Schema riepilogativo dell'isolamento e della morfologia delle cellule tumorali. Le cellule tumorali sono state isolate dai campioni di biopsia plerica. Le cellule sono state seminata in un pallone di 12,5 cm2 e coltivata in Human Endothelial Cell Serum Free Medium - 10% FBS. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Effetto di C1q sull'adesione delle cellule tumorali. Le cellule tumorali (MES) o la linea cellulare primaria del mesotelioma (MSTO-211H) sono state semiate a pozzi di microtiteri pre-rivestiti con acido ialuronico (HA), HA legata a C1q o albumina del siero bovina (BSA). Nella parte superiore della figura, è stato mostrato l'aspetto morfologico di una linea cellulare primaria rappresentativa aderente all'HA, HA legata all'HA, HA legata a C1q o a BSA. Le immagini sono state acquisite tramite il microscopio a contrasto di fase, ingrandimento originale: 200x. FAST DiI etichettato cellule mesotelioma primarie o una linea cellulare mesotelioma (MSTO-211H) sono stati autorizzati ad aderire a pozzi di microtiter pre-rivestiti con HA, HA legato a C1q o BSA. I dati sono espressi come mezzo di tre esperimenti indipendenti effettuati in triplicati : S.E.M. - p < 0.01 vs HA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Descriviamo un metodo semplice per studiare come il componente complementare C1q, interagendo con l'acido ialuronico, è in grado di modulare il comportamento delle cellule primarie isolate dai tessuti tumorali umani. Sia l'HA che il C1q sono abbondantemente presenti nel microambiente tissutale sia in condizioni fisiologiche che patologiche, partecipando a diversi processi biologici cellulari. Per esempio, C1q ha dimostrato di essere presente nel microambiente della placenta dove favorisce l'invasione extravillous tropoblasto della decidua materna durante la placentazione8. C1q si deposita anche nella pelle curativa dalle ferite dove favorisce il processo angiogenetico necessario per la rigenerazione dei tessuti e la riparazione10. Infine, C1q è stato identificato in diversi tessuti tumorali4. L'HA ad alto peso molecolare è una barriera naturale per l'angiogenesi e la proliferazione e recenti prove hanno dimostrato che C1q, oltre al suo ruolo classico nell'attivazione del complemento, è in grado di agire come una molecola ECM, favorendo la migrazione cellulare.
La novità di questo lavoro consiste nella scoperta che il legame di C1q all'HA modifica fortemente l'interazione delle cellule tumorali con HA. Per impostare questo metodo sono stati presi in considerazione diversi checkpoint. Prima di tutto, abbiamo fatto in modo che una quantità sufficiente di HA fosse legata alla plastica della coltura e ai pozzi ELISA che usavano HA biotinylated. La colorazione blu Alcian dei pozzi ha confermato questi risultati (dati non mostrati). L'incubazione è stata eseguita durante la notte nel buffer di bicarbonato, pH 9.6, e questa procedura garantisce la completa saturazione dei pozzi da HA (dati non mostrati).
Il secondo passo è stato quello di legare C1q alla HA. Il legame di C1q all'HA è stato eseguito a un pH fisiologico (7.4) e in presenza di Ca2 . Per questo motivo, abbiamo utilizzato un buffer dPBS-BSA con ioni bivalenti. Inizialmente abbiamo eseguito un esperimento di risposta alla dose al fine di identificare e scegliere la quantità ottimale di C1q che può essere trovato collegato all'HA. Anche se nella nostra curva dose-risposta non abbiamo raggiunto esattamente l'altopiano, abbiamo usato la concentrazione di 25 g/mL per essere più vicini alla concentrazione fisiologica di C1q libero, considerando che la quantità di C1q normalmente presente nel siero è di 75-150 g/mL. È stato calcolato che il siero C1q privo di C1r e C1s è di circa il 10%-20% del complesso C111. C1q è noto per la sua capacità di legare i polianioni, è stato definito come una molecola di riconoscimento del modello di carica e HA è un polimero lineare caricato negativamente di unità ripetute di acido (1-4)-D-glucuronico-((1-3)-N-acetyl-D-glucosamine12, 13. Per questo motivo, abbiamo studiato questa forte interazione non covalente. Le nostre osservazioni hanno indicato che le cellule tumorali percepisce la differenza tra HA e HA legato a C1q. Le cellule sembrano essere più diffuse se confrontate con la cellula che aderisce alla sola HA. Abbiamo osservato che questo effetto non è mediato da C1q solubile, il che indica che questa modifica nell'adesione cellulare dipende dall'interazione di C1q con HA, probabilmente a causa di un cambiamento conformazionale della molecola complementare come conseguenza dell'associazione.
Vogliamo sottolineare l'importanza dell'uso delle cellule primarie come modelli in vitro del comportamento del tumore per gli esperimenti di adesione, poiché notiamo una forte differenza nella capacità di adesione tra le cellule primarie rispetto a diverse linee cellulari, come mostrato in Figura 3. Un modello alternativo e molto interessante per valutare le proprietà biologiche di HA è l'uso di modelli 3D di scaffold idrogel HA. Questo scaffold con l'incorporazione di molecole biologiche può essere utilizzato per la valutazione dei segnali bioattivi e per diverse applicazioni nella medicina rigenerativa14. Il modello che proponiamo in questo studio è un metodo più facile, più veloce ed economico per la valutazione delle risposte cellulari a una combinazione di stimoli, e può essere considerato come un primo passo per la comprensione dei meccanismi molecolari coinvolti in questo tipo di interazione f.
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Disclosures
Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di rapporti commerciali o finanziari che potrebbero essere interpretati come un potenziale conflitto di interessi.
Acknowledgments
Ringraziamo Ivan Donati per aver fornito ha, Leonardo Amadio, Gabriella 'ito (Dipartimento di Ginecologia di IRCCS "Burlo Garofolo", Trieste, Italia) e Andrea Romano (Unità Operativa Clinica di Anatomia e Istologia Patologica, Ospedale Cattinara, Trieste, Italia ) per la raccolta dei campioni di tessuto. Ringraziamo anche Nicolò Morosini per l'aiuto nella preparazione video e Alex Coppola, la voce. Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni dell'Istituto per la salute materna e infantile, IRCCS "Burlo Garofolo", Trieste, Italia (RC20/16) e della Fondazione Cassa di Risparmio Trieste a R.Bulla.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm pore filter | BD Falcon | 352360 | |
| Amphotericin B solution (fungizone) | Sigma-Aldrich | 1397-89-3 | |
| basic FGF | Immunological Sciences | GRF-15595 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C-4901 | |
| Collagenase type I | Worthington Biochemical Corporation, DBA | MX1D12644 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| DNase I | Roche | 10 104 159 001 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | |
| EGF | Immunological Sciences | GRF-10544 | |
| FAST DiI | Molecular probes, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | D7756 | |
| Fetal bovine serum | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Fibronectin | Roche | 11051407001 | |
| Flask for cell culture | Corning | 430639 | Sterile, vented |
| Gentamicin solution | Sigma-Aldrich | G1397-10ML | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBBS) | Sigma-Aldrich | H6648 | Supplemented with EDTA, Glucose, penicillin-streptamicin, gentamicin and fungizone |
| High molecular weight hyaluronic acid | Kind gift by Prof. Ivan Donati | ||
| Human endothelial serum free medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11111-044 | Supplemented with EGF (5 ng/mL), basic FGF (10 ng/mL), and 1% penicillin–streptomycin (Sigma-Aldrich) |
| Magnesium Chloride | Carlo Erba | 13446-18-9 | |
| Medium 199 with Hank’s salt | Sigma-Aldrich | M7653 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Time-lapse microscopy | Nikon | Imaging System BioStation IM-Q | |
| Titertek Multiskan ELISA Reader | Flow Labs | ||
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4674 |
References
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