Summary
Komplement komponenten C1q er en Pro-inflammatorisk molekyl høyt uttrykt i vevet mikromiljøet som kan samhandle med ekstracellulære matrise. Her beskriver vi en metode for å teste hvordan C1q bundet til hyaluronsyre virkninger celle vedheft.
Abstract
Det har blitt stadig demonstrert at tumor mikromiljøet spiller en aktiv rolle i neoplasi vekst og metastasering. Gjennom ulike trasé, kan tumorceller effektivt rekruttere stromal, uimottakelig og endothelial celler ved sekresjon stimulerende faktorer, chemokiner og cytokiner. I sin tur disse cellene kan endre signalering egenskapene til mikromiljøet ved å frigjøre vekst-fremme signaler, metabolitter og ekstracellulære matrise komponenter for å opprettholde høy spredning og metastatisk kompetanse. I denne sammenheng identifiserer vi at komplement komponenten C1q, høyt uttrykt lokalt av en rekke menneskelige ondartede svulster, ved samspill med ekstracellulære matrise hyaluronsyre, sterkt påvirker atferden til primær celler isolert fra menneskelig svulst Prøver. Her beskriver vi en metode for å teste hvordan C1q bundet til hyaluronsyre (HA) virkninger tumor celle vedheft, underliggende det faktum at de biologiske egenskapene til viktige komponenter i ekstracellulære matrise (i dette tilfellet HA) kan formes av bioaktive signaler mot tumor Progresjon.
Introduction
Svulsten mikromiljøet (TME) påvirker kreftutvikling og progresjon siden det kan gi en ettergivende nisje for celle overlevelse, vekst og invasjon. Identifisering av nye sentrale aktører i TME kan være nyttig for oppdagelsen av nye molekylære verktøy for mål behandling. TME inkluderer et komplekst og dynamisk nettverk av ikke-ondartet celler, slik som endothelial celler, fibroblaster og celler av immunsystemet, innebygd i de omkringliggende ekstracellulære Matrix (ECM) komponenter inkludert kollagen, laminins, fibronectins, proteoglycans og hyaluronans. Både tumor og ikke-tumorceller syntetisere og skiller ut ECM komponenter sammen med cytokiner, chemokiner, vekstfaktorer og inflammatorisk og matrise remodeling enzymer som samlet endre fysiske, kjemiske og signalering egenskaper TME. Blant disse bestanddeler, hyaluronsyre (HA) har dukket opp for å utøve en avgjørende rolle i tumor biologi. Til tross for sin enkle kjemiske sammensetning, HA, sammen med sine HA-bindende molekyler (hyaladherins), kan modulere angiogenese, immunsystemet respons og ECM remodeling i en størrelse og konsentrasjon avhengig måte1.
Komplement (C) systemet er også en del av den lokale TME, som nylig har fått økende oppmerksomhet. C-systemet omfatter et sett av løselige og membran bundne proteiner som er involvert i den første forsvarslinjen mot ikke-selv-celler, uønskede verts elementer og patogener. Funksjonelt, forbinder C de to-effektor armer av medfødte og adaptive systemer for å fremme enten direkte celle drap eller montering av en inflammatorisk respons2. C aktivering kan undertrykke tumor vekst, ved å ødelegge kreftceller eller hemme deres utvekst, men det har blitt stadig klarere at det kan ha en svulst-fremme aktivitet ved å opprettholde kronisk betennelse, fremme etablering av en immunsuppressiv miljø, inducing angiogenese, og aktivere kreft-relaterte signalnettverk trasé3. I denne sammenheng C1q, den første anerkjennelse molekyl av den klassiske veien til C-systemet har dukket opp til å utøve viktige funksjoner i svulsten mikromiljøet uavhengig av C-aktivering4. C1q har vist seg å være uttrykt lokalt av en rekke menneskelige ondartede svulster, hvor det kan favorisere kreftcelle vedheft, migrasjon og spredning i tillegg til angiogenese og metastasering5. Interessant C1q samhandler med en stor bestanddel av ECM som HA.
Vi utviklet en teknikk for å isolere den primære kreftceller fra tumor massen. Videre skapte vi matrisen, som kan stimulere tumor mikromiljøet, spesielt samspillet mellom C1q og høy molekylvekt hyaluronsyre. C1q bundet til HA var i stand til å indusere vedheft av tumorceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vevsprøver fra pasienter ble innhentet etter informert samtykke etter godkjennelse av de etiske betraktninger fra det institusjonelle styret ved Universitetssykehuset i Trieste i Italia.
1. tumor celle isolasjon og kultur (dag 1)
- Isoler humant Mesothelioma celler fra MPM solide prøver. Fint hakke vevet med en kutter for å få fragmenter av ca 2-3 mm2 i størrelse og ruge i 5 ml fordøyelsen løsning bestående av Hanks ' balansert salt Solution (HBSS) supplert med 0,5 mm ca2 +/Mg2 +, 0,5% Trypsin og 50 μg/ml DNase I, over natten ved 4 ° c.
- Tumor celle isolasjon og kultur (dag 2)
- Etter over natten inkubasjons, plasserer fordøyd vevet i 30 min i en 37 ° c inkubator med forsiktig risting.
- Erstatt fordøyelsen løsningen ved sentrifugering (250 x g) med 3 mg/ml kollagenase type 1 oppløst i 5 mL middels 199 med HBSS og ytterligere ruge i 30 min ved 37 ° c med mild risting.
- Blokker enzymatisk reaksjonen ved å tilsette 10% varme-deaktivert fosterets storfe serum (FBS). Resuspend cellene nøye med en 5 mL Pipet for å sikre at de fleste cellene frigjøres fra vevet. Deretter filtrerer du celle fjæringen gjennom et filter på 100 μm pore.
- Seed cellene i en 12,5 cm2 kolbe og kultur dem ved 37 ° c med humant endothelial celler serum fritt medium (HESF), med 10% FBS og SUPPLERT med EGF (10 ng/ml), grunnleggende FGF (20 ng/ml), og 1% penicillin-Streptomycin.
Merk: Erstatt med friskt medium hver 2-3 dager.
2. HA-belegg (dag 1)
- Resuspend høy molekylvekt HA (1,5 kDa) i dobbelt destillert vann ved konsentrasjonen av 1 mg/mL6.
- Fortynne HA lagerløsning til 50 μg/mL i buffer/bikarbonat-bufferen (0,1 M, pH 9,6) med skånsom pipettering.
- Coat den 96-brønn plate med 100 μL av fortynnet HA lagerløsning per brønn over natten ved 4 ° c.
Merk: hyaluronsyre var en slags gave fra professor Ivan Donati, Department of Life Sciences, University of Trieste7.
3. C1q belegg (dag 2)
- Etter over natten inkubasjons, vakuum aspirer de behandlede brønnene og vask 96-brønn plate med 100 μL av Dulbecco PBS (dPBS) per brønn.
- Tillat C1q (25 μg/mL eller forskjellige konsentrasjoner for eksperimenter med dose respons) eller BSA (som en negativ kontroll) for å binde til plast immobilisert-HA ved incubating disse proteinene ved en konsentrasjon på 25 μg/mL i 100 μL av dPBS + 0,5% BSA og 0,7 mM ca2 +/mg2 + . Deretter ruge over natten ved 4 ° c.
- Vakuum aspirer brønnene og vask 96-brønn platen med 100 μL/brønn av dPBS.
4. cellemerking med FAST DiI
- Resuspend 1 x 105 tumorceller i 500 ΜL av dPBS inneholdende 10 μg/ml av fluorescerende fargestoff fast DiI. Ruge i 15 min ved 37 ° c i en 5% v/v CO2 inkubator for merking, miksing manuelt etter 5 min intervaller.
- For å fjerne overflødig FAST DiI, tilsett 10 mL dPBS, Pipetter forsiktig opp og ned, og sentrifuger på 250 x g i 7 min. Resuspend celle pellet i 1 ml humant endothelial serum medium som inneholder 0,1% BSA (HESF + 0,1% BSA).
5. Cell vedheft på HA/C1q matriser (dag 1)
- Vakuum aspirer brønnene belagt med de forskjellige matriser (brønnene var belagt i trinn 3,2).
- Distribuer 100 μL av den merkede celle fjæringen til de belagte brønnene og ruge platen i 35 min ved 37 ° c i 5% v/v CO2 inkubator.
- Fjern de ikke-tilhenger cellene ved å aspirating supernatanten. Vask én gang med dPBS som inneholder 0,5% BSA, 0,7 mM ca2 + og 0,7 mm mg2 +.
- Lyse de tilhenger cellene ved å tilsette 200 μL/brønn på 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 + 0,1% v/v SDS og umiddelbart lese den 96-brønn platen med en fluorescens-leser (544 NM, utslipps 590 NM) ved hjelp av en kalibrerings kurve som genereres gjennom lyse av et økende antall merkede Celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HA er en negativt ladet høy molekylvekt polysakkarid, som består av repeterende (β, 1-4)-D-glucuronic acid-(β, 1-3)-N-acetyl-D-Glucosamine disakkarid Units (figur 1B)7. Forekomsten av bindingen av HA på 96-brønn plate samt effektiviteten av sine immobilisering ble testet dra nytte av biotinylated HA (bio-HA). Ulike konsentrasjoner av bio-HA, fra 10 μg/mL til 1 mg/mL, ble re-suspendert i 100 mM/bikarbonat-buffer pH 9,6 og inkubert over natten ved 4 ° c.
Etter omfattende vask, bio-HA bundet til 96-brønner plate ble oppdaget ved hjelp streptavidin bøyd til alkalisk fosfatase, mens tilstedeværelsen av streptavidin ble kvantifisert ved hjelp av pNPP (1 mg/mL) som et substrat. Lesingen ble utført ved bølgelengden til 405 NM ved hjelp av en ELISA-leser. Bio-HA var i stand til å binde til en 96-brønn plate i en dose respons måte (data ikke vist); 50 μg/mL ble valgt som et metnings platå og derfor benyttet i våre analyser.
Våre tidligere data viste at C1q er i stand til å binde til et bredt spekter av mål ligander lokalisert i ECM8. Denne bindingen er spesielt sterk med HA9. Brønnene til en mikrotiterbrønnene plate var belagt med 50 μg/mL HMW-HA og inkubert med økende konsentrasjon av C1q. Bound C1q ble påvirket inkubasjons med anti-C1q polyklonale antistoffer. C1q er i stand til å binde til høy molekylvekt HA i en dose avhengig måte (figur 1a), og nådde det maksimale nivået av binding ved konsentrasjonen av 50 μg/ml. Etter å ha fastslått at C1q kan binde seg til HA, undersøkte vi konsekvensen av denne samhandlingen med å endre signal egenskapene til ECM og deres implikasjoner i tumor utvikling. Til dette målet etablerte vi en protokoll til isolerte tumorceller fra Bioptic prøver innhentet fra berørte pasienter. Primære tumorceller ble isolert fra vev biopsi, som oppsummert i figur 2. Evnen til tumorceller til å samhandle med C1q ble evaluert ved å utføre en celle vedheft analysen ved hjelp av ulike matrise kombinasjoner, som vist i Figur 3. Tumor celler ble farget med fluorescerende sonde FAST DiI og seeded på immobilisert HA, HA bundet til C1q eller BSA (brukt som en negativ kontroll), for 35 min. Hvis sammenlignet med HA, belegget med HA-Bound-C1q var i stand til å øke mengden av å følge primære celler, men er ikke i stand til å stimulere vedheft av tumor cellelinjer som vi testet, som vist i representative grafen i Figur 3.
Figur 1 . Interaksjon av C1q med hyaluronsyre. (A) binding av C1Q på HMW ha i en dose avhengig måte. Dataene uttrykkes som gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter i tre eksemplarer ± S.E.M. (B) skjematisk representasjon av C1q-molekylet og av rekombinant single Chain globular region. C1q er satt sammen av tre polypeptid kjeder (A, B, C): hver inneholder en N-Terminal kollagen-lignende sekvens og en C-terminal globular gC1q hodet. (C) kjemisk formel av hyaluronsyre, en svært polymerisert kjede av glucuronic syre og N-acetylglucosamine. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Oppsummering ordningen med isolasjon og morfologi av tumorceller. Tumor celler ble isolert fra pleural biopsi eksemplarer. Cellene ble sådd i en 12,5 cm2 kolbe og kultivert i Human endothelial Cell serum gratis medium + 10% FBS. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Effekt av C1q på tumorceller vedheft. Tumor celler (MES) eller primære Mesothelioma cellelinje (MSTO-211H) ble sådd til mikrotiterbrønnene brønner pre-belagt med hyaluronsyre (HA), HA bundet til C1q eller storfe serum albumin (BSA). I den øvre delen av figuren, den morfologiske aspekt av en representant primær cellelinje overholdt HA, HA bundet til C1q eller til BSA ble vist. Bilder ble anskaffet via fase kontrast mikroskop, original forstørrelse: 200x. FAST DiI merket primære Mesothelioma celler eller en Mesothelioma cellelinje (MSTO-211H) fikk lov til å følge mikrotiterbrønnene brønner pre-belagt med HA, HA bundet til C1q eller BSA. Dataene uttrykkes som gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter gjort i triplicates ± S.E.M. * p < 0,01 vs HA. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en enkel metode for å undersøke hvordan komplement komponenten C1q, i samspill med hyaluronsyre, er i stand til å modulere atferden til primære celler isolert fra menneskelig tumor vev. Både HA og C1q er rikelig tilstede i vevet mikromiljøet både under fysiologiske og patologiske tilstander, som deltar i flere celle biologiske prosesser. For eksempel har C1q vist seg å være til stede i mikromiljøet av morkaken der det favoriserer extravillous trophoblast invasjon av mors Vertsplanter under placentation8. C1q er også avsatt i sår-healing hud hvor det fremmer angiogenetic prosessen som kreves for vev regenerering og reparasjon10. Til slutt, C1q har blitt identifisert i flere forskjellige tumor vev4. Høy molekylvekt HA er en naturlig barriere for angiogenese og spredning og nyere bevis viste at C1q, foruten dens klassiske rolle i Komplement aktivering, er i stand til å fungere som et ECM-molekyl, og favoriserer celle migrasjon.
Nyheten av dette arbeidet består i å finne at bindingen av C1q til HA sterkt endre samspillet av tumorceller med HA. For å sette opp denne metoden har flere sjekkpunkter blitt vurdert. Først av alt, vi sørget for at en tilstrekkelig mengde HA var bundet til plast av kultur og ELISA brønner ved hjelp biotinylated HA. Alcian blå farging av brønnene bekreftet disse resultatene (data ikke vist). Inkubasjons har blitt utført over natten i bikarbonat buffer, pH 9,6, og denne prosedyren sikre fullstendig metning av brønnene ved HA (data ikke vist).
Det andre trinnet var å binde C1q til HA. Bindingen av C1q til HA har blitt utført ved en fysiologisk pH (7,4) og i nærvær av ca2 +. Derfor brukte vi en dPBS-BSA-buffer med bivalent ioner. Vi har i utgangspunktet utført en dose respons eksperiment for å identifisere og velge den optimale mengden av C1q som kan bli funnet knyttet til HA. Selv om vi i vår dose reaksjons kurve ikke nådde nøyaktig platået, brukte vi konsentrasjonen av 25 μg/mL for å være nærmere den fysiologiske konsentrasjonen av fri C1q, med tanke på at mengden C1q som normalt finnes i serum er 75-150 μg/mL. Det har blitt beregnet at serum C1q fri fra C1r og C1s er ca 10%-20% av C1 kompleks11. C1q er kjent for sin evne til å binde polyanions, det har blitt definert som en kostnad mønster anerkjennelse molekyl og HA er en negativt ladet lineær polymer av repeterende enheter av (β, 1-4)-D-glucuronic acid-(β, 1-3)-N-acetyl-D-Glucosamine12, 13. på grunn av dette undersøkte vi denne sterke ikke-kovalente interaksjonen. Våre observasjoner indikerte at tumorceller forstand forskjellen mellom HA og HA bundet til C1q. Cellene ser ut til å være mer spredt ut hvis sammenlignet med cellen som følger HA alene. Vi observerte at denne effekten ikke er formidlet av løselig C1q, noe som indikerer at denne endringen i celle vedheft er avhengig av samspillet av C1q med HA, sannsynligvis på grunn av en conformational endring av komplement molekylet som en konsekvens av bindingen.
Vi ønsker å understreke viktigheten av bruk av primær celler som in vitro-modeller av tumor adferd for vedheft eksperimenter, siden vi merker en sterk forskjell i vedheft evne mellom primær celler sammenlignet med flere cellelinjer, som vist i Figur 3. Et alternativ og svært interessant modell for å evaluere de biologiske egenskapene til HA er bruken av 3D-modeller av HA hydrogel stillaset. Dette stillaset med inkorporering av biologiske molekyler kan brukes til evaluering av bioaktive signaler og for flere anvendelser i regenererende medisin14. Modellen som vi foreslår i denne studien er en enklere, raskere og billigere metode for evaluering av cellulære reaksjoner på en kombinasjon av stimuli, og det kan betraktes som et første skritt for forståelsen av de molekylære mekanismene som er involvert i denne typen Samhandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at forskningen ble gjennomført i fravær av kommersielle eller finansielle forhold som kan tolkes som en potensiell interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi takker Ivan Donati for å gi av HA, Leonardo Amadio, Gabriella Zito (Department of gynekologi av IRCCS "Burlo Garofolo", Trieste, Italia) og Andrea Romano (operative Clinical Unit of Anatomy og patologiske histologi, Cattinara Hospital, Trieste, Italia ) for Vevsprøve samlingen. Vi takker også Nicolò Morosini for hjelp i videoen forberedelse og Alex Coppola, stemmen. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra instituttet for mødre-og barnehelse, IRCCS "Burlo Garofolo", Trieste, Italia (RC20/16) og Fondazione Cassa di Risparmio Trieste til R. Bulla.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm pore filter | BD Falcon | 352360 | |
| Amphotericin B solution (fungizone) | Sigma-Aldrich | 1397-89-3 | |
| basic FGF | Immunological Sciences | GRF-15595 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C-4901 | |
| Collagenase type I | Worthington Biochemical Corporation, DBA | MX1D12644 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| DNase I | Roche | 10 104 159 001 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | |
| EGF | Immunological Sciences | GRF-10544 | |
| FAST DiI | Molecular probes, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | D7756 | |
| Fetal bovine serum | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Fibronectin | Roche | 11051407001 | |
| Flask for cell culture | Corning | 430639 | Sterile, vented |
| Gentamicin solution | Sigma-Aldrich | G1397-10ML | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBBS) | Sigma-Aldrich | H6648 | Supplemented with EDTA, Glucose, penicillin-streptamicin, gentamicin and fungizone |
| High molecular weight hyaluronic acid | Kind gift by Prof. Ivan Donati | ||
| Human endothelial serum free medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11111-044 | Supplemented with EGF (5 ng/mL), basic FGF (10 ng/mL), and 1% penicillin–streptomycin (Sigma-Aldrich) |
| Magnesium Chloride | Carlo Erba | 13446-18-9 | |
| Medium 199 with Hank’s salt | Sigma-Aldrich | M7653 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Time-lapse microscopy | Nikon | Imaging System BioStation IM-Q | |
| Titertek Multiskan ELISA Reader | Flow Labs | ||
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4674 |
References
- Zamboni, F., Vieira, S., Reis, R. L., Oliveira, J. M., Collins, M. N. The potential of hyaluronic acid in immunoprotection and immunomodulation: Chemistry, processing and function. Progress in Materials Science. 97, 97-122 (2018).
- Lorusso, G., Ruegg, C. The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).
- Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. D. Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis. Nature Immunology. 11 (9), 785-797 (2010).
- Bulla, R., et al. C1q acts in the tumour microenvironment as a cancer-promoting factor independently of complement activation. Nature Communications. 7, 10346 (2016).
- Winslow, S., Leandersson, K., Edsjo, A., Larsson, C. Prognostic stromal gene signatures in breast cancer. Breast Cancer Research. 17, 23 (2015).
- Collins, M. N., Birkinshaw, C. Hyaluronic acid solutions: A processing method for efficient chemical modification. Journal of Applied Polymer Science. 130 (1), 145-152 (2013).
- Itano, N. Simple primary structure, complex turnover regulation and multiple roles of hyaluronan. Journal of Biochemistry. 144 (2), 131-137 (2008).
- Agostinis, C., et al. An alternative role of C1q in cell migration and tissue remodeling: contribution to trophoblast invasion and placental development. Journal of Immunology. 185 (7), 4420-4429 (2010).
- Agostinis, C., et al. Complement Protein C1q Binds to Hyaluronic Acid in the Malignant Pleural Mesothelioma Microenvironment and Promotes Tumor Growth. Frontiers in Immunology. 8, 1559 (2017).
- Bossi, F., et al. C1q as a unique player in angiogenesis with therapeutic implication in wound healing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4209-4214 (2014).
- Hosszu, K. K., et al. Cell surface expression and function of the macromolecular c1 complex on the surface of human monocytes. Frontiers in Immunology. 3, 38 (2012).
- Laurent, T. C., Fraser, J. R. Hyaluronan. Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 6 (7), 2397-2404 (1992).
- Gaboriaud, C., et al. The crystal structure of the globular head of complement protein C1q provides a basis for its versatile recognition properties. Journal of Biological Chemistry. 278 (47), 46974-46982 (2003).
- Lam, J., Truong, N. F., Segura, T. Design of cell-matrix interactions in hyaluronic acid hydrogel scaffolds. Acta Biomaterialia. 10 (4), 1571-1580 (2014).
