Summary
O componente complementar de-de-de-a é uma molécula pró-inflamatória altamente expressa no microambiente tecidual que pode interagir com a matriz extracelular. Aqui, nós descrevemos um método para testar como o-de-de-ácido hialurônico afeta a adesão celular.
Abstract
Tem sido demonstrado cada vez mais que o microambiente tumoral desempenha um papel ativo no crescimento e metástase da neoplasia. Através de diferentes vias, as células tumorais podem eficientemente recrutar células estromal, imunológicas e endoteliais secretando fatores estimulatórios, quimiocinas e citocinas. Por sua vez, essas células podem alterar as propriedades de sinalização do microambiente, liberando sinais de promoção de crescimento, metabólitos e componentes da matriz extracelular para sustentar alta proliferação e competência metastática. Neste contexto, identifica-se que o componente complementar-de-n, altamente expresso localmente por uma gama de tumores malignos humanos, ao interagir com o ácido hialurônico da matriz extracelular, afeta fortemente o comportamento das células primárias isoladas do tumor humano Espécimes. Aqui, nós descrevemos um método para testar como o-de-de-aço para o ácido hialurônico (HA) impacta a adesão de células tumorais, subjacente ao fato de que as propriedades biológicas dos principais componentes da matriz extracelular (neste caso HA) podem ser moldadas por sinais bioativos em direção ao tumor Progressão.
Introduction
O microambiente do tumor (TME) influencia o desenvolvimento e a progressão do cancro desde que pode fornecer um Niche permissiva para a sobrevivência, o crescimento e a invasão da pilha. A identificação de novos atores-chave na TME pode ser útil para a descoberta de novas ferramentas moleculares para a terapia alvo. A TME inclui uma rede complexa e dinâmica de células não malignas, como células endoteliais, fibroblastos e células do sistema imunológico, encaixadas nos componentes da matriz extracelular circundante (ECM), incluindo colágenos, lamininas, fibronectinas, proteoglicanos e hyaluronans. Ambas as células tumorais e não-tumorais sintetizam e secretam componentes de ECM em conjunto com citocinas, quimiocinas, fatores de crescimento e enzimas de remodelação inflamatória e matricial que alteram globalmente as propriedades físicas, químicas e de sinalização da TME. Entre esses constituintes, o ácido hialurônico (HA) surgiu para exercer um papel crucial na biologia tumoral. Apesar de sua simples composição química, a HA, juntamente com suas moléculas de ligação à HA (hialaderinas), pode modular a angiogênese, a responsividade do sistema imunológico e a remodelação do ECM de forma dependente de tamanho e concentração1.
O sistema complementar (C) também faz parte do TME local, que recentemente recebeu uma atenção crescente. O sistema C engloba um conjunto de proteínas solúveis e ligadas à membrana envolvidas na primeira linha de defesa contra não-células-auto, elementos hospedeiros indesejados e patógenos. Funcionalmente, o C vincula os braços de dois efetores de sistemas inatos e adaptativos para promover a matança direta de células ou a montagem de uma resposta inflamatória2. A ativação de C pode suprimir o crescimento do tumor, destruindo as células cancerosas ou inibindo seu crescimento, mas tornou-se cada vez mais claro que ele pode possuir uma atividade que promove o tumor, sustentando a inflamação crônica, promovendo o estabelecimento de um meio imunossupressor, induzindo a angiogênese e ativando as vias de sinalização relacionadas ao câncer3. Neste contexto, foi a primeira molécula de reconhecimento da via clássica do sistema C que tem emergido para exercer funções importantes no microambiente tumoral, independentemente da ativação do C4. Foi demonstrado que a r. 5 foi expressa localmente por uma série de tumores malignos humanos, onde pode favorecer a adesão, a migração e a proliferação de células cancerosas, além da angiogênese e metástasecinco. Curiosamente, a-n interage com um dos principais constituintes do ECM, como HA.
Nós desenvolvemos uma técnica para isolar as pilhas de cancro preliminares da massa de tumor. Além disso, nós criamos a matriz, que pode estimular o microambiente do tumor, particular a interação entre o de-o e o ácido hialurónico do peso molecular elevado. A capacidade para a HA foi capaz de induzir a adesão das células tumorais.
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Protocol
Amostras de tecido de pacientes foram coletadas após consentimento informado após aprovação das considerações éticas pelo Conselho institucional do hospital universitário de Trieste, Itália.
1. isolamento e cultura de células tumorais (dia 1)
- Isole pilhas humanas do mesotelioma dos espécimes contínuos do MPM. Picar finamente o tecido com um cortador para obter fragmentos de cerca de 2-3 mm2 em tamanho e incubar em 5 ml de solução de digestão composta de Hanks ' Balanced Salt Solution (HBSS) suplementado com 0,5 mm CA2 +/mg2 +, 0,5% tripsina e 50 μg/ml DNase I, durante a noite a 4 ° c.
- Isolamento e cultura de células tumorais (dia 2)
- Após a incubação durante a noite, coloque o tecido digerido por 30 min em uma incubadora de 37 ° c com agitação suave.
- Substitua a solução de digestão após a centrifugação (250 x g) com 3 mg/ml de colagenase tipo 1 dissolvida em 5 ml de média 199 com HBSS e incubar mais por 30 min a 37 ° c com agitação suave.
- Bloqueie a reação enzimática adicionando 10% de soro bovino fetal inativado por calor (FBS). Resuspend as pilhas muito com cuidado com um Pipet de 5 mL para assegurar-se de que a maioria das pilhas estejam liberadas do tecido. Em seguida, filtre a suspensão da célula através de um filtro de poros de 100 μm.
- Sementes as células em um 12,5 cm2 balão e cultura-los a 37 ° c com células endoteliais humanas médio livre de soro (hesf), com 10% FBS e suplementado com EGF (10 ng/ml), FGF básico (20 ng/ml), e 1% penicilina-estreptomicina.
Nota: substitua por meio fresco a cada 2-3 dias.
2. revestimento de HA (dia 1)
- Ressuscito de alto peso molecular HA (1,5 kDa) em água destilada dupla na concentração de 1 mg/mL6.
- Diluir a solução de estoque de HA para 50 μg/mL em tampão carbonato/bicarbonato (0,1 M, pH 9,6) com pipetagem suave.
- Cubra a placa 96-well com 100 μL de solução de estoque de HA diluir por poço durante a noite a 4 ° c.
Nota: o ácido hialurónico era um presente amável do professor Ivan Donati, departamento de Ciências da vida, Universidade de Trieste7.
3. de revestimento (dia 2)
- Após a incubação durante a noite, aspirar os poços tratados e lavar a placa 96-well com 100 μL de PBS de Dulbecco (dPBS) por poço.
- Permitir (25 μg/mL ou concentrações diferentes para experimentos de resposta à dose) ou BSA (como um controle negativo) para ligar ao plástico imobilizados-HA incubando essas proteínas em uma concentração de 25 μg/mL em 100 μL de dPBS + 0,5% BSA e 0,7 mM CA2 +/mg2 + . Em seguida, incubar durante a noite a 4 ° c.
- Aspirar os poços e lavar a placa 96-well com 100 μL/poço de dPBS.
4. rotulagem celular com FAST DiI
- Resuspend 1 x 105 células tumorais em 500 ΜL de dpbs contendo 10 μg/ml de corante fluorescente Fast DII. Incubar por 15 min a 37 ° c em uma incubadora de 5% v/v CO2 para a rotulagem, misturando manualmente após intervalos de 5 minutos.
- Para remover o excesso FAST DiI, adicionar 10 mL de dPBS, pipeta suavemente para cima e para baixo, e centrifugar a 250 x g por 7 min. ressuscite o pellet celular em 1 ml de soro endotelial humano livre médio contendo 0,1% BSA (hesf + 0,1% BSA).
5. adesão de células em matrizes HA/1 (1º dia)
- Aspirar os Poços revestidos com as diferentes matrizes (os poços foram revestidos na etapa 3,2).
- Distribuir 100 μL da suspensão da célula rotulada para os Poços revestidos e incubar a placa por 35 min a 37 ° c em 5% v/v CO2 incubadora.
- Retire as células não aderentes aspirando o sobrenadante. Lave uma vez com dPBS contendo 0,5% BSA, 0,7 mM CA2 + e 0,7 mm mg2 +.
- Lyse as células aderentes, adicionando 200 μL/poço de 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 + 0,1% v/v SDS e imediatamente ler a placa 96-bem com um leitor de fluorescência (544 nm, emissão 590 nm) usando uma curva de calibração gerada através da lise de um número crescente de rotulados Células.
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Representative Results
HA é um polissacárido de alto peso molecular carregado negativamente, que é composto de repetição (β,1-4)-D-glucurônico ácido-(β,1-3)-N-acetil-D-glucosamina dissacarínico unidades (Figura 1b)7. A ocorrência da ligação de HA na placa 96-well, bem como a eficiência de sua imobilização foram testadas aproveitando-se de HA biotinylated (bio-HA). Diferentes concentrações de bio-HA, variando de 10 μg/mL a 1 mg/mL, foram resuspensas em 100 mM de carbonato/bicarbonato-tampão pH 9,6 e incubadas durante a noite a 4 ° c.
Após lavadas extensas, a placa de bio-HA ligada a 96-Wells foi detectada com streptavidina conjugada à fosfatase alcalina, enquanto a presença de estreptavidina foi quantificada utilizando pNPP (1 mg/mL) como substrato. A leitura foi realizada no comprimento de onda de 405 nm, utilizando-se um leitor ELISA. Bio-HA foi capaz de ligar a uma placa 96-well em uma maneira da resposta da dose (dados não mostrados); 50 μg/mL foi escolhida como um platô de saturação e, portanto, utilizada em nossos ensaios.
Nossos dados anteriores demonstraram que o n. º8é capaz de se vincular a uma ampla gama de ligantes-alvo localizados no ECM. Esta ligação é particularmente forte com HA9. Os poços de uma placa de de microtitulação foram revestidos com 50 μg/ml de HMW-ha e incubados com concentração crescente de $300. o limite foi visualizado na incubação com Anticorpos policlonais anti-de--------------- É possível vincular a HA de alto peso molecular de forma dependente da dose (Figura 1a), atingindo o nível máximo de ligação na concentração de 50 μg/ml. Tendo estabelecido que o a. n pode se vincular à HA, investigamos a implicação dessa interação na modificação das propriedades de sinalização do ECM e suas implicações no desenvolvimento tumoral. Para este objetivo, estabelecemos um protocolo para células tumorais isoladas de espécimes Bioptic obtidos de pacientes afetados. As células tumorais primárias foram isoladas da biópsia tecidual, como resumida na Figura 2. A capacidade das células tumorais de interagir com o n. º foi avaliada através da realização de um ensaio de adesão celular utilizando diferentes combinações de matrizes, como mostra a Figura 3. As células tumorais foram coradas com a sonda fluorescente FAST DiI e semeadas em HA imobilizada, HA ligada a m. 20 ou a BSA (usada como controle negativo), por 35 min. Se comparado ao HA, o revestimento com HA-Bound-de-de--------------------foi capaz de aumentar a quantidade de células primárias aderindo, mas não é capaz de estimular a adesão de linhagens celulares tumorais que testamos, como mostrado
Figura 1 . Interação de US $, com ácido hialurônico. (A) ligação de h. n em HMW ha de forma dependente da dose. Os dados são expressos como a média de três experimentos independentes em triplicado ± M.E.V. (B) representação esquemática da molécula de 2, e da região globular de cadeia única recombinante. M. 3 é montado a partir de três cadeias polipeptídicas (a, B, C): cada uma contendo um N-terminal colágeno-como a seqüência e um C-terminal globular gC1q cabeça. (C) fórmula química do ácido hialurônico, uma cadeia altamente polimerizada de ácido glucurônico e N-acetilglucosamina. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Esquema de síntese do isolamento e morfologia das células tumorais. As pilhas do tumor foram isoladas dos espécimes pleurais da biópsia. As células foram semeadas em um balão de 12,5 cm2 e cultivadas em meio livre de soro de células endoteliais humanas + 10% FBS. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Efeito de n. n. As pilhas do tumor (MES) ou a linha de pilha preliminar do mesotelioma (msto-211h) foram semeadas aos poços do de microtitulação pré-revestidos com o ácido hialurónico (ha), o ha limitado a de 2 a 2 ou à albumina de soro bovina (BSA). Na parte superior da figura, foi demonstrado o aspecto morfológico de uma linha celular primária representativa aderido à HA, HA ligada a de n. º ou à BSA. As imagens foram adquiridas via microscópio de contraste de fase, ampliação original: 200x. As pilhas primárias etiquetadas do mesotelioma do Fast DII ou uma linha celular do mesotelioma (msto-211h) foram permitidas aderir aos poços do de microtitulação pré-revestidos com o ha, o ha limitado a de 2 a 2 ou a BSA. Os dados são expressos em média de três experimentos independentes realizados em triplicados ± M.E.V. * p < 0, 1 vs HA. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nós descrevemos um método fácil para investigar como o componente do complemento, que interage com o ácido hialurônico, é capaz de modular o comportamento de células primárias isoladas de tecidos tumorais humanos. Tanto o HA quanto o n. º n estão presentes no microambiente tecidual em condições fisiológicas e patológicas, participando de diversos processos biológicos celulares. Por exemplo, foi demonstrado que o n. º-8 está presente no microambiente da placenta, onde favorece a invasão de trofoblastos trophoblast da decídua materna durante a placentaçãooito. É depositado também na pele ferida-Healing onde promove o processo angiogenetic exigido para a regeneração e o reparo do tecido10. Finalmente, foi identificado o n.º 4em vários tecidos tumorais diferentes. A HA de alto peso molecular é uma barreira natural para a angiogênese e proliferação, e evidências recentes mostraram que a a. v., além de seu papel clássico na ativação do complemento, é capaz de atuar como uma molécula de ECM, favorecendo a migração celular.
A novidade deste trabalho consiste na constatação de que a vinculação de n-de de n a HA modifica fortemente a interação das células tumorais com HA. Para configurar esse método vários pontos de verificação foram considerados. Em primeiro lugar, asseguramos que uma quantidade suficiente de HA estava ligada ao plástico da cultura e aos poços ELISA utilizando HA biotinilada. A coloração azul Alcian dos poços confirmou estes resultados (dados não mostrados). A incubação foi realizada durante a noite em tampão de bicarbonato, pH 9,6, e este procedimento assegura a saturação completa dos poços por HA (dados não mostrados).
O segundo passo foi vincular a 2, a HA. A ligação de n-2 a HA foi realizada em pH fisiológico (7,4) e na presença de CA+ +. Por esta razão, utilizamos um tampão dPBS-BSA com íons bivalentes. Inicialmente, realizou-se um experimento de resposta à dose para identificar e escolher a quantidade ideal de n. º de $, que pode ser encontrada anexada à HA. Embora em nossa curva de dose-resposta não atingimos exatamente o planalto, utilizou-se a concentração de 25 μg/mL para estar mais próxima da concentração fisiológica de livre de $300, considerando-se que a quantidade de $300 normalmente presente no soro é de 75-150 μg/mL. Calculou-se que o soro n. º C1r e C1S é de cerca de 10%-20% do complexo C111. M. 1 é conhecido por sua capacidade de ligar polianions, tem sido definido como uma molécula de reconhecimento de padrão de carga e HA é um polímero linear carregado negativamente de unidades repetitivas de (β,1-4)-D-glucurônico ácido-(β,1-3)-N-acetil-D-glucosamina12, 13. por esta razão, investigamos esta forte interação não covalente. Nossas observações indicaram que as pilhas do tumor sentem a diferença entre o HA e o HA limitados a a... As células parecem ser mais spread-out se comparado com a célula aderindo a HA sozinho. Observou-se que esse efeito não é mediado por o solúvel de n º, indicando que essa modificação na adesão celular é dependente da interação de i. n com HA, provavelmente devido a uma mudança conformacional da molécula do complemento como consequência da ligação.
Queremos enfatizar a importância do uso de células primárias como modelos in vitro de comportamento tumoral para os experimentos de adesão, uma vez que notamos uma forte diferença na capacidade de adesão entre as células primárias em comparação com várias linhas celulares, como mostrado na Figura 3. Um modelo alternativo e muito interessante para avaliar as propriedades biológicas da HA é o uso de modelos 3D de andaime de hidrogel HA. Este andaime com a incorporação de moléculas biológicas pode ser usado para a avaliação de sinais bioativos e para diversas aplicações na medicina regenerativa14. O modelo que propomos neste estudo é um método mais fácil, mais rápido e mais barato para a avaliação das respostas celulares a uma combinação de estímulos, podendo ser considerado como um primeiro passo para a compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos nesse tipo de Interação.
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Disclosures
Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.
Acknowledgments
Agradecemos a Ivan Donati pelo fornecimento de HA, Leonardo Amadio, Gabriella Zito (departamento de Ginecologia da IRCCS "burlo Garofolo", Trieste, Itália) e Andrea Romano (unidade clínica operatória de anatomia e histologia patológica, hospital Cattinara, Trieste, Itália ) para a coleta de amostras de tecido. Agradecemos também Nicolò Morosini pela ajuda na preparação de vídeo e Alex Coppola, a voz. Este trabalho foi apoiado por subsídios do Instituto de saúde materna e infantil, IRCCS "burlo Garofolo", Trieste, Itália (RC20/16) e Fondazione Cassa di risparmio Trieste para R. Bulla.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm pore filter | BD Falcon | 352360 | |
| Amphotericin B solution (fungizone) | Sigma-Aldrich | 1397-89-3 | |
| basic FGF | Immunological Sciences | GRF-15595 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C-4901 | |
| Collagenase type I | Worthington Biochemical Corporation, DBA | MX1D12644 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| DNase I | Roche | 10 104 159 001 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | |
| EGF | Immunological Sciences | GRF-10544 | |
| FAST DiI | Molecular probes, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | D7756 | |
| Fetal bovine serum | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Fibronectin | Roche | 11051407001 | |
| Flask for cell culture | Corning | 430639 | Sterile, vented |
| Gentamicin solution | Sigma-Aldrich | G1397-10ML | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBBS) | Sigma-Aldrich | H6648 | Supplemented with EDTA, Glucose, penicillin-streptamicin, gentamicin and fungizone |
| High molecular weight hyaluronic acid | Kind gift by Prof. Ivan Donati | ||
| Human endothelial serum free medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11111-044 | Supplemented with EGF (5 ng/mL), basic FGF (10 ng/mL), and 1% penicillin–streptomycin (Sigma-Aldrich) |
| Magnesium Chloride | Carlo Erba | 13446-18-9 | |
| Medium 199 with Hank’s salt | Sigma-Aldrich | M7653 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Time-lapse microscopy | Nikon | Imaging System BioStation IM-Q | |
| Titertek Multiskan ELISA Reader | Flow Labs | ||
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4674 |
References
- Zamboni, F., Vieira, S., Reis, R. L., Oliveira, J. M., Collins, M. N. The potential of hyaluronic acid in immunoprotection and immunomodulation: Chemistry, processing and function. Progress in Materials Science. 97, 97-122 (2018).
- Lorusso, G., Ruegg, C. The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).
- Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. D. Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis. Nature Immunology. 11 (9), 785-797 (2010).
- Bulla, R., et al. C1q acts in the tumour microenvironment as a cancer-promoting factor independently of complement activation. Nature Communications. 7, 10346 (2016).
- Winslow, S., Leandersson, K., Edsjo, A., Larsson, C. Prognostic stromal gene signatures in breast cancer. Breast Cancer Research. 17, 23 (2015).
- Collins, M. N., Birkinshaw, C. Hyaluronic acid solutions: A processing method for efficient chemical modification. Journal of Applied Polymer Science. 130 (1), 145-152 (2013).
- Itano, N. Simple primary structure, complex turnover regulation and multiple roles of hyaluronan. Journal of Biochemistry. 144 (2), 131-137 (2008).
- Agostinis, C., et al. An alternative role of C1q in cell migration and tissue remodeling: contribution to trophoblast invasion and placental development. Journal of Immunology. 185 (7), 4420-4429 (2010).
- Agostinis, C., et al. Complement Protein C1q Binds to Hyaluronic Acid in the Malignant Pleural Mesothelioma Microenvironment and Promotes Tumor Growth. Frontiers in Immunology. 8, 1559 (2017).
- Bossi, F., et al. C1q as a unique player in angiogenesis with therapeutic implication in wound healing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4209-4214 (2014).
- Hosszu, K. K., et al. Cell surface expression and function of the macromolecular c1 complex on the surface of human monocytes. Frontiers in Immunology. 3, 38 (2012).
- Laurent, T. C., Fraser, J. R. Hyaluronan. Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 6 (7), 2397-2404 (1992).
- Gaboriaud, C., et al. The crystal structure of the globular head of complement protein C1q provides a basis for its versatile recognition properties. Journal of Biological Chemistry. 278 (47), 46974-46982 (2003).
- Lam, J., Truong, N. F., Segura, T. Design of cell-matrix interactions in hyaluronic acid hydrogel scaffolds. Acta Biomaterialia. 10 (4), 1571-1580 (2014).
