Summary

Identifizierung der Codierung und nicht-kodierende RNA-Klassen ausgedrückt bei Schweinen Vollblut

Published: November 28, 2018
doi:

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Verarbeitung der Codierung (mRNA) optimiert und nicht-kodierenden (NcRNA) Globin reduziert RNA-Seq-Bibliotheken von einer einzigen Vollblut-Probe.

Abstract

Das Aufkommen von innovativer und leistungsfähiger nächste Generation Sequenzierung Techniken eröffnet neue Wege in der Fähigkeit, die zugrunde liegenden Genexpression im Zusammenhang mit biologischen Prozesse von Interesse zu untersuchen. Diese Innovationen ermöglichen nicht nur Forscher, Ausdruck aus der mRNA-Sequenzen zu beobachten, die diesen Effekt zelluläre Funktion für Gene kodieren, aber auch die nicht-kodierende RNA (NcRNA) Moleküle, die nicht übersetzten, aber dennoch bleiben regulatorische Funktionen. Obwohl Forscher die Fähigkeit haben, mRNA und NcRNA Ausdruck zu beobachten, wurde es üblich, dass eine Studie, die auf eine oder die andere zu konzentrieren. Jedoch wenn Studien an mRNA und NcRNA Ausdruck interessiert sind, verwenden viele Male sie separate Proben, um Codierung oder nicht-kodierende RNAs aufgrund der Differenz in Bibliothek Vorbereitungen zu untersuchen. Das führt zu der Notwendigkeit mehr Proben die Zeit, Verbrauchsmaterialien und tierischen Stress erhöhen können. Darüber hinaus kann es kommen Forscher zu entscheiden, zur Vorbereitung von Proben für nur eine Analyse, in der Regel die mRNA, Begrenzung der Zahl der biologischen Fragestellungen, die untersucht werden können. Allerdings umfassen NcRNAs mehrere Klassen mit regulatorischen Rollen diesen Effekt mRNA Ausdruck. Da NcRNA sind wichtig, grundlegende biologische Prozesse und Störung dieser Prozesse in während der Infektion, können sie daher attraktive Ziele für Therapeutika vornehmen. Diese Handschrift zeigt eine geänderte Protokoll für die Generation mRNA und nicht-kodierende RNA Ausdruck Bibliotheken, einschließlich der viralen RNA aus einer einzigen Stichprobe von Vollblut. Optimierung dieses Protokolls RNA Reinheit verbessert, erhöht Ligatur für die Wiederherstellung der methylierten RNAs und ausgelassen Größenauswahl, um Erfassung von mehr RNA-Spezies zu ermöglichen.

Introduction

Sequenzierung der nächsten Generation entstanden (NGS) als ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung der Veränderungen, die auf Genomebene von biologischen Organismen auftreten. Probenvorbereitung für die NGS Methoden variiert werden, je nach Organismus, Gewebetyp, und vor allem die Fragen die Forscher wollen Adresse. Viele Studien haben NGS als Mittel zur Untersuchung der Unterschiede in der Genexpression zwischen Staaten wie gesunde und kranke Personen1,2,3,4geworden. Die Sequenzierung legen Sie auf ein ganzes Genom-Basis und ermöglicht ein Forscher, der meisten zu erfassen, wenn nicht alle, die genomische Informationen für einen bestimmten genetischen Marker zu einem Zeitpunkt zeigen.

Die am häufigsten verwendeten Marker des Ausdrucks beobachtet sind der Messenger-RNAs (mRNAs). Die am häufigsten verwendeten Verfahren zur prepping Bibliotheken für RNA-Seq sind optimiert für die Erholung der mRNA-Moleküle durch den Einsatz einer Reihe von Reinigungen, Fragmentierungen und grundsätzlich5,6. Die Entscheidung darüber, wie ein Protokoll durchgeführt werden stützt sich jedoch auf Probentyp und die Fragen über diese Probe. In den meisten Fällen wird die Gesamt-RNS extrahiert; Doch nicht alle RNA-Moleküle sind von Interesse und in Fällen wie mRNA Ausdruck Studien allzu reichlich RNA-Spezies, wie ribosomale RNA (rRNA) müssen entfernt werden, um die Zahl der nachweisbaren Abschriften der mRNAs zugeordnet. Die beliebtesten und am weitesten verbreitete Methode zur Entfernung der reichlich rRNA Moleküle ist die Reduzierung von Polyadenylated RNA-Transkripte als PolyA Erschöpfung7bezeichnet. Dieser Ansatz funktioniert gut für die Analyse der mRNA Ausdruck, da es die mRNA Transkripte nicht beeinträchtigt wird. In Studien, die in nicht-kodierenden oder viralen RNAs interessiert sind, entfernt jedoch auch PolyA Erschöpfung dieser Moleküle.

Viele Studien wählen, um auf die RNA-Sequenz Bibliothek Vorbereitung mRNA Expression (Codierung) zu untersuchen oder eine bestimmte Klasse von kleinen oder großen nicht-kodierender RNA zu konzentrieren. Zwar gibt es andere Verfahren8 wie der unsrigen, die für die duale Probenvorbereitung ermöglichen, bereiten viele Studien Bibliotheken aus gesonderten Proben für separate Studien wenn verfügbar. Für eine Studie wie der unsrigen erfordert dies normalerweise mehrere Blutproben, die Erhöhung der Zeit, Verbrauchsmaterialien und Tier Stress. Ziel unserer Studie war es, möglicherweise verwenden Vollblut von Tieren zu identifizieren und quantifizieren die verschiedenen Klassen der beiden mRNA und nicht-kodierender RNA ausgedrückt zwischen gesunden und hochpathogenen Porcines reproduktives und respiratorisches Syndrom Virus (HP-PRRSV) Schweine-9,10 trotz des Habens von nur einer einzigen Vollblut-Probe (2,5 mL) von jedem Schwein in Frage gestellt. Um dies zu tun, mussten wir zur Optimierung der typischen Extraktion und Bibliothek erstellen Protokolle, die richtigen Daten für die Analyse von mRNA und nicht-kodierende RNA (NcRNA) Ausdruck11 aus einer einzigen Probe ermöglichen zu generieren.

Dies veranlasste eine Notwendigkeit für ein Protokoll, das für mRNA und nicht-kodierende RNA Analyse zulässig, da die verfügbaren standard-Kits und Methoden für die Erstellung RNA-Extraktion und Bibliothek hauptsächlich für mRNA bestimmt wurden und ein Poly-A Erschöpfung Schritt12 verwenden. Dieser Schritt würde es wieder nicht-kodierender RNA oder viralen Transkripte aus der Probe unmöglich gemacht haben. Daher bedurfte es eine optimierte Methode, die für insgesamt RNA-Extraktion ohne Probe PolyA Erschöpfung zulässig. In diesem Manuskript vorgestellte Methode wurde für den Einsatz von Vollblut als Probentyp ermöglichen und Sequenzierung Bibliotheken für mRNA und NcRNAs von kleinen und großen Größen zu bauen optimiert. Die Methode wurde optimiert, um für die Analyse von allen nachweisbar nicht-kodierende RNAs sowie virale RNA für spätere Untersuchung13zu behalten. Alles in allem ermöglicht unsere optimierte Bibliothek-Vorbereitung-Protokoll für die Untersuchung mehrere RNA-Moleküle aus einer einzigen Blutprobe ganz.

Das übergeordnete Ziel hinter der Verwendung dieser Methode war, ein Verfahren zu entwickeln, die für die Sammlung von nicht-kodierende RNA und mRNA aus einer Stichprobe von Vollblut zulässig. Dies ermöglicht es uns, mRNA, NcRNA und virale RNA für jedes Tier in unserer Studie, die aus einer einzigen Probe9bezogen haben. Dies, letztlich ermöglicht weitere wissenschaftliche Entdeckung ohne Zusatzkosten Tier und gibt ein vollständigeres Bild des Ausdrucks von jeder einzelnen Probe. Das beschriebene Verfahren ermöglicht die Untersuchung der Regulierungsbehörden der gen-Expression als auch für den Abschluss der korrelative Studien zum Vergleich beide mRNA und nicht-kodierende RNA-Ausdruck mit Hilfe einer einzigen Vollblut-Stichprobe. Unserer Studie dieses Protokoll verwendet, um die Änderungen in der Genexpression zu untersuchen und mögliche epigenetische Regulatoren in Viral infiziert 9 – Wochen alten männlichen kommerzielle Schweine.

Protocol

Tier-Protokolle wurden vom National Animal Disease Center (USDA-ARS-NADC) Animal Care and Use Committee genehmigt. 1. Sammlung von Schweine Blut Proben Sammeln Sie Blutproben in RNA Röhrchen. Sammeln Sie ~2.5 mL oder mehr, wenn größere Röhrchen zur Verfügung stehen. 2. Verarbeitung von Schweinen Blut Proben Zentrifugieren Sie die Blut-Röhrchen 5.020 x g für 10 min bei Raumtemperatur (15-25 ° C). Wenn Verarbeitung gefrorene …

Representative Results

Die repräsentativen Proben in unserer Studie sind die Globin und Ribo-abgereicherte Vollblut-Proben. Das repräsentative Ergebnis des Protokolls besteht aus einer Globin abgereichertem Bibliothek Probe mit einer RNA-Integrität-Anzahl (RIN) über 7 (Abbildung 1(ein) und 260/280 nm Konzentrationsverhältnis bei oder über 2 (Abbildung 1b und 1 c). Validierung der Probe Ergebnisse erfolgte mittels…

Discussion

Der erste wichtige Schritt in das Protokoll, das es optimiert gemacht enthalten die zusätzlichen Globin Erschöpfung Schritte, die es möglich gemacht, Qualität liest aus Vollblut-Proben zu erhalten. Eine der größten Einschränkungen zur Verwendung von Vollblut in Sequenzierung Studien sind die hohe Anzahl der Lesevorgänge in der Probe, die Globin Moleküle ordnen und reduziert das liest, die andere Moleküle Interesse18zuordnen könnte. Daher mussten wir bei der Optimierung des Protokolls f?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde vor allem von unterstützt die von der USDA NIFA AFRI 2013-67015-21236 und zum Teil durch USDA NIFA AFRI 2015-67015-23216. Diese Studie wurde zum Teil durch einen Termin, um die landwirtschaftliche Forschung Service Teilnahme Forschungsprogramm verwaltet vom Oak Ridge Institut für Wissenschaft und Bildung (ORISE) durch eine interinstitutionelle Vereinbarung zwischen dem US-Department of Energy (unterstützt DOE) und das US-Landwirtschaftsministerium. ORISE wird von Oak Ridge verbundene Universitäten DOE vertraglich nicht verwaltet. DE-AC05-06OR2310.

Wir möchten Dr. Kay Faaberg für die HP-PRRSV infektiöse Klone, Dr. Susan Brockmeier für ihre Hilfe mit Tieren an dem Experiment beteiligt und Sue Ohlendorf für Sekretariatsaufgaben in der Manuskripterstellung danken.

Materials

PAXgene Tubes PreAnalytix 762165
Molecular Biology Grade Water ThermoFisher 10977-015
mirVana miRNA Isolation Kit ThermoFisher AM1560
Rneasy MinElute Clean Up Kit QIAGEN 74204
100% Ethanol Decon Labs, Inc. 2716
0.2 mL thin-walled tubes ThermoFisher 98010540
1.5 mL RNase/DNase – free tubes Any supplier
Veriti 96-well Thermocycler ThermoFisher 4375786R
Globin Reduction Oligo (α 1) Any supplier Sequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT
Globin Reduction Oligo (α 2) Any supplier Sequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA
Globin Reduction Oligo (β 1) Any supplier Sequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT
Globin Reduction Oligo (β 2) Any supplier Sequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT
10X Oligo Hybridization Buffer
-Tris-HCl, pH 7.6 Fisher Scientific BP1757-100
-KCl Millipore Sigma 60142-100ML-F
10X RNase H Buffer
 -Tris-HCl, pH 7.6 Fisher Scientific BP1757-100
 -DTT ThermoFisher Y00147
 -MgCl2 Promega A351B
 -Molecular Biology Grade Water ThermoFisher 10977-015
RNase H ThermoFisher AM2292
SUPERase-IN ThermoFisher AM2694 Rnase inhibitor
EDTA Millipore Sigma E7889
Microcentrifuge Any supplier
 2100 Electrophoresis BioAnalyzer Instrument Agilent Technologies G2938C
Agilent RNA 6000 Nano Kit Agilent Technologies 5067-1511
Agilent High Sensitivity DNA  Kit Agilent Technologies 5067-4626
TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero  Illumina RS-122-2201 mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A  (48 samples, 12 indexes)
TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide Illumina Available on-line
RNAClean XP Beads BeckmanCoulter A63987
AMPure XP Beads BeckmanCoulter A63880
MicroAmp Optical 8-tube Strip ThermoFisher N8010580 0.2 ml thin-walled tubes
MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap ThermoFisher N801-0535
RNase/DNase – free reagent reservoirs Any supplier
SuperScript II Reverse Transcriptase ThermoFisher 18064-014
MicroAmp Optical 96 well plates ThermoFisher N8010560 These were used in place of .3mL plates as needed
MicroAmp Optical adhesive film ThermoFisher 4311971
NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 1)  New England Biolabs E73005 small RNA kit
NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 2)  New England Biolabs E75805 small RNA kit
QIAQuick PCR Purification Kit QIAGEN 28104
96S Super Magnet Plate ALPAQUA A001322

References

  1. Finotello, F., Di Camillo, B. Measuring differential gene expression with RNA-seq: challenges and strategies for data analysis. Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 130-142 (2015).
  2. Coble, D. J., et al. RNA-seq analysis of broiler liver transcriptome reveals novel responses to high ambient temperature. BMC Genomics. 15, 1084 (2014).
  3. Koltes, J. E., et al. Identification of a putative quantitative trait nucleotide in guanylate binding protein 5 for host response to PRRS virus infection. BMC Genomics. 16, 412 (2015).
  4. Miller, L. C., et al. Comparative analysis of signature genes in PRRSV-infected porcine monocyte-derived cells to different stimuli. PLoS One. 12 (7), 0181256 (2017).
  5. Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. Biotechniques. 56 (2), 61-64 (2014).
  6. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature reviews. Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
  7. Dominic, O. N., Heike, G., Martin, S. Ribosomal RNA Depletion for Efficient Use of RNA-Seq Capacity. Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).
  8. Fleming, D. S., Miller, L. C. Identification of small non-coding RNA classes expressed in swine whole blood during HP-PRRSV infection. Virology. 517, 56-61 (2018).
  9. Fleming, D. S., Miller, L. C. Small non-coding RNA expression status in animals faced with highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV). Proceedings of the World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. (11), (2018).
  10. Bivens Nathan, J., Zhou, M. RNA-Seq Library Construction Methods for Transcriptome Analysis. Current Protocols in Plant Biology. 1 (1), 197-215 (2016).
  11. Cui, P., et al. A comparison between ribo-minus RNA-sequencing and polyA-selected RNA-sequencing. Genomics. 96 (5), 259-265 (2010).
  12. Guo, Y., et al. RNAseq by Total RNA Library Identifies Additional RNAs Compared to Poly(A) RNA Library. BioMed Research International. 2015, 9 (2015).
  13. Choi, I., et al. Increasing gene discovery and coverage using RNA-seq of globin RNA reduced porcine blood samples. BMC Genomics. 15, 954 (2014).
  14. . TruSeq® Stranded Total RNA Sample Preparation Guide. Illumina. , (2018).
  15. . New England Biolabs Inc. Protocol for use with NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina (Index Primers 1-48) (E7560) Available from: https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg (2018)
  16. Shin, H., et al. Variation in RNA-Seq transcriptome profiles of peripheral whole blood from healthy individuals with and without globin depletion. PLoS One. 9 (3), 91041 (2014).
  17. Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 853916 (2010).
  18. Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. Beyond microRNA–novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer. Cancer Letters. 340 (2), 201-211 (2013).

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Cite This Article
Fleming, D. S., Anderson, S. J., Miller, L. C. Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood. J. Vis. Exp. (141), e58689, doi:10.3791/58689 (2018).

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