Summary
このプロトコルでは、高深度単一細胞 RNA 配列のため mRNA 転写に基づく増幅体外に続いて単一の蛍光に分類されたニューロンを分離するプロシージャを並べ替えマニュアルについて説明します。
Abstract
単一細胞 RNA シーケンス (seq RNA) 遺伝子発現を試金するため広く実装されているツールは、現在。市販の単一細胞 RNA シーケンス プラットフォームは無差別にすべての入力セルを処理します。時々、関心の特にラベル付きの人口を隔離する蛍光活性化セル (FACS) を並べ替え、上流に使用されます。FACS の制限は、収集およびマウス脳から希少またはまばらにラベル付けされた神経細胞集団をプロファイリングする非現実的です大幅ラベル付きの分数の入力セルの高数値の必要性です。ここでは、マウスの脳組織を分離した手動で収集スパースにたてから単一ニューロンを蛍光標識の手法について述べる。このプロセスにより、高純度と内生コピー比率を保持するの in vitro転写に基づく増幅プロトコルで統合単一標識細胞を取り込むため。ユニークな分子識別子 (Umi) を使用して個々 の mRNA の数を生成する二重線形増幅法について述べる。単一細胞あたりの遺伝子検出の高度の増幅結果の 2 つのラウンド。
Introduction
単一細胞 RNA シーケンス (seq RNA) は、トランスクリプトーム研究を変えてきました。ほとんどのメソッドは、定義済みのセルの種類を並べ替えることはできませんさまざまな液滴1、2マイクロ3nanogrids4マイクロウェル5などの技術を使用して大規模な単一セル RNAseq を実行できます。遺伝的コード化の同時を発現します。選択セル人口を隔離するには、蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えは単一セル モードでラベル付きセルを並べ替えるによく使用されます。ただし、FACS はいくつかの制限をあり、細心のサンプル処理手順が必要です。まず、入力セルの数が多いは通常、かなりの割合で (しばしば数百万セル mL あたり) を必要な (> 15-20%) ラベル付きの人口を含みます。第二に、細胞はグリア細胞分画、破片、およびノズルやフロー セルを詰まらせる可能性がありますそれ以外の場合細胞塊を削除する密度勾配遠心法手順を複数回を必要があります。第三に、FACS は通常染色と染め色ライブ/デッド (4 ′など6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)、ヨウ化 propidium (PI)、Cytotracker 染料) を染色、追加の時間をとるための手順を採用します。第四に、2 色 (DAPI、赤/緑の蛍光蛋白質 (GFP/RFP) など)、並べ替えの通常 2 つのサンプルの 1 つの親指のルールは、必要に応じて必要なマウスの緊張だけでなく処理されるラベルのないサンプルを必要とします。第五に、フィルタ リングが実行されるは、複数回する前に、サンプルは、FACS マシンで詰まったサンプル線を予防するために並べ替え中に頻繁です。第六に、初期化し流体流を安定させるし、液滴の調整を実行する最も一般的に使用される FACS 設定で時間を割り当てる必要があります。サンプルは通常、実際のサンプル コレクション、早めに 6 と 7 の彼らの自身の手順を実行いずれかゲートなどのユーザーの設定や必要補償行列、ダブレット除去をセットアップする前にシーケンスで実行、コントロール、並列で技術者の支援します。最後に、ポスト FACS、しばしば単一ラベルだけ細胞が各井戸に存在することを確認する手順がありますたとえばで高速プレート撮像素子など高コンテンツ スクリーニング セットアップのサンプルをチェックします。
上記の手順を回避して比較的短時間で容易に単一の蛍光に分類されたニューロンの小さい人口のシーケンスを対象に述べる選別高感度体外の 2 ラウンドに続いて手順マニュアル絶対数のシーケンス (Seq 歌姫) とダブルの生体外のトランスクリプションと呼ばれる増幅プロトコル。RNA 増幅と cDNA ライブラリを生成、Eberwineらから適応6 Hashimshonyら7、携帯電話より小さいボリュームを持つマウスの介在ニューロンに合わせて特定の変更さらに、興奮性錐体細胞に均等に有用であるまた発見しました。
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Protocol
動物科目を含むすべてのプロシージャは、冷たいばね港研究所ニューヨーク (IACUC #16-13-09-8) で IACUC によって承認されています。
1. 手動による並べ替えの蛍光に分類されたマウス神経細胞
- キャピラリーの引き手を使用して次の設定で 10-15 μ m 出口径ガラス microcapillaries (材料の表を参照) を引く: 熱: 508、プル: 空白、ヴェル: 空白時間: 空白。
- 120-150 cm 柔軟なシリコーン チューブ (内部の直径 ~0.8 mm) を 0.2 μ m ポリフッ化ビニリデン (PVDF) 二フッ化膜シリンジ フィルターと適切なチューブ コネクタを使用して双方向のチューブ バルブに接続します。
- 冷蔵 (4 ° C) 人工髄液 (アプライド、表 1)、500 mL を準備し、15 分間またはソリューションを完全にクリアするまで、airstone をバブルのバランス 5% 二酸化炭素酸素による酸素を送り込みます。
- 150 mL ビーカー (表 1) に活動ブロッカーのカクテルとアプライドの 100 mL を準備します。
- 1 mg/mL 150 mL ビーカー (表 1) の連鎖球菌分数 IV プロテアーゼとアプライドの 100 mL を準備します。
- 1% ウシ胎児血清 (FBS) 溶液 150 mL ビーカーとアプライドの 100 mL を準備し、airstone を通じてバランス 5% 二酸化炭素酸素と酸素を送り込みます。
- 小さなハサミで頭蓋を開き、新鮮な脳皮質を損傷することがなく微細鉗子を使用して抽出 euthanized マウスの脳を解剖します。
注: 任意のひずみ、年齢、および性別のマウスを使用するに応じて。脳をフリーズしたり、投与ウイルスまたは他の有害/感染エージェントに手動並べ替えを実行しないでください。 - 脳を断面の全期間中に 5% の二酸化炭素収支酸素に接続、airstone を残して、チルドと酸素のアプライドにおいて。
- Vibratome チャックの脳を置き、300 μ m の厚みでコロナや矢状のセクションをカットします。~ 10-50 の最小値を取得するために必要なセクションを収集いくつかの百のセルまでのセルのラベルします。彼らは酸素のアプライドでぬれているので、ビーカー内に配置、綿メッシュ スライス ホルダーにスライスを置きます。
- アプライド活動ブロッカーと室温で 15-20 分のブロックが含まれているビーカーに新鮮なスライスを移動します。バブル酸素 airstone を使用をしてください。
- 室温で軽度の消化を実行するプロテアーゼ溶液でアプライドを含むビーカーにスライスを移動: P4 14 動物のため 20-30 分または P28 56 動物のための 45-60 分まで。バブル酸素を保ちます。
- スライスを室温で 5-10 分の活動ブロッカー ソリューションでアプライドを含むビーカーに戻って移動し、プロテアーゼとウォッシュ アウト アプライド。バブル酸素を保ちます。
- 1% とアプライドを含む 100 mm のペトリ皿に個々 のセクションを移動部屋の温度で FBS。蛍光郭清範囲、microdissect エリア、興味の層の下で (数百) まで 10-50 セルの最小値を有する。微細鉗子または木製ホルダー (串) に 22-28 G 注射針を接続することによってペアでレーザーマイクロダイ セクションを実行します。
- ~0.8 mL の 1% を含む 2 mL および microfuge の管に microdissected 駒を動かすパスツール ピペットを使用して FB アプライド ソリューションの。
- 室温および microfuge の管で切り裂かれたティッシュをカップ刻んだ。直火それらの転がりによって出口径の低下とともに 3 つの茎が長いパスツール ピペットを作る。各ピペットで 〜 10 ストロークを実行最大と最小の終了を開始します。
- 酸素アプライドを含む 100 mm のペトリ皿に解離細胞を分注 (シャーレが薄く塗ら 5 mm 1% 寒天培地または明確なシリコーン系化合物で、1:10 の比率、必要な場合)。室温で維持します。
- 徐々 に解決し、解剖顕微鏡の下で GFP/RFP の信号を観察するセルの待機 5 ~ 7 分。
注: 単一のセル、破片、および小さな塊明視野 (BF) に表示になります。 - 柔軟なシリコーン チューブに接続されている (ステップ 1.1) からキャピラリー ピペットを使用時に 10-15 GFP/RFP セルを選択 (0.4-0.8 mm 内径) し、新鮮な酸素を含んだアプライドを含む 100 mm のペトリ皿にセルを分配します。
- 舌をチューブ弁の端をブロックすることによって目的のセルに近い毛細血管を配置します。ブロックを取り除く時に毛細管を使用してセルをキャプチャし、迅速に余分な水分がピペットに入るを防ぐために再度ブロックします。蛍光光学解剖顕微鏡の下で先端部にキャピラリーを観察しながら、やさしく吹いてで 100 mm ペトリ皿と新鮮な酸素アプライドにセルを吐出します。〜 100-150 を収集することを目的セルを合計します。
- 手順 1.19 回 (破片) に応じて転送 〜 50-75 の合計細胞と新しい 100 mm のペトリ皿にがれきなどの汚染物質が明視野微分干渉の対照 (DIC) の光学系で最小を確かめます。
- 最後に、たびに新鮮なマイクロキャピ ラリー ピペットを使用して、0.5 μ l 以上の 1 つのセルを選択、0.2 mL の 1 つおよび microfuge の管にそれ (または 8 0.2 mL microfuge の管の 1 つのストリップ) プライマーのサンプル収集バッファーの 1 μ L を含む追放N10B1-N10B96 (表 2)。セルがコレクション バッファーのようにおよび microfuge の管にピペット チップを破る。ピペットを破棄します。
- セルをフリーズしドライアイスにチューブを入れて、それらを格納することによって長期-80 ° C のフリーザーでの RNA 増幅処理する準備ができるまで。
2. 最初のラウンドの RNA 増幅
注: 次の手順は、8 つの 0.2 mL microfuge の管の 1 つのストリップです。必要に応じて、反応をスケールします。
- 最初鎖 cDNA を合成 (1 回戦)。
- 熱は 5 分 5 分の 4 ° C に続いての 70 ° C でステップ 1.22 からストリップします。2 回繰り返します。
- 氷逆転写酵素 (RT) マスター ミックス/最初繊維の合成マスター ミックス (材料表参照) 次の食材を使った組み立て: 最初繊維のバッファー (2 μ L)、dNTP ミックス (4 μ L)、RNase 阻害剤 (1 μ L)、酵素 (1 μ L) × 10。
- 簡単に遠心分離機の下部にすべてを収集する卓上遠心分離機の帯。氷の上を保ちます。
- 上記のチューブに RT マスター ミックス/最初繊維の合成マスター ミックスの 1 μ L を追加 (合計セルのコレクションからサンプル バッファーの 1 μ L + RT の 1 μ L のボリューム 2 μ L/チューブを =)。ピペッティングでよく混ぜます。簡単に下部に全体のコンテンツを収集し、氷の上にそれを維持するスピンします。
- 上記管/s 空気オーブンで 2 h の 42 ° C で孵化させなさい。すぐに反応を終了、第 2 鎖合成手順に進みます氷にチューブを入れてください。
- 第 2 繊維の cDNA を合成 (1 回戦)。
- 1.5 mL チューブに以下の順番で氷の上 2 番目のストランド マスター ミックス (80 μ L) を作る: ヌクレアーゼ フリー水 (63 μ L)、2 番目のストランドのバッファー (10 μ L)、dNTP ミックス (4 μ L)、DNA ポリメラーゼ (2 μ L)、RNaseH x 10 (1 μ L)。ボルテックス、下部に収集し、氷の上を保つのためにスピンでよく混ぜます。
- 中古装置を冷却、2.2.3 のステップを開始する準備ができて次プログラムを実行、サーマルサイクラーを開始 (熱を蓋 = オフ; 2 h、4 ° C ホールドの 16 ° C)、および 16 ° C で一時停止
- 80 μ L/ストリップ (10 μ L/チューブ) ストリップし各管に 2 番目のストランドのマスター ミックスの氷の上を追加します。熱 cycler にストリップを転送し、上開始 16 ° C の手順を再開します。16 ° C で 2 h のためのストリップを孵化させなさい
- 第 2 鎖合成ステップの後次の cDNA の浄化のステップに進むための氷にチューブを配置します。
- 二重鎖 cDNA を浄化 (1 回戦)。
注: すべての遠心室温 〜 8,000 × g で行われます。フィルター カートリッジへの損傷を避けるために 16,000 x g を超えることはありません。- ヌクレアーゼ フリー水 50-55 ° C 乾燥暖房のブロックの後で使用のための 100 μ L を加熱を開始します。CDNA の部分の変性を防ぐために 58 ° C を超えることはありません。
- 1.5 mL チューブに cDNA 結合バッファーの 250 μ L を追加します。バッファー中の析出物をチェックし、再析出物を溶解する 10 分の 37 ° C に緩衝液を温めます。
- 単一 8 チューブ ストリップから Cdna を cDNA 結合バッファーに転送します。さらに下流 (1 管の 8 セル) でのこの手順のセルを結合します。徹底的に 2-3 回のピペッティングしてフリック ミックス 3-4 回。下部にコンテンツを収集するスピン。
- 洗浄管への cDNA のフィルター カートリッジをの in vitro転写 (IVT) キット () からしっかりと置きます。フィルターのセンターに上記ミックスを追加します。〜 1 分またはフィルターを通してそれまで 8,000 の x g で遠心分離機します。流れを破棄し、洗浄チューブを交換します。
- 列に IVT キットから 500 μ L の洗浄バッファーを追加します。
注: そのエタノール洗浄バッファーに既に追加されていることを確認します。 - 〜 1 分またはフィルターを通してそれまで 8,000 の x g で遠心分離機します。フローを通じて、再びカートリッジを空にする ~ 1 分 8,000 × g で遠心分離機を破棄します。
- CDNA フィルターを cDNA 溶出チューブ (1.5 mL ヌクレアーゼ フリー チューブ) に転送します。フィルターのセンターに予め温めておいたヌクレアーゼ フリー水の 8.5 μ L を適用します。2 分待って、~1.5 分 8,000 × g で遠心分離します。
- 予め温めておいたヌクレアーゼ フリー水の 8.5 μ L で再び溶出し、すぐに最初のラウンドの IVT に進みます。
注: 二本鎖 cDNA 回復量は ~ 16 μ L になります。
- CDNA からの増幅された RNA (aRNA) 生産のための in vitro転写 (IVT) 反応を実行 (1 回戦)。
- 交配空気オーブンを 37 ° C に設定します。
- 次の順序で氷上 IVT のためマスター ミックスを調製: ステップ 2.3.8 から溶出した二本鎖 cDNA の 16 μ T7 ATP ソリューション (75 mM) の 4 μ L を追加T7 CTP ソリューション (75 mM) の 4 μ LT7 GTP ソリューション (75 mM) の 4 μ LT7 UTP ソリューション (75 mM) の 4 μ LT7 10 倍反応バッファーの 4 μ LT7 酵素ミックスの 4 μ L。よく混ぜて、スピン、および氷の上を保持します。
- CDNA の 16 μ L を含む各チューブに IVT マスター ミックスの 24 μ L を追加します。慎重かつ徹底的にピペッティングして内容をミックスします。14 h の 37 ° C でチューブを孵化させなさい。
注: インキュベーション < 12 h 収量に大きく影響します。 - 非ジエチルエステル (非 DEPC) 60 μ 処理 100 μ L にボリュームを高め、IVT 反応を停止する RNase フリーの水を追加します。
- ARNA を浄化します。
注: すべての遠心室温 〜 8,000 × g で行われます。フィルター カートリッジへの損傷を避けるために 16,000 x g を超えることはありません。- ヌクレアーゼ フリー水 50-55 ° C 乾燥暖房のブロックまたは PCR 機械の後で使用のための ~ 200 μ L を加熱を開始します。ARNA の部分の変性を防ぐために 58 ° C を超えることはありません。
- ARNA を 1.5 mL ヌクレアーゼ フリー チューブに転送します。ARNA 結合バッファーの 350 μ L を各 aRNA サンプルに追加します。各チューブ、ピペッティング (do いないミックスしてスピン渦) で 3 回ミックス 100% エタノールの 250 μ L を追加します。
- フィルター カートリッジの中心にそっとそれを追加することによって、RNA 精製列にすぐにミックスを転送します。8,000 の x g 〜 1 分またはミックスがフィルターを通して完全に通過するまでの遠心分離機します。流れを破棄し、廃棄物収集の管を再利用
注: RNA はエタノールの添加によって沈降が開始されます。 - 洗浄バッファーの 650 μ L を各フィルター カートリッジに追加します。8,000 g x またはバッファー全体が経過するまでに 〜 1 分間遠心します。フロー ・ スルーを破棄し、洗浄バッファーのトレースを削除する追加 〜 1 分のフィルターをスピンします。
- 新鮮な aRNA コレクション管にフィルターを転送します。フィルターのセンターに事前に加熱された (50-55 ° C) ヌクレアーゼ フリー水の 100 μ L を追加します。~1.5 8,000 g x またはコレクションの管に経過分の遠心分離機まで、2 分間待ちます。
3. 第二ラウンド増幅
- 最初繊維の cDNA を合成 (2 回目)。
- 転送 aRNA ステップ 2.5.5 200 μ L および microfuge の管と真空集中 100 μ L に 10 μ L 熱、減少量を推定する 200 μ L 管の水の 10 μ L で 65 分比較用真空濃縮器を実行を使用していない elutant。
- 42 ° c. に交配空気オーブンします。
- ARNA、簡潔に、渦に IVT キットからランダム hexamer プライマーの 2 μ L を追加し、コンテンツを収集するスピンします。
- 熱 cycler で 10 分間の 70 の ° c および microfuge の管をインキュベートし、氷の上に置きます。
- 次の RT マスター ミックスを調製: 最初の鎖合成バッファー、dNTP ミックスの 4 μ L、RNase 阻害剤の 1 μ L、1 μ L ArrayScript 酵素の x 10 の 2 μ L。軽くボルテックスで 200 μ L および microfuge チューブでもミックスし内容を収集し、氷の上に配置するスピンします。
- 8 を追加 RT マスターの μ L 各および microfuge の管に (最初の鎖) をミックスします。2 h の 42 ° C の空気のインキュベーターにチューブを置きます。
- 上記の反応に RNaseH の 1 μ L を追加します。2-3 回のピペッティングし、フリックで混ぜる 3-4 回と内容を収集するスピン。PCR マシン上で 30 分の 37 ° C で孵化させなさい。インキュベーション後、すぐに第 2 鎖合成の手順に進みます。
- 第 2 繊維の cDNA を合成 (2 回目)。
- (25 ng/μ L 作業希釈、表 2) で RA5 T7 プライマーの 3 μ L を追加し、各 cDNA サンプルに RNase フリー水 2 μ L。よく混合し、コンテンツを収集してスピンします。
- 70 ° C の熱 cycler で 10 分間インキュベートします。氷の上の反応を配置します。
- 準備 RT マスター氷の上 (第 2 繊維) をミックス: ヌクレアーゼ フリー水 58 μ、2 番目のストランド バッファー x 10 の 10 μ L、dNTP ミックスの 4 μ L、DNA ポリメラーゼの 2 μ L。内容を集めるためにスピンしてボルテックスでよく混ぜます。氷の上を保ちます。
- 3.2.2 のステップから各チューブに上記ミックス 74 μ L を追加します。2-3 回のピペッティングで混ぜると 3-4 回、フリック内容を収集するために、スピンします。氷の上を維持し、保持します。
- あらかじめ蓋熱をオフに 16 ° c サーマルサイクラーを冷たい。16 ° C で 2 時間サーマルサイクラーにチューブを配置します。
- 第 2 鎖合成ステップの後 cDNA の精製ステップに進むか、-20 ° C の凍結する氷のチューブを場所します。
注: 凍結する前には、cDNA 浄化の使用をお勧めします。
- CDNA 浄化を実行 (2 回目)。
注: すべての遠心室温 〜 8,000 × g で行われます。フィルター カートリッジへの損傷を避けるために 16,000 x g を超えることはありません。- 50-55 ° c 乾燥暖房のブロックの後で使用のためのヌクレアーゼ フリー水を加熱を開始します。CDNA の部分の変性を防ぐために 58 ° C を超えることはありません。
- 1.5 mL ヌクレアーゼ フリー チューブに cDNA を転送します。各チューブに cDNA 結合バッファーの 250 μ L を追加します。バッファー中の析出物のチェックし、再溶解する 10 分の 37 ° C に緩衝液を温めます。徹底的に 2-3 回のピペッティングしてフリック ミックス 3-4 回。内容を収集するスピン。
- しっかりと洗浄管の cDNA のフィルター カートリッジを置きます。フィルターのセンターに上記ミックスを追加します。〜 1 分またはフィルターを通してそれまで 8,000 の x g で遠心分離機します。流れを破棄し、洗浄チューブを交換します。
- 500 μ L の洗浄バッファーを追加します。エタノール洗浄バッファーに既に追加されていることを確認します。〜 1 分またはフィルターを通してそれまで 8,000 の x g で遠心分離機します。
- 流れを破棄し、再びカートリッジを空にする ~ 1 分 8,000 × g で遠心分離機します。CDNA 溶出チューブに cDNA フィルターを転送します。
- フィルターのセンターに予め温めておいたヌクレアーゼ フリー水の 8.5 μ L を適用します。2 分待ってから、予め温めておいたヌクレアーゼ フリー水の追加 8.5 μ L で再び ~1.5 分想定し, 浸出液 8,000 × g で遠心分離機します。
注: 二本鎖 cDNA 回復量は ~ 16 μ L になります。 - 2 番目のラウンドの IVT または-20 ° C で cDNA を一晩凍結に進んでください。
- IVT aRNA 生産の第 2 ラウンドを実行します。
- 空気の交配のオーブンを 37 ° C (36 ° C setpoint) に設定します。
- 次の順序で氷上 IVT のためマスター ミックスを調製: ステップ 3.3.7 から溶出した二本鎖 cDNA の 16 μ T7 ATP ソリューション (75 mM) の 4 μ L を追加T7 CTP ソリューション (75 mM) の 4 μ LT7 GTP ソリューション (75 mM) の 4 μ LT7 UTP ソリューション (75 mM) の 4 μ LT7 10 倍反応バッファーの 4 μ LT7 酵素ミックスの 4 μ L。よく混ぜ、簡潔に内容を収集するためにスピン、氷の上を保持します。
- CDNA の 16 μ L を含む各チューブに IVT マスター ミックスの 24 μ L を追加します。慎重かつ徹底的にピペッティングして内容をミックスします。14 h の 37 ° C でチューブを孵化させなさい。
メモ: < 12 h の孵化は深刻な収量に影響します。 - 60 μ L の DEPC 非処理 100 μ L にボリュームを高め、IVT 反応を停止する RNase フリーの水を追加します。
- ARNA 浄化を実行 (2 回目)。
注: すべての遠心室温 〜 8,000 × g で行われます。フィルター カートリッジへの損傷を避けるために 16,000 x g を超えることはありません。- ヌクレアーゼ フリー水 50-55 ° C 乾燥暖房のブロックまたは PCR 機械の後で使用のための ~ 200 μ L を加熱を開始します。ARNA の部分の変性を防ぐために 58 ° C を超えることはありません。
- 1.5 mL ヌクレアーゼ フリー チューブに、aRNA を転送します。ARNA 結合バッファーの 350 μ L を各 aRNA サンプルに追加します。各チューブし、ピペッティング (do いないミックスしてスピン渦) で 3 回をミックスする ACS グレード 100% エタノールの 250 μ L を追加します。
注: RNA はエタノールの添加によって沈降が開始されます。 - フィルター カートリッジの中心にそっとそれを追加することによって、RNA 精製列にすぐにミックスを転送します。8,000 の x g 〜 1 分またはミックスがフィルターを通して完全に通過するまでの遠心分離機します。流れを破棄し、廃棄物収集の管を再利用します。
- 洗浄バッファーの 650 μ L を各フィルター カートリッジに追加します。8,000 g x またはバッファー全体が経過するまでに 〜 1 分間遠心します。フロー ・ スルーを破棄し、洗浄バッファーのトレースを削除する追加 〜 1 分のフィルターをスピンします。
- 新鮮な aRNA コレクション管にフィルターを転送します。フィルターのセンターにあらかじめ温めておいたヌクレアーゼ フリー水の 100 μ L を追加します。2 分待つし、8,000 g x またはそれが経過するまでに ~1.5 分間遠心します。
- (260 nm) の分光光度計とバイオアナライザーの管で 2 μ L 分注は広がる aRNA 収量と品質をチェックするための分析です。
注: 集中する必要があります少なくとも 5 ng/μ L。それ以外の場合、このサンプルを拒否します。サンプルは-80 ° C の ~ 1 年に保存できます。サンプルの凍結融解は避けてください。 - ARNA 製品製造元のプロトコル (図 2) を次の適切な広がりを視覚化する、バイオアナライザーを用いたサンプルを確認してください。
4. 増幅した RNA の断片化とクリーンアップ
- 氷 (容量 40 μ L、aRNA 非重複サンプル バーコードの組み合わせ 2 管) には、次のミックス: 36 μ aRNA (200 ng の合計) と RNA 断片化バッファーの 4 μ L。90 94 ° C で混合物を孵化させなさい s。
- 氷 RNA 断片化停止バッファーの 4 μ l 添加し混合物をすぐに移動します。ヌクレアーゼ フリー水の 56 μ L を追加することにより 100 μ L にボリュームを調整します。
- 追加 350 μ L の RNA の浄化から RLT バッファー キット (材料の表を参照してください)、ピペッティングでよく混ぜます。江藤の 250 μ L を加えて、ピペッティングでよく混ぜる RNA 精製スピン列にサンプルを転送します。15 スピン 8,000 の x g で s。
- 新しいコレクションの管に列を転送し、RPE バッファーを 500 μ l 添加します。15 スピン 8,000 の x g に s を流れを破棄します。8,000 の x g で 80% エタノールと 2 分間スピンの 500 μ L を追加します。
- 列を新しいコレクション チューブ、列、および全速力で 5 分間スピンのオープン蓋に転送します。
- 新しいコレクションの管に列を転送し、ヌクレアーゼ フリー水、1 分のフルスピードで回転の 16 μ L で溶出します。
5. ライブラリの準備
注: IVTs をプールできるこの時点でバーコード使用でオーバー ラップがない場合。ホスファターゼの治療時間は 40 分ポリ ヌクレオチド キナーゼ治療時間 1 h です。
- 0.7 mL PCR チューブに断片化された aRNA の 16 μ L は、次のミックスの 4 μ L を追加: ホスファターゼ バッファー、南極ホスファターゼの 1 μ L および組換えリボヌクレアーゼ阻害剤 (例えばRNaseOUT) の 1 μ L x 10 の 2 μ L。次のプロトコルのサーマルサイクラーで孵化させなさい: 65 ° C 4 ° C で 5 分押しで、30 分の 37 ° C
- ステップ 5.1 から 0.7 mL PCR チューブ、次のミックスの 30 μ L を追加: ヌクレアーゼ フリー水の 17 μ L、ホスファターゼ バッファー、ATP (10 mM) の 5 μ、1 μ L 組換えリボヌクレアーゼ阻害剤の x 10 の 5 μ L、PNK の 2 μ L。60 分の 37 ° C で熱 cycler で孵化後、4 ° C で押し続ける
- ホスファターゼと PNK 扱わ aRNA の列をクリーンアップします。
- ヌクレアーゼ フリー水の 50 μ L を追加することにより 100 μ L にボリュームを調整します。バッファー RLT の 350 μ L を加え、よく混ぜます。江藤の 250 μ L を加えて、ピペッティングでよく混ぜる RNA 精製スピン列にサンプルを転送します。
- 15 スピン s 8,000 の x g に新しいコレクション チューブに列を転送し、RPE バッファーを 500 μ l 添加します。
- 15 スピン s 8,000 の x g にフロー ・ スルーを破棄し、80% を 500 μ l 添加エタノール。
- 8,000 の x g 新しいコレクション チューブへの転送列に 2 分のためのスピンは、列、および全速力で 5 分間スピンのカバーを開きます。
- 新しいコレクションの管に列を転送し、ヌクレアーゼ フリー水、素材の ~ 10 μ L のボリュームを回復する 1 分のフルスピードで回転の 14 μ L で溶出します。列を破棄します。真空濃縮を使用して 〜 10 分の 5 μ L にボリュームを減らします。
- 縛る 3' コマーシャルを使用してアダプター キット (材料の表を参照してください)。
- 3' (RA3) からアダプター TrueSeq キット 3 ひだヌクレアーゼ フリー水を希釈し、-20 ° C で因数を格納
- ホスファターゼと PNK 扱われる RNA の 5 μ L、1 μ L の希釈 3' アダプターを追加します。70 ° C、2 分間インキュベートし、すぐに二次構造形成を防ぐために氷の上管を配置します。
- 次のミックスの 4 μ L を追加: HM 結紮バッファー (HML)、RNase 阻害剤の 1 μ L と 1 μ L の RNA T4 リガーゼ (切り捨て) 2 x 5 の 2 μ L。28 ° C (非加熱または蓋を開けて) 1 h であらかじめ温めておいたサーマルサイクラーにチューブを孵化させなさい。
- 熱 cycler で残りの反応管と停止液 (STP) を 1 μ l 添加し優しくピペット ボリューム全体を上下 6-8 回を徹底的にミックスします。28 ° C、15 分でサーマルサイクラーの反応管をインキュベートし、氷の上にチューブを配置し続けます。
- 12 μ L。 使用 6 μ L の容量を取得し、-80 ° C で残り 6 μ L を格納するヌクレアーゼ フリー水の 3 μ L を追加します。
- 逆転写反応を実行します。
- PCR チューブに次を組み合わせる: アダプター結紮の RNA のプライマー RNA RT (RTP) の 1 μ L 6 μ L。70 ° C、2 分間でチューブをインキュベートし、すぐにチューブを氷の場所します。
- 次のミックスの 5.5 μ L を追加: 最初の鎖バッファー、12.5 mM dNTP ミックス 0.5 μ、1 μ L 100 mM DTT、RNase 阻害剤の 1 μ L と逆転写酵素の 1 μ L の x 5 の 2 μ L。1 h は 50 ° C に予熱のサーマルサイクラーでチューブを孵化させなさい (サンプルは-20 ° C で保存することができます) 氷の上管を配置します。
- 5', 3' プライマー結紮製品を豊かに 11-15 サイクルの PCR 増幅を実行します。
- 各逆転写反応に次のミックスの 35.5 μ L を追加: 超純水の 8.5 μ、25 μ L の PCR ミックス (PML)、2 μ L の RNA PCR プライマー (RP1)。各反応に固有インデックス化された RNA PCR プライマーの 2 μ L を追加 (RPIX, X = 24 1)。
- サーマルサイクラー PCR サイクル以下を使用して管内を増幅: 98 ° C、30 秒。12-15 サイクル 98 ° C の 10 s。60 ° C 30 s;72 ° C、30 秒。72 ° C 10 分;4 ° C で押し
6. PCR 製品クリーンアップとサイズの選択
- Prewarm AmpureXP 室温での磁気ビーズ。渦まではよ分散し、ビーズは、50 μ L の PCR 反応 (1:1 PCR 製品: ビーズ) に 50 μ L を追加。ミックス徹底的に 10 倍を内容をミックスします。
- 液体がはっきり表示されるまで少なくとも 5 分、マグネット スタンドに 15 分位室温で孵化させなさい。削除し、上澄みの 95 μ L を破棄します。
- 作りたての 80% を 200 μ l 添加エタノール。ビーズを妨げないで少なくとも 30 s、し削除破棄上清をインキュベートします。これをもう一度繰り返します。
- 15 分または完全に乾燥するまでビーズを風乾します。再懸濁バッファーの 32.5 μ L で再懸濁します。ミックス徹底的に 10 回上下全体のボリュームをピペットします。
- 液体がはっきり表示されるまで 5 分、マグネット スタンドに 2 分位室温で孵化させなさい。30 μ L の培養上清を新しいチューブに転送します。50 μ L の総ボリュームを取得するヌクレアーゼ フリー水の 20 μ L を追加します。
- 固相リバーシブル固定 (スプリング) 磁気ビーズの PCR の製品のサイズの選択を実行します。
- SPRI ビーズのピペッティングにより徹底的にステップ 6.5 とミックスで作製したチューブに 0.7 x ボリューム (35 μ L) を追加します。室温で 5 分間インキュベートします。
- マグネット スタンドにチューブを置き、5 分、または別のビーズまで待機します。ビーズを乱すことがなく上澄みを慎重に削除します。
- 作りたての 85% を 200 μ l 添加エタノール。30 s、それから、エタノールを待ちます。10 分のビーズを風乾します。
- ヌクレアーゼ フリー水の 20 μ L を追加します。磁石チューブをバックに、5 分待つし、液体部分をピペットの妨害やビーズに触れることがなく。-20 ° C で DNA を保存します。
7. ライブラリの量と質の定量
- 波長 260 nm で分光光度計による DNA の濃度をチェック (濃度は、少なくとも ~ 5-10 ng/μ L)。
- サイズ分布を調べる高感度 DNA チップを用いたバイオアナライザーに各サンプルの 1 μ L を実行 (ピーク時は 300-400 bp に期待される (図 3を参照))。
8. サンプルの提出
- 非重複配列 PCR バーコード (1:1 の比率) を結合します。たとえば、等しいナノグラムの量で一緒に RPI 4 RPI 3 と RPI 2 RPI 1 サンプルの PCR の製品を組み合わせる、RNA に従ってシーケンス コアの総入力サンプル量要件に関する推奨事項。
- 結合後、濃度 5 ng/μ L と少なくとも 10 μ L のボリュームまたはシーケンス設備コアによって推奨されているように調整します。
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Representative Results
上記プロトコルを使用して、gaba 作動性ニューロンが手動で並べ替えられます (図 1)、RNA 増幅し、cDNA ライブラリ (図 2) に、高深さ8シーケンスします。増幅された RNA (aRNA) 製品のレンジに 500 を少し超えるピーク分布のサイズで 200-4,000 bp 間 bp (図 3 a)。ビーズ精製 cDNA ライブラリはさらに小さい 200 より小さい断片を除去ビーズを用いた浄化の第 2 ラウンドでサイズ制限 (図 3 b 3 C) bp ~ 350 でピークと bp。一方より長いフラグメントより多くのスペース フロー セル合計出力の読み取りを削減 (mRNA 挿入なし、唯一のアダプターおよびプライマー シーケンス)、空の読み取りにつながる短い断片を持っています。シーケンス、時に日常的に 105中央値、または 6.9 × 105平均マップの読み取り (図 4 a) セルあたり x 4.8 を取得しました。Umi を用いた RNA の重複除去後、は、各単一セルは、(図 4 b) 細胞 1 個あたり 105中央値、または 1.4 x 10 の5の平均ユニークな読み取り x 1.0 を持っていた。各セルの外部 RNA コントロール コンソーシアム (ERCC)、スパイクの RNA サンプルに追加される分子の絶対数の計算の対象とする内部統制として使用されました。入力の線形関係があった観測数 0.92 と調整済み R2勾配 = 0.94 (図 4)。平均 (12,000 の遺伝子/細胞 〜 7,500 に至るまで) 単一ニューロンあたり 10,000 〜 遺伝子を検出した、> 95% 単一の細胞検出 > 6,000 遺伝子 (図 4-4 階)。この同じようなマウス脳由来単一ニューロン (例えば、 1,865 4,760 遺伝子 Zeiselらからパブリッシュされたデータに対して好意的比較9、Tasicら7,250 遺伝子10、および Okatyらの 8,000 の遺伝子11). poulin さんら読者宛て12の詳細な比較のため。
図 1:手動による並べ替えの歌姫シーケンスによってニューロンのワークフロー新鮮なマウス脳を収集され、スライスと関心領域は microdissected。蛍光蛋白質を表現するニューロンは手動で収集された、線形増幅器の 2 つのラウンドを使用して生体外のトランスクリプションによって増幅されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 歌姫 Seq のユニークな分子識別子 (Umi) または品種タグを取り入れながら増幅の 2 つのラウンドでのワークフロー図。サンプル コード (SBC) では、その 9 塩基配列コード (ティール) によって識別されるそれぞれの単一のセルをことができます。海は、使用されるプライマーはそれぞれに異なる長さのランダムなヌクレオチド 10 bp のストレッチです。したがって増幅重複を排除し、絶対成績証明書カウントを可能にするバイオインフォマティクスのステップの間に同じ海シーケンスを持つ 2 つのマップされたトラン スクリプト 1 回だけカウントされます。RA5 と RA3 が配列のプライマー、RA5 T7 プライマーは生体外のトランスクリプションによって T7 RNA ポリメラーゼが再バインドして線形増幅の第 2 ラウンドを実行できるように、第 1 ラウンド aRNA 製品紹介へ T7 シーケンスを追加する必要です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 例バイオアナライザー プロットします。(A) aRNA サイズ分布は 500 前後でピークを持つ 200 4,000 bp の間する必要があります跪く x 軸は任意蛍光ユニット [フー]。(B) サイズのビードのクリーンアップ後の cDNA ライブラリ製品の分布。(C) 0.7 x SPRI サイズの選択 (ステップ 6.6) 約 350 のピーク後分布 bp。
図 4: シーケンスの例は、ニューロンを手動で並べ替えから分布と遺伝子検出を読む歌姫 Seq8後.マップ (A) 合計分布を読みます。(B) 合計ユニークな分布を読み取ります。(C) ERCC 読み取りは、以上 4 桁の線形関係を示します。(D) 遺伝子検出対読んでカウントを示す > 95% 単一セルが > 6000 遺伝子/細胞。(E) 遺伝子は 6 の間で検出された介在型、匹敵します。(F) GEO 加盟 #GSE92522 セルごとに検出した遺伝子の分布。この図は、ポールらから適応されています。8.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| バッファー | 項目 | 濃度 | 量 (μ L) |
| サンプル収集バッファー | 組換えリボヌクレアーゼ阻害剤 | 55 | |
| ERCC | 1:50K 希釈 | 110 | |
| ヌクレアーゼ フリー水 | 605 | ||
| 上記の 16 チューブ (8; 200 μ L の PCR チューブの 2 ストリップ); に因数の 43.75 μ が L追加次のチューブあたり | |||
| T7-海-プライマー (例えば N10B1 N10B16) | 1 ng/μ l | 6.25 μ L/チューブ | |
| 各最終巻管 50 μ L (各チューブを 25 μ L 因数で分割、-80 ° C で凍結することができます) | |||
| ソリューション: | 項目 | 濃度 | 量 |
| L 5 つ作るとアプライド: 解散します。 | 塩化ナトリウム | 126 mM | 36.8 g |
| KCl | 3 mM | 1.15 g | |
| NaH2PO4 | 1.25 mM | 0.75 g | |
| NaHCO3 | 20 mM | 8.4 g | |
| アプライドの 500 mL は、10 〜 15 分のための酸素バブルし、新鮮なたびに次を追加します。 | |||
| D-グルコース | 20 mM | 1.8 g | |
| MgSO4 | 2 mM | 4 M 在庫から 0.5 mL | |
| CaCl2 | 2 mM | 4 M 在庫から 0.5 mL | |
| アプライド酸素を保つ out を介して | |||
| ソリューション: | 項目 | 濃度 | |
| アクティビティ ブロック カクテル: 100 x 在庫を作る | |||
| 100 mL アプライドに追加します。 | |||
| APV | 0.05 mM | ||
| CNQX | 0.02 mM | ||
| TTX | 0.0001 mM (0.1 μ M) | ||
| ソリューション: | 項目 | 量 | |
| プロテアーゼ soltion (100 mL) | ストレプト ミセス属のプロテアーゼ | 100 mg | |
| ウシ胎児血清: 商業のソース、使用するたびに 500 μ L で割り切れる。 | |||
表 1: 解決およびバッファーのリスト。
表 2: プライマーとシーケンスの一覧。N10B1 N10B96 最初の鎖プライマーし、T7 RA5 は第 2 ラウンドのプライマー。この表をダウンロードするにはここをクリックしてください。
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Discussion
プロトコルをソート マニュアルに適してまばら、人口マウス脳のラベルまたは現在のスループットの高いセルを用いた検討することですそれ以外の場合稀な細胞集団を代表しているニューロンのチャイルド RNA の塩基配列を解読並べ替えと増幅方法。通常 FACS を受ける細胞は ~ 9-14 psi、ノズルのサイズに応じての範囲で鞘とサンプルのライン圧力を受けるし、イベント レートを必要に応じています。さらに、ノズルから噴射されている時にセル上陸できるハード コレクション チューブまたは影響を与えるストレスを引き起こすサンプル バッファーでコーティングの井戸の表面に。手動並べ替え、中にこのような高圧は決して適用されるセルの毛細管ピペットに吸い込ま、そっとそれらを吹きガラス ピペットの先端を単に破壊して追放。歌姫 Seq プロトコルは細胞量が少ないと細胞から RNA 増幅に役立つ (< 8 μ L) と出発物質と一貫して検出可能な遺伝子 (8-10 K) の利回り多数低、ディープ シーケンスと相まって、時により詳細なセルの id8,13,14の基になる細胞機能のコヒーレント分子画像の再構成。セル コレクション手順、高感度遺伝子検出の絶対分子数を実行する能力の純度のためこのメソッドは細胞の状態、高深さ精度とする疾患の病態を調べる場合に役立ちます。
増幅された RNA と遺伝子検出の程度の収穫は、このプロトコルでは比較的高いが、一定の手続き的措置は、一貫性を保つできます。第 2 鎖合成時に氷の上のアセンブリを行う必要があります、熱 cycler は予冷装置へ転送する前にする必要があります、反応、厳密に 16 ° C (または少し下) aRNA 収量を減らすことができるヘアピンの形成を避けるために行う必要があります。また第 2 鎖合成時に 16 ° C で 2 時間を超えないように勧め、cDNA の精製ステップをできるだけ早く移動することが重要です。IVT 手順中に 12 h 未満の孵化はでいくつかの aRNA 劣化原因 IVT 時間の 14 時間を超えるに対し aRNA 収量を減らすかもしれない。
ゴミ仲間 FACS と歌姫 Seq; を使用して手動による並べ替えを受けるから同じ入力サンプルとの比較研究を実行できませんでした。したがって、我々 は FACS、手選別ではなくに、任意の特定の遺伝子のカテゴリを misregulated することを主張しません。FACS と手動並べ替えの両方可能性が高い遺伝子表現の成果物のある程度をご紹介します。差動遺伝子発現状況などの効果キャンセルすべき理論で、コントロールとサンプルの両方のグループのそれ明らかにされるように。最近では、転写阻害剤のカクテルは、即時の早い遺伝子発現の活性化を防ぐために使用されているし、このような手順は、このプロトコルは15に組み込むことができます。
選別処理マニュアル、穏やかかつ迅速に (通常 90-160 分) FACS (サンプル準備時間除く) 密度勾配遠心法を必要とする生存率、cytotracker 染料、染色およびポスト可視化を並べ替えと比較して。手選別しても、井戸に並べ替え時に高いシース圧、衝撃ストレスにセルは与えないでください。また、酸素アプライドと全体的な定数の近くへのアクセスは、高代謝要求の高速スパイク細胞などのストレスに敏感な細胞に不可欠である可能性があります親切でストレスの少ない並べ替え環境を提供できます。歌姫 Seq に現在、96 セル多重化できる試薬コストを節約し、絶対 mRNA は、セルごとの高い遺伝子数のカウントを提供します。
ただし、このメソッドに欠点があります。たとえば、信頼性の高いニーズを蛍光分類マニュアル標識細胞開始人口として。各並べ替えセッションで FACS でよりかなり低いが、その最大の 32-64 セルを降伏の低スループット プロセスに本質的にです。また手動による並べ替えには、モータースキルと解剖顕微鏡の下でガラス ピペットを操作しマイクロキャピ ラリー ピペット内の単一のセルをキャプチャいくつかの練習を取る必要があります。歌姫 Seq 増幅、3'-バイアス;したがって、それは全体トランスクリプトーム増幅には使用できず、スプライス ・ アイソ フォームの検出に適してはまた。
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Disclosures
著者は、競合する金銭的な利益がないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、(5R01MH094705-04 と R01MH109665-01 Z.J.H.) NIH からの補助金、(Z.J.H.) に CSHL ロバートソン神経科学基金、(兼) に NARSAD ドクトラル ・ フェローシップにサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ERCC RNA Spike-In Control Mixes | Thermo Fisher | Cat# 4456740 | |
| SuperScript III | Thermo Fisher | Cat# 18080093 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | Cat# 10777019 | |
| RNA fragmentation buffer | New England Biolabs | Cat# E6105S | |
| RNA MinElute kit | Qiagen | Cat# 74204 | |
| Antarctic phosphatase | New England Biolabs | Cat# M0289 | |
| Poly nucleotide kinase | New England Biolabs | Cat# M0201 | |
| T4 RNA ligase2, truncated | New England Biolabs | Cat# M0242 | |
| Ampure Xp magnetic beads | Beckman Coulter | Cat# A63880 | |
| SPRIselect size selection magnetic beads | Thermo Fisher | Cat# B23317 | |
| DL-AP5 | Tocris | Cat# 0105 | |
| CNQX | Tocris | Cat# 1045 | |
| TTX | Tocris | Cat# 1078 | |
| Protease from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | Cat# P5147 | |
| Message Amp II kit | Thermo Fisher | Cat# AM1751 | |
| Carbogen | Airgas | Cat# UN3156 | |
| Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | Cat# 761036 | |
| Illumina TrueSeq smallRNA kit | Illumina | Cat# RS-200-0012 | |
| Bioanalyzer RNA Pico chip | Agilent | Cat# 5067-1513 | |
| Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip | Agilent | Cat# 5067-4626 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | ||
| Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics. (Leica model MZ-16F). | Leica | Model MZ-16F | |
| Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm. | Warner instruments | Model GC100-15, Order# 30-0017 | |
| Capillary pipette puller | Sutter Instruments Co | P-97 | |
| Vibratome | Thermo Microm | HM 650V | |
| Vibratome tissue cooling unit | Thermo Microm | CU 65 |
References
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