Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Single-cell RNA-sekvensering av Fluorescently märkt mus nervceller med manuell sortering och dubbel In Vitro transkription med absolut räknas sekvensering (DIVA-Seq)

Published: October 26, 2018 doi: 10.3791/58690

Summary

Det här protokollet beskriver manuell sortering procedur för att isolera enstaka fluorescently märkt nervceller följt av in vitro- transkription-baserade mRNA förstärkning för hög-djup encelliga RNA-sekvensering.

Abstract

Encelliga RNA-sekvensering (RNA-seq) är nu ett allmänt genomförda verktyg för testmetoder genuttryck. Kommersiellt tillgängliga encelliga RNA-sekvensering plattformar bearbeta alla indataceller urskillningslöst. Fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) används ibland, uppströms att isolera en specifikt märkt population av intresse. En begränsning av FACS är behovet stort antal indataceller med betydligt märkt fraktioner, som är opraktiskt för insamling och profilering sällsynta eller glest märkt neuron populationer från mus hjärnan. Här, beskriver vi en metod för manuellt samla glesa fluorescently märkt enda nervceller från färska dissocierade mus hjärnvävnad. Denna process möjliggör fånga singel-märkt nervceller med hög renhet och efterföljande integration med ett in vitro- transkription-baserade förstärkning protokoll som bevarar endogena avskrift nyckeltal. Vi beskriver en dubbel linjär förstärkning metod som använder identifierare för unik molekyl (UMIs) för att generera individuella mRNA räknas. Två omgångar av förstärkning resulterar i en hög grad av gen upptäckt per enskild cell.

Introduction

Encelliga RNA-sekvensering (RNA-seq) har förändrat transcriptomic studier. Medan storskaliga encelliga RNAseq kan utföras med hjälp av olika tekniker, såsom droppar1,2, mikrofluidik3, nanogrids4och mikrobrunnar5, kan inte de flesta metoder sortera definierade celltyper som express genetiskt kodade fluorophores. För att isolera en Markera cell befolkningen, används fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) ofta för att sortera märkta celler i en enskild cell-läge. Dock FACS har vissa begränsningar och kräver noggranna prov bearbetningssteg. Först, ett stort antal indataceller är vanligtvis behövs (ofta flera miljoner celler per mL), med en betydande fraktion (> 15 – 20%) som innehåller märkt befolkningen. Det andra kan cell preparat kräva flera rundor av täthet lutning centrifugering steg ta bort gliaceller bråkdel, skräp och cell klumpar som kanske annars täpper till munstycke eller flöde cellen. För det tredje, FACS vanligtvis sysselsätter färgning och avfärgning steg för live/dead färgning (t.ex. 4, 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI), propidium jodid (PI) och Cytotracker färgämnen), vilket tar ytterligare tid. För det fjärde, som en tumregel för två-färg sortering (såsom DAPI och grön/röd fluorescerande protein (GFP/RFP)), vanligtvis två prov och en kontroll behövs, som kräver en omärkt prov ska behandlas förutom önskad mus stammen. Det femte utförs filtrering ofta flera gånger före och under prov sortering för att proaktivt förhindra tilltäppta prov rader i en FACS maskin. Det sjätte måste tid tilldelas i vanligaste FACS uppställningar att initiera och stabilisera den flytande strömmen och utföra droplet kalibrering. Sjunde, kontroll prover vanligtvis körs i ordning innan den faktiska provtagning att ställa in kompensation matriser, doublet avvisande, grindar, etc. användare antingen Utför steg sex och sju sig före tid eller kräver den assistans av en tekniker parallellt. Slutligen, post-FACS, finns det ofta åtgärder för att säkerställa att endast märkt enstaka celler är närvarande i varje brunn; exempelvis genom att kontrollera prover i en hög-innehåll screening setup såsom en snabb platta imager.

För att kringgå de steg som beskrivs ovan och underlätta en relativt snabb, riktade sekvensering av en liten befolkning av enstaka fluorescently märkt nervceller, beskriver vi en manuell sortering procedur följt av två rundor av en mycket känsliga in vitro förstärkning protocol, kallad dubbel in vitro-transkription med absolut räknas sekvensering (DIVA-Seq). Den RNA amplifiering och cDNA bibliotek generationen är anpassade från Eberwine et al. 6 och Hashimshony o.a. 7, med vissa ändringar som passar musen interneuroner som har mindre cellulära volymer; Dessutom har vi också funnit att det är lika användbara för excitatoriska pyramidal nervceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla förfaranden inklusive animaliska ämnen har godkänts av IACUC vid kalla Spring Harbor Laboratory, NY (IACUC #16-13-09-8).

1. manuell sortering av Fluorescently märkt mus nervceller

  1. Dra glas microcapillaries (se Tabell för material) till 10-15 µm exit diameter med hjälp av kapillär avdragare med följande inställningar: värme: 508, pull: Tom, vel: Tom, tid: tomt.
  2. Tillmäter ett 0,2 µm polyvinylidene kryptondifluorid (PVDF) spruta membranfilter och en tvåvägs slangar ventil med lämplig slang kopplingar 120 – 150 cm flexibel silikon slangar (~0.8 mm innerdiameter).
  3. Bereda 500 mL kylt (4 ° C) konstgjorda cerebrospinalvätska (ACSF, tabell 1) och syresätta av bubblande 5% koldioxid balanserad syre genom ett airstone i 15 min eller tills lösningen försvinner helt.
  4. Bereda 100 mL ACSF med en cocktail av aktivitet blockerare i en 150 mL-bägare (tabell 1).
  5. Bereda 100 mL ACSF med 1 mg/mL Streptococcus bråkdel IV proteashämmare i en 150 mL-bägare (tabell 1).
  6. Bereda 100 mL ACSF med 1% fetalt bovint serum (FBS) lösning i en 150 mL-bägare och syresätta med 5% koldioxid balanserad syre genom ett airstone.
  7. Dissekera hjärnan från en euthanized mus genom att öppna kraniet med en liten sax och utvinna färska hjärnan med hjälp av fina tången utan att skada hjärnbarken.
    Obs: Möss av någon stam, ålder och kön kan användas som önskat. Inte frysa hjärnan eller utföra manuell sortering på möss som injicerats med virus eller andra farliga/smittämnen.
  8. Håll hjärnan i kylda och syresatt ACSF, lämnar ett airstone bifogas 5% koldioxid balans syre under hela den tid de snittning.
  9. Placera hjärnan på vibratome chucken och skär koronalt eller sagittal sektioner på 300 µm tjocklek. Samla så många sektioner som behövs för att erhålla minst ~ 10 – 50 märkt celler upp till flera hundra celler. Sätta skivor på en bomull småmaskig slice hållare, placeras inuti en bägare så de badar i syresatt ACSF.
  10. Flytta färska skivor till en bägare som innehåller ACSF med aktivitet-blockerare och block för 15 – 20 min i rumstemperatur. Hålla bubblande syre använder airstone.
  11. Flytta sektorerna till en bägare som innehåller ACSF med proteas lösningen att utföra mild matsmältningen i rumstemperatur: 20 – 30 min för P4-14 djur eller upp till 45 – 60 min för P28-56 djur. Hålla bubblande syre.
  12. Skölj ACSF med proteas genom att flytta segment tillbaka i den bägare som innehåller ACSF med aktivitet blockerare lösning för 5 – 10 min i rumstemperatur. Hålla bubblande syre.
  13. Flytta enskilda sektioner till en 100 mm petriskål innehållande ACSF med 1% FBS vid rumstemperatur. Att ha ett minimum av 10 – 50 celler (upp till några hundra) under en fluorescerande dissektion omfattning, microdissect områden och lager av intresse. Utföra lokalt med ett par fina pincett eller genom att fästa 22 – 28 G injektionsnålar på trä innehavare (grillspett).
  14. Med pipett Pasteur flytta microdissected bitar till en 2 mL mikrofugrör med ~0.8 mL 1% FBS i ACSF lösning.
  15. Pulverisera dissekerade vävnaden i mikrofugrör vid rumstemperatur. Gör tre långskaftade Pasteur-pipetter med minskande exit diametrar genom att rulla dem över öppen eld. Utföra ~ 10 slag med endospipett, börjar med den största och slutar med den minsta.
  16. Fördela de dissocierade cellerna i en 100 mm petriskål som innehåller syresatt ACSF (petriskål kan vara tunt belagd med 5 mm 1% agar eller tydlig silikon sammansatta på 1:10 förhållandet, om så önskas). Förvara i rumstemperatur.
  17. Vänta ~ 5-7 min för cellerna att gradvis bosätta sig och sedan iaktta god Jordbrukarsed/RFP signalen i dissektion Mikroskop.
    Obs: Enstaka celler, skräp och små klumpar kommer att visas i ljusa-fältet (BF).
  18. Plocka 10 – 15 GFP/RFP celler samtidigt med kapillär pipett (från steg 1.1) bifogas flexibel silikon slangar (0,4 – 0,8 mm innerdiameter) och fördela cellerna i en 100 mm petriskål som innehåller färskt syresatt ACSF.
  19. Genom att blockera placera slutet av ventilens slangar med tungan, kapillären nära cellen av intresse. Fånga celler med hjälp av kapillärkraften vid lindra blocket och snabbt blockera igen så att överflödig vätska in pipetten. Fördela cellerna på en 100 mm petriskål med färskt syresatt ACSF genom att försiktigt blåsa, medan du observerar kapillär spetsen under fluorescens optik av mikroskopet dissektion. Målet att samla in ~ 100 – 150 celler totalt.
  20. Upprepa steg 1,19 gånger mer (beroende på skräp) och överföring sammanlagt ~ 50 – 75 celler till en nya 100 mm petriskål, att se till att föroreningar såsom skräp minimal i ljusa fält differentiell störningar kontrast (DIC) optik.
  21. Slutligen, med färska microcapillary pipett varje gång välja en enda cell i ingen mer än 0,5 µL volym och utvisa det in ett enda 0.2 mL mikrofugrör (eller en remsa av åtta 0,2 mL microfuge rör) som innehåller 1 µL prov samling buffert med grundfärg N10B1-N10B96 (tabell 2). Bryta pipettspetsen i den mikrofugrör att se till att cellen håller i samlingen bufferten. Kassera pipetterna.
  22. Frysa cellerna genom att sätta rör på torris och lagra dem långsiktiga i-80 ° C frys tills de är redo att behandlas för RNA förstärkning.

2. första runda RNA förstärkning

Anmärkning: Följande procedur är för enstaka remsa av åtta 0,2 mL microfuge rör. Skala reaktionerna som behövs.

  1. Syntetisera den första delen av cDNA (första omgången).
    1. Värme remsor från steg 1,22 vid 70 ˚C för 5 min följt av 4 ˚C för 5 min; Upprepa två gånger.
    2. Montera på isen omvänt transkriptas (RT) master mix/första-strand syntes master mix med följande ingredienser (se Tabell för material): 10 x första-strand buffert (2 µL), dNTP mix (4 µL), RNase inhibitor (1 µL) och enzym (1 µL).
    3. Kort Centrifugera remsan på en bordsskiva centrifug att samla allt på botten. Hålla på is.
    4. Tillsätt 1 µL av RT master mix/första-strand syntes master mix ovan rören (total volym av 1 µL prov buffert från cell samling + 1 µL RT = 2 µL/rör). Blanda väl genom pipettering. Kort snurra för att samla hela innehållet längst ned och hålla det på is.
    5. Inkubera i ovanstående tube/s vid 42 ° C under 2 timmar i ugn luft. Lägg rören på is omedelbart att avsluta reaktionen och gå vidare till andra-strand syntes steg.
  2. Syntetisera den andra delen av cDNA (första omgången).
    1. Göra andra strand master mix (80 µL) på is i följande ordning i en 1,5 mL tub: nuclease-fritt vatten (63 µL), 10 x andra strand buffert (10 µL), dNTP mix (4 µL), DNA-polymeras (2 µL) och RNaseH (1 µL). Blanda ingredienserna väl genom vortexa och sedan snurra för att samla på botten och hålla på is.
    2. Start termocykel, kör följande program före svalna enheten, vara redo att börja steg 2.2.3 (lock värme = off; 16 ° C i 2 h, 4 ° C håll), och paus vid 16 ° C.
    3. Lägg en 80 µL/band (eller 10 µL/tube) av andra strand master mix till varje rör på remsan och hålla på is. Överföra remsan till termocykel och återuppta den 16 ° C steg initierade ovan. Inkubera remsan för 2 h vid 16 ° C.
    4. Efter det andra-strand syntes, placera rören på isen att gå vidare till nästa cDNA reningssteg.
  3. Rena dubbel strandsatta cDNA (första omgången).
    Obs: Alla centrifugations utförs vid ~ 8 000 x g vid rumstemperatur. Aldrig överstiga 16 000 x g för att undvika skador på filterpatronen.
    1. Starta uppvärmning 100 µL nuclease-fritt vatten till 50 – 55 ° C för senare användning i en torr värmeblocket. Aldrig överstiga 58 ° C för att förhindra partiell denaturering av cDNA.
    2. Tillsätt 250 µL cDNA bindande buffert i en 1,5 mL tub. Kontrollera om fällningar i bufferten och sedan värma buffertlösningen till 37 ° C i ca 10 min att åter upplösa fällningar.
    3. Överföra cDNAs från en enda 8-tube-remsa till cDNA bindande bufferten. Kombinera cellerna i det här steget för ytterligare nedströms processer (8 celler i 1 tub). Blanda noggrant genom pipettering 2 - 3 gånger och rulla 3 - 4 gånger. Snurra för att samla in innehållet i botten.
    4. Satte cDNA filterpatronen i tvätta rör (från en in vitro- transkription (IVT) kit) fast. Lägga till ovanstående blandningen i mitten av filtret. Centrifugera vid 8000 x g för ~ 1 min eller tills den är genom filtret. Kassera genomströmmande och ersätta tvätta röret.
    5. Tillsätt 500 µL av tvättbuffert från IVT kit till kolumnen.
      Obs: Kontrollera att etanol har lagts till tvättbuffert tidigare.
    6. Centrifugera vid 8000 x g för ~ 1 min eller tills den är genom filtret. Kassera genomflöde och centrifugera igen vid 8 000 x g för ~ 1 min att tömma ampullen.
    7. Överföra cDNA filtret till ett cDNA eluering rör (1,5 mL nuclease-gratis tub). Tillämpa 8,5 µL före värmde nuclease-fritt vatten till mitten av filtret. Vänta 2 min och centrifugera vid 8000 x g i ~1.5 min.
    8. Eluera igen med 8,5 µL före värmde nuclease-gratis vatten och omedelbart gå vidare till den första runda IVT.
      Obs: Dubbelsträngat cDNA återställningsvolym blir ~ 16 µL.
  4. Utföra en in vitro- transkription (IVT) reaktion för förstärkt RNA (aRNA) produktion från cDNA (första omgången).
    1. Ange hybridisering lufta ugnen till 37 ° C.
    2. Förbereda huvudmixen för IVT på is i följande ordning: 16 µL av de eluerade dubbelsträngat cDNA från steg 2.3.8, tillsätt 4 µL T7 ATP lösning (75 mM); 4 µL T7 CTP lösning (75 mM); 4 µL T7 GTP lösning (75 mM); 4 µL T7 UTP lösning (75 mM); 4 µL av T7 10 x reaktion buffert; och 4 µL av T7 enzym mix. Blanda väl, snurra och hålla på is.
    3. Tillsätt 24 µL av IVT huvudmixen till varje tub som innehåller 16 µL av cDNA. Blanda innehållet genom pipettering försiktigt och noggrant. Inkubera röret vid 37 ° C för 14 h.
      Obs: Inkubation för < 12 h allvarligt påverkar avkastningen.
    4. Lägga till 60 µL av icke-dietyleter pyrocarbonate (icke-DEPC) behandlat RNase-fritt vatten för att öka volymen till 100 µL och stoppa IVT reaktionen.
  5. Rena i Árna.
    Obs: Alla centrifugations utförs vid ~ 8 000 x g vid rumstemperatur. Aldrig överstiga 16 000 x g för att undvika skador på filterpatronen.
    1. Starta uppvärmning ~ 200 µL nuclease-fritt vatten till 50 – 55 ° C för senare användning i torra värmeblock eller PCR-maskin. Aldrig överstiga 58 ° C för att förhindra partiell denaturering av Árna.
    2. Överföra Árna till ett 1,5 mL nuclease-fri rör. Tillsätt 350 µL Árna bindande buffert i varje Árna prov. Tillsätt 250 µL av 100% etanol till varje rör och blanda av 3 gånger genom pipettering (gör inte vortex att blanda och snurra).
    3. Överför blandningen omedelbart till kolumnen RNA rening genom att lägga den försiktigt till mitten av filterpatronen. Centrifugera vid 8000 x g för ~ 1 min eller tills blandningen har helt passerat filtret. Kassera genomströmmande och återanvända avfallsinsamling röret
      Obs: RNA startar utfällning vid tillägg av etanol.
    4. Tillsätt 650 µL tvättlösning till varje filterpatron. Centrifugera i ~ 1 min vid 8000 x g eller tills hela bufferten har passerat. Kassera genomströmmande och snurra filtren för en ytterligare ~ 1 min att avlägsna spår av tvättbuffert.
    5. Överföra filtret till en färsk Árna collection tube. Tillsätt 100 µL föruppvärmd (50-55 ° C) nuclease-fritt vatten till mitten av filtret. Vänta 2 min, sedan Centrifugera i ~1.5 min vid 8000 x g eller tills det har gått in i samling röret.

3. andra runda förstärkning

  1. Syntetisera den första strand cDNA (andra omgången).
    1. Överföring Árna från kliva 2.5.5 ett 200 µL mikrofugrör och vakuum koncentrera den 100 µL elutant till 10 µL. använder ingen värme, kör Platskoncentratorn vakuum för 65 min. jämför med 10 µL av vatten i ett 200 µL rör att uppskatta den reducerade.
    2. Sätt hybridisering lufta ugnen till 42 ° C.
    3. Tillsätt 2 µL av slumpmässiga hexamer primers från IVT kit i Árna, vortex kort, och snurra för att samla in innehållet.
    4. Inkubera i mikrofugrör vid 70 ° C i 10 min i en termocykel, sedan placera den på isen.
    5. Förbered följande RT huvudmixen: 2 µL 10 x första strand syntes buffert, 4 µL av dNTP mix, 1 µL RNase inhibitor och 1 µL ArrayScript enzym. Blanda väl i ett 200 µL mikrofugrör av försiktigt vortexa, snurra sedan för att samla in innehållet och placera på is.
    6. Lägg till 8 µL av RT master mix (Sodra) till varje mikrofugrör. Placera rören i en 42 ° C luft inkubator för 2 h.
    7. Tillsätt 1 µL av RNaseH till ovanstående reaktion. Blanda väl genom pipettering 2 - 3 gånger och rulla 3 - 4 gånger, och snurra för att samla in innehållet. Inkubera vid 37 ° C i 30 min på en PCR-maskin. Efter inkubation, vidare till andra-strand syntes steg omedelbart.
  2. Syntetisera den andra delen av cDNA (andra omgången).
    1. Tillsätt 3 µL T7-RA5 grundfärg (vid 25 ng/µL arbetsutspädningen, tabell 2) och 2 µL RNase-fritt vatten till varje cDNA prov. Blanda väl och snurra för att samla in innehållet.
    2. Inkubera vid 70 ° C i 10 min i en termocykel. Placera reaktionen på is.
    3. Förbereda RT master mix (andra delen) på is: 58 µL nuclease-gratis vatten, 10 µL 10 x andra strand buffert, 4 µL av dNTP mix och 2 µL av DNA-polymeras. Blanda väl genom vortexa och snurra för att samla in innehållet. Hålla på is.
    4. Lägga till 74 µL av ovanstående blandning i varje rör från steg 3.2.2. Blanda väl genom pipettering 2 – 3 gånger och snärta 3 - 4 gånger, sedan snurra för att samla in innehållet. Hålla på is och håll.
    5. Pre cool termocykel till 16 ° C genom att stänga locket värmen. Placera rören i termocykel för 2 h vid 16 ° C.
    6. Efter det andra-strand syntes, placera rören på is för att fortsätta till cDNA reningssteg eller frysa vid-20 ° C.
      Obs: cDNA rening rekommenderas före frysning.
  3. Utföra cDNA rening (andra omgången).
    Obs: Alla centrifugations utförs vid ~ 8 000 x g vid rumstemperatur. Aldrig överstiga 16 000 x g för att undvika skador på filterpatronen.
    1. Starta uppvärmning nuclease-fritt vatten till 50 – 55 ° C för senare användning i en torr värmeblocket. Aldrig överstiga 58 ° C för att förhindra partiell denaturering av cDNA.
    2. Överföra cDNA till ett 1,5 mL nuclease-fri rör. Tillsätt 250 µL cDNA bindande buffert i varje rör. Kontrollera om fällningar i bufferten och värma buffertlösningen till 37 ° C i ca 10 min att åter upplösa. Blanda noggrant genom pipettering 2 – 3 gånger och rulla 3 - 4 gånger. Snurra för att samla in innehållet.
    3. Fast sätta cDNA filterpatronen i tvätta rören. Lägga till ovanstående blandningen i mitten av filtret. Centrifugera vid 8000 x g för ~ 1 min eller tills den är genom filtret. Kassera genomströmmande och ersätta tvätta röret.
    4. Tillsätt 500 µL tvättlösning. Kontrollera att etanol har lagts till tvättbuffert tidigare. Centrifugera vid 8000 x g för ~ 1 min eller tills den är genom filtret.
    5. Kassera genomströmmande och centrifugera igen vid 8 000 x g i ~ 1 min att tömma ampullen. Överföra cDNA filtret till ett cDNA eluering rör.
    6. Tillämpa 8,5 µL före värmde nuclease-fritt vatten till mitten av filtret. Vänta 2 min och centrifugera 8000 x g för ~1.5 min. Elute igen med ytterligare 8,5 µL före värmde nuclease-gratis vatten.
      Obs: Dubbelsträngat cDNA återställningsvolym blir ~ 16 µL.
    7. Omedelbart gå vidare till andra omgången IVT eller frysa cDNA vid-20 ° C över natten.
  4. Utföra en andra omgång Árna produktion av IVT.
    1. Ange hybridisering luft ugn till 37 ° C (36 ° C börvärde).
    2. Förbereda huvudmixen för IVT på is i följande ordning: 16 µL av de eluerade dubbelsträngat cDNA från steg 3.3.7, tillsätt 4 µL T7 ATP lösning (75 mM); 4 µL T7 CTP lösning (75 mM); 4 µL T7 GTP lösning (75 mM); 4 µL T7 UTP lösning (75 mM); 4 µL av T7 10 x reaktion buffert; och 4 µL av T7 enzym mix. Blanda väl, snurra kort för att samla in innehållet och hålla på is.
    3. Tillsätt 24 µL av IVT huvudmixen till varje tub som innehåller 16 µL av cDNA. Blanda innehållet genom pipettering försiktigt och noggrant. Inkubera röret vid 37 ° C för 14 h.
      Obs: Inkubation för < 12 h allvarligt påverkar avkastningen.
    4. Lägga till 60 µL av icke-DEPC behandlat RNase-fritt vatten för att öka volymen till 100 µL och stoppa IVT reaktionen.
  5. Utföra Árna rening (andra omgången).
    Obs: Alla centrifugations utförs vid ~ 8 000 x g vid rumstemperatur. Aldrig överstiga 16 000 x g för att undvika skador på filterpatronen.
    1. Starta uppvärmning ~ 200 µL nuclease-fritt vatten till 50 – 55 ° C för senare användning i torra värmeblock eller PCR-maskin. Aldrig överstiga 58 ° C för att förhindra partiell denaturering av Árna.
    2. Överföra Árna till ett 1,5 mL nuclease-fri rör. Tillsätt 350 µL Árna bindande buffert i varje Árna prov. Tillsätt 250 µL av ACS grade 100% etanol till varje rör och blanda 3 gånger genom pipettering (gör inte vortex att blanda och snurra).
      Obs: RNA startar utfällning vid tillägg av etanol.
    3. Överför blandningen omedelbart till kolumnen RNA rening genom att lägga den försiktigt till mitten av filterpatronen. Centrifugera vid 8000 x g för ~ 1 min eller tills blandningen har helt passerat filtret. Kassera genomströmmande och återanvända avfallsinsamling röret.
    4. Tillsätt 650 µL tvättlösning till varje filterpatron. Centrifugera i ~ 1 min vid 8000 x g eller tills hela bufferten har passerat. Kassera genomströmmande och snurra filtren för en ytterligare ~ 1 min att avlägsna spår av tvättbuffert.
    5. Överföra filtren till en färsk Árna collection tube. Tillsätt 100 µL föruppvärmd nuclease-fritt vatten till mitten av filtret. Vänta 2 min, sedan Centrifugera i ~1.5 min vid 8000 x g eller tills det har gått.
    6. Alikvotens 2 µL i ett rör för spektrofotometer (vid 260 nm våglängd) och bioanalyzer sprida analyser för att kontrollera för Árna avkastning och kvalitet.
      Obs: Koncentration måste vara minst 5 ng/µL; i annat fall avslå provet. Provet kan förvaras i ~ 1 år vid-80 ° C. Undvika att frysa-upptining proverna.
    7. Kontrollera de prover som använder en bioanalyzer för att visualisera ordentlig spridning av Árna produkter efter tillverkarens protokollet (figur 2).

4. förstärkt RNA fragmentering och rensning

  1. Blanda följande på is (total volym 40 µL, kombinera 2 tuber av Árna icke-överlappande prov streckkoder): 36 µL av Árna (200 ng totalt) och 4 µL av RNA fragmentering buffert. Inkubera blandningen vid 94 ° C i 90 s.
  2. Omedelbart flytta blandningen till is och tillsätt 4 µL av RNA fragmentering stop buffert. Justera volymen till 100 µL genom att lägga till 56 µL nuclease-gratis vatten.
  3. Lägga till 350 µL RLT buffert från RNA rening kit (se Tabell av material) och blanda väl genom pipettering. Tillsätt 250 µL EtOH, blanda väl genom pipettering och överföra provet till kolumnen RNA rening spin. Snurra för 15 s vid 8 000 x g.
  4. Flytta kolumnen till nya collection tube och tillsätt 500 µL av RPE buffert. Snurra för 15 s vid 8000 x g. Kassera genomflöde. Tillsätt 500 µL av 80% EtOH och spin för 2 min vid 8000 x g.
  5. Flytta kolumnen till en ny samling tub, öppna locket på kolumn och spin för 5 min i full fart.
  6. Flytta kolumnen till en ny samling tub och eluera med 16 µL nuclease-gratis vatten, spinning i full fart för 1 min.

5. bibliotek förberedelse

Obs: IVTs kan poolas vid denna punkt, om det finns ingen överlappning i streckkoder används. Fosfatas behandlingstiden är 40 min. Poly-nukleotid kinase behandlingstiden är 1 h.

  1. Till 16 µL av fragmenterade Árna i ett 0,7 mL PCR-rör, tillsätt 4 µL av följande blandning: 2 µL 10 x fosfatas buffert, 1 µL av Antarctic fosfatas och 1 µL av rekombinant ribonukleasinhibitor (t.ex., RNaseOUT). Inkubera i en termocykel med följande protokoll: 37 ° C i 30 min, 65 ° C i 5 min, och håll vid 4 ° C.
  2. Till 0,7 mL PCR-röret från steg 5.1, tillsätt 30 µL av den följande mix: 17 µL nuclease-gratis vatten, 5 µL 10 x fosfatas buffert, 5 µL av ATP (10 mM), 1 µL av rekombinant ribonukleasinhibitor och 2 µL av PNK. Inkubera i termocykel vid 37 ° C i 60 min och sedan hålla vid 4 ° C.
  3. Utföra en kolumn rensning av fosfatas och PNK-behandlade Árna.
    1. Justera volymen till 100 µL genom att lägga till 50 µL nuclease-gratis vatten. Tillsätt 350 µL RLT buffert och blanda väl. Tillsätt 250 µL EtOH, blanda väl genom pipettering och överföra provet till kolumnen RNA rening spin.
    2. Snurra för 15 s vid 8000 x g. överföra kolumnen till en ny samling tub och tillsätt 500 µL av RPE buffert.
    3. Snurra för 15 s vid 8000 x g. Kassera genomströmmande och tillsätt 500 µL av 80% EtOH.
    4. Snurra för 2 min vid 8000 x g. överföring kolumnen till en ny samling tub, öppna locket till kolumn- och spinn för 5 min i full fart.
    5. Flytta kolumnen till en ny samling tub och eluera med 14 µL nuclease-gratis vatten, spinning i full fart för 1 min att återställa en ~ 10 µL volymer material. Kassera kolumnen. Minska volymen till 5 µL med en vakuum koncentrator för ~ 10 min.
  4. Ligera en 3' adaptern med en kommersiell kit (se Tabell för material).
    1. Späd den 3' adaptern (RA3) från TrueSeq kit 3 veck med nuclease-gratis vatten och lagra alikvoter vid-20 ° C.
    2. 5 µL av fosfatas och PNK-behandlade RNA, tillsätt 1 µL utspädda 3' adapter. Inkubera vid 70 ° C i 2 min och sedan omedelbart placera röret på is för att förhindra sekundära strukturerabildandet.
    3. Tillsätt 4 µL av följande blandning: 2 µL av 5 x HM ligering buffert (HML), 1 µL RNase inhibitor och 1 µL T4 RNA ligase 2 (trunkerade). Inkubera röret på den förvärmda termocykel vid 28 ° C för 1 h (ouppvärmd eller med locket öppet).
    4. Med reaktionsröret kvar på termocykel, tillsätt 1 µL stopplösning (STP) och Pipettera försiktigt hela volymen upp och ner 6 – 8 gånger att blanda. Fortsätta att Inkubera reaktionsröret på termocykel vid 28 ° C i 15 min, sedan placera röret på is.
    5. Tillsätt 3 µL nuclease-fritt vatten för att få en total volym av 12 µL. användning 6 µL och lagra de återstående 6 µL vid-80 ° C.
  5. Utföra en omvänd Transkription reaktion.
    1. Kombinera följande i ett PCR-rör: 6 µL av adapter-sammanskrivna RNA och 1 µL RNA RT primer (RTP). Inkubera röret vid 70 ° C i 2 min, sedan omedelbart placera röret på is.
    2. Tillsätt 5,5 µL av följande blandning: 2 µL av 5 x första strand buffert, 0,5 µL av 12,5 mM dNTP mix, 1 µL 100 mM DTT, 1 µL RNase inhibitor och 1 µL av omvänt transkriptas. Inkubera röret i den förvärmda termocykel vid 50 ° C för 1 h, sedan placera röret på is (prover kan förvaras vid-20 ° C).
  6. Utför PCR-amplifiering med 11-15 cykler att berika 5', 3'-primer sammanskrivna produkt.
    1. Till varje omvänd Transkription reaktion, tillsätt 35,5 µL av den följande mix: 8,5 µL av ultrarent vatten, 25 µL av PCR-mix (PML) och 2 µL av RNA PCR primer (RP1). Till varje reaktion, tillsätt 2 µL av en unikt indexerade RNA PCR-primer (RPIX, X = 1 – 24).
    2. Förstärka röret i den termocykel med följande PCR cykling villkor: 98 ° C i 30 s; 12-15 cykler av 98 ° C för 10 s; 60 ° C 30 s; 72 ° C under 30 s; 72 ° C i ca 10 min; Håll sedan vid 4 ° C.

6. PCR-produkt rensning och storlek urval

  1. Prewarm AmpureXP magnetiska pärlor i rumstemperatur. Vortex pärlorna tills de är väl spridda, sedan Tillsätt 50 µL till 50 μl PCR-reaktion (1:1 PCR-produkt: pärlor). Blanda innehållet till tio gånger för att blanda.
  2. Odla i rumstemperatur i 15 min. plats på en magnetisk stå för minst 5 min, tills vätskan visas tydligt. Avlägsna och kassera 95 µL av supernatanten.
  3. Tillsätt 200 µL av nylagade 80% EtOH. Inkubera i minst 30 s, och sedan ta bort och Kassera supernatanten utan att störa pärlorna. Upprepa detta en gång till.
  4. Lufttorka pärlorna i 15 min eller tills helt torr. Blandas med 32,5 µL av resuspension buffert. Pipettera hela volymen upp och ner tio gånger för att blanda.
  5. Odla i rumstemperatur i 2 min. plats på en magnetisk stå i 5 minuter tills vätskan visas tydligt. Överföra 30 µL av supernatanten till en ny tub. Tillsätt 20 µL nuclease-fritt vatten för att få en 50 µL totala volym.
  6. Utföra storlek urval av PCR-produkter med fasta fasen reversibel immobilisering (SPRI) magnetiska pärlor.
    1. Tillsätt 0.7 x volym (35 µL) SPRI pärlor till röret utarbetats i steg 6,5 och blanda grundligt av pipettering. Inkubera i 5 min i rumstemperatur.
    2. Placera röret på en magnetisk stå och vänta 5 min eller tills pärlorna separat. Ta bort supernatanten försiktigt utan att störa pärlorna.
    3. Tillsätt 200 µL av nylagade 85% EtOH. Vänta 30 s och sedan ta bort EtOH. Lufttorka pärlorna i 10 min.
  7. Tillsätt 20 µL av nuclease-gratis vatten. Placera röret tillbaka på magneten, vänta 5 min och Pipettera upp den flytande delen utan att störa eller röra pärlorna. Lagra DNA vid-20 ° C.

7. bestämning av bibliotek mängden och kvaliteten

  1. Kontrollera koncentrationen av DNA med en spektrofotometer vid 260 nm våglängd (förväntad koncentration är minst ~ 5 – 10 ng/µL).
  2. Kör 1 µL av varje prov på en bioanalyzer som använder en högkänslig DNA chip för att undersöka storleksfördelning (förväntade toppen är 300 – 400 bp (se figur 3)).

8. prov inlämning

  1. Kombinera icke-överlappande sekvensering PCR streckkoder (1:1 ratio). Till exempel kombinera PCR-produkter av prover med RPI-1 och RPI-2, RPI-3 och RPI-4 tillsammans i lika nanogram mängder varje, enligt RNA sekvensering core's totala ingående prov belopp krav rekommendationer.
  2. Justera den totala koncentrationen 5 ng/µL och minst en 10 µL volym eller som rekommenderas av sekvensering anläggning kärnan efter att kombinera.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Med hjälp av protokollet som beskrivs ovan, GABAergic nervceller var manuellt sorteras (figur 1) och RNA förstärks, då gjordes till cDNA bibliotek (figur 2) och sekvenserade på hög djup8. De förstärkta RNA (aRNA) produkterna varierade mellan 200 – 4 000 bp i storlek, med en topp strax över 500 bp (figur 3A). Bead-renat cDNA biblioteket var ytterligare storlek-begränsad av en andra omgång av rening med pärlor som eliminerade mindre fragment mindre än 200 bp (figur 3B och 3 C) och med en topp på ~ 350 bp. Att ha kortare fragment leder till tomma läsningar (ingen mRNA infogar, enda adapter och primer sekvenser), medan längre fragment kommer att uppta mer utrymme på flödesceller, minska totalt läsa utdata. Vid sekvensering erhöll vi rutinmässigt en 4.8 x 105 median eller 6,9 x 105 genomsnittliga mappade läsningar per cell (figur 4A). Efter dubbla RNA borttagning med hjälp av UMIs, hade varje enskild cell en 1,0 x 105 median, eller 1,4 x 105 genomsnittliga unika läsningar per cell (figur 4B). I varje enskild cell externa RNA kontroller konsortium (ERCC) användes spike-i RNA som intern kontroll som det absoluta antalet molekyler som tillsätts provet kan beräknas. Fanns ett linjärt förhållande till ingång till observerade räknas, med en lutning på 0,92 och justerat R2 = 0,94 (figur 4 c). Vi upptäckt i genomsnitt ~ 10 000 gener per enda neuron (alltifrån ~ 7.500 till 12.000 gener/cell), med > 95% av singeln celler upptäcka > 6 000 gener (figur 4 d-4F). Detta nummer jämför gynnsamt mot publicerade data från liknande mus brain-derived enda nervceller (t.ex. 1 865-4,760 gener i Zeisel o.a. 9, 7,250 gener i Tasic o.a. 10och 8 000 gener i Okaty et al. 11). läsare hänvisas till Poulin o.a. 12 för en detaljerad jämförelse.

Figure 1
Figur 1 : Arbetsflödet för manuell sortering av nervceller följt av DIVA-följande punkter Färska musen hjärnor samlades och skivad, och regionen av intresse var microdissected. Enda nervceller att uttrycka fluorescerande proteiner samlades manuellt och förstärks med två rundor av linjär förstärkning genom in vitro- transkription. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Figure 2
Figur 2 : Schematisk arbetsflödet för DIVA-Seq med två rundor av förstärkning samtidigt som den innehåller unika molekylära identifierare (UMIs) eller sortrenhet-taggar. Prov streckkod (SBC) tillåter varje enskild cell kan identifieras av sin 9-nukleotid kod (mörk turkos). UMI är en sträcka av slumpmässiga nukleotider 10 bp i längd som är olika för varje grundfärg som används. Under bioinformatik steg räknas två mappade avskrifter med samma UMI sekvens endast en gång, således eliminera förstärkning dubbletter och möjliggör absoluta avskrift räknar. RA5 och RA3 är sekvensering grundfärger, och T7-RA5 primer behövs för att lägga till T7 sekvenser tillbaka till de första omgången Árna produkterna så att de T7 RNA-polymerasen kan binda och utföra en andra omgång av linjär förstärkning genom in vitro- transkription. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Exemplet bioanalyzer tomter. (A) Árna storlek distributioner bör vara mellan 200-4000 bp med en topp på runt 500 bp. x-axeln har godtyckliga fluorescens enhet [FU]. (B) storlek distribution av cDNA bibliotek produkter efter pärla rensning. (C) storlek fördelningen efter 0,7 x SPRI storlek urval (steg 6,6) med en topp omkring 350 bp.

Figure 4
Figur 4 : Exempelsekvens Läs distributioner och gen upptäckt från manuellt-sorterade nervceller efter DIVA-Seq8 . (A) totalt kartlade Läs distribution. (B) totalt unika läser distribution. (C), ERCC läser visar linjärt samband över 4 tiopotenser. (D) gener upptäckts vs. Läs räknas visar att > 95% enstaka celler har > 6000 gener/cell. (E) gener upptäckts bland 6 interneuron typer är jämförbara. (F) fördelning av gener upptäckts per cell, GEO anslutning #GSE92522. Denna siffra har anpassats från Paul et al. 8. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Buffert Objekt Koncentration Belopp (µL)
Sample Collection buffert Rekombinant ribonukleasinhibitor 55
ERCC 1:50K utspädd 110
Nuclease gratis vatten 605
Alikvotens 43.75 µL av ovan i 16 rör (2 blisterkartor med 8; 200 µL PCR-rören); Lägg till följande per rör
T7-UMI-primers (t.ex. N10B1-N10B16) 1 ng/µL 6,25 µL/tube
Slutlig volym i varje tub 50 µL (varje tub kan delas upp i 25 µL portioner och fryst vid-80 ° C)
Lösningar: Objekt Koncentration Belopp
ACSF: för att göra 5 L lös NaCl 126 mM 36,8 g
JCM 3 mM 1,15 g
NaH2PO4 1,25 mM 0,75 g
NaHCO3 20 mM 8,4 g
Till 500 mL ACSF, bubbla syre för 10-15 min sedan Lägg till följande färska varje gång:
D-glukos 20 mM 1,8 g
MgSO4 2 mM 0,5 mL 4 M lagervara
CaCl2 2 mM 0,5 mL 4 M lagervara
Hålla ACSF syresatt runt om
Lösningar: Objekt Koncentration
Aktivitet blockerare cocktail: göra en 100 x lager
100 mL ACSF tillsätt
APV 0,05 mM
CNQX 0,02 mM
TTX 0,0001 mM (0,1 µM)
Lösningar: Objekt Belopp
Proteas soltion (100 mL) Proteashämmare från Streptomyces griseus 100 mg
Fostrets Nötkreaturserum: kommersiella källan, alikvotens i 500 µL för varje användning.

Tabell 1: Lista över lösningar och buffertar.

Tabell 2: lista av primers och sekvenser. N10B1-N10B96 första strand primers och T7-RA5 är den andra omgång primern. Vänligen klicka här för att hämta tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Manuell sortering protokoll är lämplig för en övervakad RNA-sekvensering av neuron populationer som antingen glest märkt i möss hjärnan eller företräder en ovanlig cell befolkning som inte annars är möjligt att studera med hjälp av aktuella hög genomströmning cellen sortering och förstärkning metoder. Celler utsätts för FACS vanligtvis genomgå slida och prov linje påtryckningar i spänna av ~ 9 – 14 psi, beroende på munstycke och önskad händelse priser. Dessutom på att matas ut från munstycket kan cellerna landa hårt på ytan av den insamling tube eller brunnar belagd med prov-buffert som orsakar påverkan stress. Under manuell sortering, tillämpas sådana höga tryck aldrig, som cellerna sugs in i pipetten genom kapillärkraften och utvisas genom att försiktigt blåsa dem ut och helt enkelt bryta tips av glas pipetterna. DIVA-Seq protokollet är användbart för RNA förstärkning från celler med små cellulära volymer (< 8 µL) och låg utgångsmaterial och konsekvent avkastning stort antal detekterbara gener (8 – 10 K), som, när den kombineras med djupsekvensering, tillåter för detaljerad rekonstruktioner av en sammanhängande molekylär bild av cellulära funktioner underliggande cell identitet8,13,14. På grund av renhet av cell samling steg, hög känslighet för gen upptäckt och möjligheten att utföra absoluta molekyl räknas, är denna metod användbar för att studera cellulära stater och sjukdomar patofysiologi med hög djup och precision.

Medan avkastningen av förstärkta RNA och graden av gen upptäckt är relativt hög i detta protokoll, bidra vissa processuella åtgärder till att upprätthålla konsistens. Under andra-strand syntes, församlingen måste göras på is, termocykel måste vara nedkylda före överföring till enheten och reaktionen måste göras strikt på 16 ° C (eller något nedan) för att undvika bildandet av hårnålar som kan minska Árna avkastning. Det är också klokt att inte överskrida 2 h vid 16 ° C under andra-strand syntes, och det är viktigt att flytta till cDNA reningssteg så snart som möjligt. Under IVT steg, kan inkubation i mindre än 12 h minska Árna avkastning, medan överstiger 14 h IVT tid kan resultera i vissa Árna nedbrytning.

Vi utföra inte en jämförande studie med samma indata prov från kull-kompisar underkastas FACS och manuell sortering med DIVA-Seq; Vi påstår alltså inte att någon särskild gen kategori är misregulated i FACS och inte i manuell sortering. Både FACS och manuell sortering kommer sannolikt att införa en viss gen uttryck artefakter. För differentiell gen uttryck situationer, bör någon sådan effekt i teorin avbryta ut varandra, eftersom det kommer att manifesteras i både kontroll och prov grupper. Nyligen, en cocktail av transkription-hämmare har använts för att förhindra aktivering av omedelbara tidiga genuttryck och sådana åtgärder kan också införlivas till detta protokoll15.

Manuell sortering process är mild och snabbare (vanligtvis 90 – 160 min) jämfört med FACS (exklusive de prov förberedelse gånger) som kräver täthet lutning centrifugering, färgning med livskraft, cytotracker färgämnen, och efter sortering visualisering. Manuell sortering inte omfattas av cellerna hög slida tryck och stötar stress vid sortering på brunnar. Det gör också nästan konstant tillgång till syresatt ACSF och övergripande ger en gästfri och mindre stressig sortering miljö, vilket kan vara avgörande för celler som är känsliga för stress såsom snabb tillsatta celler med höga metaboliska krav. I DIVA-Seq för närvarande kan upp till 96 celler vara multiplexed för att spara reagens kostnader och ge absoluta mRNA räknar med hög genen räknas per cell.

Det finns dock nackdelar med denna metod; till exempel manuell sortering behov tillförlitlig fluorescently märkt celler som en start befolkning. Det är till sin natur en låg genomströmning process, med varje sortering session ger 32 – 64 celler på maximum, vilket är betydligt lägre än i FACS. Manuell sortering kräver också finmotoriken och lite övning att manipulera glas pipetter i dissektion Mikroskop och fånga enstaka celler i microcapillary pipetter. DIVA-Seq förstärkning är 3'-partisk; Därför, det kan inte användas för hela transkriptom förstärkning och är inte heller lämplig för skarvning isoform upptäckt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att det finns inga konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgments

Detta arbete fick stöd genom bidrag från NIH (5R01MH094705-04 och R01MH109665-01-Z.J.H.), av CSHL Robertson neurovetenskap fonden (till Z.J.H.) och av en publicerade Post-Doctoral Fellowship (att A.P.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ERCC RNA Spike-In Control Mixes Thermo Fisher Cat# 4456740
SuperScript III Thermo Fisher Cat# 18080093
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor Thermo Fisher Cat# 10777019
RNA fragmentation buffer New England Biolabs Cat# E6105S
RNA MinElute kit Qiagen Cat# 74204
Antarctic phosphatase New England Biolabs Cat# M0289
Poly nucleotide kinase New England Biolabs Cat# M0201
T4 RNA ligase2, truncated New England Biolabs Cat# M0242
Ampure Xp magnetic  beads Beckman Coulter Cat# A63880
SPRIselect size selection magnetic beads Thermo Fisher Cat# B23317
DL-AP5 Tocris Cat# 0105
CNQX Tocris Cat# 1045
TTX Tocris Cat# 1078
Protease from Streptomyces griseus Sigma-Aldrich Cat# P5147
Message Amp II kit Thermo Fisher Cat# AM1751
Carbogen Airgas Cat# UN3156
Sylgard 184 Sigma-Aldrich Cat# 761036
Illumina TrueSeq smallRNA kit Illumina Cat# RS-200-0012
Bioanalyzer RNA Pico chip Agilent Cat# 5067-1513
Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip Agilent Cat# 5067-4626
Bioanalyzer 2100 Agilent
Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics.  (Leica model MZ-16F). Leica Model MZ-16F
Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm. Warner instruments Model GC100-15, Order# 30-0017
Capillary pipette puller Sutter Instruments Co P-97
Vibratome Thermo Microm HM 650V
Vibratome tissue cooling unit Thermo Microm CU 65

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  2. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  3. Xin, Y., et al. Use of the Fluidigm C1 platform for RNA sequencing of single mouse pancreatic islet cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3293-3298 (2016).
  4. Gao, R., et al. Nanogrid single-nucleus RNA sequencing reveals phenotypic diversity in breast cancer. Nature Communications. 8 (1), 228 (2017).
  5. Yuan, J., Sims, P. A. An Automated Microwell Platform for Large-Scale Single Cell RNA-Seq. Scientific Reports. 6, 33883 (2016).
  6. Eberwine, J., et al. Analysis of gene expression in single live neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).
  7. Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification. Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).
  8. Paul, A., et al. Transcriptional Architecture of Synaptic Communication Delineates GABAergic Neuron Identity. Cell. 171 (3), 522-539 (2017).
  9. Zeisel, A., et al. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 1934, (2015).
  10. Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19, 335-346 (2016).
  11. Okaty, B. W., et al. Multi-Scale Molecular Deconstruction of the Serotonin Neuron System. Neuron. 88 (4), 774-791 (2015).
  12. Poulin, J. F., Tasic, B., Hjerling-Leffler, J., Trimarchi, J. M., Awatramani, R. Disentangling neural cell diversity using single-cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (9), 1131-1141 (2016).
  13. Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. Exploiting single-cell expression to characterize co-expression replicability. Genome Biology. 17, 101 (2016).
  14. Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. Characterizing the replicability of cell types defined by single cell RNA-sequencing data using MetaNeighbor. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  15. Hrvatin, S., et al. Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).

Tags

Neurovetenskap fråga 140 manuell sortering neuron encelliga RNA sekvensering DIVA-Seq in vitro transkription linjär förstärkning unik molekylär identifierare (UMI)
Single-cell RNA-sekvensering av Fluorescently märkt mus nervceller med manuell sortering och dubbel <em>In Vitro</em> transkription med absolut räknas sekvensering (DIVA-Seq)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Paul, A., Huang, Z. J. Single-cellMore

Paul, A., Huang, Z. J. Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq). J. Vis. Exp. (140), e58690, doi:10.3791/58690 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter