Summary
量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応による感染症の定量化、ひと初代細胞、ひと血清を用いたデング ウイルスに対する耐性が既存のジカ ウイルス感染に及ぼす影響を評価する方法について述べる。
Abstract
フラビ ウイルス ジカとギランバレー症候群や乳児、小頭症などの神経合併症の最近の出現は深刻な公共の安全の懸念をもたらしています。ジカ ウイルス (ZIKV) の最近の再出現は、地域人口がさらされているし、他の密接に関連する事前の免疫の状態は、主に、最も重要な脅威となる抗体依存的な増強 (ADE) 危険因子のうち発現、特にデング熱ウイルス (DENV)。ここでは、ひと初代細胞または細胞株における ZIKV 感染 DENV に対する血清抗体の効果を定量化するためのプロトコルについて述べる。
Introduction
蚊媒介性ウイルス疾患、間ジカ感染症は臨床的に最も重要な1であります。感染は、ほとんどの場合、その主要なベクトル1,2としてネッタイシマカを使用する ZIKV フラビ ウイルスによって引き起こされます。ただし、いくつかの ZIKV の発生3の主要なベクトルとしてヒトスジシマカを報告している研究もあります。感染症は多くの場合無症候性であるが、最も一般的な症状は発熱、頭痛、筋肉痛2。治療法やワクチン使用可能なありません ZIKV 感染症のため、利用できる治療法は主に支持。南アメリカの ZIKV の最近の発生は、重症の病気と小頭症2という名前の胎児の神経発達障害で、約 20 倍の増加をもたらした。南アメリカは、DENV と西ナイル ウイルスなどいくつかのアルボ ウイルスに固有の領域は、他の flavivirus(es) に前の免疫が ZIKV 感染症と疾患の重症度の役割を果たしているかどうかを調査することが重要です。
昔からウイルスは宿主の細胞機構を引き継ぐし、抗ウイルス応答を抑制するために感染の機会を増やすにさまざまな戦略を進化してきました。すべての中で最も魅力的なの 1 つは、ADE4現象とのレプリケーションを強化するウイルスによるホスト前免疫抗体の使用です。よく学び、ウイルス抗体価と疾患の結果5,6,7を向上させる実証 DENV の 4 血清型すべてにわたって ADE がされています。以前の in vitro の研究では、既存のプライマリひと免疫細胞8DENV 免疫のために ZIKV レプリケーションの重要な拡張機能を示しました。また、初代培養細胞で ZIKV のレプリケーションを強化する DENV 既存抗体の機能を定量化する関連する in vitro 法を示した。
私たちが開発したプロトコル使用テスト、血清サンプル TCID 50 DENV 中和または生体関連セルまたは ZIKV に感染することができます組織由来細胞の ZIKV と共に、プラック減数中和試験 (PRNT) の試金。
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Protocol
本研究では血清試料は、コロンビアからコホートの人間の参加者から得られました。検体の採取は、グァテマラ ・ デ ・ パンプローナ (コロンビア、南アメリカ) とロサンゼルス Potios 病院8内部審査委員会 (IRB) によって承認されました。サンプルは匿名で提供された、患者情報にアクセスしていた捜査官。血清サンプルは、DENV 血清型についてチェックされました。サンプルはさらに DENV 感染を中和するために確認されたの in vitro 。コントロール、アメリカから健常者 (HC) から血清サンプルを使用しました。
注:このプロトコルは、Fcγ 受容体発現細胞の種類で ZIKV ADE のレプリケーションを確認する使用できます。プロトコルの構成は 3 つの部分 (図 1)。
1. セルのシードと感染のセットアップ
注:この特定の研究や人間プライマリ大食細胞 U937 骨髄単球性細胞株 (ATCC-CRL-1593.2) 使用されました。セルは、5% の二酸化炭素 (CO2) と 37 ° C の定温器で 10% 牛胎児血清 (FBS) 添加 RPMI 培地に維持されました。無菌状態で 2 (BSL-2) 安全キャビネット レベルのすべて、バイオ セーフティにおける手順を行った。
- シード 3 x 10 の4セル数と共に媒体の 100 μ L 滅菌平底 96 ウェル プレートでと 5% CO2と 37 ° C の定温器に入れます。
- 細胞を播種後室温で血清サンプルを解凍し、10 倍のシリアル希薄を作る (すなわち1/10、1/100、1/1,000、1/10,000) の無血清培地サンプルを混合することによって。分注希釈滅菌 96 ウェル プレートに。付加的な制御として血清なしウイルスを使用します。
- 1-2 分間水浴の 37 ° C で ZIKV 株を解凍し、すぐに氷の将来使用するためにそれらを転送します。
- 血清試料に ZIKV 株 MR766 の感染 (MOI) 相当額の 0.1 の多様性を追加します。
注:希釈倍率は一定、総量が 〜 200 μ L; かどうかを確認します。各治療のトリプリケートのために十分であります。感染下流解析のネガティブ コントロールとして使用する 3 つの井戸を保ちます。 - ジカ ビリオン (便宜上、「免疫複合体」といいます) と錯形成 DENV 抗体可能にするため 1 時間 5 CO2と 37 ° C のインキュベーターで追加されたウイルス血清希釈を孵化させなさい。
- フラット底 96 ウェル プレートに播種した細胞からメディアを吸い出しなさい。洗浄と滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (1 x PBS) x セル。
- 免疫複合体の 50 μ L を各ウェルに追加、2 h の 5% CO2と 37 ° C のインキュベーターでそれらを孵化させなさい。
- 後 2 時間、吸引細胞から免疫複合体を含むメディア、マルチ チャンネルを使用して、ピペットし、洗浄セル 2 x 1 x PBS 免疫複合体とすべての未接続のウイルス粒子を完全に削除するとします。
- 10 %fbs それぞれにも、48 時間 5% CO2と 37 ° C のインキュベーターで細胞をインキュベートを添加した新鮮な完全なメディアの 100 μ L を追加します。
2. RNA の抽出
- インキュベーターから 96 ウェル プレートを外し、バイオ セーフティ キャビネットにそれを転送します。
- メディアを吸引、洗浄セル 2 x 1x PBS で、RNA の抽出に進みます。
注:RNA の抽出には、選択した任意のメソッド (材料の表を参照してください)。 - 10% β-メルカプトエタノール ウェルあたりのセル換散バッファーの 250 μ L を追加します。ピペットの溶解手順をスピードアップするためピペット チップで細胞の傷と共に、少なくとも 5 倍上下バッファー。
- セル lysates を新しい、ラベル、滅菌 1.5 mL チューブに転送します。
- 70% エタノール (250 μ L) の等しい量を追加します。混合物がクリアされるまでの 4 倍 - 5 倍上下ピペットします。
- 2 mL の採血管に、シリカ系カラムのラベルに (〜 500 μ L) の混合物を転送し 30 s. 破棄の 15,000 × gで遠心分離機の流れ、同じコレクション チューブで列を保ちます。
- 洗浄バッファー 1 の 700 μ L を各列に追加 30 s. 廃棄の流れ 15,000 × gで遠心分離機し、同じコレクション管列を維持します。
- 15,000 × gで 30 s. 破棄上清の各列と遠心分離機に洗浄バッファー 2 の 500 μ L を追加します。2 x この手順を繰り返します。
- 転送洗浄バッファー 2 から左列を新しい 2 mL 管および 15,000 × gで遠心する 2 分シリカ系カラムは完全に乾くし、エタノールがないことを確認してください。
- 2 mL の管を破棄し、配置の列、新しい滅菌、ラベル、1.5 mL 回復チューブ。
- 各列と 15,000 × gで 1 分間遠心の中央に水の RNase フリーの prewarmed (42 ° C) 30 μ L を追加します。
- 溶出の RNA を回復し、波長 260 nm で分光光度計を使用して、サンプルを定量化します。
注:理想的には、260 で吸光度の比率を計算することによって、RNA の純度を決定する nm と 280 nm。浄化された RNA の 260/280 の比率は、1.8 2.0 間理想的です。
3 量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応
注:量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (qRT PCR) は、通常私色素 SYBR グリーン、Taq DNA ポリメラーゼ、deoxynucleotide 三リン酸塩 (dNTPs) と受動的な色素で構成されている任意の SYBR グリーン ミックスを使用して実施することができます。SYBR グリーンの検出の任意 qPCR のマシンは、反応を実行し、データを取得する使用できます。この実験は、ワンステップ RT-PCR キットを用いて SYBR グリーンのカクテルがあった私、ROX 染料、Taq DNA ポリメラーゼ、dNTPs、逆転写酵素の追加混合物 (材料の表を参照してください).エンベロープ領域に対して設計されていますおよび ZIKV ゲノムのレベルを定量化する本研究で使用されるプライマーは、ZIKV qF のため CCGCTGCCCAACACAAG と ZIKV qR の CCACTAACGTTCTTTTGCAGACAT です。コントロールとしてヒト β-2 ミクログロブリン (B2M) は測定し、ZIKV (ハウスキーピング遺伝子) の式を正規化するために使用されました。本研究で用いた B2M 遺伝子の発現を定量化するためのプライマー シーケンス、B2M qF の CTCCGTGGCCTTAGCTGTG と B2M qR の TTTGGAGTACGCTGGATAGCCT。ZIKV と B2M 遺伝子の各サンプルの 3 つの技術的な複製を配置することを確認します。RT-PCR のセットアップを簡単に説明します。
-
RT-PCR セットアップ
- RNA の ng サンプルごとに 100 を使用。
- 各反作用のための特定の遺伝子のプライマーは前方および逆の 10 μ M 株から 1 μ L を追加します。
- 逆転写酵素ミックス サンプルごとの 0.25 μ L を追加します。
- 個々 の反応、SYBR グリーン ミックスの 12.5 μ L を追加します。
- 水の最大 25 μ L を追加します。96 ウェル PCR プレートに RNA、分注を除くすべての上記の試薬の混合し、RNA、最後のマスターを確認します。
- 透明粘着テープでプレートをシールします。
- 試薬を混ぜて 1 分 1,000 x gでプレートを遠心します。
- QPCR 機に皿を置きます。
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RT-PCR のプロファイル
注:の表 1に示すように RT-PCR プロファイルを使用します。- 相補的 DNA (cDNA) の合成を確保するために 50 ° C 10 分でサンプルをインキュベートします。
- CDNA 合成後 95 ° C、5 分で Taq DNA ポリメラーゼをアクティブにします。
- 10 s およびプライマーアニー リングおよび 30 の 60 ° C で拡張のため変性 95 ° c の 40 のサイクルを実行 s。
- 最後に追加融解曲線ステップ (65 ° C) を置きます。
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データ分析
- 1.6 以上の場合 1 つだけ増幅し、増幅値の存在を確認する特定の遺伝子のすべてのサンプルの単一のピークを理想的には、表示する qPCR マシン、algori で実行するために使用プログラムでメルト曲線] タブをクリックして融解曲線を監視します。トリハロ メタンは、(増幅値は qPCR マシンが使用するアルゴリズムによって異なります) 100% の増幅値として 2 を考慮します。必ず手順と保持時間 10 の最小の 0.5 の ° C 温度単位を使用して最適な結果を得るのため、融解曲線のプロトコルで s。
- 単一の増幅と良い増幅値があることを確認して、最初各サンプルの定量サイクル (Ct/Cq 値) を取得し、Excel にエクスポートする定量化データ] タブをクリックします。
- スプレッドシートを使用して、Ct 値を使用して各サンプルの平均値を計算します。次に、数式をクリックし、平均を選択します。各サンプル (複製) の平均 CT 値は、さらなる分析のため使用されます。
- 次に、計算式の ΔCt を使用して ΔCt = ターゲット遺伝子の Ct を平均 - 制御遺伝子の Ct の平均 (この場合は ΔCt = ZIKV 遺伝子の Ct を平均 - B2M 遺伝子の Ct の平均)。
- データの正規化に ΔΔCt を計算する (この場合は ΔΔCt = ΔCt ZIKV サンプル - B2M サンプル)。
- 倍は単一 ΔΔCt 正規化値ごとに数式の 2^-(ΔΔCt) を入力することによって遺伝子発現を増加を計算します。以前研究9,10で説明したよう、統計テストを実行する倍の増加の結果を取得できます。
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Representative Results
図 1、ADE プロトコルの実施に関わるすべての手順のステップバイ ステップの図式図があります。DENV に ADE の ZIKV の既存の免疫のための全体の手順を示す模式図です。図 2は、どのように人間の血清サンプルは、3 つのグループに分類された: DENV 感染確認サンプル DENV 感染グループと呼ばれます、DENV 抗体確認サンプルは DENV 公開グループと呼ばれる、健康なDENV 中和抗体や RNA なしで個人の血清は、健康コントロール (HC) グループと呼ばれます。(図 2)。
すべての血清 ZIKV 錯体を作るため、マクロファージ細胞に感染する使用されました。感染後 48 時間後、RNA 抽出し、qRT PCR を受けます。図 3に代表的な実験は、DENV 血清型 1 に 4 抗体を含む血清のほとんどがさまざまなレベルでの ZIKV のレプリケーションを強化することを示しています。ZIKV 抗体の最高の増加は血清型 1 および ZIKV の比較的少ないの誘導を示した 3 に比べて DENV 血清型 2 および 4 抗体を含む血清で治療マクロファージで発見されました。
図 1: ADE プロトコルの図式図。ステップバイ ステップの図は、一連のプロトコルに関連するすべての手順を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 実験手順の概略図。ジカと 3 種類の血清培養。グループ DENV RNA 肯定的な (DENV 感染) サンプルから成っています。グループ II DENV 抗体陽性検体の (DENV 公開) 成っていた。III 群は DENV RNA や抗体 (健常者) のサンプルから成っています。ウイルス血清の混合物は、ヒトのマクロファージや定量化感染症に追加されました。この図は、フェルナンドロンドーニョ レンテリアら8から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: DENV 免疫抗血清を高める主なヒトのマクロファージにおける ZIKV 感染。DENV 抗体を含む血清 (DENV1 4 血清型の確認、コルは血清型不明) 健常者からあった希釈 1:10 1: 10,000 にや ZIKV と孵化させます。血清は、表 1のとおりです。プライマリ分離人間の大食細胞は、単独で ZIKV もしくは ZIKV 血清混合物に感染していた。(、) DENV1 抗体を含む血清。DENV2 (b) 抗体を含む血清。(c) DENV3 抗体を含む血清。(d) DENV4 抗体を含む血清。(e) DENV 抗体血清コロンビア各 1。コロンビア個々 2 (f) DENV 抗体血清。感染症は、感染後 48 時間で qRT PCR 分析により測定しました。技術と生物の複製は、3 通で行われました。データをプールし、誤差範囲は標準偏差を示します。学生のt-テストと分散分析は統計分析のために使用されました。P 0.001 <。この図は、フェルナンドロンドーニョ レンテリアら8から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
表 1: qRT PCR の熱プロファイル。
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Discussion
その他 DENV 血清型の ADE につながる DENV 抗体の交差反応性は、効果的なワクチン11の開発を阻害しています。ZIKV は同じ、フラビに属し、他の発現、特に DENV12とかなり相同性を持っています。ZIKV、DENV 中和抗体の主なターゲットは、2 つのウイルス13,14,15間非常に高い構造と第四紀のシーケンス相同を共有するエンベロープ蛋白質です。DENV または ZIKV のいずれかに事前の免疫が他ウイルス8,16の感染を高めることができることが実証されています。
ADE 実験、プラクの試金17からのウイルス感染性を定量化するための異なる手法の数は、細胞内のウイルス抗原染色抗体を用いた蛍光染料とフローサイトメトリー18 共役 ,19。これらのアッセイ時間がかかり、複数のサンプルの高スループット容易に適応しない同時に。重要なは、研究のほとんどは DENV 特異的モノクローナル抗体を使用して ZIKV への影響をチェックし、セルの行だけ20,21で ADE。このプロトコルでは我々 が主な人の免疫細胞を用いて患者血清中の ZIKV レプリケーションに及ぼす影響を検討するとともに、DENV に対する中和能力がある前免疫血清サンプルを使用するシンプルで効果的な手法について述べるqRT PCR。このメソッドは、堅牢な関連性の高い、3 日間で完了することができます。本稿では代表的な結果は、ZIKV の応用を表示、このプロトコルが簡単に変更、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、西ナイル ウイルスのような他の発現に使用します。検討する 1 つの重要な要因は、このプロトコルに成長した、未熟のウイルス RNA 間の区別に制限があることです。
プロトコルの中に RNase フリーの環境を確保、RNA の抽出を実行するときに慎重に検討を与えることが重要ですすべての RNA をステップの処理中に。さらに、ウイルス株は 37 ° c に 1-2 分の水浴で解凍し、すぐに氷を入れてください。ただし、ウイルスは、感染力を失うことができる限り、その後、それの氷の上保持されません必要があります。
以前の結果は、このプロトコルが、非常便利で多数のサンプルの処理に適応し、他の方法より比較的短時間で完了することができますを示しています。このプロトコルには、将来の ADE 研究有用な試金として使用する可能性があります。
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Disclosures
著者申告するものがあります。
Acknowledgments
この作品は、1R21AI129881-01 (T.M.C.) へ、国立新興感染症研究所とボストン大学医学部からスタートアップ資金によって支えられた寛大。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Bovine Serum | GEMINI | 100-106 | |
| iCycler | BioRad | 785BR02188 | Model No. CFX96 Optics Module |
| Microfuge 18 Centrifuge | Beckman Coulter | 367160 | |
| Nanodrop-1000 | Thermoscientific | 1072 | |
| Quantifast SYBR-One step RT-PCR kit | Qiagen | 204154 | Used for 1 step RT-qPCR |
| RNeasy RNA Isolation Kit | Qiagen | 74106 | Used for RNA extraction |
| RPMI-medium | Gibco | 11875093 |
References
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