Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

प्राथमिक मानव कोशिकाओं में Zika विषाणु के एंटीबॉडी-आश्रित संवर्धन की ठहराव

doi: 10.3791/58691 Published: January 18, 2019

Summary

हम मानव सीरम, प्राथमिक मानव कोशिकाओं का उपयोग करके Zika वायरस के संक्रमण पर डेंगू वायरस के खिलाफ पूर्व मौजूदा उन्मुक्ति के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक विधि का वर्णन है, और मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया द्वारा संक्रमण ठहराव.

Abstract

flavivirus Zika और स्नायविक जटिलताओं के हाल ही में उद्भव, जैसे Guillain-Barré सिंड्रोम और शिशुओं में microcephaly, गंभीर सार्वजनिक सुरक्षा चिंताओं लाया है । जोखिम वाले कारकों में, एंटीबॉडी-निर्भर वृद्धि (ADE) सबसे महत्वपूर्ण खतरा बन गया है, के रूप में हाल ही में पुनः Zika वायरस के उद्भव (ZIKV) मुख्य रूप से क्षेत्रों में जहां जनसंख्या उजागर किया गया है और पूर्व के एक राज्य में है प्रतिरक्षा अंय बारीकी से संबंधित flaviviruses, खासकर डेंगू वायरस (देंव) । यहां, हम प्राथमिक मानव कोशिकाओं या सेल लाइनों में ZIKV संक्रमण पर देंव के खिलाफ मानव सीरम एंटीबॉडी के प्रभाव को बढ़ाता है के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन ।

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

मच्छरों जनित वायरल रोगों के बीच, Zika संक्रमण सबसे नैदानिक महत्वपूर्ण1में से एक है । संक्रमण flavivirus ZIKV के कारण होता है, जो ज्यादातर मामलों में, एडीज aegypti का प्राथमिक वेक्टर1,2के रूप में उपयोग करता है । हालांकि, वहां अध्ययन है कि कुछ ZIKV प्रकोपों में एक प्राथमिक सदिश के रूप में एडीज albopictus की सूचना दी है3। हालांकि संक्रमण कई मामलों में स्पर्शोन्मुख है, सबसे आम लक्षण बुखार, सिरदर्द, और मांसपेशियों में दर्द2हैं । वहां कोई इलाज या ZIKV संक्रमण के लिए उपलब्ध वैक्सीन और उपचार उपलब्ध है ज्यादातर सहायक है । दक्षिण अमेरिका में ZIKV के हाल के प्रकोप रोग के गंभीर मामलों के लिए नेतृत्व किया और एक लगभग 20 microcephaly2नाम भ्रूण में neurodevelopmental विकार में वृद्धि गुना । के रूप में दक्षिण अमेरिका के एक ऐसे देंव और पश्चिम नील नदी वायरस के रूप में कई arboviruses के लिए स्थानिकमारी वाले क्षेत्र है, यह जांचना महत्वपूर्ण है कि पहले अंय flavivirus (es) के लिए प्रतिरक्षा ZIKV संक्रमण और रोग की गंभीरता में एक भूमिका निभाता है ।

उम्र के दौरान, वायरस मेजबान सेल मशीनरी पर लेने के लिए और एंटीवायरल प्रतिक्रिया को दबाने के क्रम में infectivity के अपने मौका बढ़ाने के लिए विभिन्न रणनीतियों विकसित किया है. सभी का सबसे आकर्षक में से एक की मेजबानी पूर्व वायरस द्वारा प्रतिरक्षा एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए घटना ADE4के साथ उनकी प्रतिकृति बढ़ाने है । देंव के सभी चार serotypes भर ADE अच्छी तरह से अध्ययन किया गया है और वायरल titers और रोग के परिणाम को बढ़ाने के लिए प्रदर्शन5,6,7. में एक पिछले इन विट्रो अध्ययन में, हम ZIKV प्रतिकृति प्राथमिक मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं8में पूर्व मौजूदा देंव उन्मुक्ति की वजह से महत्वपूर्ण वृद्धि दिखाई है । हम भी प्रदर्शन में एक प्रासंगिक इन विट्रो विधि प्राथमिक कोशिकाओं में ZIKV प्रतिकृति को बढ़ाने के लिए देंव पूर्व मौजूदा एंटीबॉडी की क्षमता यों तो ।

प्रोटोकॉल है कि हम विकसित किया है मानव सीरम नमूने है कि TCID में देंव बेअसर के लिए परीक्षण कर रहे है का उपयोग करता है-५० या पट्टिका कमी बेअसर परीक्षण (PRNT) परख, जैविक रूप से प्रासंगिक कोशिकाओं या कोशिकाओं है कि ZIKV संक्रमित कर सकते है ऊतकों से व्युत्पंन में ZIKV के साथ ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

इस अध्ययन में प्रयुक्त सीरम नमूने कोलंबिया से एक पलटन के मानव प्रतिभागियों से प्राप्त किया गया । नमूना संग्रह आंतरिक समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) द्वारा Universidad de पाम्प्लोना (कोलंबिया, दक्षिण अमेरिका) और लॉस Potios अस्पताल8में अनुमोदित किया गया था । नमूने गुमनाम रूप से उपलब्ध कराए गए थे और जांचकर्ताओं को मरीज की जानकारी तक नहीं पहुंची थी । देंव सीरोटाइप के लिए सीरम के नमूनों को चेक किया गया । नमूनों में आगे इन विट्रो में देंव संक्रमण को बेअसर करने की पुष्टि की गई. नियंत्रण के लिए, संयुक्त राज्य अमेरिका से स्वस्थ व्यक्तियों (एचसी) से सीरम नमूने इस्तेमाल किया गया ।

नोट: इस प्रोटोकॉल Fcγ रिसेप्टर व्यक्त किसी भी मानव कोशिका प्रकार में ZIKV प्रतिकृति के ADE की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । प्रोटोकॉल तीन भागों (चित्रा 1) के होते हैं ।

1. सेल सीडिंग और संक्रमण सेटअप

नोट: इस विशेष अध्ययन के लिए मानव प्राथमिक मैक्रोफेज या U937 myelomonocytic सेल लाइन (ATCC-CRL-१५९३.२) का उपयोग किया गया । कोशिकाओं को RPMI विकास में बनाए रखा गया था 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक 5% कार्बन डाइऑक्साइड (2CO) के साथ एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन पर । सभी कदम एक सुरक्षा स्तर 2 में किया गया (बीएसएल-2) बाँझ परिस्थितियों में सुरक्षा कैबिनेट ।

  1. बीज 3 x 104 प्रति एक बाँझ फ्लैट-नीचे ९६-अच्छी तरह से प्लेट में १०० µ एल माध्यम के साथ और 5% CO2के साथ ३७ ° c मशीन में रखें ।
  2. कोशिकाओं के बीज बोने के बाद, गल सीरम नमूने कमरे के तापमान पर और 10 गुना सीरियल कमजोर पड़ने (यानी, 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000) सीरम मुक्त माध्यम में नमूनों को मिलाकर बनाते हैं । एक बाँझ ९६-अच्छी तरह से थाली में कमजोर पड़ने Aliquot. एक अतिरिक्त नियंत्रण के रूप में सीरम के बिना वायरस का उपयोग करें ।
  3. गल 1-2 मिनट के लिए एक पानी के स्नान में ३७ ° c पर ZIKV शेयर और जल्दी से भविष्य के उपयोग के लिए उंहें बर्फ हस्तांतरण ।
  4. सीरम aliquots के लिए संक्रमण की ०.१ गुणा (MOI) ZIKV तनाव MR766 के समतुल्य राशि जोड़ें ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि कमजोर पड़ने का पहलू स्थिर रहता है और कुल मात्रा ~ २०० µ l है; कि प्रत्येक उपचार के triplicates के लिए पर्याप्त है । बहाव विश्लेषण के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग करने के लिए तीन कुओं को संक्रमित रखें ।
  5. देंव एंटीबॉडी Zika virions के साथ परिसरों के रूप में अनुमति देने के लिए 1 ज के लिए 5% सह2 के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में जोड़ा वायरस के साथ सीरम कमजोर पड़ने की मशीन (सुविधा के लिए, इसके बाद के रूप में संदर्भित करने के लिए "प्रतिरक्षा परिसरों").
  6. महाप्राण ने फ्लैट में सीड की गई कोशिकाओं से मीडिया को नीचे की ओर ९६-वेल प्लेट में ही लगा दिया. बाँझ 1x फॉस्फेट-बफर खारा (1x पंजाब) के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
  7. एक अच्छी तरह से करने के लिए प्रतिरक्षा परिसरों के ५० µ एल जोड़ें और उंहें 5% 2 एच के लिए2 सह के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में गर्मी ।
  8. मशीन के 2 एच के बाद, महाप्राण कोशिकाओं से प्रतिरक्षा परिसरों से युक्त मीडिया, एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर, और धो 1x पंजाबियों के साथ 2x कोशिकाओं को पूरी तरह से प्रतिरक्षा परिसरों और किसी भी संलग्न virions हटा दें ।
  9. ताजा पूरा मीडिया के १०० µ एल जोड़ें एक अच्छी तरह से 10% FBS के साथ पूरक और 5% सह के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में कोशिकाओं गर्मी ४८ एच के लिए2

2. आरएनए निष्कर्षण

  1. मशीन से ९६ अच्छी तरह से थाली निकालें और यह सुरक्षा कैबिनेट के लिए स्थानांतरण ।
  2. मीडिया महाप्राण, 1x पंजाबियों के साथ 2x कोशिकाओं धो, और आरएनए निष्कर्षण करने के लिए आगे बढ़ना ।
    नोट: आरएनए पसंद के किसी भी विधि द्वारा निकाला जा सकता है ( सामग्री की तालिकाको देखें) ।
  3. 10% β-mercaptoethanol प्रति well के साथ कक्ष lysis बफ़र के २५० µ l जोड़ें । पिपेट बफर ऊपर और नीचे कम 5x पिपेट टिप के साथ कोशिकाओं scratching के साथ lysis प्रक्रिया को गति के साथ नीचे ।
  4. नए, लेबल, बाँझ १.५ मिलीलीटर ट्यूबों के लिए सेल lysates स्थानांतरण ।
  5. ७०% इथेनॉल (२५० µ एल) की एक बराबर राशि जोड़ें । पिपेट ऊपर और नीचे 4x-5x जब तक मिश्रण स्पष्ट है ।
  6. मिश्रण स्थानांतरण (~ ५०० µ एल) 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूबों में सिलिका आधारित कॉलम लेबल करने के लिए और 30 एस के लिए १५,००० x g पर केंद्रापसारक के माध्यम से प्रवाह त्यागें और एक ही संग्रह ट्यूबों में कॉलम रखना ।
  7. जोड़ें ७०० µ एल की धुलाई बफर 1 प्रत्येक स्तंभ के लिए और 30 एस के लिए १५,००० x g पर केंद्रापसारक के माध्यम से प्रवाह त्यागें और एक ही संग्रह ट्यूबों में कॉलम रखना ।
  8. जोड़ें ५०० µ एल धोने की बफर 2 प्रत्येक स्तंभ के लिए और 30 एस के लिए १५,००० x g पर केंद्रापसारक supernatant त्यागें । इस चरण 2x दोहराएं ।
  9. नए 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूबों के लिए कॉलम स्थानांतरण और 2 मिनट के लिए १५,००० x g पर केंद्रापसारक । सुनिश्चित करें कि सिलिका-आधारित कॉलम पूरी तरह से शुष्क हो और धो बफर 2 से कोई इथेनॉल छोड़ दिया है ।
  10. 2 मिलीलीटर ट्यूबों त्यागें और नए, बाँझ, लेबल, १.५ मिलीलीटर वसूली ट्यूबों में कॉलम जगह है ।
  11. जोड़ें गरम (४२ ° c) RNase के 30 µ एल-प्रत्येक कॉलम के केंद्र में मुफ्त पानी और 1 मिनट के लिए १५,००० x g पर केंद्रापसारक ।
  12. eluted आरएनए पुनर्प्राप्त करें और नमूने को बढ़ाता है, एक २६० एनएम तरंग दैर्ध्य पर एक spectrophotometer का उपयोग कर ।
    नोट: आदर्श रूप में, २६० एनएम और २८० एनएम पर अवशोषक मूल्यों के बीच अनुपात की गणना करके आरएनए की पवित्रता का निर्धारण । शुद्ध आरएनए के 260/280 अनुपात १.८-२.० के बीच आदर्श है ।

3. मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन

नोट: मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qRT-पीसीआर) किसी भी SYBR ग्रीन मिश्रण है जो आम तौर पर SYBR ग्रीन मैं डाई, Taq डीएनए पोलीमरेज़, deoxynucleotide triphosphates (dNTPs), और एक निष्क्रिय डाई से बना है का उपयोग करके बाहर किया जा सकता है । किसी भी qPCR मशीन SYBR हरी का पता लगाने में सक्षम प्रतिक्रिया करने के लिए और डेटा प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस प्रयोग के लिए, एक एक कदम आरटी पीसीआर किट जो SYBR ग्रीन मैं, ROX डाई, Taq डीएनए पोलीमरेज़, dNTPs, और रिवर्स transcriptase का एक अतिरिक्त मिश्रण ( सामग्री की तालिकाको देखें) का एक कॉकटेल था इस्तेमाल किया गया था लिफाफा क्षेत्र के खिलाफ बनाया गया है और इस अध्ययन में इस्तेमाल किया ZIKV जीनोमिक स्तर यों तो qF-qR के लिए ZIKV-CCACTAACGTTCTTTTGCAGACAT और ZIKV के लिए CCGCTGCCCAACACAAG है प्राइमरों । एक नियंत्रण के रूप में, मानव β-2-microglobulin (B2M) मापा और ZIKV (गृह व्यवस्था जीन) की अभिव्यक्ति को सामान्य करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. इस अध्ययन में प्रयुक्त B2M जीन अभिव्यक्ति को मात्रा देने के लिए प्राइमरी जुगाड़ TTTGGAGTACGCTGGATAGCCT-qR के लिए B2M-qF और B2M के लिए CTCCGTGGCCTTAGCTGTG हैं. दोनों ZIKV और B2M जीन के लिए प्रत्येक नमूने के लिए तीन तकनीकी प्रतिकृति डाल करने के लिए सुनिश्चित करें । आरटी-पीसीआर का सेटअप संक्षेप में नीचे बताया गया है ।

  1. RT-पीसीआर सेटअप
    1. नमूना प्रति आरएनए के १०० एनजी का उपयोग करें ।
    2. प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए एक विशेष जीन के दोनों आगे और रिवर्स प्राइमरों के 10 µ एम स्टॉक्स से 1 µ एल जोड़ें ।
    3. नमूना प्रति रिवर्स transcriptase मिश्रण के ०.२५ µ एल जोड़ें ।
    4. प्रत्येक व्यक्ति की प्रतिक्रिया के लिए, SYBR ग्रीन मिक्स के १२.५ µ एल जोड़ें ।
    5. पानी के 25 µ l तक डालें । आरएनए के अलावा उपर्युक्त सभी रिएजेंट के एक मास्टर मिश्रण बनाओ, यह ९६-well पीसीआर प्लेट में aliquot, और आरएनए पिछले जोड़ें.
    6. पारदर्शी चिपकने वाला टेप के साथ प्लेट सील ।
    7. 1 मिनट के लिए १,००० x g पर प्लेट केंद्रापसारक मिश्रण करने के लिए एजेंट ।
    8. qPCR मशीन में प्लेट लगा दें ।
  2. RT-पीसीआर प्रोफाइल
    नोट: तालिका 1में दिखाए गए RT-पीसीआर प्रोफ़ाइल का उपयोग करें.
    1. पूरक डीएनए (सीडीएनए) के संश्लेषण को सुनिश्चित करने के क्रम में 10 मिनट के लिए ५० ° c पर नमूनों की मशीन.
    2. सीडीएनए संश्लेषण के बाद, 5 मिनट के लिए ९५ ° c पर Taq डीएनए पोलीमरेज़ को सक्रिय करें ।
    3. 30 एस के लिए ६० ° c पर 10 एस और प्राइमरी एनीलिंग और विस्तार के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस पर विकार के ४० चक्र प्रदर्शन ।
    4. अंत में अतिरिक्त पिघल वक्र कदम (65 डिग्री सेल्सियस) रखो ।
  3. डेटा विश्लेषण
    1. मॉनिटर पिघल वक्र पर क्लिक करके qPCR मशीन, जो, आदर्श, एक विशेष जीन के लिए सभी नमूनों में एक ही चोटी के लिए केवल एक amplicon और एक प्रवर्धन मूल्य से अधिक की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए चला करते थे चलाने के लिए प्रयोग किया जाता है १.६ अगर algori thm १००% प्रवर्धन मूल्य के रूप में 2 समझता है (प्रवर्धन मूल्य qPCR मशीन द्वारा इस्तेमाल किया एल्गोरिथ्म के अनुसार बदलता रहता है) । कदम के बीच ०.५ ° c तापमान में वृद्धि का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें और 10 एस की एक ंयूनतम होल्डिंग समय पिघल वक्र प्रोटोकॉल में, इष्टतम परिणामों के लिए ।
    2. बनाने के बाद यकीन है कि वहां एक एकल amplicon और अच्छा प्रवर्धन मूल्य रहे हैं, पहले ठहराव डेटा टैब पर क्लिक करने के लिए एक मात्रात्मक चक्र (सीटी/सीक्यू मूल्य) प्रत्येक नमूने और माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल में निर्यात ।
    3. किसी स्प्रेडशीट का उपयोग करके, सीटी मान का उपयोग करके प्रत्येक नमूने के औसत की गणना करें. इसके बाद, सूत्रों में क्लिक करें और औसत चुनें । प्रत्येक नमूने के औसत सीटी मूल्यों (दोहराने) आगे विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है ।
    4. अगला, सूत्र का उपयोग कर ΔCt की गणना ΔCt = लक्ष्य जीन की औसत सीटी-नियंत्रण जीन की औसत सीटी (इस मामले में, ΔCt = औसत सीटी के ZIKV जीन-B2M जीन की औसत सीटी).
    5. डेटा को सामान्य करने के लिए ΔΔCt परिकलित करें (इस स्थिति में, ΔΔCt = ΔCt ZIKV नमूने-B2M नमूने) ।
    6. हर एक ΔΔCt सामान्यीकृत मूल्य के लिए फार्मूला 2 ^-(ΔΔCt) टाइप करके गुना वृद्धि जीन अभिव्यक्ति की गणना । सांख्यिकीय परीक्षण करने के लिए गुना वृद्धि के परिणाम के रूप में पहले अध्ययन9,10में वर्णित प्राप्त किया जा सकता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

चित्र 1में, ADE प्रोटोकॉल को पूरा करने के लिए शामिल सभी चरणों का एक चरण दर चरण diagrammatic चित्रण है । यह एक योजनाबद्ध देंव करने के लिए पूर्व मौजूदा उन्मुक्ति के कारण ZIKV के ADE की पूरी प्रक्रिया दिखा आरेख है. चित्रा 2 से पता चलता है कैसे मानव सीरम नमूने तीन अलग समूहों में वर्गीकृत किया गया: देंव संक्रमण-पुष्टि नमूनों को देंव-संक्रमित समूह के रूप में संदर्भित कर रहे हैं, देंव एंटीबॉडी-पुष्टि नमूनों देंव उजागर समूह के रूप में संदर्भित कर रहे हैं, और स्वस्थ कोई देंव-बेअसर एंटीबॉडी या आरएनए के साथ ' व्यक्तियों सीरा स्वस्थ नियंत्रण (एचसी) समूह कहा जाता है । (चित्रा 2) ।

सभी सीरम नमूनों को ZIKV के साथ कॉम्प्लेक्स बनाने की अनुमति दी गई थी और फिर मैक्रोफेज कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । ४८ ज postinfection के बाद, आरएनए निकाला गया था और qRT-पीसीआर के अधीन । चित्र 3 में प्रतिनिधि प्रयोग दर्शाता है कि देंव सीरोटाइप 1 से 4 एंटीबॉडी युक्त सीरा के अधिकांश विभिंन स्तरों पर ZIKV प्रतिकृति बढ़ाने में सक्षम थे । ZIKV titers में सबसे अधिक वृद्धि सीरोटाइप 1 और 3, जो सीरोटाइप की एक अपेक्षाकृत कम प्रेरण दिखाया की तुलना में देंव ZIKV 2 और 4 एंटीबॉडी युक्त सीरा के साथ इलाज मैक्रोफेज में पाया गया ।

Figure 1
चित्रा 1 : ADE प्रोटोकॉल का चित्रण Diagrammatic । चरण-दर-चरण उदाहरण पूरे प्रोटोकॉल में शामिल सभी चरणों को दिखाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : प्रयोगात्मक प्रक्रिया की योजनाबद्ध । सीरा के तीन प्रकार Zika वायरस के साथ मशीन थे । समूह मैं देंव-आरएनए सकारात्मक (देंव संक्रमित) के नमूने शामिल हैं । समूह द्वितीय देंव-एंटीबॉडी सकारात्मक (देंव उजागर) नमूने शामिल हैं । समूह III कोई देंव आरएनए या एंटीबॉडी (स्वस्थ नियंत्रण) के साथ नमूनों के शामिल थे. वायरस-सीरा मिक्सचर को ह्यूमन मैक्रोफेज और इंफेक्शन quantified से जोड़ा गया था । यह आंकड़ा Londono-Renteria एट अल.8से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : देंव इम्यून सीरा प्राइमरी ह्यूमन मैक्रोफेज में ZIKV इंफेक्शन को बढ़ाता है । मानव देंव एंटीबॉडी युक्त सीरा (DENV1-4 सीरोटाइप पुष्टि कर रहे हैं, कर्नल अज्ञात सीरोटाइप रहे हैं) या स्वस्थ नियंत्रण से 1 को 1:10 पतला: 10000 थे और ZIKV के साथ मशीन । सीरा तालिका 1में बताया गया है । प्राथमिक पृथक मानव मैक्रोफेज या तो अकेले ZIKV के साथ या ZIKV-सीरा मिश्रण के साथ संक्रमित थे । () DENV1 एंटीबॉडी-युक्त सीरा. () DENV2 एंटीबॉडी-युक्त सीरा । () DENV3 एंटीबॉडी-युक्त सीरा । () DENV4 एंटीबॉडी-युक्त सीरा. () देंव-एंटीबॉडी का सीरा कोलंबियाई वैयक्तिक १ से. () देंव-एंटीबॉडी सीरा कोलंबिया व्यक्तिगत 2 से । ४८ ज postinfection में qRT-पीसीआर एनालिसिस द्वारा संक्रमण को मापा गया । तकनीकी और जैविक प्रतिकृति तपसिल में किया गया । डेटा pooled हैं, और त्रुटि पट्टियां मानक विचलन इंगित करते हैं । सांख्यिकी विश्लेषण के लिए छात्र का टी-टेस्ट और ANOVA उपयोग किया गया । * P < ०.००१. यह आंकड़ा Londono-Renteria एट अल.8से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Table 1
तालिका 1: qRT-पीसीआर के थर्मल प्रोफाइल ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

पार देंव एंटीबॉडी के अंय देंव serotypes के ADE के लिए अग्रणी की जेट एक प्रभावी वैक्सीन11के विकास में बाधा है । ZIKV एक ही परिवार के अंतर्गत आता है, Flaviviridae, और अंय flaviviruses के साथ एक काफी समरूपता है, विशेष रूप से12देंव । दोनों ZIKV और देंव के लिए एंटीबॉडी को निष्क्रिय करने का मुख्य लक्ष्य लिफाफा प्रोटीन है, जो दो वायरस13,14,15के बीच एक बहुत ही उच्च संरचनात्मक और चतुर्धातुक अनुक्रम समरूपता के शेयरों है । यह प्रदर्शित किया गया है कि पूर्व प्रतिरक्षा या तो देंव या ZIKV अंय वायरस8,16के संक्रमण को बढ़ा सकते हैं ।

वहां विभिंन ADE प्रयोगों में वायरल infectivity मात्राएं, पट्टिका परख17से लेकर, intracellular वायरल प्रतिजन फ्लोरोसेंट रंजकता के साथ एंटीबॉडी संयुग्मित का उपयोग कर धुंधला, और प्रवाह cytometry 18 कार्यरत तरीकों की एक संख्या है ,19. इन परख समय लेने वाली है और एक ही समय में कई नमूनों के उच्च प्रवाह के लिए आसानी से अनुकूलनीय नहीं हैं । महत्वपूर्ण बात, अध्ययन के अधिकांश देंव-विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया ZIKV पर अपने प्रभाव की जांच और सेल लाइनों में ADE केवल20,21की जांच की । इस प्रोटोकॉल में, हम एक सरल अभी तक प्रभावी विधि का वर्णन जिसमें हम मानव पूर्व प्रतिरक्षा सीरम नमूने है कि देंव के खिलाफ एक बेअसर करने की क्षमता है, प्राथमिक मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ, ZIKV प्रतिकृति पर रोगी सीरम के प्रभाव को रोजगार से जांच qRT-पीसीआर । इस विधि मजबूत, प्रासंगिक है, और तीन दिनों में पूरा किया जा सकता है । हालांकि इस पांडुलिपि में प्रतिनिधि परिणाम ZIKV के लिए अपने आवेदन दिखाने के लिए, इस प्रोटोकॉल को आसानी से संशोधित किया जा सकता है और अंय flaviviruses के लिए इस्तेमाल किया, पीले बुखार वायरस, डेंगू वायरस, और पश्चिम नील नदी वायरस की तरह । एक महत्वपूर्ण पहलू पर विचार करने के लिए है कि इस प्रोटोकॉल परिपक्व और अपरिपक्व वायरल आरएनए के बीच भेद में एक सीमा है ।

प्रोटोकॉल के दौरान, आरएनए निकालने का प्रदर्शन करते समय सावधान विचार देने के लिए महत्वपूर्ण है, यह सुनिश्चित करना कि सभी आरएनए हैंडलिंग चरण के दौरान पर्यावरण RNase-मुक्त है । इसके अलावा, वायरल स्टॉक 1-2 मिनट के लिए एक जल स्नान में ३७ डिग्री सेल्सियस पर गल जाना चाहिए और तुरंत बर्फ पर डाल दिया । हालांकि, वायरस लंबे समय के लिए बर्फ पर नहीं रखा जाना चाहिए, तो, यह अपनी infectivity खो सकते हैं ।

पिछले परिणामों का प्रदर्शन किया है कि इस प्रोटोकॉल अत्यधिक सुविधाजनक और अनुकूलनीय नमूनों की एक बड़ी संख्या को संभालने के लिए और अंय तरीकों की तुलना में अपेक्षाकृत कम समय में पूरा किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल भविष्य ADE अध्ययन के लिए एक उपयोगी परख के रूप में इस्तेमाल किया जा करने की क्षमता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों की घोषणा करने के लिए कुछ नहीं है.

Acknowledgments

यह काम उदारता से 1R21AI129881-01 (T.M.C.), शुरू से धन राष्ट्रीय उभरते संक्रामक रोगों प्रयोगशालाओं, और बोस्टन चिकित्सा विश्वविद्यालय के स्कूल द्वारा समर्थित किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fetal Bovine Serum  GEMINI 100-106
iCycler  BioRad 785BR02188 Model No. CFX96 Optics Module
Microfuge 18 Centrifuge Beckman Coulter  367160
Nanodrop-1000 Thermoscientific  1072
Quantifast SYBR-One step RT-PCR kit  Qiagen  204154 Used for 1 step RT-qPCR
RNeasy RNA Isolation Kit  Qiagen  74106 Used for RNA extraction
RPMI-medium  Gibco 11875093

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hayes, E. B. Zika virus outside Africa. Emerging Infectious Diseases. 15, 1347-1350 (2009).
  2. Grard, G., et al. Zika virus in Gabon (Central Africa) - 2007: a new threat from Aedes albopictus. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8, (2), 2681 (2014).
  3. Fauci, A. S., Morens, D. M. Zika Virus in the Americas--Yet Another Arbovirus Threat. New England Journal of Medicine. 374, (7), 601-604 (2016).
  4. Hawkes, R. A. Enhancement of the Infectivity of Arboviruses by Specific Antisera Produced in Domestic Fowls. Australian Journal of Experimental Biology and Medical Science. 42, 465-482 (1964).
  5. Musso, D., Gubler, D. J. Zika Virus. Clinical Microbiology Reviews. 29, (3), 487-524 (2016).
  6. Vaughn, D. W., et al. Dengue viremia titer, antibody response pattern, and virus serotype correlate with disease severity. The Journal of Infectious Diseases. 181, (1), 2-9 (2000).
  7. Khandia, R., et al. Modulation of Dengue/Zika Virus Pathogenicity by Antibody-Dependent Enhancement and Strategies to Protect Against Enhancement in Zika Virus Infection. Frontiers of Immunology. 9, 597 (2018).
  8. Londono-Renteria, B., et al. A relevant in vitro human model for the study of Zika virus antibody-dependent enhancement. Journal of General Virology. 98, (7), 1702-1712 (2017).
  9. Ganger, M. T., Dietz, G. D., Ewing, S. J. A common base method for analysis of qPCR data and the application of simple blocking in qPCR experiments. BMC Bioinformatics. 18, (1), 534 (2017).
  10. Renn, L. A., et al. High-throughput quantitative real-time RT-PCR assay for determining expression profiles of types I and III interferon subtypes. Journal of Visualized Experiments. (97), e52650 (2015).
  11. McArthur, M. A., et al. Dengue vaccines: recent developments, ongoing challenges and current candidates. Expert Review of Vaccines. 12, (8), 933-953 (2013).
  12. Priyamvada, L., et al. Humoral cross-reactivity between Zika and dengue viruses: implications for protection and pathology. Emerging Microbes and Infections. 6, (5), 33 (2017).
  13. Dai, L., et al. Molecular basis of antibody-mediated neutralization and protection against flavivirus. IUBMB Life. 68, (10), 783-791 (2016).
  14. Dai, L., et al. Structures of the Zika Virus Envelope Protein and Its Complex with a Flavivirus Broadly Protective Antibody. Cell Host & Microbe. 19, (5), 696-704 (2016).
  15. Sirohi, D., et al. The 3.8 A resolution cryo-EM structure of Zika virus. Science. 352, (6284), 467-470 (2016).
  16. George, J., et al. Prior Exposure to Zika Virus Significantly Enhances Peak Dengue-2 Viremia in Rhesus Macaques. Scientific Reports. 7, (1), 10498 (2017).
  17. Morens, D. M., Halstead, S. B. Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies. Journal of General Virology. 71, Pt 12 2909-2914 (1990).
  18. Dejnirattisai, W., et al. Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans. Science. 328, (5979), 745-748 (2010).
  19. Priyamvada, L., et al. Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (28), 7852-7857 (2016).
  20. Charles, A. S., Christofferson, R. C. Utility of a Dengue-Derived Monoclonal Antibody to Enhance Zika Infection In Vitro. PLoS Currents. 8, (2016).
  21. Swanstrom, J. A., et al. Dengue Virus Envelope Dimer Epitope Monoclonal Antibodies Isolated from Dengue Patients Are Protective against Zika Virus. MBio. 7, (4), (2016).
प्राथमिक मानव कोशिकाओं में Zika विषाणु के एंटीबॉडी-आश्रित संवर्धन की ठहराव
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Asad, S., Feitosa-Suntheimer, F., Gold, A., Londono-Renteria, B., Colpitts, T. M. Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells. J. Vis. Exp. (143), e58691, doi:10.3791/58691 (2019).More

Asad, S., Feitosa-Suntheimer, F., Gold, A., Londono-Renteria, B., Colpitts, T. M. Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells. J. Vis. Exp. (143), e58691, doi:10.3791/58691 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter