Summary
우리는, 사용 하 여 인간의 혈 청 기본 인간 세포 감염 부 량 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응에 의해 Zika 바이러스 감염에 뎅기열 바이러스에 대 한 기존의 면역의 효과 평가 하는 방법을 설명 합니다.
Abstract
Flavivirus Zika Guillain-바레 증후군 등 유아, microcephaly 신경 합병증의 최근 출현은 심각한 공공 안전 문제를 가져왔다. 위험 요인 중 항 체 의존 향상 (ADE) 포즈 가장 중요 한 위협을 Zika 바이러스 (ZIKV)의 최근 재 출현은 주로 지역 인구는 다른 밀접 하 게 관련을 사전 면제의 상태 flaviviruses, 특히 뎅기열 바이러스 (DENV) 여기, 우리 ZIKV 감염 기본 인간 세포 또는 세포에 DENV에 대 한 인간의 혈 청 항 체의 효과 측정에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.
Introduction
모기 품 어진 바이러스 성 질병 가운데 Zika 감염1가장 임상적으로 중요 한 중 하나입니다. 감염은 flavivirus ZIKV는, 대부분의 경우에는 기본 벡터1,2 Aedes aegypti 사용에 의해 발생 합니다. 그러나, 일부 ZIKV 발생3주 벡터로 Aedes albopictus 보고 연구 있다. 많은 경우에서 무 증상 감염 이지만, 가장 일반적인 증상은 발열, 두통, 근육 통증2. 아무 치료 또는 백신 ZIKV 감염에 사용할 수 있는 이며 사용 가능한 치료는 주로 지원. 남아메리카에 있는 ZIKV의 최근 발발 microcephaly2라는 태아에 neurodevelopmental 장애에 약 20-fold 증가 질병의 심한 경우에 지도 했다. 남미 지역 여러 arboviruses DENV 및 웨스트 나 일 바이러스에 발병으로 조사 여부 다른 flavivirus(es)에 이전 면역 역할 ZIKV 감염 및 질병의 심각도에 결정적 이다.
연령대에 걸쳐 바이러스는 호스트 셀 기계를 정복 하 고 항 바이러스 반응 억제 infectivity의 그들의 기회를 증가 하는 다른 전략을 진화 했다. 모두의 가장 매혹적인 중 현상 에이드4그들의 복제를 향상 시키기 위해 바이러스에 의해 호스트 미리 면역 항 체의 사용 이다. DENV의 모든 4 개의 serotypes에 걸쳐 ADE 잘 공부 하 고 바이러스 titers 및 질병 결과5,,67증가 입증 되었습니다. 이전 체 외 연구에서 우리는 기존의 기본 인간의 면역 세포8DENV 면제 때문에 ZIKV 복제의 향상을 나타났습니다. 우리는 또한 관련 생체 외에서 메서드 기본 셀에 ZIKV 복제 향상 DENV 기존의 항 체의 기능을 정량화를 시연 했다.
우리가 개발한 프로토콜 DENV 중화 TCID 50에 대 한 테스트는 인간의 혈 청 샘플 사용 또는 플 라크 감소 중립화 시험 (PRNT) 분석 실험, 생물학으로 관련 된 셀 또는 셀 ZIKV 감염 시킬 수 있는 조직에서 파생 된 ZIKV 함께.
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Protocol
이 연구에 사용 된 혈 청 샘플은 콜롬비아에서 코 호트의 인간 참가자에서 얻은 했다. 샘플 컬렉션 대학 데 팜 플로 나 (콜롬비아, 남 아메리카)와 로스 Potios 병원8내부 검토 위원회 (IRB)에 의해 승인 되었다. 샘플 제공 익명으로 하 고 조사 했다 환자 정보에 액세스할 수 없습니다. 혈 청 샘플 DENV serotype 확인 했다. 샘플 추가 DENV 감염을 중화 확인 되었다 생체 외에서. 컨트롤에 대 한 미국에서 건강 한 개인 (HC)에서 혈 청 샘플 사용 되었다.
참고: 이 프로토콜은 Fcγ 수용 체를 표현 하는 모든 인간 세포 종류에 에이드의 ZIKV 복제 검사를 사용할 수 있습니다. 프로토콜의 구성 부품 (그림 1).
1. 셀 시드 및 감염 설치
참고: 이 특별 한 연구, 인간의 기본 세포 또는 U937 myelomonocytic 셀 라인 (ATCC-CRL-1593.2)에 대 한 사용 되었다. 셀 5% 이산화탄소 (CO2)와 함께 37 ° C 배양 기에서 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 보충 RPMI 성장 매체에 유지 되었다. 단계는 biosafety에 실시 했다 모든 멸 균 조건에서 2 (BSL-2) biosafety 내각 수준.
- 시드 3 x 104 셀 당 매체의 100 µ L 함께 메 마른 플랫 바닥 96 잘 접시에 고 5% CO2와 37 ° C 배양 기에 넣어.
- 셀을 뿌리기, 후 혈 청 샘플 실 온에서 해 동 하 고 10 직렬 희석 (즉, 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000) 혈 청 자유로운 매체에 샘플을 혼합 하 여. Aliquot 살 균 96 잘 접시로 희석. 혈 청 하지 않고 바이러스를 사용 하 여 추가 제어로.
- ZIKV 재고 1-2 분 동안 물 목욕에서 37 ° C에서 녹여 하 고 신속 하 게 나중을 위해 얼음에 그들을 전송.
- 혈 청 aliquots를 ZIKV 변형 MR766의 감염 (MOI) 상응 하는 금액의 0.1 다양성을 추가 합니다.
참고: 희석 비율 일정 하 게 유지 하 고 총 볼륨은 ~ 200 µ L; 다는 것을 확인합니다 그건 각 치료의 triplicates에 대 한 충분입니다. 다운스트림 분석에 대 한 부정적인 제어로 사용 하는 감염 되지 않은 3 개의 우물을 유지. - 양식 단지 Zika virions (편의 위해,이 "면역성이 있는 복합물" 라고 합니다)와 함께 DENV 항 체를 허용 하기 위하여 5% CO2 1 h 37 ° C 배양 기에서 추가 된 바이러스 혈 청 희석을 품 어.
- 평면-바닥 96 잘 접시에 시드 된 셀에서 미디어 발음 워시 살 균 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (1 x PBS) x 셀.
- 각 잘 하는 면역성이 있는 복합물의 50 µ L을 추가 하 고 2 시간에 대 한 5% CO2 37 ° C 배양 기에서 그들을 품 어.
- 외피의 2 h 발음 세포에서 면역 단지를 포함 하는 미디어, 후는 멀티 채널을 사용 하 여 플라스틱, 그리고 세척 셀 2 x 1 x PBS 완전히 면역 단지와 연결 되지 않은 모든 virions를 제거.
- 10 %FBS 각각을 잘 품 어 48 h에 대 한 5% CO2 와 37 ° C 배양 기에서 세포 보충 하는 신선한 완전 한 미디어의 100 µ L를 추가 합니다.
2. RNA 추출
- 인큐베이터에서 96 잘 접시를 제거 하 고 캐비닛 biosafety에 그것을 전송.
- 미디어 발음, 세척 셀 2 x 1 x PBS, RNA 추출을 진행.
참고: RNA는 어떤 방법의 선택에 의해 추출 될 수 있다 ( 테이블의 자료를 참조). - 잘 당 10% β-mercaptoethanol 세포 세포의 용 해 버퍼의 250 µ L를 추가 합니다. 피 펫 팁 속도 세포 절차를 가진 세포를 긁 적와 함께 적어도 5 배 아래로 버퍼 플라스틱
- 새로운, 레이블, 살 균 1.5 mL 튜브에 세포 lysates 전송.
- 70% 에탄올 (250 µ L)의 동일한 금액을 추가 합니다. 때까지 혼합물은 분명 4 배-5 배 아래로 플라스틱.
- 2 mL 컬렉션 튜브에 실리 카 기반 열 표시를 혼합물 (~ 500 µ L)를 전송 및 통해 흐름 30 s. 폐기를 위해 15000 x g 에서 원심 및 동일한 컬렉션 튜브에 열을 유지.
- 각 열에 워시 버퍼 1의 700 µ L을 추가 하 고 통해 흐름 30 s. 폐기를 위해 15000 x g 에서 원심 동일한 컬렉션 튜브에 열을 유지.
- 30 미 삭제는 상쾌한 15000 x g 에서 각 열을 원심 분리기 세척 버퍼 2의 500 µ L를 추가 합니다. 2 x이이 단계를 반복 합니다.
- 워시 버퍼 2에서에서 새로운 2 mL 컬렉션 튜브 및 15000 x g 에서 원심 분리기 2 분 확인 실리 카 기반 열 얻을 완전히 건조 그리고 아무 에탄올에 대 한 열 왼쪽으로 이동.
- 2 mL 튜브를 삭제 하 고 장소에 열 새로운, 살 균, 분류, 1.5 mL 복구 튜브.
- 각 열과 1 분 15000 x g 에서 원심 분리기의 센터에서 RNase 무료 물 prewarmed (42 ° C) 30 µ L를 추가 합니다.
- 복구 eluted RNA와 260 nm 파장에는 분 광 광도 계를 사용 하 여 샘플을 계량 합니다.
참고: 이상적으로, 260에서 흡 광도 값 사이의 비율을 계산 하 여 RNA의 순도 결정 nm 및 280 nm. 순화 된 RNA의 260/280 비율이 1.8-2.0 사이 이상적으로 이다.
3. 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응
참고: 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR) 보통 SYBR 녹색 나 염색, Taq DNA 중 합 효소, deoxynucleotide 된 (dNTPs), 및 수동 염료의 구성 되는 어떤 SYBR 녹색 믹스를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 모든 정량 Pcr 기계 SYBR 녹색의 검출 능력이 반응을 수행 하 고 데이터를 얻기 위해 사용할 수 있습니다. 이 실험에 대 한 1 단계 RT-PCR 키트 SYBR 녹색의 칵테일을 했다 사용 된 내가 이용한 염료, Taq DNA 중 합 효소, dNTPs, 역전사의 추가 혼합물 ( 테이블의 자료를 참조). 봉투 영역에 대 한 설계 및 ZIKV 게놈 수준의 척도를이 연구에 사용 된 뇌관 ZIKV-qF에 대 한 CCGCTGCCCAACACAAG 및 CCACTAACGTTCTTTTGCAGACAT ZIKV-qR에 대 한 있습니다. 컨트롤, 인간의 β-2-microglobulin (B2M) 측정 하 고 ZIKV (내부 관리 유전자)의 표현을 표준화 하는 데 사용 했다. B2M 유전자 발현이이 연구에 사용 된 척도를 뇌관 순서는 B2M qF에 대 한 CTCCGTGGCCTTAGCTGTG 및 TTTGGAGTACGCTGGATAGCCT B2M qR에 대 한 이다. 모두는 ZIKV와 B2M 유전자에 대 한 각 샘플에 대 한 3 개의 기술 복제를 넣어 확인 하십시오. RT-PCR의 설치는 아래 간략하게 설명 되어 있습니다.
-
RT-PCR 설치
- 샘플 당 RNA의 사용 100 ng
- 각 반응에 대 한 특정 유전자의 앞으로 역 뇌관의 10 µ M 주식에서 1 µ L를 추가 합니다.
- 샘플 당 역전사 믹스의 0.25 µ L를 추가 합니다.
- 각 개별 반응 SYBR 녹색 믹스의 12.5 µ L를 추가 합니다.
- 최대 25 µ L의 물 추가 합니다. 마스터 그것은 96-잘 PCR 접시에서 RNA, aliquot를 제외한 모든 위에서 언급 한 시 약의 혼합 및 마지막 RNA를 추가 확인 합니다.
- 투명 접착 테이프를 가진 접시를 봉인.
- 1000 x g 는 시 약을 섞어 1 분 동안에 격판덮개 원심
- 정량 Pcr 기계에 접시를 넣어.
-
RT-PCR 프로필
참고: 표 1에 표시 된 RT-PCR 프로필을 사용 합니다.- 보완 DNA (cDNA)의 합성을 위해 10 분 동안 50 ° C에서 샘플을 품 어.
- CDNA 합성 후 5 분 동안 95 ° C에서 Taq DNA 중 합 효소를 활성화 합니다.
- 10 s 뇌관 어 닐 링 및 확장 30 60 ° C에서 95 ° C에서 변성의 40 주기를 수행 s.
- 결국에서 추가 용융 곡선 단계 (65 ° C)를 넣어.
-
데이터 분석
- 이상적으로, 단일 피크 1.6 이상의 경우 하나만 amplicon와 증폭 값의 존재를 확인 하는 특정 유전자에 대 한 모든 샘플에서 보여줍니다 정량 Pcr 기계는 algori를 실행 하는 데 사용 하는 프로그램에서 용융 곡선 탭을 클릭 하 여 용융 곡선을 모니터링 thm (증폭 값 정량 Pcr 기계에 의해 사용 되는 알고리즘에 따라 다름) 100% 증폭 값으로 2를 고려 합니다. 단계 사이의 최소 10 시간을 잡고 0.5 ° C 온도 단위로 사용 해야 최적의 결과 대 한 용융 곡선 프로토콜에 s.
- 거기 다는 것을 확인 한 후 단일 amplicon 및 좋은 증폭 값을 먼저 클릭 각 샘플의 양적 주기 (Ct/Cq 값)을 Microsoft Excel로 내보내기 정량화 데이터 탭에서.
- 스프레드시트를 사용 하 여, Ct 값을 사용 하 여 각 샘플의 평균을 계산 합니다. 다음, 수식을 클릭 하 고 평균을 선택 합니다. 각 샘플 (복제)의 평균 CT 값 추가 분석을 위해 사용 됩니다.
- 다음, 계산 하는 수식 ΔCt을 사용 하 여 ΔCt = 평균 대상 유전자의 Ct-코네티컷 제어 유전자의 평균 (이 경우, ΔCt = 평균 ZIKV 유전자의 Ct-코네티컷 B2M 유전자의 평균).
- 계산 하는 데이터를 정규화 하는 ΔΔCt (이 경우, ΔΔCt = ΔCt ZIKV 샘플-B2M 샘플).
- 배 모든 정규화 단일 ΔΔCt 값에 대 한 수식 2^-(ΔΔCt)를 입력 하 여 유전자 발현을 증가 계산 합니다. 이전 연구9,10에 설명 된 대로 통계 테스트 배 증가의 결과 얻을 수 있습니다.
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Representative Results
그림 1, 에이드 프로토콜 수행에 관련 된 모든 단계의 단계별 도표 그림이 이다. 그것은 DENV에 기존의 면역 인 에이드의 ZIKV의 전체 절차를 보여주는 회로도입니다. 그림 2 는 어떻게 인간의 혈 청 샘플 세 가지 그룹으로 분류 되었다: DENV 감염 확인 샘플 이라고 DENV에 감염 된 그룹, DENV 항 체 확인 샘플은 DENV 노출 그룹으로 하 고 건강 한 DENV 중화 항 체 또는 RNA 개인 세라 건강 한 제어 (HC) 그룹을 이라고 합니다. (그림 2)입니다.
모든 혈 청 샘플 ZIKV와 단지를 만들기 위해 허용 되었다 고 대 식 세포 세포를 감염 하는 데 사용 했다. 48 h 바람직합니다, 후 RNA 추출 하 고 qRT-PCR을 복종 되었다. 그림 3 에 대표적인 실험 DENV serotype 1 ~ 4 항 체를 포함 하는 세라의 대부분은 서로 다른 수준에서 ZIKV 복제를 향상 시킬 수 보여줍니다. ZIKV titers에 가장 높은 증가 1, 3, ZIKV의 비교적 적은 유도 보여준 serotype에 비해 DENV serotype 2, 4 항 체를 포함 하는 세라로 치료 하는 세포에서 발견 되었다.
그림 1 : 에이드 프로토콜의 도표 그림. 단계별 그림 전체 프로토콜에 관련 된 모든 단계를 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 실험 절차의 도식. 세 가지 유형의 세라 Zika 바이러스 incubated 했다. 그룹 DENV RNA 긍정적인 (DENV 감염) 샘플의 구성. DENV 항 체 양성 (DENV 노출) 샘플 그룹 II에 의하여 이루어져 있다. DENV RNA 또는 항 체 (건강 한 컨트롤) 샘플 그룹 III에 의하여 이루어져 있다. 바이러스-세라 혼합물 인간의 세포와 계량 감염에 추가 되었습니다. 이 그림은 Londono Renteria 외.8에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : DENV 면역 세라 향상 기본 인간의 세포에 ZIKV 감염. DENV 항 체를 포함 하는 인간의 세라 (DENV1-4 serotype 확인, Col serotype 알 수 없는) 또는 건강 한 컨트롤에서 1:10,000에 1:10 희석된 되었고 ZIKV와 알을 품을. 세라 표 1에 설명 되어 있습니다. 기본 절연 된 인간의 세포 혼자 ZIKV 또는 ZIKV-세라 혼합물으로 감염 되었다. (한) DENV1 항 체를 포함 하 세라. (b) DENV2 항 체를 포함 하 세라. (c) DENV3 항 체를 포함 하 세라. (d) DENV4 항 체를 포함 하 세라. (e) DENV 항 체 세라 콜롬비아 개별 1에서. (f) DENV 항 체 세라 콜롬비아 개별 2에서. 감염 48 h 바람직합니다에서 qRT-PCR 분석에 의해 측정 되었다. 기술 및 생물 복제는 3 중에서 수행 되었다. 데이터는 풀링된 및 오차 막대 표준 편차를 나타냅니다. 학생의 t-테스트와 ANOVA 통계 분석을 위해 사용 되었다. P < 0.001. 이 그림은 Londono Renteria 외.8에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
표 1: qRT-PCR의 열 프로 파일.
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Discussion
다른 DENV serotypes 에이드로 이어지는 DENV 항 체의 분11효과적인 백신 개발을 방해 했다. ZIKV 같은 가족 Flaviviridae에 속해 있으며 다른 flaviviruses, 특히 DENV12와 상당한 상 동. ZIKV와 DENV에 대 한 항 체를 중화의 주요 목표 두 바이러스13,,1415사이 매우 높은 구조 및 제 사기 순서 상 동을 공유 하는 봉투 단백질 이다. 그것은 DENV 또는 ZIKV를 사전 면제 다른 바이러스8,16의 감염을 향상 시킬 수 입증 되었습니다.
상 패 분석 실험17에서 이르기까지 에이드 실험에서 바이러스 infectivity 척도를 고용 하는 다른 방법의 수 있다, 형광 성 염료와 cytometry18 활용 된 세포내 바이러스 항 원 항 체를 사용 하 여 얼룩 ,19. 이 분석 실험 시간과 하지 쉽게 적응 여러 샘플의 높은 처리량에 대 한 동시에 있습니다. 중요 한 것은, 대부분 연구의 ZIKV에 그들의 효과 확인 하기 DENV 특정 단일 클론 항 체를 사용 하 고 셀 라인만20,21에이드를 검사. 이 프로토콜에서 우리는 우리 능력을가지고 있는 중화 DENV에 대 한 기본 인간의 면역 세포, 채용 하 여 ZIKV 복제에 환자 혈 청의 영향을 검사를 함께 인간의 미리 면역 혈 청 샘플을 사용 하는 간단 하면서도 효과적인 방법 설명 qRT-PCR입니다. 이 방법은 강력 하 고, 관련, 이며 3 일에 완료 될 수 있다. 이 원고에서 대표 결과 ZIKV에 대 한 응용 프로그램, 비록이 프로토콜 수 있습니다 쉽게 수정 되며 황열병 바이러스, 뎅기열 바이러스 및 웨스트 나 일 바이러스 같은 다른 flaviviruses에 대 한 사용. 고려해 야 할 한 가지 중요 한 요소는이 프로토콜 성숙 하 고 미 성숙한 바이러스 성 RNA 사이 구별에 한계가 있다.
프로토콜, 동안 그것은 환경 RNase 무료 보장 RNA 추출 수행할 때 신중에 게 중요 한 단계를 처리 하는 모든 RNA 동안. 또한, 바이러스 성 주식 1-2 분 동안 물 목욕에서 37 ° C에서 해 동 한다 고 즉시 얼음에 넣어. 그러나, 바이러스 하지 지켜져야 한다 얼음에 대 한 만큼, 다음, 그것은 그것의 infectivity 잃을 수 있다.
이전 결과이 프로토콜은 매우 편리 하 고 많은 수의 샘플을 처리할 수 있는 하 고 다른 방법 보다 상대적으로 짧은 시간에 완료할 수 있습니다 설명 했다. 이 프로토콜 미래 에이드 연구에 유용한 분석 결과로 사용할 가능성이 있다.
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Disclosures
저자는 선언할 수 없다.
Acknowledgments
이 작품 (T.M.C.)에 1R21AI129881-01, 국가 신흥 전염 성 질환 연구소, 그리고 보스턴 대학 학부에서 시작 자금 아낌없이 지원 했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Bovine Serum | GEMINI | 100-106 | |
| iCycler | BioRad | 785BR02188 | Model No. CFX96 Optics Module |
| Microfuge 18 Centrifuge | Beckman Coulter | 367160 | |
| Nanodrop-1000 | Thermoscientific | 1072 | |
| Quantifast SYBR-One step RT-PCR kit | Qiagen | 204154 | Used for 1 step RT-qPCR |
| RNeasy RNA Isolation Kit | Qiagen | 74106 | Used for RNA extraction |
| RPMI-medium | Gibco | 11875093 |
References
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