Summary
Messung von Nagetier Skelettmuskulatur kontraktile Funktion ist ein nützliches Tool, das Fortschreiten der Krankheit sowie die Wirksamkeit der therapeutischen Intervention zu verfolgen verwendet werden kann. Wir beschreiben hier die nicht-invasive, in Vivo Beurteilung der releveurs Muskeln, die im Laufe der Zeit in der gleichen Maus wiederholt werden kann.
Abstract
Bewertung der Skelettmuskulatur kontraktile Funktion ist ein wichtiges Maß für beide klinische und wissenschaftliche Zwecke. Zahlreiche Bedingungen können skelettartigen Muskel negativ beeinflussen. Dadurch kann sich ein Verlust von Muskelmasse (Atrophie) und/oder Qualitätsverlust Muskel (reduzierte Kraft pro Einheit von Muskel Masse), beide sind weit verbreitet in chronischen Erkrankungen, Muskel-spezifische Krankheit, Immobilisierung und Alterung (Sarkopenie). Skelettartiger Muskelfunktion bei Tieren kann durch eine Reihe von verschiedenen Tests ausgewertet werden. Alle Tests haben Beschränkungen in Bezug auf die physiologischen Testumgebung, und die Auswahl eines bestimmten Tests oft hängt von der Art der Experimente. Hier beschreiben wir eine in-vivo, nicht-invasive Technik, die mit eine hilfreiche und einfache Bewertung der Kraft-Frequenzkurve (FFC) bei Mäusen, die im Laufe der Zeit auf dem gleichen Tier durchgeführt werden kann. Dies ermöglicht die Überwachung der Progression der Erkrankung und/oder Wirksamkeit einer möglichen therapeutischen Behandlung.
Introduction
Skelettmuskulatur ist eine wichtige metabolische Gewebe, das umfasst etwa 40 % des gesamten Körpergewichts. Es spielt eine entscheidende Rolle bei der Kontrolle der Energie-Stoffwechsel und Homöostase1. Skelettartiger Muskel Masse wird durch eine feine Balance zwischen den beiden Tarifen der Protein-Synthese und Abbau1beibehalten. Zahlreiche Erkrankungen beeinflussen diese Prozesse in der Skelettmuskulatur, führt zu einem Verlust an Muskelmasse (Atrophie). Dazu gehören, aber sind nicht beschränkt auf, Krebs, AIDS, Aging, Fasten, und Gliedmaßen Ruhigstellung2,3. In der alternden Bevölkerung, Kraftverlust ist verbunden mit einem Verlust von Muskel Masse und ist ein Prädiktor der Mortalität All-Fall4. In diesem Zusammenhang bietet die Bewertung der Muskelfunktion eine wichtige Maßnahme bei der Bestimmung der Wirksamkeit von therapeutischen Strategien zur Bekämpfung bzw. skelettartiger Muskel verschwenden und Verlust der Funktion zu verhindern.
Forscher haben viele verschiedene Ansätze und Tiermodelle verwendet, um die molekularen Signalwege von Muskel-Atrophie5,6 und die Auswirkungen dieser Mechanismen auf Muskel kontraktile Funktion2,3 verstehen ,7. Daher ist die korrelierenden Veränderungen auf molekularer Ebene, Unterschiede in der Funktion des Muskels im Verständnis unerlässlich, wie molekulare Pegeländerungen Muskel Funktionen auswirken können.
Skelettartiger Muskelfunktion, vor allem in kleinen Nagetieren wird normalerweise durchgeführt mit drei gut beschriebenen Verfahren8,9 zu erkennen, Kraft Produktion beeinträchtigt und/oder Fortschreiten der Krankheit zu überwachen. (1) ex-Vivo; wo ist Muskel vom Tier entfernt und in ein Ringer-Bad-Lösung zu beurteilen, die Funktion des Muskels mit Feld Stimulation10inkubiert. (2) In-situ; wo die proximale Anlage des Muskels bleibt das Tier und die distale Sehne ist an ein Kraftaufnehmer, so dass Muskelfunktion durch direkte Nerven Stimulation11durchgeführt werden. (3) In-vivo; wo subkutan Elektroden sind zu Nerven-evozierten Muskel Kraft Produktion9,12. Während dieser drei Verfahren für verschiedene Zwecke verwendet werden, besitzen sie jeweils vor- und Nachteile. Daher ist es wichtig, eine geeignete Methode, basierend auf der Studie auswählen. Die Haupteinschränkung mit ex-Vivo-Experimente ist die Entfernung der Muskel aus seiner normalen Umgebung und die Verwendung von Feld-Stimulation. Die in-situ-Methode eine normale Blutversorgung unterhält und nutzt Stimulation durch den Nerv, aber normale Anatomie verändert und die Natur des Experiments ist terminal; So macht das Follow-up-Muskel Funktion Messungen unmöglich. Die in-vivo am ehesten hier beschriebene Methode ahmt normale Physiologie, der Anatomie ist ungestört, das neuromuskuläre Bundle bleibt intakt und das Experiment ist nicht terminal, Follow-up-Maßnahmen innerhalb des gleichen Tieres über Zeit8ermöglicht.
Hier beschreiben wir eine in-vivo Verfahren, die mehrere Messungen der Muskelfunktion im gleichen Tier im Laufe der Zeit ermöglicht. Dieses Verfahren beinhaltet die Beurteilung der Muskeln der vorderen musculorum Fach – einschließlich der Tibialis anterior(TA), Beinstrecker m.digitorum Longus (EDL) und Hallicus (EHL) Longus Streckmuskeln, verantwortlich für Dorsalflexion – in ein nicht-invasives Verfahren durch Fibuladefekt (auch bekannt als peroneus) Stimulation. Die TA bietet die Kraft für Knöchel Dorsalflexion13, mit nur minimalen Beitrag von der EDL und EHL die Steuerbewegung der Zehen. Dieses nicht-Terminal-Protokoll sorgt für die Erhaltung der Nerven und Blut. Dies ermöglicht die Untersuchung der Krankheit Evolution und Behandlung Wirksamkeit im Laufe der Zeit in der meisten physiologischen Umgebung derzeit in einem Tiermodell.
Protocol
Deakin University Tier-Ethik-Kommission (Projekt Nr. G19/2014) stimmten alle experimentelle Verfahren.
1. Geräte-Setup
- Stellen Sie sicher, dass alle Geräte ordnungsgemäß angeschlossen sind.
- Schalten Sie den Computer, die Hochleistungs-Biphase-Stimulator und Dual-Mode-Hebel-System.
- Richten Sie die Maus Knie Klemme auf der Plattform sowie die Maus Fußplatte auf der Transductor.
- Schalten Sie die Heizung-Plattform auf 37 ° C.
- Öffnen Sie die dynamische Muskel-Steuerungssoftware auf dem Desktop.
Hinweis: Dies ist die Software benötigt, um Funktionstests durchführen.
2. Software und Modellaufbau
- Sobald das Programm geöffnet wird (Abbildung 1), den Schallkopf zu kalibrieren und wählen Sie Setup | Meine Instrumente | Kalibrieren Sie.
- Auf die Schaltfläche "Setup" wählen Sie InstantStim und ändern Sie die Parameter "Run Time" bis 120 s (Abb. 1A).
Hinweis: Optimale Spannung kann auch erreicht werden, indem einzelne Zuckungen durchführen, manuell einrichten oder starten die InstantStim so oft wie nötig. - Im Fenster Typ in der Lage mit der Bezeichnung "Autosave Base" auf den Namen der automatischen Eingaben speichern Sie Speicherort (z. B., mouse1-Datum-timepoint1). Aktivieren Sie das Kontrollkästchen auf der linken Seite des Fensters "Autosave Base" und ändern Sie es in Autosave aktivieren.
- An der Spitze des Kontrollstreifens DMC Bildschirm gehen, Sequenzer, wodurch einen neue Pop-up-Fenster geöffnet wird. Wählen Sie Offene Sequenz und wählen Sie die vorgefertigte Protokoll verwendet (Abbildung 1 b). Klicken Sie Ladesequenz | Schließen Sie Fenster.
Hinweis: Dieser Schritt dient zum Generieren einer Kraftmessung Frequenzkurve (FFC) (1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 250 Hz). - Setzen Sie den Knopf "RANGE" auf 10 mA auf der Biphase-Stimulator.
Hinweis: Sicherstellen Sie, dass der "ADJUST" Knopf (direkt neben unten) auf Null ist. Diese Feineinstellung ermöglicht das Setup der Elektroden.
(3) Maus-Setup
Hinweis: Alle Kraftmessungen wurden am männlichen Wildtyp Mäusen (C57BI/6) im Alter von 12 Wochen durchgeführt.
- Legen Sie jede Maus in der Anästhesie-Kammer mit einer Sauerstoff-Durchfluss von 1 L/min mit 5 % Isofluran (über Nosecone Inhalation) bis die Maus das Bewusstsein verliert. Ausreichende Anästhesie über Verlust der Fuß Reflex zu bestätigen.
- Entfernen Sie alle Haare auf dem rechten Bein der Maus durch Rasur mit elektrischen Haarschneidemaschinen.
- Legen Sie das Tier in Rückenlage auf der beheizten Plattform und reinigen Sie das rechte Bein (beidseitig verwendbar) mit 70 % Alkohol und Jod. An dieser Stelle passen Sie Isofluran auf 2 % (mit Sauerstoffzufuhr bei 1 L/min an) und tragen Sie das leitfähige Gel auf die Haut, wo die Elektroden platziert wird.
Hinweis: Verwenden Sie eine rektale Temperatursonde überwachen die Körpertemperatur während des Verfahrens und Augensalbe um Trockenheit und/oder Schäden für das Auge zu verhindern. - Setzen Sie den Fuß auf der Fußplatte und mit medizinischen Klebeband befestigen. Klemmen Sie das Knie zu stabilisieren und das Bein während des Verfahrens zu immobilisieren.
Hinweis: Einige Studien haben beschrieben, mit einer sehr dünnen Nadel eingefügt durch die proximalen Tibia (posterior der Fußheber Muskeln)12 zur Stabilisierung. Dieses Protokoll entscheidet sich für eine Klemme, da dadurch ausreichende Stabilisierung ohne unnötige Kompression/Schäden bis zum Knie. Die Klemme vermeidet auch mögliche Entzündung, die eine Trans-knöcherner Pin erstellen könnte, gleichzeitig genaue Beurteilung der Muskel Kontraktilität. Darüber hinaus wurde die Maus Knie Klemme erfolgreich verwendeten14. - Zu diesem Zeitpunkt verwenden Sie die Knöpfe auf der Plattform, um die Maus Megalosauridae zu positionieren, so dass es einem 90°-Winkel am Knöchel (Abbildung 2).
4. Optimierung der Elektroden Position
- Sobald die Maus auf der Plattform platziert wird, positionieren Sie die Elektroden unter die Haut (subkutan) im rechten Bein.
Hinweis: Dies ist ein entscheidender Schritt, und einige Neupositionierung erforderlich sein, um die gewünschte Position während der Installation im Schritt 4.4. - Platzieren Sie die Elektroden an der lateralen Seite des rechten Beins; Platz eins in der Nähe der Leiter der Fibula und der anderen Elektrode mehr distal an der lateralen Seite des Beines (Abbildung 2).
Hinweis: Eine maßgeschneiderte Elektrodensystem soll dieser Schritt zu optimieren. Jedoch kann dieser Test mit Elektrode Nadeln in diesem System des Herstellers durchgeführt werden. - Sobald diese Schritte erreicht werden, auf der High-Power-Biphase-Stimulator passen Sie den Knopf mit der Aufschrift "ADJUST" wie erforderlich, um eine Stimulation des Nervus Peronaeus, der maximale Dorsalflexion Drehmoment führt.
Hinweis: Dieser Bereich ist für Erwachsene Wildtyp Mäusen, weniger als 2 mA; Dies kann jedoch abhängig von Größe, Alter und Geschlecht des Tieres sein. Die Kraft-Produktion (Gipfel der Kurven) sollte langsam erhöht werden, bis die maximale Kraft erreicht ist. - Während der Stimulation drehen Sie den Schallkopf negative Werte (Abbildung 3), nachgeben, die sind wichtig, um sicherzustellen, dass die Elektroden nur die releveurs Muskeln durch peroneus stimuliert werden. Sobald dieser Schritt erreicht ist, stabilisieren Sie die Elektroden mit einer Schelle, jede Bewegung während des Verfahrens zu verhindern.
Hinweis: Die Gipfel steigen langsam in der Größenordnung und die maximale Stromstärke richtet sich wie die Ebene, an der drei oder mehr aufeinander folgenden Stimulationen identisch Kontraktilität führen. Drehen die Stromstärke höher als notwendig zu widerstehen; die maximale Stromstärke regt der benachbarten und potenziell Antagonistenmuskeln, sich zusammenzuziehen, was Co-Kontraktion, die Spitzen der positiven Werte generieren können. - Stoppen Sie die Instant Stim auf die Software.
- Aktivieren Sie auf dem Hauptbildschirm die Schaltfläche "Sequenz starten", um die vorherige Einrichtung Sequenz beginnen (wie in Schritt 2.4 beschrieben).
5. Beendigung des Verfahrens
- Sobald die Kraftmessungen fertig sind, entfernen Sie die Elektroden, lassen Sie die Knie Klemme und entfernen Sie den Fuß.
- Schalten Sie die Isoflurane und erhalten Sie Sauerstoffzufuhr für ein paar Minuten, die Beihilfe der tierischen Erholung zu. Sobald die Maus bewegt und/oder Bewusstsein wiedererlangt und kann selbst rechts, die Maus zurück in seinen Käfig.
Hinweis: Eine nicht-steroidale entzündungshemmende Medikament (NSAID) kann subkutan injiziert werden (1 mg/kg Meloxicam), Beschwerden und/oder Schmerzen nach dem Eingriff zu verhindern.
(6) Datenanalyse
- Öffnen Sie die Software zur Datenanalyse.
- Gehen Sie zu Hohen Durchsatz (oben links auf dem Bildschirm). Select Force Frequenz zu analysieren, die oben beschriebene Setup-Sequenz.
- Wählen Sie manuell aus, und ändern Sie den Wert "Ende Cursor" auf 3. Wählen Sie auch Entfernen Baseline.
- Klicken Sie auf Wählen Sie Dateien zugreifen, die zuvor durchgeführte Verfahren und klicken Sie dann auf analysieren. An dieser Stelle kann das Ergebnis auf dem Bildschirm zugegriffen oder in eine Kalkulationstabelle für weitere Analysen und/oder Berechnungen ausgeführt werden.
Hinweis: Die Daten wurden in mN gemessen; jedoch kann das Drehmoment berechnet durch Multiplikation der Kraftwert durch die Länge des Hebelarms (absolute Kraft). Wenn Normalisierung erforderlich (spezifische Kraft) ist, Drehmoment auf das Körpergewicht normalisiert werden kann, oder terminal Experimente durchgeführt werden können, um Muskelmasse von Alter abgestimmt zu sammeln.
Representative Results
Die Kraft-Frequenzkurve ist ein nützlicher Test, in dem durch niedrigeren und höheren Frequenzen zu suboptimalen und optimale Kraft Antworten15unterscheiden Muskeln stimuliert werden können. Die Kraft im unteren Frequenzbereich kann eine einzige zucken, weniger und kleinere motorische Einheiten aktiviert anregen und bei höheren Frequenzen eine stabile Spitze erreicht ist, wo isolierte Zuckungen (Tetanus) verschmolzen, erreichte Maximalkraft durch Aktivierung alle motorische Einheiten16 . Der Test präsentiert die tetanische Kurve beginnt bei ~ 60 Hz, wo die Potenzierung visualisiert werden können (Abb. 4A) und die maximale Kraft richtet sich bei ~ 150 Hz (Abbildung 4 b), wenn das Plateau mit einer abgeschlossenen verschmolzen Kurve9erreicht ist, 16.
Abweichungen von diesen Ergebnissen kann bedeuten, dass die Muskeln nicht richtig durch die Elektroden stimuliert wird. Platzierung der Elektrode ist ein wichtiger Schritt bei der Vorbereitung dieses Verfahrens, da die elektrische Stimulation richtig positioniert werden, muss um innervieren die peroneus und somit vollständig aktivieren die Muskeln der Dorsalflexion, welche It liefert (TA, EDL und EHL). Richtige Positionierung der Elektrode in der Generation der negativen Peaks (Abbildung 3) während dieses Prozesses ergibt sich während Fehlausrichtung der Elektroden oder höhere Stromstärke auf die Stimulation der Muskeln, was Co-Kontraktion der umliegenden führen kann die benachbarten Muskeln und Antagonisten, die wiederum Gipfeln der positiven Werte erzeugt.
Abbildung 5A zeigt repräsentative Kraft Frequenzkurve Daten von einer Maus über die Zeit, wo das Verfahren wiederholt wurde einmal in der Woche bis 5 Zeitpunkte abgeschlossen wurden. Diese Beobachtungen zeigten konsistent Kraft Produktionswerte innerhalb des Zeitpunkte bzw. Beobachtungen gemessen. Dieses Verfahren hat auch gezeigt, um zwischen den Mäusen Messungen übereinstimmen, wie Abbildung 5 b dem Vertreter zeigt, dass die Fläche unter der Kurve der FFC angeregt über 5 verschiedene Beobachtungen bei 6 Mäusen getestet einmal pro Woche.
Abbildung 1 : Software-System. (A) Software Abbildung der Schritte zum Einrichten der "Instant Stim" Parameter zu kontrollieren. Klicken Sie auf das Hintergrundfoto,, Setup | Sofortige Stim. Tauchte auf das kleine Fenster (vordere Foto), richten Sie die Parameter. (B) Darstellung der Ansicht "Sequencer" Setup. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Maus-Setup. Übersicht über die Position des narkotisierten Tier. Rechtes Knie Klemme wird platziert, so dass das Knie im 90 °-Winkel ist und damit der Fuß und Knöchel im 90° Winkel (gestrichelte weiße Linie sind). Kontraktion der Fußheber Muskeln wird durch die Stimulation des Nervus Peronaeus, liegt knapp erreicht (distal) der Kopf der Fibula. Wir verwenden speziell angefertigte Elektroden (kleines Foto); Nadelelektroden, die mit dem Gerät zur Verfügung gestellt, oder separat erhältlich, sind aber auch ausreichend. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Ausgabe von Platzierung der Elektroden. Sobald die Elektroden sich unter der Haut befinden und die Spannung wird initiiert, werden Spitzen mit negativen Werten beobachtet. Zu diesem Zeitpunkt ist erreichte negative Werte (grüne Linien) ein entscheidender Schritt um sicherzustellen, dass die Stimulation in den releveurs Muskeln nur (TA, EDL und EHL) erreicht ist. Die Echtzeit-Messung wird zwischen die beiden roten Linien angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Repräsentative Kurven. (A) Beispiel der Kraftverlauf bei 60 Hz (Maus #06). (B)-Probe der tetanische Kurve bei 150 Hz (Maus #03). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Vertreter zwingen Frequenzkurve (FFC) und die Anbaufläche für die Kurvendaten. (A) FFC (x-Achse) über 5 verschiedene Zeitpunkte (Wochen 1, 2, 3, 4 und 5) in einer Probe-Maus (#05). (B) Fläche unter der Kurve (AU, y-Achse) des FFC über 5 verschiedene Zeitpunkte (Maus #01, 02, 03, 04, 05 und 06; x-Achse). Ergebnisse sind als Mittelwert ± Standardfehler der Messung (SEM) von fünf Zeitpunkten (Tests) in 6 Mäuse und analysiert wurden durch einfache ANOVA Test (p < 0,05). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Discussion
Messung der maximalen kontraktilen Muskelfunktion auf genaue und wiederholbare Weise ist entscheidend für die progressive Bewertung der genetischen, metabolischen und Muskel Bedingungen17. Ebenso kann in-vivo kontraktilen Muskelfunktion für die Beurteilung von neuen Behandlungsmethoden und Therapeutika für den lähmenden Muskel Bedingungen. Wir zeigen hier die Messung der Kraft Produktion der releveurs Muskeln der unteren Megalosauridae Maus durch ein in-vivo-Verfahren.
Kommerzielle Geräte sind effizient und hilfreich bei der Durchführung dieser nicht-invasiven Verfahren. Dieser Test bietet wichtige Vorteile im Zusammenhang mit der Beurteilung der kontraktilen Muskelfunktion unter Beibehaltung einer nativen physiologische Umgebung, in das, die Blut Versorgung und Innervation intakt bleiben. Seine Nachteile beziehen sich auf der anderen Seite zu einer Normalisierung der Kraft pro Flächeneinheit Kreuz Querschnittsfläche des Muskels (bestimmte Kraft), die nur in einem isolierten Muskel festgestellt werden kann, die nach Experimenten geerntet wird. Erlaubt jedoch die nicht-invasive Test mehrere Messungen der kontraktilen Funktion der Beugemuskeln in das gleiche Tier im Laufe der Zeit was zu reduzierten Anzahl von Versuchstieren, die erforderlich ist, besonders wenn das Ziel zu beurteilen (relative Änderung Änderungen in absolute Kraft im Laufe der Zeit).
Es sind wichtige Schritte, die bei diesem Verfahren berücksichtigt werden müssen, um konsistente Daten über die Zeitpunkte zu erreichen. Zunächst sollte man versuchen, tierische Positionierung, wann immer möglich zu standardisieren. Zweitens ist während die Einrichtung wichtig, seien Sie konsequent mit Elektrode zu positionieren, so dass optimale Stimulation durch Stimulation des Nervus Peronaeus erreicht werden kann. Die Lage der Elektroden sollte an der lateralen Seite des Beines (in diesem Fall rechts), in der Nähe der Leiter der Fibula und andere weiter unten auf der lateralen Seite des Beines (Abbildung 2). Auf dieser Grundlage sind die maßgeschneiderten Elektroden so konzipiert, dass beide jedesmal an der gleichen Position platziert werden können. Jedoch kann auch ausreichende Stimulation erreicht werden mit der Elektrode Nadeln mit der kommerziellen Apparate zur Verfügung gestellt. Drittens ist es entscheidend, die negativen Spitzen während des Setups Spannung zu erreichen, durch Drehen im Uhrzeigersinn den Schallkopf auf der Fußplatte verbunden. Korrekte Positionierung der Maus Bein Elektroden mit Maximalspannung Setup hat gezeigt, eine Technik, die im Laufe der Zeit auf die gleiche Maus ausgeführt werden können.
Die Fähigkeit zu beurteilen und Muskelfunktion an verschiedenen Zeitpunkten zu verfolgen, auf dem gleichen Tier ist eine wichtige Einschätzung zu verschiedenen Muskelkrankheiten sowie ihre Entwicklung prägen. Darüber hinaus kann diese Messung der Muskel Dorsalflexion bei Mäusen ein Werkzeug, um die Wirksamkeit der möglichen Behandlungen in einer nativen physiologische Umgebung mit minimalen metabolischen Stress12beurteilen. So bietet es eine Technik bei der Beurteilung der Muskel Krankheit Fortschreiten und Potenzial Behandlung.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Finanzierung aus diesem Projekt wurde von der Schule für Sport und Ernährungswissenschaften, Deakin University. Die Autoren möchten Mr Andrew Howarth danken für seine umfangreiche Arbeit bei der Optimierung der Elektroden-Gerät.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1300A: 3-in-1 Whole Animal System – Mouse | Aurora Scientific Inc. | 305C-LR: Dual-Mode Footplate; 605A: Dynamic Muscle Data Acquisition And Analysis System; 701C: Electrical Stimulator and 809C: in-situ Mouse Apparatus | Complete muscle function system |
| Conductive gel | Livingstone | ECGEL250 | conductive gel used in the mice |
| Eye ointment | Alcon | Poly Visc | pharmaceutic product (ophthalmic use) |
| nonsteroidal anti-inflammatory drug (NSAID) | Ilium | Metacam | veterinary medicine (injectable 5mg/ml) |
| Isoflurane | Zoetis | Isoflo | veterinary inhalation Anaesthetic |
References
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