Summary
Måling av gnager skjelettlidelser muskel kontraktile funksjonen er et nyttig verktøy som kan brukes til å spore sykdomsprogresjon samt effekten av terapeutisk intervensjon. Her beskriver vi de ikke-invasive, i vivo vurdering av dorsiflexor musklene som kan gjentas over tid i samme musen.
Abstract
Vurdering av skjelettlidelser muskel kontraktile funksjonen er et viktig mål for både klinisk og forskning. Rekke forhold kan negativt påvirke skjelettmuskulatur. Dette kan resultere i et tap av muskelmasse (atrofi) og/eller tap av muskel kvalitet (redusert kraft per enhet av muskelen masse), begge er utbredt i kronisk sykdom, muskel-spesifikk sykdommen, immobilisering og aldring (sarcopenia). Skjelettmuskel funksjon i dyr kan bli vurdert av en rekke ulike tester. Alle testene har begrensninger knyttet til fysiologiske testing miljøet, og valget av en bestemt test ofte avhenger av innholdet av eksperimenter. Her beskriver vi en i vivo, ikke-invasiv teknikk involverer en nyttig og enkel vurdering av force frekvens-kurven (FFC) i mus som kan utføres på samme dyret over tid. Dette tillater overvåking av sykdomsprogresjon og/eller effekten av potensielle terapeutisk behandling.
Introduction
Skjelettmuskulatur er en betydelig metabolic vev som består av ca 40% av den totale kroppsvekten. Det spiller en avgjørende rolle i kontrollen av energi metabolisme og homeostase1. Skjelettlidelser muskel massen vedlikeholdes av en fin balanse mellom utbredelsen av protein syntese og nedbrytning1. Mange sykdom forhold påvirker disse prosessene i skjelettmuskulatur, fører til et netto tap i muskelmasse (atrofi). Dette inkluderer, men er ikke begrenset til, kreft, AIDS, aldring, faste, og lemmer immobilisering2,3. Aldrende befolkning, tap av styrke er forbundet med tap av muskel masse og er en prediktor for all-sak dødelighet4. I denne sammenheng gir vurdering av muskel-funksjonen et viktig mål ved beregning av effekten av terapeutisk strategier for å bekjempe og/eller hindre skjelettlidelser muskel sløse og tap av funksjon.
Forskere har brukt mange ulike tilnærminger og dyr modeller for å forstå molekylær veier muskel atrofi5,6 og konsekvensene av disse mekanismene på muskel kontraktile funksjon2,3 ,7. Derfor er samkjøre endringer på molekylært nivå til forskjeller i muskler avgjørende i forståelse hvordan molekylær endringer kan påvirke muskel funksjonalitet.
Skjelettmuskel funksjon, særlig i små gnagere, utføres vanligvis bruker tre godt beskrevet prosedyrer8,9 oppdager nedsatt kraft produksjon og/eller overvåke sykdomsprogresjon. (1) ex vivo; der muskel er fjernet fra dyret og ruges i en Ringer i Bad løsning å vurdere muskel funksjonen bruker feltet stimulering10. (2) In situ; hvor proksimale feste muskler forblir i dyret og distale sene er koblet til en force svinger, slik at muskelen funksjon som skal utføres av direkte nerve stimulering11. (3) In vivo; hvor elektroder blir plassert subcutaneously for å få nerve-utløste muskel kraft produksjon9,12. Mens disse tre prosedyrer brukes til ulike formål, har de hver sine fordeler og ulemper. Derfor er det viktig å velge en passende metode basert på målet av studien. Den viktigste begrensningen med ex vivo eksperimenter er fjerning av muskel fra sine normale miljøet og bruk av feltet stimulering. Metoden i situ opprettholder en normal blodtilførsel og bruker stimulering gjennom nerve, men normal anatomi endres og eksperimentet er terminal; dermed gjør dette oppfølging muskel funksjon målinger umulig. I vivo metoden beskrevet her nærmest etterligner normale fysiologi som anatomi er uforstyrret, nevromuskulær bunten intakte og eksperimentet er ikke terminal, slik at oppfølging tiltak innen samme dyret over tid8.
Her beskriver vi en i vivo prosedyre som tillater flere målinger av muskler i samme dyret over tid. Denne prosedyren innebærer vurdering av musklene i fremre crural rommet, inkludert tibialis anterior(TA), extensor digitorum longus (EDL) og extensor hallicus longus (EHL) muskler, ansvarlig for dorsiflexion, i en ikke-invasiv prosedyre ved fibular (også kjent som peroneal) nervestimulering. TA inneholder de fleste av styrken for ankel dorsiflexion13, med bare minimal hjelp av EDL og EHL som kontroll bevegelse av tærne. Denne ikke-terminal protokollen sikrer bevaring av nerve og blod. Dette gir etterforskningen av sykdom evolusjon og behandling effekt over tid i mest fysiologiske miljøet tilgjengelig i en dyremodell.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av Deakin University dyr etikk (prosjekt #G19/2014).
1. utstyr oppsett
- Kontroller at alle maskiner er riktig koblet.
- Slå på datamaskinen, kraftige bi-fase stimulator og dobbel modus spaken systemet.
- Definere musen kneet klemmen på plattformen, samt mus fotplaten på transductor.
- Slå på oppvarming plattformen 37 ° C.
- Åpne den dynamiske muskel Kontrollprogramvaren på skrivebordet.
Merk: Dette er programvaren som trengs for å utføre funksjonstesting.
2. programvare og modell oppsett
- Når programmet er åpnet (figur 1), kalibrere svingeren og velg installasjon | Min instrumenter | Kalibrere.
- På "Setup"-knappen, velg InstantStim og endre parameterne "Løpe tid" til 120 s (figur 1A).
Merk: Optimal spenning kan også oppnås ved utfører enkelt muskelrykninger, manuelt konfigurerer eller starter InstantStim så mange ganger som nødvendig. - I vinduet type-stand merket "Autosave Base" for å angi navnet på auto lagre filplassering (f.eks, mouse1-dato-timepoint1). Klikk i avmerkingsboksen til venstre for vinduet "Autosave Base" og endre den å Aktivere automatisk lagring.
- På toppen av kontrollen DMC skjermen gå til Sequencer, som vil åpne en ny popmusikk opp vindu. Velg Åpne sekvens og forhåndslagde protokollen skal brukes (figur 1B). Klikk Last sekvens | Lukk vinduet.
Merk: Dette trinnet brukes til å generere en force frekvens-kurven (FFC) test (1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 250 Hz). - Angi "RANGE" knotten til 10 mA på bi-fase stimulator.
Merk: Kontroller at "JUSTER" knotten (akkurat neste nederst) er på null. Denne fine justering kan oppsettet av elektrodene.
3. musen oppsett
Merk: Alle makt mål ble utført på mannlige vill-type mus (C57BI/6) på 12 ukens av alderen.
- Plasser hver musen i anestesi kammer med en oksygen flow rate på 1 L/min med 5% isoflurane (via nosecone innånding) til musen mister bevisstheten. Bekreft tilstrekkelig anestesi via tap av foten refleks.
- Fjern alle hår på høyre benet for musen ved barbering med elektrisk hårklippere.
- Plasser dyret i supine posisjon på oppvarmet plattformen og ren høyre benet (hver side kan brukes) med 70% alkohol og jod. På dette punktet, justere isoflurane til 2% (med oksygen flyt på 1 L/min) og bruke ledende gel på huden hvor elektroder blir plassert.
Merk: Bruke en endetarms temperatur probe å overvåke kroppstemperaturen under prosedyren og bruke øye ointment å forhindre alle tørrhet og/eller skade på øyet. - Sett foten på fotplaten og legger ved hjelp av medisinsk bånd. Klemme kneet for å stabilisere og nakkens beinet under prosedyren.
Merk: Noen studier har beskrevet med en svært tynn nål satt inn gjennom den proksimale tibia (bakenfor dorsiflexors muskler)12 gi stabilisering. Denne protokollen opts for en klemme, fordi dette gir tilstrekkelig stabilisering uten unødvendige komprimering/skade kneet. Klemmen unngår også potensielle betennelse som en trans-osseous pin kan opprette, samtidig gir nøyaktig vurdering av muskel contractility. Videre er musen kneet klemmen vellykket brukt14. - På dette punktet, bruke knotter på plattformen for å plassere musen hindlimb slik at det er en 90-graders vinkel på ankelen (figur 2).
4. optimalisering av elektroder posisjonen
- Når musen er plassert på plattformen, plasser elektrodene under huden (subkutan) i den høyre ben.
Merk: Dette er et viktig skritt, og noen reposisjonering kan bli pålagt å få ønsket plassering under installasjonen i trinn 4.4. - Plass elektrodene på den laterale siden av høyre benet; plass en nær fibula og andre elektroden mer distally på den laterale siden av beinet (figur 2).
Merk: Et skreddersydd elektrode system er konstruert dette trinnet. Imidlertid kan denne testen utføres med elektroden pinne fra produsenten i dette systemet. - Når disse trinnene er oppnådd, på kraftige bi-fase stimulator justere knotten merket "JUSTER" som nødvendig for å oppnå en stimulering av peroneal nerve som gir maksimal dorsiflexion dreiemoment.
Merk: Voksen vill-type mus, dette området er mindre enn 2 mA; Dette kan imidlertid være avhengig av størrelse, alder og sex av dyret. Kraft produksjon (topper på kurver) økes sakte til maksimal kraft er nådd. - Under stimulering, slå svingeren klokken å gi negative verdier (Figur 3), som er viktig å sikre at elektrodene er stimulerende bare dorsiflexor musklene av peroneal nerve. Når dette trinnet er oppnådd, stabilisere elektrodene med en klemme, hindrer enhver bevegelse under prosedyren.
Merk: Toppene øke gradvis i omfang, og maksimal strømstyrke bestemmes som som tre eller flere påfølgende stimulations resultere i identiske contractility. Motstå snu strømstyrken høyere enn nødvendig. maksimal strømstyrke vil stimulere nabolandet og potensielt antagonist muskler til kontrakt, forårsaker co kontraksjon, som kan generere toppene av positive verdier. - Stopp Instant Stim på programvaren.
- På hovedskjermen kan du slå på knappen merket "Starte Sequence" for å starte forrige installasjonen sekvens (som beskrevet i trinn 2.4).
5. slutt prosedyren
- Når force målingene er ferdig, Fjern elektrodene, kneet klemmen, og fjerne foten tapen.
- Slå av isoflurane og opprettholde oksygen levering i noen minutter hjelpe dyr utvinning. Når musen begynner å flytte og/eller gjenvinner bevisstheten og kan selv rett, tilbake musen til buret sitt.
Merk: En steroide antiinflammatoriske medikament (NSAID) kan injiseres subcutaneously (1 mg/kg har meloksikam) å hindre noen ubehag og/eller sårhet etter inngrepet.
6. dataanalyse
- Åpne data analyseprogramvare.
- Gå til Høy gjennomstrømning (øverst til venstre på skjermen). Velg Force frekvens analysere ovenfor beskrevet installasjonsprogrammet sekvens.
- Velg manuell og endre "Slutten markør" verdien til 3. Også velge Fjern opprinnelig plan.
- Klikk på Velg filer tilgang tidligere utførte prosedyren og deretter analysere. På dette punktet kan resultatet åpnes på skjermen eller eksporteres til et regneark for videre analyse og/eller beregninger.
Merk: Dataene ble målt i mN; Imidlertid kan dreiemoment beregnes ved å multiplisere på verdien av lengden på spaken armen (absolutt kraft). Hvis normalisering er nødvendig (bestemt kraft), dreiemoment kan normaliseres til kroppsvekt eller terminal eksperimenter kan utføres for å samle muskelmasse av alder-matchet.
Representative Results
Force-frekvens kurven er en nyttig test der musklene stimuleret av lavere og høyere frekvenser å skille suboptimal og optimal svar15. Styrken på lavere frekvenser kan stimulere en enkelt trekning, aktivere færre og mindre motor enheter, og en stabil toppen nås ved høyere frekvenser, hvor isolert rykninger smeltet (stivkrampe), nå maksimal kraft gjennom aktivering av alle motoriserte enheter16 . Testen presentert, den tetanic kurve startvekt ved ~ 60 Hz, hvor potensiering kan visualiseres (figur 4A) og maksimal kraft bestemmes ved ~ 150 Hz (figur 4B) når platået med en fullført smeltet kurve9, 16.
En variant av disse resultatene kan indikere at musklene ikke er blitt riktig stimulert av elektrodene. Elektrodeplassering er et viktig skritt i utarbeidelsen av denne prosedyren, som elektrisk stimulering må plasseres riktig innervate peroneal nerve og dermed fullt aktivere musklene i dorsiflexion, som den leverer (TA EDL og EHL). Riktig elektroden posisjonering resulterer i generasjonen av negative topper (Figur 3) under denne prosessen mens vinkelavvik til elektrodene eller høyere strømstyrke kan føre til stimulering av omkringliggende muskler, forårsaker co sammentrekning av det nærliggende muskler og antagonist muskler, produseres toppene av positive verdier.
Figur 5A viser representant force frekvens-kurven data fra musen over tid, hvor prosedyren ble gjentatt en gang i uken til 5 timepoints var fullført. Disse observasjonene har vist konsekvent kraft produksjonsverdier gjennom timepoints og/eller observasjoner målt. Denne prosedyren har også vist for å være konsekvent mellom mus målinger, som finne 5B viser representant området under kurven av FFC stimulert 5 ulike observasjoner i 6 mus testet en gang i uken.
Figur 1 : Programvaresystem. (A) kontrollere programvare illustrasjon av trinnene for å konfigurere parametrene "Instant Stim". Bakgrunnsbilde, klikk Oppsett | Instant Stim. På små dukket opp vinduet (foran foto), angi parametere. (B) illustrasjon av visningen "Sequencer" oppsett. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Museoppsett. Oversikt over plasseringen av bedøvet dyret. Høyre kneet klemmen er plassert slik at kneet er på 90° og slik at foten og ankelen er 90-graders vinkel (prikkede hvite linjen). Sammentrekning av dorsiflexors musklene oppnås ved stimulering av peroneal nerve, som ligger like under (distale til) leder av fibula. Vi bruker spesialdesignede elektroder (innfelt); men er p-elektroder som fulgte med enheten, eller kjøpes separat, også tilstrekkelig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Produksjonen fra plasseringen av elektrodene. Når elektrodene er plassert under huden og spenningen er startet, er topper med negative verdier observert. På dette punktet, er nå negative verdier (grønn linje) et viktig skritt i å sørge for at stimulering oppnås i dorsiflexor muskler bare (TA, EDL og EHL). Sanntids måling angis mellom de to røde linjene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Representant kurver. (A) prøve av makt kurven på 60 Hz (mus #06). (B) eksempel på tetanic kurven på 150 Hz (mus #03). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Representant tvinge frekvenskurve (FFC) og området under kurven dataene. (A) FFC (x-aksen) over 5 forskjellige timepoints (uker 1, 2, 3, 4 og 5) i en prøve mus (#05). (B) området under kurven (AU, y-aksen) av FFC over 5 forskjellige timepoints (mus #01, 02, 03, 04, 05 og 06. x-aksen). Resultater uttrykkes som gjennomsnittlig ± standard feil av måling (SEM) av fem timepoints (tester) i 6 mus og ble analysert av enveis ANOVA test (p < 0,05). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Måling av maksimal muskel kontraktile funksjonen på en nøyaktig og repeterbare måte er kritisk til progressiv vurdering av genetisk, metabolske og muskel forhold17. Tilsvarende kan i vivo muskel kontraktile funksjonen for vurdering av romanen behandlinger og legemiddelselskap for ødeleggende muskel forhold. Her viser vi måling av kraft produksjon av dorsiflexor musklene i musen lavere hindlimb gjennom en i vivo prosedyre.
Kommersielle apparatene er effektiv og hjelpsomt utfører denne ikke-invasiv prosedyre. Denne testen gir viktige fordeler knyttet til vurdering av muskel kontraktile funksjonen samtidig bevare en innfødt fysiologiske miljø, i hvilken blod forsyning og gir forblir intakt. På den annen side, knyttet sine ulemper til normalisering av kraft per enhet tverrsnitt av muskel (bestemt force), som bare kan konstatert i en isolert muskel som er høstet etter eksperimentering. Ikke-invasiv test kan imidlertid flere målinger av kontraktile bøyer musklene i samme dyr over tid, noe som resulterer i redusert antall forsøksdyr er påkrevd, spesielt hvis målet er å vurdere relativ endringer ( endringer i absolutt makt over tid).
Det er viktige skritt som må vurderes under denne prosedyren for å oppnå konsekvente data over på timepoints. En bør først forsøke å standardisere dyr plassering når det er mulig. Andre er under innstillingen det viktig å være forenlig med elektroden posisjonering slik at optimal stimulering kan nås via stimulering av peroneal nerve. Plasseringen av elektrodene bør være på den laterale siden av (i dette tilfellet til høyre) beinet, nær hodet av fibula og andre lenger ned den laterale siden av beinet (figur 2). Basert på dette, er skreddersydde elektrodene utformet slik at begge kan være plassert på samme posisjon hver gang. Imidlertid kan tilstrekkelig stimulering også oppnås ved hjelp av elektroden nålene med kommersielle apparatene. For det tredje er det avgjørende for negative topper under spenning installasjonen ved å slå klokken svingeren koblet til fotplaten. Korrekt plassering av musen etappe elektrodene med maksimal spenning installasjonsprogrammet har vist seg for å være en teknikk som kan utføres på samme musen over tid.
Muligheten til å vurdere og spore muskel funksjon på forskjellige timepoints på samme dyret er en viktig vurdering å karakterisere forskjellige muskelgrupper sykdommer, samt deres progresjon. Videre kan målingen av muskel dorsiflexion i mus være et verktøy for å vurdere effekten av mulige behandlinger i en innfødt fysiologiske miljø, med minimal metabolske belastning12. Dermed gir en teknikk i vurderingen muskel sykdom, progresjon og potensial behandling.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Finansiering fra dette prosjektet var fra skolen av trening og ernæring Sciences, Deakin University. Forfatterne vil gjerne takke Mr. Andrew Howarth for sitt omfattende arbeid i optimalisere elektroder enheten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1300A: 3-in-1 Whole Animal System – Mouse | Aurora Scientific Inc. | 305C-LR: Dual-Mode Footplate; 605A: Dynamic Muscle Data Acquisition And Analysis System; 701C: Electrical Stimulator and 809C: in-situ Mouse Apparatus | Complete muscle function system |
| Conductive gel | Livingstone | ECGEL250 | conductive gel used in the mice |
| Eye ointment | Alcon | Poly Visc | pharmaceutic product (ophthalmic use) |
| nonsteroidal anti-inflammatory drug (NSAID) | Ilium | Metacam | veterinary medicine (injectable 5mg/ml) |
| Isoflurane | Zoetis | Isoflo | veterinary inhalation Anaesthetic |
References
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- Gerlinger-Romero, F., Guimaraes-Ferreira, L., Yonamine, C. Y., Salgueiro, R. B., Nunes, M. T. Effects of beta-hydroxy-beta-methylbutyrate (HMB) on the expression of ubiquitin ligases, protein synthesis pathways and contractile function in extensor digitorum longus (EDL) of fed and fasting rats. The Journal of Physiological Sciences. 68 (2), 165-174 (2018).
- Pinheiro, C. H., et al. Metabolic and functional effects of beta-hydroxy-beta-methylbutyrate (HMB) supplementation in skeletal muscle. European Journal of Applied Physiology. 112 (7), 2531-2537 (2012).
- Metter, E. J., Talbot, L. A., Schrager, M., Conwit, R. Skeletal muscle strength as a predictor of all-cause mortality in healthy men. The Journal of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 57 (10), B359-B365 (2002).
- Foletta, V. C., White, L. J., Larsen, A. E., Leger, B., Russell, A. P. The role and regulation of MAFbx/atrogin-1 and MuRF1 in skeletal muscle atrophy. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 461 (3), 325-335 (2011).
- Zacharewicz, E., et al. Identification of microRNAs linked to regulators of muscle protein synthesis and regeneration in young and old skeletal muscle. PLoS One. 9 (12), e114009 (2014).
- Ryan, M. J., et al. Suppression of oxidative stress by resveratrol after isometric contractions in gastrocnemius muscles of aged mice. The Journal of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 65 (8), 815-831 (2010).
- Iyer, S. R., Valencia, A. P., Hernandez-Ochoa, E. O., Lovering, R. M. In Vivo Assessment of Muscle Contractility in Animal Studies. Methods in Molecular Biology. 1460, 293-307 (2016).
- Mintz, E. L., Passipieri, J. A., Lovell, D. Y., Christ, G. J. Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair. Journal of Visualized Experiments. (116), e54487 (2016).
- Hakim, C. H., Wasala, N. B., Duan, D. Evaluation of muscle function of the extensor digitorum longus muscle ex vivo and tibialis anterior muscle in situ in mice. Journal of Visualized Experiments. (72), e50183 (2013).
- Moorwood, C., Liu, M., Tian, Z., Barton, E. R. Isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies. Journal of Visualized Experiments. 71, e50036 (2013).
- Lovering, R. M., Roche, J. A., Goodall, M. H., Clark, B. B., McMillan, A. An in vivo rodent model of contraction-induced injury and non-invasive monitoring of recovery. Journal of Visualized Experiments. (51), e50036 (2011).
- Corona, B. T., Ward, C. L., Baker, H. B., Walters, T. J., Christ, G. J. Implantation of in vitro tissue engineered muscle repair constructs and bladder acellular matrices partially restore in vivo skeletal muscle function in a rat model of volumetric muscle loss injury. Tissue Engineering Part A. 20 (3-4), 705-715 (2014).
- Collins, B. C., et al. Deletion of estrogen receptor alpha in skeletal muscle results in impaired contractility in female mice. Journal of Applied Physiology (1985). 124 (4), 980-992 (2018).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old. The Journal of Physiology. 535 (Pt 2), 591-600 (2001).
- Vitzel, K. F., et al. In Vivo Electrical Stimulation for the Assessment of Skeletal Muscle Contractile Function in Murine Models. Methods in Molecular Biology. 1735, 381-395 (2018).
- Jackman, R. W., Kandarian, S. C. The molecular basis of skeletal muscle atrophy. American Journal of Physiology Cell Physiology. 287 (4), C834-C843 (2004).
