Summary
Mätning av gnagare skelettmuskulaturen kontraktila funktion är ett användbart verktyg som kan användas för att spåra sjukdomsprogression samt effekten av terapeutisk intervention. Här beskriver vi de icke-invasiva, i vivo bedömningen av dorsiflexor muskler som kan upprepas över tid i samma mus.
Abstract
Bedömning av skelettmuskulaturen kontraktila funktion är ett viktigt mått för både kliniska och forskningsändamål. Många förhållanden kan negativt påverka skelettmuskulaturen. Detta kan resultera i en förlust av muskelmassa (atrofi) och/eller förlust av muskel kvalitet (minskad kraft per enhet av muskel massa), vilka båda är utbredd i kronisk sjukdom, muskel-specifik sjukdom, immobilisering och åldrande (sarcopeni). Skelettmuskulaturen funktion hos djur kan utvärderas av en rad olika tester. Alla tester har begränsningar relaterade till fysiologiska testmiljön och valet av ett visst test ofta beror på vilken typ av experimenten. Här beskriver vi ett invivo, icke-invasiv teknik som inbegriper en bra och enkel bedömning av kraft frekvens-kurva (FFC) hos möss som kan utföras på samma djur över tid. Detta möjliggör övervakning av sjukdomsprogression och/eller effekten av en potentiell terapeutisk behandling.
Introduction
Skelettmuskulaturen är en viktiga metaboliska vävnad som består av cirka 40% av den totala kroppsvikten. Det spelar en avgörande roll i kontrollen av energi metabolism och homeostas1. Skelettmuskulaturen massa upprätthålls av en fin balans mellan protein syntes och nedbrytning1. Många sjukdomstillstånd påverkar dessa processer i skelettmuskler, vilket leder till en nettoförlust i muskelmassa (atrofi). Dessa inkluderar, men är inte begränsade till, cancer, AIDS, åldrande, fasta, och extremiteter immobilisering2,3. Den åldrande befolkningen, förlust av styrka är förknippad med en förlust av muskel massa och är en prediktor för all-fall dödlighet4. I detta sammanhang ger bedömning av muskelfunktion en viktig åtgärd vid fastställandet av effekten av terapeutiska strategier för att bekämpa och/eller förhindra skelettrelaterade muskelförtvining och förlust av funktion.
Forskare har använt många olika metoder och modeller för att förstå de molekylära vägarna muskel atrofi5,6 och konsekvenserna av dessa mekanismer på muskel kontraktila funktion2,3 ,7. Därför, korrelera förändringar på molekylär nivå till skillnader i muskelfunktion är absolut nödvändigt i förståelse hur molekylära förändringar kan påverka muskler funktionalitet.
Skelettmuskulaturen funktion, särskilt i små gnagare, utförs normalt med tre väl beskrivna förfaranden8,9 att upptäcka nedsatt kraft produktion och/eller övervaka sjukdomsprogression. (1) ex vivo; där muskel avlägsnas från djuret och inkuberas i ett bad lösning att bedöma den muskelfunktion använder fält stimulering10. (2) på plats. där proximala fastsättning av muskeln kvar i djuret och distala senan är ansluten till en kraftgivare, vilket gör att hjärtmuskeln funktion ska utföras av direkta nerv stimulering11. (3) In vivo; nerv-framkallat muskel där elektroderna placeras subkutant för att erhålla och tvinga produktion9,12. Medan dessa tre förfaranden används för olika ändamål, äger var och en de fördelar och nackdelar. Därför är det viktigt att välja en lämplig metod baserat på syftet med studien. Den största begränsningen med ex vivo experiment är avlägsnande av muskel från dess normala miljö och användning av fältet stimulering. Metoden jordbaserad underhåller en normal blodtillförsel och använder stimulering genom nerv, men normal anatomi förändras och arten av experimentet är terminal; Sålunda, detta omöjliggör uppföljning muskel funktion mätningar. Invivo metoden beskrivs här närmast härmar normal fysiologi däri Anatomi är ostört, neuromuskulära bunten förblir intakt, och experimentet är inte terminalen, så att uppföljande åtgärder inom samma djur över tid8.
Här beskriver vi ett invivo förfarande som tillåter flera mätningar av muskelfunktion i samma djur över tid. Detta förfarande innebär att bedömningen av musklerna i den främre crural facket — inklusive tibialis anterior(TA), extensor digitorum longus (EDL) och extensor hallicus longus (EHL) muskler, ansvarig för dorsalflexion — i en icke-invasiv förfarande genom fibular (kallas även peroneal) nervstimulering. TA tillhandahåller det mesta av styrkan för fotled dorsalflexion13, med endast minimala bidrag av EDL och EHL det kontroll rörelsen av tårna. Detta icke-terminal protokoll garanterar bevarandet av nerv-och blod. Detta tillåter för utredning av sjukdom evolution och behandling effekt över tiden i den mest fysiologiska miljön som för närvarande finns i en djurmodell.
Protocol
Alla experimentella rutiner godkändes av Deakin University djur etikkommittén (projekt #G19/2014).
1. utrustning Setup
- Se till att alla maskiner är korrekt anslutna.
- Slå på datorn, high-power bi-fas stimulator och dual-mode använder påtryckning systemet.
- Ställa in mus knä klämman på plattformen, liksom mus fotplattan på transductor.
- Slå på värme plattformen till 37 ° C.
- Öppna programvaran dynamiska muskel kontroll på skrivbordet.
Obs: Detta är den programvara som behövs för att utföra funktionstester.
2. programvara och modell Setup
- När programmet öppnas (figur 1), kalibrera givaren och välj Setup | Mina instrument | Kalibrera.
- På knappen ”Inställningar”, Välj InstantStim och ändra parametrarna ”kör Time” till 120 s (figur 1A).
Obs: Optimal spänning kan också uppnås genom utför enda ryckningar, manuellt ställa in, eller starta InstantStim så många gånger som behövs. - I fönstret typ-stånd märkt ”Autospara bas” för att mata in namnet på auto spara filens plats (t.ex., mouse1-datum-timepoint1). Klicka på kryssrutan till vänster om fönstret ”Autospara Base” och ändra den till Aktivera Autospara.
- Överst i kontrollen DMC skärmen Gå till Sequencer, som kommer att öppna en ny pop up-fönster. Välj Öppna sekvens och premade protokollet ska användas (figur 1B). Klicka på belastning sekvens | Stäng fönstret.
Obs: Det här steget används för att generera en kraft frekvens-kurva (FFC) test (1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 250 Hz). - Ställ ”RANGE” vredet till 10 mA på den bi-fas-stimulatorn.
Obs: Se till att ”justera” vredet (rätt nästa botten) på noll. Denna finjustering tillåter installationen av elektroderna.
3. musinställningar
Obs: Alla kraft mätningar utfördes på vildtyp hanmöss (C57BI/6) vid 12 veckors ålder.
- Placera varje mus i anestesi kammaren med en syre flöde 1 L/min med 5% isofluran (via noskon inandning) tills musen förlorar medvetandet. Bekräfta adekvat anestesi via förlust av foten reflexen.
- Ta bort alla hår på det högra benet av musen genom rakning med elektriska hårklippningsmaskiner.
- Placera djuret i ryggläge på uppvärmd plattformen och rengör höger ben (båda sidor kan användas) med 70% alkohol och jod. Vid denna punkt, justera isofluran till 2% (med syre flöde vid 1 L/min) och applicera den ledande gel på huden där elektroderna ska placeras.
Obs: Använda en rektal temperatursond och övervaka kroppstemperaturen under förfaranden som du kan tillämpa ögonsalva för att förhindra eventuella torrhet eller skador på ögat. - Placera foten på fotplattan och fäst med medicinsk tejp. Klamma fast knät för att stabilisera och immobilisera benet under förfarandet.
Obs: Vissa studier har beskrivit med en mycket tunn nål in genom den proximala tibia (posteriort dorsiflexors muskler)12 för att ge stabilisering. Detta protokoll väljer en klämma, eftersom detta ger tillräcklig stabilisering utan onödig kompression/skada knäet. Klämman undviker också potentiella inflammation som en trans-bendefekter pin kan skapa, samtidigt tillåta korrekt bedömning av muskel kontraktilitet. Dessutom varit mus knä klämman framgångsrikt använt14. - Vid denna punkt, använda rattarna på plattformen för att placera mus bakbenet så att det finns en 90° vinkel på vristen (figur 2).
4. optimering av elektroder Position
- När musen placeras på plattformen, Placera elektroderna under huden (subkutant) i höger ben.
Obs: Detta är ett avgörande steg, och vissa ompositionering kan krävas för att få önskad position under installationen i steg 4,4. - Placera elektroderna på den laterala sidan av höger ben; Placera en nära huvudet av fibula och andra elektroden mer distalt på den laterala sidan av benet (figur 2).
Obs: En skräddarsydd elektrod system är utformat för att optimera detta steg. Men kan detta test utföras med elektrod nålar som tillhandahålls av tillverkaren i detta system. - När dessa steg uppnås, på den kraftfulla bi-fas stimulatorn justera vredet märkt ”justera” som krävs för att erhålla en stimulering av peroneal nerv som resulterar i maximal dorsalflexion vridmoment.
Obs: För vuxna vildtyp möss, detta intervall är mindre än 2 mA; Detta kan dock vara beroende av storlek, ålder och kön av djuret. Kraft produktion (toppar av kurvor) bör ökas långsamt tills den maximala kraften uppnås. - Vid stimulering, medurs givaren att ge negativa värden (figur 3), vilket är viktigt att se till att elektroderna stimulerar bara dorsiflexor musklerna av peroneal nerv. När detta steg är uppnått, stabilisera elektroderna med en klämma, förhindra någon rörelse under förfarandet.
Obs: Topparna ökar långsamt i storlek, och det maximala strömstyrkan bestäms som nivå där tre eller fler i rad stimuli resultera i identiska kontraktilitet. Motstå att vrida strömstyrkan högre än nödvändigt. maximal strömstyrka kommer att stimulera de angränsande och potentiellt antagonist muskler att ingå avtal, orsakar samtidig kontraktion, som kan generera toppar av positiva värden. - Stoppa den omedelbar Stim på programvaran.
- Slå på knappen märkt ”starta Sequence” för att starta tidigare inställningssekvensen (enligt beskrivningen i steg 2,4) på huvudskärmen.
5. avsluta förfarandet
- När kraft mätningarna är klar, ta bort elektroderna, knä klämman och ta bort foten tejpen.
- Stäng av isofluran och underhålla syre leverans för några minuter medhjälp djur återhämtningen. När musen börjar röra sig eller återfår medvetandet och kan själv rätt, återgå musen till sin bur.
Obs: En icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel (NSAID) kan injiceras subkutant (1 mg/kg meloxikam) att förhindra eventuella obehag och/eller ömhet efter ingreppet.
6. dataanalys
- Öppna programvaran data analys.
- Gå till Hög genomströmning (överst till vänster på skärmen). Välj Kraft frekvens att analysera ovanstående beskrivs inställningssekvensen.
- Välj manuellt och ändra värdet ”End markören” till 3. Också välja Bort baslinjen.
- Klicka på Välj filer att komma åt tidigare utfört proceduren och klicka sedan på analysera. På denna punkt kan resultatet nås på skärmen eller exporteras till ett kalkylblad för vidare analys och/eller beräkningar.
Obs: Data mäts i mN; vridmomentet kan dock beräknas genom att multiplicera värdet kraft med längden på hävarmen (absoluta styrka). Om normalisering krävs (specifik kraft), vridmoment kan normaliseras till kroppsvikt eller terminal experiment kan utföras för att samla in muskelmassa av åldersmatchade.
Representative Results
Kraft-frekvenskurvan är ett användbart test där musklerna stimuleras genom högre och lägre frekvenser att skilja suboptimala och optimal kraft Svaren15. Kraften på lägre frekvenser kan stimulera en enda twitch, aktivera färre och mindre motoriska enheter, och vid högre frekvenser nås en stabil topp, där isolerade ryckningar smält (stelkramp), når maximal kraft genom att aktivera alla motoriska enheter16 . I testet presenteras, den tetanic kurva börjar på ~ 60 Hz, där potentiering kan visualiseras (figur 4A) och den maximala kraften bestäms vid ~ 150 Hz (figur 4B), när platån nås med en avslutade smält kurva9, 16.
Någon variant av dessa resultat kan tyda på att musklerna inte är korrekt stimuleras av elektroderna. Elektrodplacering är ett viktigt steg i utarbetandet av detta förfarande, som elektrisk stimulering måste vara korrekt placerad för att innerverar den peroneal nerven och därmed fullt ut aktivera musklerna i dorsalflexion, som den levererar (TA EDL och EHL). Rätt elektrod placering resulterar i framtagningen av negativa toppar (figur 3) under denna process, medan feljusteringen av elektroder eller högre strömstyrka kan leda till stimulering av omgivande muskler, orsakar samtidig kontraktion av den angränsande muskler och antagonist muskler, som i sin tur genererar toppar av positiva värden.
Figur 5A visar representativa kraft frekvenskurvan data från en mus över tiden, där förfarandet upprepades en gång i veckan tills 5 tidpunkter slutfördes. Dessa observationer har visat konsekvent kraft produktionsvärden i hela den tidpunkter eller observationer mätt. Detta förfarande har också visat sig överensstämma mellan möss mätningar, som figur 5B visar representant arean under kurvan för FFC stimuleras över 5 olika observationer i 6 möss testas en gång i veckan.
Figur 1 : Programvarusystem. (A) Kontrollera programvara illustration av stegen för att ställa in parametrarna ”Instant Stim”. Bakgrunden fotot, klicka på Setup | Instant Stim. På den lilla dök upp fönster (främre foto), ställa in parametrar. (B) Illustration av vyn ”Sequencer” setup. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Musinställningar. Översikt av placera av den sövda djuren. Höger knä klämman placeras så att knäet är i 90° och så att foten och fotleden i 90° vinkel (streckade vita linjen). Sammandragning av dorsiflexors musklerna uppnås genom stimulering av peroneal nerv, som ligger precis under (distalt) huvudet av fibula. Vi använder specialdesignade elektroder (infälld); visarelektroderna som medföljer enheten eller köps separat, är dock också tillräckligt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Utdata från placering av elektroderna. När elektroderna placeras under huden och spänningen initieras, observeras toppar med negativa värden. Vid denna punkt, är nå negativa värden (gröna linjer) ett avgörande steg för att se till att stimulans uppnås i dorsiflexor muskler bara (TA, EDL, och EHL). Realtid mätningen indikeras mellan de två röda linjerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Representativa kurvor. (A) prov av kraft kurvan vid 60 Hz (mus #06). (B) prov av tetanic kurvan vid 150 Hz (mus #03). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Representant tvinga frekvenskurvan (FFC) och arean under kurvan data. (A), FFC (x-axeln) över 5 olika tidpunkter (vecka 1, 2, 3, 4 och 5) i en prov mus (#05). (B) Area under kurvan (AU, y-axeln) av FFC över 5 olika tidpunkter (mus #01, 02, 03, 04, 05 och 06, respektive; x-axeln). Resultaten uttrycks som medelvärde ± medelfelet för mätning (SEM) av fem tidpunkter (tester) i 6 möss och analyserades av envägs ANOVA test (p < 0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Mätning av maximal kontraktila muskelfunktion på ett exakt och repeterbar sätt är kritiska till progressiv utvärdering av genetiska, metaboliska och muskel villkorar17. På samma sätt tillåter invivo kontraktila muskelfunktion för bedömning av nya behandlingar och therapeutics för försvagande muskel villkor. Vi visar häri mätning av kraft produktion av dorsiflexor musklerna i mus lägre bakbenet genom ett förfarande för Invivo.
Kommersiella apparaturar är effektiva och till hjälp för att utföra denna icke-invasiv förfarande. Detta test ger viktiga fördelar relaterade till bedömningen av kontraktila muskelfunktion samtidigt bevara en native fysiologisk miljö, där blodet leverans och innervation förblir intakt. Däremot, är dess nackdelarna relaterade till normalisering av kraft per enhet av tvärsnittsarea för muskel (specifik kraft), som endast kan fastställas i en isolerad muskel som skördas efter experimenterande. Icke-invasiva testet ger dock flera mätningar av kontraktila funktion av flexor musklerna på samma djur över tid, vilket resulterar i minskat antal försöksdjur som krävs, speciellt om målet är att bedöma relativa förändringar ( förändringar i absoluta kraft över tid).
Det finns viktiga steg som måste beaktas under proceduren för att uppnå konsekventa data över tidpunkter. Först bör man försöka standardisera djur positionering när det är möjligt. Andra är under inställningen upp det viktigt att vara konsekvent med elektrod positionering så att optimal stimulering kan nås via stimulering av peroneal nerv. Placeringen av elektroderna bör på den laterala sidan av (i detta fall höger) benet, nära huvudet av fibula och andra längre ner på den laterala sidan av benet (figur 2). Baserat på detta är skräddarsydda elektroderna utformade som sådan att både kan placeras på samma position varje gång. Dock kan tillräcklig stimulans också uppnås med elektrod nålar med de kommersiella apparaturarna. För det tredje är det avgörande att uppnå negativa toppar under installationen av spänningen genom att vrida medsols givaren ansluten till fotplattan. Korrekt positionering av mus ben elektroderna med maximal spänning inställning har visat sig vara en teknik som kan utföras på samma mus över tid.
Förmågan att bedöma och spåra muskelfunktion vid olika tidpunkter på samma djur är en viktig bedömning att karakterisera olika muskelsjukdomar samt deras progression. Denna mätning av muskel dorsalflexion i möss kan dessutom vara ett verktyg för att bedöma effekten av potentiella behandlingar i en native fysiologisk miljö, med minsta metabol stress12. Det ger således en teknik i bedömning av muskel sjukdomen, dess förlopp och potential behandling.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Finansiering från detta projekt var från skolan av motion och näring vetenskaper, Deakin University. Författarna vill tacka Mr Andrew Howarth för omfattande arbete i att optimera enhetens elektroder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1300A: 3-in-1 Whole Animal System – Mouse | Aurora Scientific Inc. | 305C-LR: Dual-Mode Footplate; 605A: Dynamic Muscle Data Acquisition And Analysis System; 701C: Electrical Stimulator and 809C: in-situ Mouse Apparatus | Complete muscle function system |
| Conductive gel | Livingstone | ECGEL250 | conductive gel used in the mice |
| Eye ointment | Alcon | Poly Visc | pharmaceutic product (ophthalmic use) |
| nonsteroidal anti-inflammatory drug (NSAID) | Ilium | Metacam | veterinary medicine (injectable 5mg/ml) |
| Isoflurane | Zoetis | Isoflo | veterinary inhalation Anaesthetic |
References
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- Gerlinger-Romero, F., Guimaraes-Ferreira, L., Yonamine, C. Y., Salgueiro, R. B., Nunes, M. T. Effects of beta-hydroxy-beta-methylbutyrate (HMB) on the expression of ubiquitin ligases, protein synthesis pathways and contractile function in extensor digitorum longus (EDL) of fed and fasting rats. The Journal of Physiological Sciences. 68 (2), 165-174 (2018).
- Pinheiro, C. H., et al. Metabolic and functional effects of beta-hydroxy-beta-methylbutyrate (HMB) supplementation in skeletal muscle. European Journal of Applied Physiology. 112 (7), 2531-2537 (2012).
- Metter, E. J., Talbot, L. A., Schrager, M., Conwit, R. Skeletal muscle strength as a predictor of all-cause mortality in healthy men. The Journal of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 57 (10), B359-B365 (2002).
- Foletta, V. C., White, L. J., Larsen, A. E., Leger, B., Russell, A. P. The role and regulation of MAFbx/atrogin-1 and MuRF1 in skeletal muscle atrophy. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 461 (3), 325-335 (2011).
- Zacharewicz, E., et al. Identification of microRNAs linked to regulators of muscle protein synthesis and regeneration in young and old skeletal muscle. PLoS One. 9 (12), e114009 (2014).
- Ryan, M. J., et al. Suppression of oxidative stress by resveratrol after isometric contractions in gastrocnemius muscles of aged mice. The Journal of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 65 (8), 815-831 (2010).
- Iyer, S. R., Valencia, A. P., Hernandez-Ochoa, E. O., Lovering, R. M. In Vivo Assessment of Muscle Contractility in Animal Studies. Methods in Molecular Biology. 1460, 293-307 (2016).
- Mintz, E. L., Passipieri, J. A., Lovell, D. Y., Christ, G. J. Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair. Journal of Visualized Experiments. (116), e54487 (2016).
- Hakim, C. H., Wasala, N. B., Duan, D. Evaluation of muscle function of the extensor digitorum longus muscle ex vivo and tibialis anterior muscle in situ in mice. Journal of Visualized Experiments. (72), e50183 (2013).
- Moorwood, C., Liu, M., Tian, Z., Barton, E. R. Isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies. Journal of Visualized Experiments. 71, e50036 (2013).
- Lovering, R. M., Roche, J. A., Goodall, M. H., Clark, B. B., McMillan, A. An in vivo rodent model of contraction-induced injury and non-invasive monitoring of recovery. Journal of Visualized Experiments. (51), e50036 (2011).
- Corona, B. T., Ward, C. L., Baker, H. B., Walters, T. J., Christ, G. J. Implantation of in vitro tissue engineered muscle repair constructs and bladder acellular matrices partially restore in vivo skeletal muscle function in a rat model of volumetric muscle loss injury. Tissue Engineering Part A. 20 (3-4), 705-715 (2014).
- Collins, B. C., et al. Deletion of estrogen receptor alpha in skeletal muscle results in impaired contractility in female mice. Journal of Applied Physiology (1985). 124 (4), 980-992 (2018).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old. The Journal of Physiology. 535 (Pt 2), 591-600 (2001).
- Vitzel, K. F., et al. In Vivo Electrical Stimulation for the Assessment of Skeletal Muscle Contractile Function in Murine Models. Methods in Molecular Biology. 1735, 381-395 (2018).
- Jackman, R. W., Kandarian, S. C. The molecular basis of skeletal muscle atrophy. American Journal of Physiology Cell Physiology. 287 (4), C834-C843 (2004).
