Summary
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य आणविक जीव विज्ञान, जैव रसायन, फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई, और प्राथमिक इन विट्रो का उपयोग करता है (जैसे, क्लोनोजेनिक) जैसे बहाव अनुप्रयोगों की एक किस्म के लिए वयस्क चूहों के पृष्ठीय त्वचा से epidermal keratincytes को अलग करने के लिए है केराटिनोसाइट्स)।
Abstract
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल वयस्क मादा चूहों से प्राथमिक केराटिनसाइट्स कटाई की एक विश्वसनीय विधि है (54 - 2 दिन पुराने) लगभग 30 x 106 माउस प्रति व्यवहार्य कोशिकाओं उपज. प्राथमिक वयस्क माउस keratincytes मादा चूहों के पृष्ठीय त्वचा से काटा जाता है. पुरुष चूहों ($6 सप्ताह पुराने) प्रयोग की आवश्यकताओं के आधार पर keratincyte कटाई के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Euthanized चूहों मुंडा और povidone आयोडीन और इथेनॉल समाधान (70% शराब) में सीरियल washes के साथ बाँझ कर रहे हैं. चूहों को कीटाणुरहित करने के बाद, पृष्ठीय त्वचा को हटा दिया जाता है और चमड़े के नीचे की वसा और मांसपेशियों को स्कैल्पल के साथ हटा दिया जाता है और खारिज कर दिया जाता है। खाल छोटे टुकड़ों में काट रहे हैं और एक हल्के, कम तापमान trypsinization के साथ इलाज के लिए epidermis से कम dermis अलग. खुरचनी epidermises कम गति पर हलचल कर रहे हैं, बालों को दूर करने के लिए फ़िल्टर, गिना, और संस्कृति के माध्यम में फिर से निलंबित. इस विधि कई downstream अनुप्रयोगों के लिए अत्यधिक कृषि योग्य कोशिकाओं का एक उत्कृष्ट एकल सेल निलंबन प्रदान करता है.
Introduction
Mammalian त्वचा पूरे शरीर को शामिल किया गया है और कार्यों की एक भीड़ में कार्य करता है (उदा. एक प्राथमिक शारीरिक बाधा, तापमान विनियमन, और नमी प्रतिधारण). पिछले पांच दशकों में, माउस त्वचा पर बुनियादी अनुसंधान संरचना और त्वचा के समारोह पर नई जानकारी मिली है. माउस त्वचा मॉडल बहुत रासायनिक या पराबैंगनी विकिरण प्रेरित carcinogenesis के जटिल आणविक तंत्र के पीछे बुनियादी जीव विज्ञान की समझ में मदद मिली है. इन माउस त्वचा मॉडल मानव त्वचा रोगों और उनके शमन की समझ की दिशा में एक महत्वपूर्ण योगदान प्रदान की. बाल कूप विकासात्मक जीव विज्ञान, स्टेम सेल अनुसंधान, कार्सिनोजेनेसिस, और बाह्य त्वचा की आनुवंशिक अन्वेषण में प्राथमिक केराटिनोसाइट्स के आगे आणविक विच्छेदन का पता लगाने के लिए, यह अक्सर अलग करने के लिए वांछनीय है और संस्कृति प्राथमिक उपकला चूहों त्वचा से keratinocytes विवो प्रयोगों में के साथ समानांतर में उपयोग करने के लिए. इस विधि को विकसित करने में प्रेरक कारक क्लोनोजेनिक एपिडरमल और बाल कूप स्टेम कोशिकाओं1,2के लिए इन विट्रो परख की आवश्यकता थी . क्लोनेजेनिक परख3, फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई, और प्रवाह साइटोमेट्री3,4के लिए उपयुक्त एपिडर्मल कोशिकाओं के एकल सेल निलंबन की भी तत्काल आवश्यकता थी. इस विधि के लाभ एक मजबूत फसल अन्य तरीकों से अधिक परिमाण के एक आदेश में वृद्धि कर रहे हैं5,6, बाल follicles के उपकला भाग के शामिल किए जाने, और काटा कोशिकाओं के उच्च culturability. 1980 के दशक में, वहाँ कोई ज्ञात तरीके है कि इन आवश्यकताओं को पूरा कर सकता था. बाद के वर्षों में, इस विधि को सेल उपज बढ़ाने के लिए परिष्कृत किया गया था। इस विधि की मुख्य सीमा कुछ ट्रिप्सिन संवेदनशील एंटीबॉडी का मास्किंग होगी जो इम्यूनोरेसक्रियता6से समझौता करेगी .
चूहों विशिष्ट रोगजन नि: शुल्क दिशा निर्देशों के अनुसार पशुपालन प्राप्त किया. एक से पांच मादा चूहों 54 - 2 दिन की उम्र प्राप्त की गई. पुराने चूहों में, बाल चक्र के एनेजेन चरण (वृद्धि) के कारण केराटिनसाइट्स की व्यवहार्यता कम हो जाएगी। इसके अलावा, trypsinization की प्रक्रिया युवा चूहों की तुलना में अधिक कठिन है. कटाई प्रक्रिया सफलतापूर्वक पुरुष की तुलना में मादा चूहों की पतली त्वचा के लिए अनुकूलित किया गया है. पुरुष चूहों आम तौर पर keratincyte फसल के लिए उपयोग नहीं कर रहे हैं के रूप में वे आवास के दौरान एक दूसरे के साथ लड़ने की प्रवृत्ति है और इसलिए खरोंच या त्वचा पर घाव छोड़ सकते हैं.
Protocol
सभी कशेरुकी पशु उपयोग प्रोटोकॉल मिनेसोटा संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति की सिफारिश की NIH और सरकार के दिशा निर्देशों के अनुसार विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया है.
1. फीडर परत प्रारंभिक और subculturing
- 1-2 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में शीशी रखकर तरल नाइट्रोजन टैंक से जमे हुए स्विस माउस 3T3 युक्त एक सेल शीशी था। शीशी में कोशिकाओं की संख्या लगभग 1 x 106है ।
- बर्फ के अंतिम sliver पिघल गया है जब 3T3 सेल शीशी निकालें. ट्यूब को 70% अल्कोहल के साथ साफ करें। फिर, एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के लिए शीशी हस्तांतरण.
- कोशिकाओं को धीरे-धीरे एक टी-150 फ्लास्क में स्थानांतरित करें, और सीजीएम माध्यम के 1 एमएल के साथ 3T3 शीशी को कुल्ला करें। धीरे-धीरे कोशिकाओं में प्री-वार्म्ड 3T3 पूर्ण वृद्धि माध्यम (सीजीएम) के 30 एमएल जोड़ें। 3T3 फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं को समान रूप से फैलाने के लिए फ्लास्क को धीरे से रॉक करें। सेल लाइन विवरण, दिनांक, और मार्ग संख्या के साथ फ्लास्क को उचित रूप से लेबल करें।
- 5% सीओ2 और 95% आर्द्रता के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
नोट: ATCC के अनुसार, स्विस माउस 3T3 के दोहरीकरण समय 18 ज है; जब confluent (संपर्क बाधित), घनत्व के बारे में 40,000 कोशिकाओं प्रति सेमी2है. हम शुरू करने के बाद 10-15 मार्ग के भीतर 3T3 की एक विशेष लाइन का उपयोग करें. अधिक तेजी से विकास या धुरी के आकार की कोशिकाओं की उपस्थिति उच्च मार्ग पर हो सकता है और आमतौर पर एक संकेत है कि 3T3 वयस्क माउस keratincytes के लिए फीडर कोशिकाओं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रदर्शन नहीं करेगा. यदि तेजी से विकास होता है, यह कम मार्ग कोशिकाओं से एक नई लाइन आरंभ करने के लिए बेहतर है. - मृत कोशिकाओं और शेष DMSO (cryopservation एजेंट) को हटाने के लिए 24 एच के बाद मीडिया बदलें, और उसके बाद दो बार साप्ताहिक. कोशिकाओं को 80% संगम के आसपास बढ़ने और संस्कृति दीक्षा के लिए टी-150 फ्लास्क का उपयोग करने की अनुमति दें। प्रारंभ होने के बाद उपकल्चर के लिए टी-225 फ्लास्क का प्रयोग करें।
- 3T3 फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं को उप-कल्चर करने के लिए, सेल कल्चर इनक्यूबेटर से फ्लास्क को हटा दें और जेंटामाइसिन के साथ ठंड बाँझ पीबीएस (1x) के साथ दो बार धोएं। पूर्व-वार्म्ड (37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान) ट्रिप्सिन समाधान (0.25%) के पाइप्ट 10 एमएल प्रत्येक टी-225 फ्लास्क में।
- फ्लास्क को 3-8 मिनट के लिए वार्मिंग प्लेट पर रखें। फ्लास्क निकालें और कोशिकाओं को अलग करने के लिए फ्लास्क की दीवारों को टैप करने के लिए हथेलियों का उपयोग करें और उल्टे माइक्रोस्कोप के नीचे सेल टुकड़ी की पुष्टि करें। ट्रिप्सिन समाधान अलग 3T3 कोशिकाओं के साथ बादल दिखाई दे सकता है।
- फ्लास्क की कोशिका वृद्धि की सतह को धोने और ट्रिप्सिनीकृत सेल को 50 एमएल शंकुन ट्यूब में 30 एमएल सीजीएम में स्थानांतरित करने के लिए ट्रिप्सिन विलयन 3-4x को पाइप करें। फ्लास्क 3-5x को 50 एमएल शंकु नली से सीजीएम-ट्रिप्सिन-सेल मिश्रण के 10 एमएल के साथ पुनः धोने।
नोट: दो फ्लास्क सामग्री की सामग्री एक 50 एमएल ट्यूब में जोड़ा जा सकता है; यदि केवल एक फ्लास्क का उपयोग किया जाता है, तो 50 एमएल ट्यूब में सीजीएम के 20 एमएल में 10 एमएल ट्रिप्सिन/कोशिकाओं को रखें। - 50 एमएल शंकु नली को 4 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट के लिए 160 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करना।
- अब सुपरनेंट को श्वास लें और सीजीएम के 5 एमएल के साथ सेल पेलेट को फिर से शुरू करें, पाइपिंग धीरे से $ 10x को पूरी तरह से सेल गोली को बाधित करने के लिए। 50 एमएल शंकु नली की कुल मात्रा को 15 एमएल तक लाने के लिए सीजीएम का 10 एमएल जोड़ें।
- फिर से मिक्स $ 10x और 3 अलग टी 150 फ्लास्क में सेल निलंबन के 5 एमएल जगह है। उपकृषि अनुपात टी-225 फ्लास्क में 1:3 या टी-150 फ्लास्क में 1:4 है। फ्लास्क में से प्रत्येक के लिए पूर्व-वार्म 3T3 सीजीएम के 30 एमएल जोड़ें।
- सेल लाइन नाम, सेल बोने की तारीख, और मार्ग संख्या के साथ फ्लास्क लेबल करें।
- उपकृषि चरण में अपकेंद्रण के बाद 3T3 कोशिकाओं को फ्रीज करने के लिए, अपकेंद्रित्र से 50 एमएल ट्यूब को हटा दें और बर्फ की बाल्टी पर रखें। सुपरनेंट को प्रेरित करें और सेल गोली को 5% DMSO-DMEM मिश्रण के 1 एमएल के साथ पुन: असाइन करें (प्रत्येक फ्लास्क काटा के लिए तालिका 1देखें)।
- प्रत्येक cryovial में सेल निलंबन के साथ DMSO-DMEM मिश्रण के 1 एमएल प्लेस (एक cryovial प्रति 3T3 फ्लास्क काटा). पासेज नंबर, सेल लाइन नाम (3T3) के साथ शीशी लेबल, और तारीख है कि कोशिकाओं जमे हुए थे.
- सेल फ्रीजर जार में इन 3T3 सेल शीशियों प्लेस (सामग्री की तालिकादेखें) और के लिए -70 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर के लिए स्थानांतरण और सावधान हटाने और सेल फ्रीजर जार से शीशियों हस्तांतरण और लंबी अवधि के भंडारण के लिए एक तरल नाइट्रोजन भंडारण टैंक में जगह अगले उपयोग तक . सेल लाइन नाम, टैंक में स्थान और प्रयोगशाला तरल नाइट्रोजन सूची शीट में तारीख के बारे में जानकारी दर्ज करें।
2. एक्स-रे विकिरण और सीडिंग के लिए 3T3 फीडर परत की तैयारी
- 3T3 कोशिकाओं को उनके विकिरण से पहले एक सप्ताह की तैयारी और उन्हें 100% संगम विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं। 3T3 कोशिकाओं को आम तौर पर 120 से 130 के मार्ग के भीतर हैं.
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प्राथमिक keratincytes के सफल क्लोनोजेनिक परख के लिए, 3T3 कोशिकाओं बोने से पहले, सतह कोट एक कोलेजन के साथ 60 मिमी पेट्री व्यंजन.
- नीचे की सतह को कोट करने के लिए 60 मिमी पेट्री व्यंजनों में कोलेजन-कोटिंग समाधान के 2-3 एमएल के आसपास पाइपेट और अतिरिक्त कोलेजन-कोटिंग तरल को हटा दें (तालिका 1देखें)। पेट्री व्यंजन को कम से कम 1 एच के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें। व्यंजन इनक्यूबेटर में सूखन न करें।
- एक्स-रे विकिरण कदम: चरणों का पालन करें 1.4-1.6. सेल गोली को फिर से निलंबित करने, शंकु ट्यूब को बंद करने और पैराफिन सीलिंग फिल्म के साथ सील करने के लिए नए सीजीएम के 50 एमएल का उपयोग करें। किसी भी संदूषण से बचने के लिए, प्लास्टिक की थैलियों का उपयोग करने के लिए डबल बैग पराफिन सील सेल ट्यूब और बर्फ पर जगह युक्त. एक mitomycin आधारित वैकल्पिक फीडर परत keratincyte संस्कृति7के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है .
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एक जैविक एक्स-रे मशीन के साथ एक 5,000 रेड (50 Cgy) खुराक के साथ 50 एमएल शंकु ट्यूब में फाइब्रोब्लास्ट 3T3 कोशिकाओं को विकिरण। सीजीएम मीडिया के साथ इन कोशिकाओं को विकिरण करें।
- एक्स-रे विकिरण के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट के लिए 160 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं। सुपरनेंट मीडिया को प्रेरित करें और धीरे से सीजीएम के 5 एमएल के साथ सेल गोली को फिर से शुरू करें। अब मध्यम और triturate 10x के अतिरिक्त 25 एमएल के साथ 30 एमएल के लिए अंतिम मात्रा ले आओ. इन triturating कदम क्लोनोजेनिकता परख के लिए एक समान 3T3 फाइब्रोब्लास्ट परत के लिए महत्वपूर्ण हैं।
- व्यवहार्य सेल गिनती: एक नियमित रूप से गिलास हेमोसाइटोमीटर का उपयोग कर keratincytes गणना. कोशिकाओं के लगभग 0.5 एमएल ले लो और एक 1.5 एमएल ट्यूब में जगह. सेल मिश्रण के 200 डिग्री सेल्सियस निकालें और 0ण्4% ट्रिपैन नीले विलयन और मिश्रण 3-4x की समान मात्रा जोड़ें। एक हेमोसाइटोमीटर के साथ स्थानांतरण कोशिकाओं और व्यवहार्य कोशिकाओं के रूप में सभी नाभिकीय कोशिकाओं (छोटे सोने और गुलाबी कोशिकाओं) गिनती। व्यवहार्य सोने की कोशिकाओं के अंतिम एकाग्रता की गणना.
- पिपेट 1 x 106 3T3 कोशिकाओं (कम से कम 7 x 105) कोशिकाओं का उपयोग किया जा सकता है) में 60 मिमी कोलेजन लेपित पेट्री व्यंजन (चरण 2.2) और धीरे से संशोधित उच्च कैल्शियम विलियम्स ई मीडिया के 4 एमएल जोड़ें (तालिका 1देखें )। ताजा बीज 3T3 कोशिकाओं 24 एच के लिए संलग्न करने के लिए अनुमति दें। अगले दिन, ताजा प्राथमिक keratincyte फसल और उन्हें क्लोनोजेनिक परख के लिए संलग्न 3T3 फाइब्रोब्लास्ट परत के शीर्ष पर बीज के रूप में नीचे संकेत दिया.
3. प्राथमिक केरातिनोसाइट हार्वेस्टिंग और सीडिंग
- अनुमोदित पशु सुविधा/IACUC मानकों के अनुसार सीओ2 इनहेलेशन के माध्यम से चार से पांच वयस्क मादा चूहों की गणना करें। हालांकि, इस प्रोटोकॉल भी एकल महिला /
- एक बिजली के जानवर क्लिपर के साथ पृष्ठीय फर के लगभग 9 सेमी2 क्लिप और पर्याप्त povidone आयोडीन एंटीसेप्टिक समाधान के साथ एक 500 एमएल जार में सभी काटा चूहों जगह (नहीं साफ़) उन्हें 1-2 मिनट के लिए कवर करने के लिए. जार अच्छी तरह से समान रूप से कोट करने के लिए एंटीसेप्टिक कोट करने के लिए चूहों पर समाधान.
- समाधान बंद डालो और साफ पानी के साथ कुल्ला जब तक तरल स्पष्ट चलाता है. एक ही एंटीसेप्टिक धोने एक पानी कुल्ला के बाद दोहराएँ. आयोडीन समाधान के साथ एंटीसेप्टिक धोने के बाद, 5-10 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में सभी चूहों लेना.
नोट: प्रकाश फर के साथ चूहे (जैसे, BALB/c) एंटीसेप्टिक आयोडीन washes से एक मामूली पीले रंग बनाए रखने, जबकि गहरा चूहों (जैसे, C57BL/ विशेष रूप से, सेल व्यवहार्यता या संस्कृति विकास पीले रंग के कारण प्रभावित नहीं है.
- ध्यान से एक laminar प्रवाह हुड में अंगूठे के सम्पऔर कैंची का उपयोग कर काटा पृष्ठीय त्वचा को हटा दें। पीबीएस/2x जेंटामाइसिन से भरी शंकु ट्यूब में एक्साइज्ड पृष्ठीय त्वचा रखें। संस्कृति में स्तन कोशिका संदूषण को रोकने के लिए अधर पक्ष त्वचा का उपयोग करने से बचें।
- ऑटोक्लेव्ड संदंश और स्केलपेल का उपयोग करके, एक समय में एक पृष्ठीय त्वचा को एक पतली पेट्री डिश पर बालों वाली साइड में रखें। त्वचा के ऊतकों के अधर पक्ष से वसा सहित सभी चमड़े के नीचे ऊतक scraping शुरू जब तक यह अर्द्ध-translucent है. त्वचा (बाल कूप हिस्सा) फाड़ के बिना चमड़े के नीचे ऊतक के अधिकतम निशान को दूर करने की कोशिश करो. इसके अलावा, एक लंबे समय के लिए परिमार्जन न करें और त्वचा सुखाने से बचें।
- पीबीएस समाधान में स्क्रैप त्वचा रखें जब तक अन्य सभी शेष खाल संसाधित कर रहे हैं. एक स्केलपेल का उपयोग करना, 0.5 सेमी x 1-1.5 सेमी स्ट्रिप्स में खाल टुकड़ा और एक बाँझ पेट्री डिश पर बालों की ओर जगह है.
- ध्यान से पिपेट 20 एमएल PBS/2x Gentamicin समाधान trypsin के साथ मिश्रित (0.25%) एक 100 मिमी x 20 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश में. बाँझ संदंश का उपयोग करना, खाल हस्तांतरण और उन्हें एक 32 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 2 एच के लिए trypsin समाधान की सतह पर बालों की ओर फ्लोट.
नोट: Trypsinization समय और तापमान उच्च कृषि योग्य प्राथमिक keratincytes की अच्छी उपज के लिए महत्वपूर्ण हैं. हालांकि अन्य तरीकों व्यवहार्य कोशिकाओं की अच्छी पैदावार प्रदान कर सकते हैं, keratincytes की खेती की क्षमता कम संतोषजनक रहा है.- इस 2 एच ऊष्मायन समय के दौरान, कोलेजन कोटिंग के साथ कोट व्यंजन और उन्हें 1 h के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें (चरण 3.1.2 देखें)। क्लोनोजेनिक परख के लिए, 60 मिमी पेट्री व्यंजन पहले से ही केराटिनसाइट कटाई से पहले 24 एच लेपित किया गया है ताकि विकिरणित 3T3 फीडर परत को नीचे से संलग्न किया जा सके और समान रूप से फैल सके।
नोट: क्लोनोजेनिक संस्कृति के लिए संस्कृति व्यंजनों की कोटिंग उचित लगाव, कॉलोनी गठन, और चूहों के अंतिम विकास /
- इस 2 एच ऊष्मायन समय के दौरान, कोलेजन कोटिंग के साथ कोट व्यंजन और उन्हें 1 h के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें (चरण 3.1.2 देखें)। क्लोनोजेनिक परख के लिए, 60 मिमी पेट्री व्यंजन पहले से ही केराटिनसाइट कटाई से पहले 24 एच लेपित किया गया है ताकि विकिरणित 3T3 फीडर परत को नीचे से संलग्न किया जा सके और समान रूप से फैल सके।
- Epidermal स्क्रैपिंग कदम: एक बाँझ प्लास्टिक वर्ग पेट्री पकवान की व्यवस्था और उचित epidermal स्क्रैपिंग के लिए एक 30 डिग्री incline पर एक सतह बनाने के लिए 15 एमएल कटाई मध्यम के साथ (तालिका 1 देखें). सावधानी से घुमावदार संदंश के साथ trypsin समाधान से एक अस्थायी त्वचा पट्टी को हटा दें। एक नए स्केलपेल ब्लेड के साथ, माध्यम में बाह्य त्वचा और बालों को खत्म कर देते हैं।
- अत्यधिक बल का उपयोग न करें, लेकिन बाह्य त्वचा को स्क्रैप करने के लिए पर्याप्त बल का उपयोग करें, या यह सेल व्यवहार्यता को प्रभावित करेगा।
- बाह्य त्वचा खुरचने के दौरान, ब्लेड को त्वचा के टुकड़े के लंबवत रखें। यदि ब्लेड ब्लेड की गति की ओर angled है, वहाँ त्वचा फाड़ की अधिक संभावना है. यदि ब्लेड ब्लेड आंदोलन से दूर angled है, वहाँ अपर्याप्त epidermis हटाने की अधिक संभावना है.
- ध्यान से एक 1.5 इंच चुंबकीय हलचल पट्टी के साथ एक बाँझ 60 एमएल जार (स्वत: योग्य और पुन: प्रयोज्य) में स्क्रैप ्ड epidermal कोशिकाओं युक्त कटाई माध्यम डालना। शेष एपिडर्मल कोशिकाओं को इकट्ठा करने और अंतिम मात्रा को 30 एमएल तक लाने के लिए अतिरिक्त कटाई माध्यम के साथ पेट्री डिश को कुल्ला करें। एक चुंबकीय उत्तेजक का प्रयोग करें और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 100 आरपीएम पर हलचल। इस प्रक्रिया के बालों से फंस epidermal कोशिकाओं को हटा देगा.
- 50 एमएल शंकुन नलिका के शीर्ष पर एक बाँझ 70 डिग्री मीटर कोशिका छलनी रखें। सेल छलनी एक 50 एमएल शंकु ट्यूब के शीर्ष पर फिट बैठता है.
- एक biosafety हुड के अंदर जार ले लो. हलचल पट्टी निकालें और एक 50 एमएल शंकु ट्यूब से जुड़ी छलनी फिल्टर में सामग्री डालना. अवांछित बालों और स्तर कॉर्नियम की चादरें बाहर तनाव.
- छलनी के भीतर स्तर corneum सामग्री के साथ बाल प्रेस और उन्हें हेरफेर करने के लिए फंस बाल कोशिकाओं को रिहा. शेष फंस कोशिकाओं को जारी करने और ट्यूब में प्रवाह करने की अनुमति देने के लिए मध्यम कटाई के 5 एमएल का उपयोग करें। शंकु नली में कुल मात्रा को 50 एमएल तक लाइए।
- सेल छानना और अपकेंद्रित्र के साथ 50 एमएल शंकु ट्यूब को 160 x ग्राम पर 7 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस पर कैप करें। इसके बाद सुपरनेंट को प्रेरित करें और 5 एमएल हार्वेस्टिंग माध्यम जोड़ें। एक 5 एमएल पाइप्ट के साथ धीरे $ 20x triturating द्वारा सेल गोली resuspend.
- इस चरण पर, किसी भी एकत्रीकरण से बचने के लिए कक्षों को आइसबॉक्स में रखें. 25 एमएल की कटाई मीडियम और ट्रिट्यूरेट को फिर से (20-25x) जोड़ें।
- इस चरण में एक सटीक केराटिनोसाइट गिनती सुनिश्चित करने के लिए, सेल निलंबन के 1 एमएल लें और 19 एमएल कटाई माध्यम जोड़ें। अब सेल कमजोर पड़ने 50 एमएल शंकु ट्यूब में 1:20 है. यदि केराटिनोसाइट्स को एकल माउस से काटा जाता है, तो सेल निलंबन की मात्रा समायोजित करें. 30 एमएल के बजाय, 15 एमएल का उपयोग करें और कोशिकाओं की गिनती के लिए 1:10 कमजोर पड़ने बनाएं।
- 50 एमएल शंकु ट्यूब (1:20 कमजोर पड़ने) से पतला कोशिकाओं के 0.5 एमएल पाइपेट और एक 1.5 एमएल ऑटोसेंड्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित। एक और 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब के लिए सेल मिश्रण के 0.2 एमएल (200 $L) निकालें और 0.4% Trypan नीले समाधान के एक बराबर मात्रा (200 $L) जोड़ें. धीरे से इस समाधान 3x मिश्रण और गणना nucleatinocytes के लिए एक हेमोसाइटोमीटर के लिए कोशिकाओं को हस्तांतरण.
- गैर-व्यवहार्य मृत कोशिकाओं के रूप में Trypan नीले रंग के लिए सकारात्मक सभी गहरे नीले रंग की कोशिकाओं को स्कोर, और व्यवहार्य कोशिकाओं के रूप में छोटे सोने और गुलाबी कोशिकाओं स्कोर। माउस प्रति अंतिम केरातिनोसाइट उपज लगभग 30 मिलियन व्यवहार्य कोशिकाओं होना चाहिए।
- मूल 50 एमएल शंकु नली (चरण 3.8 से) को 4 डिग्री सेल्सियस पर 160 x g पर 7 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। इस चरण में, वांछित माध्यम में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और बीज कोशिकाओं के लिए आवश्यक कमजोर पड़ने बनाते हैं।
- जन संस्कृति के लिए, सेल संस्कृति माध्यम में प्रत्येक 35 मिमी पेट्री डिश में 2 से 4 लाख व्यवहार्य सोने की कोशिकाओं बीज (KGM-प्रकार मध्यम + मोनोलेयर संस्कृतियों के लिए पूरक) (तालिका 1देखें)। एक क्लोनोजेनिक (कोलोनी गठन) परख के लिए, एक्स-रे पर 60 मिमी पेट्री डिश प्रति 1,000 कोशिकाओं को कोलेजन-कोटिंग और पूरक और सीरम के साथ संशोधित विलियम के ई माध्यम के साथ विकिरणित स्विस माउस 3T3 फीडर परतों के लिए।
- क्रमशः 35 मिमी और 60 मिमी पेट्री व्यंजनों के लिए कुल 2 से 4 एमएल मध्यम का उपयोग करें। इसके अलावा, 5% सीओ2पर उपयोग के लिए सोडियम बाइकार्बोनेट के कम स्तर के साथ ATCC से प्राप्त DMEM और विलियम्स ई माध्यम तैयार करें।
- 32 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति कोशिकाओं (बड़े पैमाने पर या क्लोनोजेनिक) हो जाना, 5% सीओ2के साथ 95% आर्द्रता। बड़े पैमाने पर संस्कृति के लिए प्रारंभिक बोने के बाद एक दिन मीडिया बदलें, और उसके बाद 3x साप्ताहिक. हालांकि, क्लोनल परख के लिए, पहले मध्यम परिवर्तन सेल बोने और उसके बाद 3x साप्ताहिक के बाद 2 दिन है.
- क्लोनल संस्कृति के लिए, दो और चार सप्ताह के अंतराल पर कोशिकाओं की खेती. क्लोनल संस्कृतियों (2 या 4 सप्ताह) के पूरा होने के बाद, माध्यम aspirate. कमरे के तापमान पर रात भर बफर औपचारिक रूप में 10% में कालोनियों को ठीक करें और 1 एच के लिए ऑटोक्लेव पानी में 0.5% रोडामाइन बी के साथ दाग। फिर, व्यंजन के किनारे से एक पिपेट के साथ रोडामाइन बी दाग को हटा दें।
- ठंडा autoclaved पानी में व्यंजन कुल्ला जब तक बर्तन स्पष्ट चलाते हैं. बर्तन के ढक्कन पर झुका बर्तन रखो और उन्हें अंतिम कॉलोनी गिनती के लिए सूखी. विशेष रूप से, जब क्लोनोजेनिक संस्कृति परख प्रदर्शन करते हैं, कभी नहीं pipet और कोशिकाओं के 1 एमएल. यदि कोशिकाओं को केंद्रित कर रहे हैं, क्रमिक कोशिका एकाग्रता पतला.
Representative Results
आमतौर पर, 20 x 106 से 30 x 106 Trypan नीले को छोड़कर कोशिकाओं को छोड़कर माउस प्रति माउस epidermal keratincytes की पैदावार प्राप्त कर रहे हैं8,9. व्यवहार्यता 80%-90% से लेकर है। ठेठ बोने की क्षमता विकिरणित 3T3 फीडर परतों पर 24 एच कॉलोनी गठन पर लगभग 30% लगाव कर रहे हैं C57BL/6 चूहों के लिए बीज प्रति 1,000 व्यवहार्य कोशिकाओं के आसपास 60 कालोनियों है, और स्विस प्रकार चूहों10 के लिए प्रति 1,000 कोशिकाओं के लगभग 30 कालोनियों ,11. उपनिवेश निर्माण परखों के विशिष्ट परिणाम चित्र 1में दर्शाए गए हैं। बाल कूप स्टेम कोशिकाओं की संख्या लगभग 9% CD34+/ CD49f+ C57BL/6 चूहों12के लिए स्टेम सेल है। प्रवाह कोशिकामिति के विशिष्ट परिणाम चित्र 2में दिए गए हैं।
चार अलग-अलग माध्यमों की वृद्धि विशेषताएँ चित्र 3में स्पष्ट की गई हैं। मीडिया का परीक्षण KGM-सोना, SFM, विलियम ई माध्यम, और मॉरिस-2 (एक कम कैल्शियम विलियम्स ई पर आधारित प्रयोगशाला में विकसित मध्यम) शामिल हैं.
चित्र 1: वयस्क चूहों से क्लोनोजेनिक केराटिनसाइट्स के लिए एक परख से प्रतिनिधि उदाहरण. यह तस्वीर सीडी-1 महिला चूहों से केराटिनसाइट कॉलोनी गठन को दर्शाता है 54 दिन की उम्र के साथ topically इलाज किया 1) कोई इलाज, 2) एसीटोन दो सप्ताह के लिए दो सप्ताह साप्ताहिक दो बार द्वारा एक सप्ताह के बाद, 3) DMBA दो सप्ताह बाद एसीटोन द्वारा दो सप्ताह के बाद दो सप्ताह साप्ताहिक दो सप्ताह के लिए, 4) एसीटोन दो सप्ताह के लिए दो सप्ताह के लिए दो बार साप्ताहिक TPA द्वारा एक सप्ताह बाद पीछा किया, और 5) DMBA दो सप्ताह के लिए दो सप्ताह के लिए दो बार साप्ताहिक TPA द्वारा बाद में एक सप्ताह के बाद. विवो उपचार में उनके बाद, keratincytes काटा गया और विकिरणित 3T3 के फीडर परतों पर पकवान प्रति 1,000 कोशिकाओं पर बीज, और दो सप्ताह के लिए सुसंस्कृत, जिसके बाद व्यंजन बफर फॉर्मलिन के साथ तय किया गया और रोडामाइन बी के साथ दाग. प्रत्येक स्तंभ में व्यंजन प्रत्येक माउस उपचार समूह से प्रतिकृति कर रहे हैं. ध्यान दें कि बड़ी कालोनियों की संख्या DMBA के साथ उपचार पर वृद्धि हुई है, और कालोनियों की कुल संख्या केटाइनसाइट फसल से पहले चूहों के टीपीए उपचार में वृद्धि हुई। संक्षिप्त नाम: DMBA: 7,12-dimethylbenz[anthracene; TPA: 12-O-tetradecanoylphorbol-13-ऐसीटेट. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: वयस्क चूहों से बाल कूप स्टेम कोशिकाओं के प्रवाह साइटोमेट्री के प्रतिनिधि उदाहरण. संक्षेप में, अलग प्राथमिक keratincytes पृष्ठीय चूहों त्वचा से अलग और सेल फिल्टर का उपयोग कर सेलुलर मलबे के लिए फ़िल्टर किया गया. पृथक केराटिनोसाइट निलंबन को CD49f या $6-integrin (पीई) और CD34 (FITC) एंटीबॉडी के साथ लाइव डेड डाई और अन्य नियंत्रणों के साथ लेबल किया गया था। FITC और पीई आइसोटाइप नियंत्रण एंटीबॉडी (Rat IgG2akappa) मुआवजा उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया गया (सामग्री की तालिकादेखें). स्टेम सेल CD49f (पीई चैनल) के माध्यम से चयन किया गया है, जो अर्ध-desmosomes के बाहरी घटक को मान्यता दी बेसल epidermal और बाल कूप कोशिकाओं पर पाया, और CD34 (FITC चैनल), जो बाल कूप स्टेम कोशिकाओं को मान्यता दी (यानी, CD34-FITC+ और a6-PE+ (ऊपरी दाएँ स्तंभ, कुल 5%))). दाईं ओर स्तंभ अलग keratincyte आबादी अर्थात् CD34-FITC केवल, CD34-FITC और a6-पीई कोशिकाओं (डबल सकारात्मक स्टेम सेल जनसंख्या), a6-पीई केवल, और बेदाग कोशिकाओं से पता चलता है. ध्यान दें कि दो सीडी34+ स्टेम सेल की आबादी है जो6,14की सूचना मिली है . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: वयस्क मादा चूहों से एपिडर्मल कोशिकाओं की प्राथमिक संस्कृतियों पर चार अलग-अलग मीडिया की तुलना। प्राथमिक keratincytes पृष्ठीय चूहों त्वचा से अलग थे और चार अलग मीडिया (KGM, SFM, Willem-E और मॉरिस-2) का उपयोग कर बोने के लिए गिना. केराटिनोसाइट्स की समान संख्या को वरीयता दी गई थी और उनके सामान्य आकारिकी और विकास पैटर्न के लिए उनका अनुसरण किया गया था। ध्यान दें कि उत्क्रमित केराटिनोसाइट्स में थोड़ा अलग आकृति विज्ञान होता है। केजीएम, एसएफएम, और मॉरिस-2 जिनमें से सभी कैल्शियम मीडिया कम कर रहे हैं चौदह दिनों के बाद सबसे मजबूत विकास किया है. इसके विपरीत, कोशिकाओं को जारी नहीं है जब विलियम्स ई माध्यम है कि 1.4 m कैल्शियम और सोडियम के लिए पोटेशियम के एक उच्च अनुपात है में सुसंस्कृत. हैरानी की बात है, की खुराक के साथ विलियम्स ई माध्यम और बीस प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम keratincyte क्लोनल संस्कृतियों का समर्थन करता है अब तक किसी भी अन्य मध्यम परीक्षण की तुलना में बेहतर है, शायद क्योंकि समृद्ध विलियम्स ई माध्यम 3T3 फीडर कोशिकाओं में मदद करता है "फ़ीड" बेहतर. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| समाधान और मीडिया | टिप्पणियाँ |
| कटाई समाधान | |
| 2.5% ट्रिप्सिन (5 एमएल) | |
| दुलबेको के पीबीएस (500 एमएल) | |
| Gentamycin (2 एमएल) | |
| 2x gentamycin के साथ पीबीएस (45 एमएल) | |
| 2x gentamycin के साथ फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) | |
| ट्रिप्सिन समाधान | |
| सेल संस्कृति समाधान | |
| Purecol-fibronectin पकवान-कोटिंग समाधान: | |
| 1 एम HEPES (1 एमएल) | |
| 116 mCaCl2 (1 एमएल) | |
| बोवाइन सीरम एल्बुमिन 1.0 मिलीग्राम/ | |
| सेल संस्कृति माध्यम (100 एमएल) | |
| फाइब्रोनेक्टिन (1 मिलीग्राम) | |
| प्यूरकोल कोलेजन (1 एमएल) | |
| सेल ठंड समाधान | |
| डीएमएसओ (2 एमएल) | |
| 10% बीसीएस और कलम-स्ट्रेप के साथ DMEM | |
| हार्वेस्टिंग मीडियम | कैल्शियम के बिना होने की जरूरत है |
| 2x gentamycin (1 एमएल) | |
| एफबीएस (50 एमएल) | |
| एसएमईएम (500 एमएल) | |
| उच्च कैल्शियम विलियम्स 'ई मीडिया के साथ: | |
| EGF (5 g/mL) 1 एमएल | |
| ग्लूटामाइन 14.5 एमएल | |
| हाइड्रोकोर्टिसोन (1 मिलीग्राम/एमएल) 0.5 एमएल | |
| इंसुलिन 1 एमएल | |
| LinoAcid-BSA (0.1 mg/mL) 0.5 एमएल | |
| एमईएम एस एस एमिनोएसिड्स 4 एमएल | |
| एमईएम विटामिन 5 एमएल | |
| पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन 5 एमएल | |
| स्थानांतरण (5mg/mL) 1 एमएल | |
| विट ए (1 mg/1,000 $L) 57.5 $L | |
| विट ई 1 mg/mL (4 डिग्री सेल्सियस) 3.5 डिग्री सेल्सियस | |
| विट डी 2 (10 मिलीग्राम/एमएल) 50 डिग्री सेल्सियस | |
| 3T3 फाइब्रोब्लास्ट पूर्ण विकास माध्यम (सीजीएम) | |
| बीसीएस (100 एमएल) | |
| डीएमईएम (900 एमएल) | |
| पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (10 एमएल) | |
| केजीएम | जन संस्कृति के लिए प्रयोग किया जाने वाले मध्यम एक कम कैल्शियम माध्यम है |
| मॉरिस 2 विलियम्स 'ई के रूप में एक ही पूरक के साथ मध्यम | पूरक के साथ विलियम्स ई की एक कम कैल्शियम संस्करण |
तालिका 1: समाधान और मीडिया व्यंजनों.
Discussion
यहाँ वर्णित केराटिनसाइट कटाई विधि वयस्क मादा चूहों के पीछे से अत्यधिक कृषि योग्य प्राथमिक एपिडर्मल केराटिनोसाइट्स की उच्च पैदावार का उत्पादन करने के लिए विकसित किया गया था। ये केरातिनोसाइट्स प्रवाह साइटोमेट्री, आणविक जीव विज्ञान अनुप्रयोग, और प्राथमिक कोशिका संस्कृति के लिए उपयुक्त हैं, जिसमें क्लोनोजेनिक परख भी शामिल है। यह केराटिनसाइट हार्वेस्टिंग विधि त्वचीय रासायनिक कैंसरजनन और ट्यूमर संवर्धन1,13के डाउनस्ट्रीम पहलुओं का अध्ययन करने के लिए भी उपयोगी रही है .
प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण चरण हैं। सबसे पहले, कठोरता और प्रजननीयता के लिए, 54 साल की उम्र की मादा चूहों - 2 दिन का इस्तेमाल किया गया. इससे हमें चूहों के अनेक प्रकारों से संवेदनशील और मात्रात्मक उपनिवेश परख प्राप्त करने और संपर्क विश्लेषण में उन्हें एक फीनोटाइप के रूप में प्रयोग करने में सहायता मिली है जिससे कम से कम एक नए स्टेम सेल विनियामक जीन की पहचान10,11. दूसरा, यह छोटे टुकड़ों में खाल में कटौती करने के लिए उपयोगी है, के रूप में trypsinization त्वचा पूरे रखने की कोशिश कर रहा से अधिक प्रभावी है. तीसरा, समय और trypsin फ्लोटेशन के तापमान के बाद संस्कृति के लिए बहुत महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, एक करने के लिए की जरूरत है "बहुत" संलग्न कोशिकाओं को उखाड़ने के लिए फिल्टर पर शेष बाल पर. यह चरण कोशिकाओं की उच्च पैदावार प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, इनक्यूबेटर का 32 डिग्री सेल्सियस तापमान वयस्क चूहों से केराटिनोसाइट्स की लंबी अवधि की खेती के लिए महत्वपूर्ण है। अंत में, इस प्रोटोकॉल में, इन विट्रो और विवोप्रयोगों 1 के समानांतर readouts प्राथमिक संस्कृतियों के बजाय subcultures या सेल लाइनों पर आधारित हैं. विशेष रूप से, यदि इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके पहली बार प्राथमिक केराटिनोसाइट्स की कटाई करें, तो हिस्टोपैथोलॉजिकल अवलोकन द्वारा बाह्य त्वचा के साथ बालों के रोम के पूर्ण हटाने की पुष्टि करने के लिए स्क्रैप करने के बाद शेष डर्मिस रखें।
वयस्क माउस keratincytes कटाई के लिए इस प्रोटोकॉल की मुख्य ताकत यह है कि यह कई downstream अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं कि कृषि योग्य कोशिकाओं की उच्च पैदावार पैदा करता है. मुख्य सीमा यह है कि कुछ सेल सतह epitopes trypsinization के प्रति संवेदनशील हो सकता है कि प्रतिरक्षा समझौता किया जा सकता है. इसलिए, जब एक नई सेल सतह एंटीबॉडी का परीक्षण, यह तुलना के लिए कटाई के लिए एक dispase6 या thermolysin5 आधारित विधि का उपयोग करने के लिए विवेकपूर्ण हो सकता है. इस प्रोटोकॉल का महत्व यह है कि इसे कड़ाई से परीक्षण किया गया है, मात्रा निर्धारित की गई है, और क्लोनोजेनिक स्टेम कोशिकाओं के लिए परख के रूप में इस तरह के विविध अनुप्रयोगों के लिए लागू किया गयाहै 1,9,10,11, बड़े पैमाने पर संस्कृतियों के लिए जैव रसायन8में , स्टेम सेल विश्लेषण 3 में FACS छँटाई के लिए3,4, आणविक जीव विज्ञान के लिए3,12,और चल रहे आरएनए और डीएनए अनुक्रमण के लिए .
Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखकों की कोई रसीद नहीं है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan blue 1x in 0.9% saline | Life Technologies Gibco | 15250-061 | |
| 1 M HEPES Buffer | Sigma | H0887 | Sterile |
| 1.5 inch magnetic stir bar with pivot ring | Bel-Art, Wayne | 371101128 | in 2 oz Nalgene jar |
| 10 mL disposable pipettes | BD Falcon | 357551 | |
| 15 mL sterile conical tube | BD Falcon | 352097 | |
| 150 cm2 (T-150) culture flask | Corning | 430825 | |
| 2 mL Screw Cap Micro Tube Conical | Sarstedt | 72.608 | |
| 2 oz Nalgene jar | Thermo Fisher Scientific | 2118-0002 | 60 mL |
| 2.5% Trypsin solution 10x | Life Technologies Gibco | 15090-046 | |
| 225 cm2 (T-225) culture flask | Corning | 431082 | |
| 32 oz Nalgene Square Storage Bottles: PETG | Thermo Fisher Scientific | 2019-1000 | 1000 mL |
| 35 mm sterile culturing dish | Corning | 430165 | |
| 5 mL disposable pipets | BD Falcon | 357543 | |
| 50 mL sterile conicle tube | BD Falcon | 352098 | |
| 60 mm sterile culturing dish | Corning | 430166 | |
| 70% ethanol | |||
| 90 mm diameter Spectra Mesh filter, 74 µm pore size | Spectrum Laboratories | 145956 | |
| Antibiotics (penicillin-streptomycin) | Life Technologies Gibco | 15140-122 | |
| Bovine calf serum (BCS) | Thermo Fisher Scientific Hyclone | SH30073.03 | |
| Bovine serum albumin | BD Biosciences | 354331 | |
| CD34 Ram34 FITC conjugated antibody | BD Pharmingen | 553733 | |
| CD49f (alpha6-integrin, GOH3) PE conjugated antibody | BD Pharmingen | 555736 | |
| Cell Strainer, 70 µm sterile | BD Discovery Labware | 352350 | |
| Collagen, Bovine, Type I, 30 mg | BD Biosciences | 354231 | |
| CoolCell Economical cell freezing container for 1 or 2 mL cryovials | Biocison | BCS-136PK | |
| Corning 2 mL Polypropylene Cryogenic Vial, Self-Standing with Round Bottom | Corning | 430659 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Distilled Milli-Q water | made fresh; twice distilled reverse osmosis water | ||
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline 1x, Ca2+ and Mg2+ free | Life Technologies Gibco | 14190-144 | Sterile |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Hyclone | SH 300070.03 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-5MG | |
| Fisherbrand 4 oz. Sterile Specimen Container | Fisher Scientific | 16-320-730 | |
| Gentamicin 50 mg/mL 10 | Life Technologies Gibco | 15750-060 | |
| KGM | Lonza | CC-3103 | |
| Nalgene “Mr. Frosty" cell freezer | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| Nalgene PC Straight-Side Wide-Mouth Jars, 16 oz | Thermo Fisher Scientific | 2116-0500 | |
| No. 22 sterile stainless-steel blades | BD Bard-Parker | 371222 | |
| No. 4 scalpel handles | Biomedical Research Instruments | 26-1200 | In a cup with 70% ethanol |
| One pair of full-curve eye dressing forceps | Militex | 18-784 | In a cup with 70% ethanol |
| One pair of scissors | Biomedical Research Instruments | 25-1050 | In a cup with 70% ethanol |
| One pair of thumb dressing forceps | Militex | 6-4 | In a cup with 70% ethanol |
| Oster Pro-Cord/Cordless Trimmer no.40 blade | Jarden Consumer Solutions/Oster | 78997-010 | |
| Plastic Petri dish 100 mm x 20 mm sterile | Corning | 430167 | |
| Pyrex Brand Plain Stemless Glass Funnel | Corning | 6240-75 | |
| Rat IgG2akappa FITC isotype control antibody | BD Pharmingen | 553929 | |
| Rat IgG2akappa PE isotype control antibody | BD Pharmingen | 555844 | |
| SFM | Life Technologies Gibco | 10725-018 | |
| SMEM | Life Technologies Gibco | 11380-037 | |
| SMEM: Ca2+ and Mg2+ free minimal essential medium for suspension culture | Life Technologies Gibco | 11380-037 | |
| Square sterile plastic Petri dishes | BD Falcon | 351112 | |
| Swiss mouse 3T3 fibroblasts | ATCC | CCL-92 | used within 10 passages |
| Triadine; 10% Povidone-Iodine Prep Topical Solution, 16 oz | Triad Group | 10-8216 | |
| VWR Plastic Petri dishes, sterile Space Saver 100 x 10 | VWR | 25384-324 | |
| Williams E Medium | Life Technologies Gibco | 12551-032 | |
| Ziploc bag |
References
- Morris, R. J., Tacker, K. C., Fischer, S. M., Slaga, T. J. Quantitation of primary in vitro clonogenic keratinocytes from normal adult murine epidermis, following initiation, and during promotion of epidermal tumors. Cancer Research. 48 (22), 6285-6290 (1988).
- Tani, H., Morris, R. J., Kaur, P. Enrichment for murine keratinocyte stem cells based on cell surface phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10960-10965 (2000).
- Morris, R. J., et al. Capturing and profiling adult hair follicle stem cells. Nature Biotechnology. 22 (4), 411-417 (2004).
- Trempus, C. S., et al. Enrichment for living murine keratinocytes from the hair follicle bulge with the cell surface marker CD34. Journal of Investigative Dermatology. 120 (4), 501-511 (2003).
- Redvers, R. P., Kaur, P. Serial cultivation of primary adult murine keratinocytes. Methods in Molecular Biology. 289, 15-22 (2005).
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- Blacker, K. L., Williams, M. L., Goldyne, M. Mitomycin C-treated 3T3 fibroblasts used as feeder layers for human keratinocyte culture retain the capacity to generate eicosanoids. Journal of Investigative Dermatology. 89 (6), 536-539 (1987).
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- Wu, W. Y., Morris, R. J. Method for the harvest and assay of in vitro clonogenic keratinocytes stem cells from mice. Methods in Molecular Biology. 289, 79-86 (2005).
- Popova, N. V., Teti, K. A., Wu, K. Q., Morris, R. J. Identification of two keratinocyte stem cell regulatory loci implicated in skin carcinogenesis. Carcinogenesis. 24 (3), 417-425 (2003).
- Popova, N. V., Tryson, K. A., Wu, K. Q., Morris, R. J. Evidence that the keratinocyte colony number is genetically controlled. Experimental Dermatology. 11 (6), 503-508 (2002).
- Trempus, C. S., et al. Comprehensive microarray transcriptome profiling of CD34-enriched mouse keratinocyte stem cells. Journal of Investigative Dermatology. 127 (12), 2904-2907 (2007).
- Baer-Dubowska, W., Morris, R. J., Gill, R. D., DiGiovanni, J. Distribution of covalent DNA adducts in mouse epidermal subpopulations after topical application of benzo(a)pyrene and 7,12-dimethylbenz(a)anthracene. Cancer Research. 50 (10), 3048-3054 (1990).
- Blanpain, C., Lowry, W. E., Geoghegan, A., Polak, L., Fuchs, E. Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche. Cell. 118 (5), 635-648 (2004).
