Summary
Formålet med denne protokol er at isolere epidermal keratinocytter fra rygskind fra voksne mus til en række downstream-applikationer såsom molekylær biologi, biokemi, fluorescens aktiveret celle sortering og primær in vitro-brug (f. eks. clonogen keratinocytter).
Abstract
Den her beskrevne protokol er en pålidelig metode til høst af primære keratinocytter fra voksne hunmus (54 ± 2 dage gamle), hvilket giver ca. 30 x 106 levedygtige celler pr. mus. Primære voksne mus keratinocytter høstes fra rygskind af hunmus. Hanmus (~ 6 uger gamle) kan anvendes til keratinocyt høst afhængigt af kravene i forsøget. Euthanized mus er barberet og steriliseret med serielle skylninger i povidon jod og ethanol løsninger (70% alkohol). Efter desinfektion af musene fjernes rygskindet, og det subkutane fedt og musklen fjernes med en skalpel og kasseres. Skindet skæres i små stykker og behandles med en mild, lav temperatur trypsinization at løsne den nedre dermis fra epidermis. De afskårne epidermider omrøres ved lav hastighed, filtreres for at fjerne hårerne, tælles, og re-suspenderet i kulturmedium. Denne metode giver en fremragende enkelt cellesuspension af meget bestemmelse antal kimtal celler for mange downstream applikationer.
Introduction
Pattedyrs hud dækker hele kroppen og tjener et væld af funktioner (f. eks. en primær fysisk barriere, temperaturregulering og fugt retention). I løbet af de sidste fem årtier, grundforskning på mus hud har givet nye oplysninger om strukturen og funktionen af huden. Musens hudmodel har i høj grad hjulpet forståelsen af den grundlæggende biologi bag de komplekse molekylære mekanismer af kemisk eller ultraviolet stråling-induceret carcinogenese. Disse muse hudmodeller leverede et betydeligt bidrag til forståelsen af menneskelige hudsygdomme og deres afbødning. For at udforske yderligere molekylære dissektion af de primære keratinocytter i hårsækken udviklingsmæssige biologi, stamcelleforskning, carcinogenese, og genetisk udforskning af epidermis, er det ofte ønskeligt at isolere og kultur primær epitelial keratinocytter fra mus hud til brug parallelt med in vivo eksperimenter. Den motiverende faktor i udviklingen af denne metode var behovet for en in vitro-analyse for clonogenic epidermal og hårsækken stamceller1,2. Der var også et presserende behov for enkelt celle suspensioner af Epidermal celler egnet til clonogenic assays3, fluorescens aktiveret celle sortering og flow flowcytometri3,4. Fordelene ved denne metode er en robust høst øge en størrelsesorden over andre metoder5,6, inddragelse af epitelial del af hårsækkene, og den høje culturability af de høstede celler. I 1980 ' erne var der ingen kendte metoder, der kunne opfylde disse krav. I de efterfølgende år blev denne metode raffineret for at øge celle udbyttet. Den vigtigste begrænsning af denne metode ville være maskering af nogle trypsin følsomme antistoffer, der ville kompromittere immunoreactivity6.
Musene fik husdyrhold i henhold til de specifikke patogenfrie retningslinjer. En til fem hunmus 54 ± 2 dages alderen blev opnået. I ældre mus, levedygtigheden af keratinocytter vil blive reduceret på grund af Anagen fase (vækst) af håret cyklus. Også, processen med trypsinization er vanskeligere i forhold til unge mus. Høst proceduren er blevet optimeret til den tyndere hud af hunmus sammenlignet med mandlige. Hanmus er generelt ikke anvendes til keratinocytproliferation høst, da de har en tendens til at kæmpe med hinanden under boliger og derfor kan efterlade ridser eller sår på huden.
Protocol
Alle protokoller for anvendelse af hvirveldyr er blevet godkendt af University of Minnesota institutionel dyrepleje og brug udvalg i overensstemmelse med anbefalede NIH og regeringens retningslinjer.
1. initialisering og Subculturing af feeder Layer
- Tø én celle hætteglas indeholdende frosne schweiziske mus 3T3 fra den flydende nitrogen tank ved at placere hætteglasset i en 37 °C vandbad for 1-2 min. Antallet af celler i hætteglasset er ca. 1 x 106.
- Fjern 3T3-celle hætteglasset, når den endelige splint af is er smeltet. Tør røret med en 70% spritserviet. Overfør derefter hætteglasset til et biosikkerheds kabinet.
- Cellerne overføres langsomt til en T-150-kolbe, og 3T3-hætteglasset skylles med 1 mL CGM-medium. Tilsæt langsomt 30 mL præ-varmet 3T3 komplet vækst medium (CGM) til cellerne. Du skal forsigtigt klippe kolben for at sprede 3T3-fibroblast cellerne jævnt. Mærk kolben med cellelinje detaljer, dato og passage nummer korrekt.
- Cellerne inkubates ved 37 °C med 5% CO2 og 95% fugtighed.
Bemærk: Ifølge ATCC, fordoblingen tid af schweiziske mus 3T3 er 18 h; Når flydende (kontakt hæmmet), Tætheden er omkring 40.000 celler pr cm2. Vi bruger en bestemt linje af 3T3 inden for 10-15 passager efter initialisering. Hurtigere vækst eller tilstedeværelsen af spindel formede celler kan forekomme ved højere passager og er normalt et tegn på, at 3T3 ikke vil udføre såvel som feeder celler til voksne mus keratinocytter. Hvis hurtig vækst opstår, er det bedre at indlede en ny linje fra nedre passage celler. - Skift medie efter 24 timer for at fjerne døde celler og resterende DMSO (cryopreservations agent) og derefter to gange ugentligt. Lad cellerne formere omkring 80% sammenløbet og bruge T-150-kolber til kultur initiering. Brug T-225-kolber til subkultur efter initialisering.
- Til subkultur 3T3 fibroblast celler, Fjern kolben fra cellen kultur inkubator og vask to gange med kold steril PBS (1x) med gentamycin. Pipet 10 mL præ-opvarmet (37 °C vandbad) trypsin opløsning (0,25%) i hver T-225 kolbe.
- Kolben anbringes på en opvarmnings plade i 3-8 min. Fjern kolben, og brug forsigtigt håndfladerne til at tappe på kolbens vægge for at frigøre cellerne og bekræfte, at cellen er løsrivelse under inverteret mikroskop. Trypsin-opløsningen kan forekomme uklar med løsrevne 3T3-celler.
- Pipet trypsin-opløsningen 3 – 4X for at vaske kolbens cellevækst flade og overføre den trypsinerede celle til 30 mL CGM i et 50 mL konisk rør. Kolben 3 – 5x genvaskes med 10 mL af CGM-trypsin-celle blandingen fra 50 mL konisk slange.
Bemærk: Indholdet af to kolbe indhold kan tilsættes til et 50 mL rør; Hvis der kun anvendes én kolbe, anbringes 10 mL trypsin/celler i 20 mL CGM i et 50 mL rør. - Centrifuger 50 mL konisk slange ved 160 x g i 7 minutter ved 4 °c.
- Nu aspirere supernatanten og resuspendere celle pellet med 5 mL CGM, pipettering forsigtigt ~ 10x at helt forstyrre celle pellet. Tilsæt 10 mL CGM for at bringe det totale rumfang 50 mL konisk slange til 15 mL.
- Bland igen ~ 10x og Placer 5 mL af cellesuspensionen i 3 separate T-150-kolber. Subkulturforholdet er 1:3 i T-225-kolber eller 1:4 i T-150-kolber. Tilsæt 30 mL forvarmet 3T3 CGM til hver af kolberne.
- Mærk kolben med celle linjens navn, datoen for celle såning og passage nummeret.
- For at fastfryse 3T3-cellerne efter centrifugering i subkultur-trinnet skal du fjerne 50 mL-røret fra centrifugen og anbringe på en isspand. Supernatanten aspirerer, og celle pellet opslæmmes med 1 mL 5% DMSO-DMEM-blanding (Se tabel 1) for hver høstet kolbe.
- 1 mL DMSO-DMEM-blanding anbringes med cellesuspension i hver cryovial (en cryovial pr. 3T3-kolbe høstet). Mærk hætteglasset med passage nummeret, celle linjens navn (3T3) og den dato, hvor cellerne blev frosset.
- Placer disse 3T3 celle hætteglas i cellen fryser jar (Se tabel over materialer) og Overfør til-70 °c fryser til > 5 h. forsigtigt fjerne og overføre hætteglassene fra cellen fryser krukke og sted i en flydende kvælstof Opbevaringstank til langtidsopbevaring indtil næste brug . Angiv oplysninger om celle linjens navn, placeringen i beholderen og datoen i lager arket for flydende kvælstof i laboratoriet.
2. klargøring af 3T3 feeder Layer til Røntgenbestråling og såning
- Forbered 3T3 celler en uge før deres bestråling og give dem mulighed for at vokse ~ 100% sammenløbet. 3T3-cellerne er typisk inden for passager 120 til 130.
-
For vellykkede clonogenic assays af primære keratinocytter, før såning 3T3 celler, overflade frakke 60 mm Petri skåle med en kollagen.
- Pipet ca. 2 – 3 mL kollagenbelægnings opløsningen til 60 mm Petri skåle for at belægge den nederste overflade og fjerne den overskydende kollagen-coatingvæske (Se tabel 1). Petri skålene overføres til en 37 °C-inkubator med 5% CO2 i mindst 1 time. Lad ikke retterne tørre i inkubator.
- Røntgenstråle bestråling trin: Følg trin 1.4 – 1.6. Brug 50 mL frisk CGM til at resuspendere celle pellet, lukke det koniske rør og forsegle med paraffin tætnings folie. For at undgå kontaminering skal du bruge plastikposer til at dobbelt taske den paraffin forseglede celle, der indeholder rør og sted på is. En mitomycin baseret alternativ feeder lag kan bruges til keratinocytproliferation kultur7.
-
Irradiat fibroblast 3T3 celler i 50 ml konisk slange med en 5.000 aftaler (50 CGY) dosis med en biologisk røntgenmaskine. Irradiate disse celler sammen med CGM medierne.
- Efter røntgenbestråling, centrifuge celler ved 160 X g i 7 min ved 4 °c. Aspirér supernatanten medierne og forsigtigt resuspendere celle pellet med 5 mL CGM triturating forsigtigt ~ 10x. Nu bringes den endelige volumen til 30 ml med yderligere 25 ml medium og udriv 10x. Disse triturating trin er afgørende for ensartet 3T3 fibroblast lag for clonogenicitetsanalyse.
- Levedygtig celletælling: Tæl keratinocytterne ved hjælp af en almindelig glas hemocytometer. Tag ca. 0,5 mL af cellerne og Placer dem i et 1,5 mL rør. Fjern 200 μL celle blanding og tilsæt en tilsvarende volumen på 0,4% Trypan blå opløsning og blanding 3 – 4X. Overfør celler med et hemocytometer og Tæl alle nukleerede celler (små guld og lyserøde celler) som levedygtige celler. Beregn den endelige koncentration af levedygtige guld celler.
- Der kan anvendes pipette 1 x 106 3T3 celler (mindst 7 x 105) i 60 mm Kollagenbelagte Petri skåle (trin 2,2), og tilsæt forsigtigt 4 ml modificerede højt calcium-Williams E-medier (Se tabel 1). Lad nyseedede 3T3-celler vedhæfte i 24 timer. På den næste dag, høst den friske primære keratinocytproliferation og frø dem på toppen af vedlagte 3T3 fibroblast lag for clonogenic assay som angivet nedenfor.
3. primær keratinocyt høst og såning
- Euthanize fire til fem voksne hunmus via CO2 indånding i henhold til godkendte dyre facilitet/IACUC standarder. Denne protokol kan dog også anvendes til enlige hunmus.
- Clip ca 9 cm2 af rygskind med en elektrisk dyr Clipper og Placer alle klippede mus i en 500 ml krukke med nok povidon jod antiseptisk opløsning (ikke skrubbe) til at dække dem for 1 – 2 min. Ryst glasset godt til jævnt pels antiseptisk løsning over musene.
- Hæld opløsningen af, og skyl med rent vand, indtil væsken løber klart. Gentag den samme antiseptiske vask efterfulgt af en vand skylning. Efter antiseptisk vask med jod opløsning, suge alle musene i 70% ethanol for 5 – 10 min.
Bemærk: Mus med let pels (f. eks., BALB/c) vil beholde en let gullig farve fra de antiseptiske jod skyller, mens mørkere mus (f. eks C57BL/6) vil ikke. Især cellelevedygtighed eller kultur vækst påvirkes ikke på grund af den gule farve.
- Fjern forsigtigt den klippede rygskind ved hjælp af tommelfinger tang og saks i en laminar flow hætte. Placer den exciserede rygskind i konisk slange fyldt med PBS/2x gentamycin. Undgå at bruge ventrale side hud til at forhindre bryst celle kontaminering i kulturen.
- Ved hjælp af autoklaveres pincet og en skalpel, Placer en rygskind på et tidspunkt behårede side ned på en tynd Petri skål. Begynd at skrabere alt subkutant væv, herunder fedt fra den ventrale side af hudvævet, indtil det er semi-gennemsigtigt. Prøv at fjerne maksimale spor af subkutant væv uden at rive huden (hårsækken del). Også, ikke skrabe i lang tid og undgå hud tørring.
- Hold skrabet hud i PBS-opløsning, indtil alle andre skind er behandlet. Brug en skalpel, skær skind i 0,5 cm x 1 – 1.5 cm strimler og Placer den hårede side op på en steril Petri skål.
- Afpipettér forsigtigt 20 mL PBS/2x gentamicin-opløsning blandet med trypsin (0,25%) til en 100 mm x 20 mm plastik Petri skål. Ved hjælp af sterile pincet, overføre skind og flyde dem behårede side op på overfladen af trypsin opløsning til 2 h i en 32 °C inkubator.
Bemærk: trypsinisering tid og temperatur er afgørende for godt udbytte af meget bestemmelse antal kimtal primære keratinocytter. Selv om andre metoder kan give gode udbytter af levedygtige celler, har keratinocytterne været mindre tilfredsstillende.- I løbet af denne 2 h inkubationstid, frakke retter med kollagen belægning og placere dem ved 37 °C for 1 t (Se trin 3.1.2). For clonogenic assays er 60 mm Petri skålene allerede blevet belagt 24 timer før keratinocyt høst for at tillade, at det bestrålede 3T3 feeder-lag fastgøres til bunden og spredes jævnt.
Bemærk: Belægning af kultur retter til clonogenic kultur er meget vigtigt for korrekt fastgørelse, koloni dannelse, og ultimative vækst/proliferation af mus epidermal keratinocytter.
- I løbet af denne 2 h inkubationstid, frakke retter med kollagen belægning og placere dem ved 37 °C for 1 t (Se trin 3.1.2). For clonogenic assays er 60 mm Petri skålene allerede blevet belagt 24 timer før keratinocyt høst for at tillade, at det bestrålede 3T3 feeder-lag fastgøres til bunden og spredes jævnt.
- Epidermal skrabning trin: Arranger en steril plastik firkantet Petri skål og skabe en overflade ved en 30 ° hældning for korrekt epidermal skrabning med 15 mL høst medium (se tabel 1). Fjern forsigtigt en flydende hudstrimmel fra trypsin-opløsningen med buede pincet. Med en ny skalpel klinge, skrabe epidermis og hårs i mediet.
- Brug ikke overdreven kraft, men brug tilstrækkelig kraft til at skrabe epidermis, eller det vil påvirke cellens levedygtighed.
- Hold kniven vinkelret på hudstykket under skrabning af epidermis. Hvis klingen er vinklet mod knivens bevægelse, er der flere chancer for at rive huden. Hvis klingen er vinklet væk fra kniv bevægelsen, er der flere chancer for utilstrækkelig epidermis fjernelse.
- Hæld forsigtigt høst mediet indeholdende skrabet Epidermal celler i en steril 60 mL krukke (autoklaverbare og genanvendelige) med en 1,5 tommer magnetisk Stir bar. Den Petri skål skylles med yderligere høst medium for at indsamle de resterende Epidermal celler og bringe det endelige volumen op på 30 mL. Brug en magnetisk omrører og rør ved 100 rpm i 20 minutter ved stuetemperatur. Denne proces vil fjerne de fangede Epidermal celler fra hår.
- Placer et sterilt 70 μm-celle-filter på toppen af et 50 mL konisk rør. Celle sien passer oven på et 50 mL konisk rør.
- Tag glasset inde i en biosikkerheds hætte. Fjern omrørings stangen, og hæld indholdet i det filter, der er fastgjort til et 50 mL konisk rør. Stamme ud uønsket hår og plader af stratum corneum.
- Tryk hårerne sammen med stratum corneum materialer i si og manipulere dem til at frigive de fangede hårceller. Brug 5 mL høst medium til at tillade resterende fangede celler at frigive og flyde ind i røret. Bring den totale volumen op til 50 mL i konisk slange.
- Cap 50 mL konisk slange med celle filtrat og centrifugeres ved 160 x g i 7 min ved 4 °c. Næste aspirere supernatanten og tilsæt 5 mL høst medium. Resuspension celle pellet ved triturating forsigtigt ~ 20x med en 5 mL pipet.
- På dette trin skal du holde cellerne i en icebox for at undgå enhver sammenlægning. Tilsæt 25 ml høst medium og udriv igen (20 – 25x).
- For at sikre en nøjagtig keratinocyt tælling på dette trin, tag 1 mL cellesuspension og tilsæt 19 mL høst medium. Nu er celle fortyndingen 1:20 i 50 mL konisk slange. Hvis der høstes keratinocytter fra en enkelt mus, justeres volumen af cellesuspensionen. I stedet for 30 mL skal du bruge 15 mL og lave en 1:10 fortynding til tælling af cellerne.
- Pipet 0,5 ml fortyndede celler fra 50 ml konisk slange (1:20 fortynding) og Overfør til et 1,5 ml autoklaveres mikrocentrifuge glas. Fjern 0,2 mL (200 μL) celle blanding til et andet 1,5 mL mikrocentrifuge glas, og tilsæt en tilsvarende mængde (200 μL) 0,4% Trypan blå opløsning. Bland forsigtigt denne opløsning 3x og Overfør celler til et hemocytometer for at tælle nukleerede keratinocytter.
- Score alle mørkeblå celler positive for Trypan blå som ikke-levedygtige døde celler, og score små guld og Rosa celler som levedygtige celler. Den endelige keratinocytproliferation udbytte per mus bør være omkring 30.000.000 levedygtige celler.
- Det originale 50 mL koniske rør (fra trin 3,8) centrifugeres i 7 min ved 160 x g ved 4 °c. På dette trin, resuspension cellerne i det ønskede medium og gøre den nødvendige fortynding til såning celler.
- For masse kultur, frø 2 til 4.000.000 levedygtige guld celler i hver 35 mm Petri skål i cellekulturmedium (kgm-type medium + kosttilskud til enkeltlags kulturer) (Se tabel 1). For en clonogenic (koloni dannelse) assay, frø 1.000 celler pr 60 mm Petri skål på røntgen bestrålede schweiziske mus 3T3 feeder lag med kollagen-belægning og modificeret William's E medium med kosttilskud og serum.
- Der anvendes i alt 2 til 4 mL medium til henholdsvis 35 mm og 60 mm Petri skåle. Også, formulere DMEM og Williams E medium indkøbt fra ATCC med reducerede niveauer af natriumbicarbonat til brug ved 5% CO2.
- Vokse kultur cellerne (masse eller clonogenic) ved 32 °C, 95% fugtighed med 5% CO2. Skift mediet en dag efter start såning for masse kultur, og derefter 3x ugentligt derefter. Men for klonale assays, den første medium ændring er 2 dage efter celle såning og 3x ugentligt derefter.
- For klonal kultur, dyrke celler med to-og fire-ugers intervaller. Efter afslutning af klonale kulturer (2 eller 4 uger), aspirere mediet. Fastgør kolonierne i 10% Buffered formalin natten over ved stuetemperatur og bejdser med 0,5% b B i autoklave vand i 1 time. Fjern derefter b B-pletten med en pipette fra kanten af Skålene.
- Skyl skålene i koldt autokat vand, indtil skålene løber klart. Sæt retterne hælder på låget af retterne og lad dem tørre for den endelige koloni optælling. Især, når du udfører clonogenic kultur assay, aldrig pipet < 1 mL celler. Hvis cellerne er koncentreret, fortynder serielt celle koncentrationen.
Representative Results
Typisk, udbytter af epidermal keratinocytter per mus spænder fra 20 x 106 til 30 x 106 trypan blå eksklusive celler er opnået8,9. Levedygtigheden svinger fra 80%-90%. Typisk såning effektivitet er omkring 30% vedhæftet fil på 24 h. koloni dannelse på bestrålede 3T3 feeder lag er omkring 60 kolonier pr 1.000 levedygtige celler seedet for C57BL/6 mus, og ca. 30 kolonier pr 1.000 celler for schweiziske-type mus10 ,11. Typiske resultater fra koloni dannelses assays er illustreret i figur 1. Antallet af hårfollikel stamceller er ca. 9% CD34+/Cd49f+ stamceller til C57BL/6 mus12. Typiske resultater fra flowcytometri er angivet i figur 2.
De fire forskellige mediers vækst karakteristika illustreres i figur 3. De testede medier omfatter KGM-Gold, SFM, William's E medium og Morris-2 (et reduceret calcium medium udviklet i Morris-laboratoriet baseret på Williams E).
Figur 1: repræsentative eksempler fra en analyse for clonogene keratinocytter fra voksne mus. Dette fotografi demonstrerer keratinocyt koloni dannelse fra CD-1 hunmus 54 dage af alder behandlet topisk med 1) ingen behandling, 2) acetone fulgte en uge senere af acetone to gange ugentligt i to uger, 3) DMBA fulgte en uge senere af acetone to gange ugentligt for to uger, 4) acetone fulgte en uge senere af TPA to gange ugentligt i to uger, og 5) DMBA fulgte en uge senere af TPA to gange ugentligt i to uger. Efter deres in vivo-behandlinger blev keratinocytter høstet og seedet ved 1.000 celler pr. skål på feeder-lag af bestrålet 3T3 og dyrket i to uger, hvorefter retterne blev fikseret med Buffered formalin og plettet med b B. Retterne i hver kolonne replikater fra hver muse behandlingsgruppe. Bemærk, at antallet af større kolonier steg ved behandling med DMBA, og det samlede antal kolonier øgede TPA-behandlingen af musene før keratinocyt-høsten. Forkortelser: DMBA: 7, 12-dimethylbenz [a] anthracen; TPA: 12-O-tetradecanoylphorbols-13-acetat. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentativt eksempel på strømnings cytometri af hårfollikel stamceller fra voksne mus. Kort, isolerede primære keratinocytter blev isoleret fra dorsale mus hud og filtreret for cellulære snavs ved hjælp af cellefilter. Den isolerede keratinocytproliferation suspension blev mærket med CD49f eller Α6-integrin (PE) og CD34 (FITC) antistoffer sammen med levende dødt farvestof og andre kontroller. FITC-og PE isotype-kontrol antistoffer (rotte IgG2akappa) blev anvendt til kompensations formål (Se tabel over materialer). Stamceller blev udvalgt ved hjælp af CD49f (PE-kanal), som anerkendte den eksterne komponent af Hemi-desmosomer fundet på basal epidermal og hårsækken celler, og CD34 (FITC kanal), som anerkendte hårsækken stamceller (dvs., CD34-FITC+ og A6-PE+ (øverste højre kolonne, i alt 5%)). Den højre side kolonne viser de forskellige keratinocyt populationer nemlig CD34-FITC kun, CD34-FITC og A6-PE celler (dobbelt positiv stamcelle population), A6-PE kun og ufarvede celler. Bemærk, at der er to CD34+ stamcellepopulationer, som er blevet rapporteret6,14. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: sammenligning af fire forskellige medier på primære kulturer af Epidermal celler fra voksne hunmus. Primære keratinocytter blev isoleret fra rygmus huden og tælles for såning ved hjælp af fire forskellige medier (KGM, SFM, Willem s-E og Morris-2). Lige antal keratinocytter blev seedet og fulgt for deres generelle morfologi og vækstmønster. Bemærk, at de prolifererende keratinocytter har lidt forskellige morfologier. KGM, SFM og Morris-2, som alle er reducerede calcium medier, har den mest robuste vækst efter fjorten dage. I modsætning hertil forbliver cellerne ikke, når de dyrkes i Williams E medium, der har 1,4 mM calcium og et højt forhold mellem kalium og natrium. Overraskende, Williams E medium med kosttilskud og tyve procent føtal kvægserum understøtter keratinocytproliferation klonal kulturer langt bedre end nogen anden medium testet, sandsynligvis fordi den berigede Williams E medium hjælper 3T3 feeder celler til "feed" bedre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Løsninger og medier | Kommentarer |
| Høst løsninger | |
| 2,5% trypsin (5 mL) | |
| Dulbecco's PBS (500 mL) | |
| Gentamycin (2 mL) | |
| PBS med 2x gentamycin (45 mL) | |
| Fosfat-bufferet saltvand (PBS) med 2x gentamycin | |
| Trypsin-opløsning | |
| Cellekultur løsninger | |
| Purecol-fibronectin skål-belægning løsning: | |
| 1 M HEPES (1 mL) | |
| 116 mM CaCl2 (1 mL) | |
| Kvægserum albumin 1,0 mg/mL (10 mL) | |
| Cellekulturmedium (100 mL) | |
| Fibronectin (1 mg) | |
| Purecol kollagen (1 mL) | |
| Celle frysning opløsning | |
| DMSO (2 mL) | |
| DMEM med 10% BCS og pen-STREP | |
| Høst medium | Skal være uden calcium |
| 2x gentamycin (1 mL) | |
| FBS (50 mL) | |
| SMEM (500 mL) | |
| High-calcium Williams ' E medier med: | |
| EGF (5 μg/mL) 1 mL | |
| Glutamin 14,5 mL | |
| Hydrocortison (1 mg/mL) 0,5 mL | |
| Insulin 1 mL | |
| Linosyre-BSA (0,1 mg/mL) 0,5 mL | |
| MEM-aminosyrer 4 mL | |
| MEM vitaminer 5 mL | |
| Penicillin-streptomycin 5 mL | |
| Transferrin (5mg/mL) 1 mL | |
| Vit A (1 mg/1.000 μL) 57,5 μL | |
| Vit E 1 mg/mL (4 °C) 3,5 μL | |
| Vit D2 (10 mg/mL) 50 μL | |
| 3T3 fibroblast komplet vækstmedium (CGM) | |
| BCS (100 mL) | |
| DMEM (900 mL) | |
| Penicillin-streptomycin (10 mL) | |
| KGM | Medium anvendt til masse kultur er et reduceret calcium medium |
| Morris 2 medium med de samme kosttilskud som Williams ' E | En reduceret calcium variant af Williams E med kosttilskud |
Tabel 1: løsnings-og medie opskrifter.
Discussion
Keratinocyt-høst metoden, der er beskrevet her, er udviklet til at producere høje udbytter af stærkt kulturable primære epidermal keratinocytter fra bagsiden af voksne hunmus. Disse keratinocytter er velegnede til flow cytometri, molekylær biologi applikation og primær cellekultur, herunder den clonogene analyse, der rapporteres her. Denne keratinocytproliferation høst metode har også været nyttigt for at studere andre downstream aspekter af kutan kemisk carcinogenese og tumor forfremmelse1,13.
Der er flere kritiske trin i protokollen. For det første blev der anvendt kvindelige mus i alderen 54 ± 2 dage til stringens og reproducerbarhed. Dette har gjort det muligt for os at udføre følsomme og kvantitative koloni assays fra flere stammer af mus og at bruge dem som en fænotype i sammenkædning analyse fører til identifikation af mindst én ny stamcelle regulerende gen10,11. For det andet, det er nyttigt at skære skind i mindre stykker, som trypsinization er mere effektiv end at forsøge at holde huden hele. For det tredje er tiden og temperaturen af trypsin flotation meget vigtig for den efterfølgende culturability. Desuden skal man "stikke betydeligt" på hårene tilbage på filteret for at opløse de vedlagte celler. Dette trin er vigtigt for at opnå høje udbytter af celler. Desuden er den 32 °C temperatur af inkubator vigtig for den langsigtede dyrkning af keratinocytter fra voksne mus. Endelig er de parallelle udlæsninger af in vitro-og in vivo-eksperimenter1 i denne protokol baseret på primære kulturer snarere end subkulturer eller cellelinjer. Især, hvis høst primære keratinocytter for første gang ved hjælp af denne protokol, holde de resterende dermis efter skrabning for at bekræfte den fulde fjernelse af hårsækkene sammen med epidermis ved histopatologiske observation.
Den vigtigste styrke af denne protokol for høst voksne mus keratinocytter er, at det producerer høje udbytter af bestemmelse antal kimtal celler, der er egnede til mange downstream applikationer. Den vigtigste begrænsning er, at nogle celleoverflade epitoper kan være følsomme over for trypsinisering, således at immun farvning kan være kompromitteret. Derfor, når du tester en ny celle overflade antistof, det kan være klogt at bruge en dispase6 eller thermolysin5 baseret metode til høst til sammenligning. Betydningen af denne protokol er, at den er blevet grundigt testet, kvantificeret og anvendt på så forskellige anvendelser som assays for de clonogene stamceller1,9,10,11, for masse kulturer i biokemi8, for FACS sortering i stamcelle analyse3,4, for molekylær biologi3,12, og for igangværende RNA og DNA sekventering.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne har ingen kvitteringer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan blue 1x in 0.9% saline | Life Technologies Gibco | 15250-061 | |
| 1 M HEPES Buffer | Sigma | H0887 | Sterile |
| 1.5 inch magnetic stir bar with pivot ring | Bel-Art, Wayne | 371101128 | in 2 oz Nalgene jar |
| 10 mL disposable pipettes | BD Falcon | 357551 | |
| 15 mL sterile conical tube | BD Falcon | 352097 | |
| 150 cm2 (T-150) culture flask | Corning | 430825 | |
| 2 mL Screw Cap Micro Tube Conical | Sarstedt | 72.608 | |
| 2 oz Nalgene jar | Thermo Fisher Scientific | 2118-0002 | 60 mL |
| 2.5% Trypsin solution 10x | Life Technologies Gibco | 15090-046 | |
| 225 cm2 (T-225) culture flask | Corning | 431082 | |
| 32 oz Nalgene Square Storage Bottles: PETG | Thermo Fisher Scientific | 2019-1000 | 1000 mL |
| 35 mm sterile culturing dish | Corning | 430165 | |
| 5 mL disposable pipets | BD Falcon | 357543 | |
| 50 mL sterile conicle tube | BD Falcon | 352098 | |
| 60 mm sterile culturing dish | Corning | 430166 | |
| 70% ethanol | |||
| 90 mm diameter Spectra Mesh filter, 74 µm pore size | Spectrum Laboratories | 145956 | |
| Antibiotics (penicillin-streptomycin) | Life Technologies Gibco | 15140-122 | |
| Bovine calf serum (BCS) | Thermo Fisher Scientific Hyclone | SH30073.03 | |
| Bovine serum albumin | BD Biosciences | 354331 | |
| CD34 Ram34 FITC conjugated antibody | BD Pharmingen | 553733 | |
| CD49f (alpha6-integrin, GOH3) PE conjugated antibody | BD Pharmingen | 555736 | |
| Cell Strainer, 70 µm sterile | BD Discovery Labware | 352350 | |
| Collagen, Bovine, Type I, 30 mg | BD Biosciences | 354231 | |
| CoolCell Economical cell freezing container for 1 or 2 mL cryovials | Biocison | BCS-136PK | |
| Corning 2 mL Polypropylene Cryogenic Vial, Self-Standing with Round Bottom | Corning | 430659 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Distilled Milli-Q water | made fresh; twice distilled reverse osmosis water | ||
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline 1x, Ca2+ and Mg2+ free | Life Technologies Gibco | 14190-144 | Sterile |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Hyclone | SH 300070.03 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-5MG | |
| Fisherbrand 4 oz. Sterile Specimen Container | Fisher Scientific | 16-320-730 | |
| Gentamicin 50 mg/mL 10 | Life Technologies Gibco | 15750-060 | |
| KGM | Lonza | CC-3103 | |
| Nalgene “Mr. Frosty" cell freezer | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| Nalgene PC Straight-Side Wide-Mouth Jars, 16 oz | Thermo Fisher Scientific | 2116-0500 | |
| No. 22 sterile stainless-steel blades | BD Bard-Parker | 371222 | |
| No. 4 scalpel handles | Biomedical Research Instruments | 26-1200 | In a cup with 70% ethanol |
| One pair of full-curve eye dressing forceps | Militex | 18-784 | In a cup with 70% ethanol |
| One pair of scissors | Biomedical Research Instruments | 25-1050 | In a cup with 70% ethanol |
| One pair of thumb dressing forceps | Militex | 6-4 | In a cup with 70% ethanol |
| Oster Pro-Cord/Cordless Trimmer no.40 blade | Jarden Consumer Solutions/Oster | 78997-010 | |
| Plastic Petri dish 100 mm x 20 mm sterile | Corning | 430167 | |
| Pyrex Brand Plain Stemless Glass Funnel | Corning | 6240-75 | |
| Rat IgG2akappa FITC isotype control antibody | BD Pharmingen | 553929 | |
| Rat IgG2akappa PE isotype control antibody | BD Pharmingen | 555844 | |
| SFM | Life Technologies Gibco | 10725-018 | |
| SMEM | Life Technologies Gibco | 11380-037 | |
| SMEM: Ca2+ and Mg2+ free minimal essential medium for suspension culture | Life Technologies Gibco | 11380-037 | |
| Square sterile plastic Petri dishes | BD Falcon | 351112 | |
| Swiss mouse 3T3 fibroblasts | ATCC | CCL-92 | used within 10 passages |
| Triadine; 10% Povidone-Iodine Prep Topical Solution, 16 oz | Triad Group | 10-8216 | |
| VWR Plastic Petri dishes, sterile Space Saver 100 x 10 | VWR | 25384-324 | |
| Williams E Medium | Life Technologies Gibco | 12551-032 | |
| Ziploc bag |
References
- Morris, R. J., Tacker, K. C., Fischer, S. M., Slaga, T. J. Quantitation of primary in vitro clonogenic keratinocytes from normal adult murine epidermis, following initiation, and during promotion of epidermal tumors. Cancer Research. 48 (22), 6285-6290 (1988).
- Tani, H., Morris, R. J., Kaur, P. Enrichment for murine keratinocyte stem cells based on cell surface phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10960-10965 (2000).
- Morris, R. J., et al. Capturing and profiling adult hair follicle stem cells. Nature Biotechnology. 22 (4), 411-417 (2004).
- Trempus, C. S., et al. Enrichment for living murine keratinocytes from the hair follicle bulge with the cell surface marker CD34. Journal of Investigative Dermatology. 120 (4), 501-511 (2003).
- Redvers, R. P., Kaur, P. Serial cultivation of primary adult murine keratinocytes. Methods in Molecular Biology. 289, 15-22 (2005).
- Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis. Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).
- Blacker, K. L., Williams, M. L., Goldyne, M. Mitomycin C-treated 3T3 fibroblasts used as feeder layers for human keratinocyte culture retain the capacity to generate eicosanoids. Journal of Investigative Dermatology. 89 (6), 536-539 (1987).
- Morris, R. J. Procedure for harvesting epidermal cells from the dorsal epidermis of adult mice for primary cell culture in “high calcium” defined medium. , Cambridge University Press. (1994).
- Wu, W. Y., Morris, R. J. Method for the harvest and assay of in vitro clonogenic keratinocytes stem cells from mice. Methods in Molecular Biology. 289, 79-86 (2005).
- Popova, N. V., Teti, K. A., Wu, K. Q., Morris, R. J. Identification of two keratinocyte stem cell regulatory loci implicated in skin carcinogenesis. Carcinogenesis. 24 (3), 417-425 (2003).
- Popova, N. V., Tryson, K. A., Wu, K. Q., Morris, R. J. Evidence that the keratinocyte colony number is genetically controlled. Experimental Dermatology. 11 (6), 503-508 (2002).
- Trempus, C. S., et al. Comprehensive microarray transcriptome profiling of CD34-enriched mouse keratinocyte stem cells. Journal of Investigative Dermatology. 127 (12), 2904-2907 (2007).
- Baer-Dubowska, W., Morris, R. J., Gill, R. D., DiGiovanni, J. Distribution of covalent DNA adducts in mouse epidermal subpopulations after topical application of benzo(a)pyrene and 7,12-dimethylbenz(a)anthracene. Cancer Research. 50 (10), 3048-3054 (1990).
- Blanpain, C., Lowry, W. E., Geoghegan, A., Polak, L., Fuchs, E. Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche. Cell. 118 (5), 635-648 (2004).
