Summary
Целью этого протокола является изоляция эпидермальных кератиноцитов из псовой кожи взрослых мышей для различных приложений вниз по течению, таких как молекулярная биология, биохимия, флуоресценция активированной сортировки клеток, и первичных в пробирке использует (например, клоногенные приложения кератиноциты).
Abstract
Описанный здесь протокол является надежным методом сбора первичных кератиноцитов у взрослых самок мышей (54 и 2 дня), приносящих примерно 30 х 106 жизнеспособных клеток на мышь. Первичные взрослые кератиноциты мыши собирают из сонной кожи самок мышей. Мышей мужского пола (6 недель) можно использовать для сбора кератиноцитов в зависимости от требований эксперимента. Эвтанированные мыши бритят и стерилизовать с помощью серийных спусков в растворах йода и этанола (70% алкоголя). После дезинфекции мышей, сонна кожа удаляется и подкожный жир и мышцы удаляются скальпелем и отбрасываются. Шкуры разрезаются на мелкие кусочки и обрабатываются мягкой, низкой температурой трипсинизации, чтобы отделить нижнюю дерму от эпидермиса. Царапины эпидермизпереваются на низкой скорости, фильтруются для удаления волос, подсчитываются и повторно подвешены в среде культуры. Этот метод обеспечивает отличную одноклеточную подвеску высоковозмутимых ячеек для многих приложений ниже по течению.
Introduction
Кожа млекопитающих охватывает все тело и выполняет множество функций (например, первичный физический барьер, регулирование температуры и удержание влаги). За последние пять десятилетий, фундаментальные исследования кожи мыши дали новую информацию о структуре и функции кожи. Модель кожи мыши в значительной степени помогла понять основную биологию, лежащую в основе сложных молекулярных механизмов химического или ультрафиолетового радиационного канцерогенеза. Эти модели кожи мыши вносят значительный вклад в понимание кожных заболеваний человека и их смягчения. Для дальнейшего молекулярного вскрытия первичных кератиноцитов в биологии развития волосяного фолликула, исследования стволовых клеток, канцерогенеза и генетического исследования эпидермиса, часто желательно изолировать и культуры первичного эпителия кератиноциты из кожи мышей для использования параллельно с in vivo экспериментов. Мотивирующей фактором при разработке этого метода была необходимость анализа in vitro для клоногенных эпидермальных и волосяных фолликулов стволовых клеток1,2. Существовал также насущной необходимости для одноклеточных суспензий эпидермальных клеток, пригодных для клоногенных анализов3, флуоресценция активированной сортировки клеток, и поток цитометрии3,4. Преимуществами этого метода являются надежный урожай увеличить напорядок по сравнению с другими методами 5,6, включение эпителиальной части волосяных фолликулов, и высокая виновность собранных клеток. В 80-е годы не существовало известных методов, которые могли бы удовлетворить эти потребности. В последующие годы этот метод был усовершенствован для повышения урожайности клеток. Основным ограничением этого метода будет маскировка некоторых пробипсин чувствительных антител, которые поставят под угрозу иммунореактивность6.
Мыши получили животноводство в соответствии с конкретными рекомендациями патогена Бесплатно. Было получено от одной до пяти самок мышей в возрасте от 54 до 2 дней. У пожилых мышей жизнеспособность кератиноцитов будет снижена из-за фазы анагена (роста) волосяного цикла. Кроме того, процесс трипсиизации сложнее по сравнению с молодыми мышами. Процедура сбора урожая была успешно оптимизирована для более тонкой кожи самок мышей по сравнению с самцами. Мышей, как правило, не используются для кератиноцитов урожаи, поскольку они имеют тенденцию бороться друг с другом во время проживания и, следовательно, может оставить царапины или раны на коже.
Protocol
Все протоколы использования позвоночных животных были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Университета Миннесоты в соответствии с рекомендуемыми NIH и правительственными руководящими принципами.
1. Инициализация инициализации слоя фидера и подскуляция
- Оттепель один флакон клетки, содержащий замороженные швейцарские мыши 3T3 из жидкого азота бак, поместив флакон в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение 1-2 мин. Количество клеток во флаконе составляет примерно 1 х 106.
- Удалите флакон 3T3 ячейки, когда последний кусочек льда растаял. Протрите трубку 70% спиртового тампона. Затем перенесите флакон в шкаф для биобезопасности.
- Перенесите клетки медленно в колбу Т-150 и промыть флакон 3T3 1 мл среды CGM. Медленно добавьте 30 мл предварительно разогретого 3T3 Complete Growth Medium (CGM) в клетки. Аккуратно раскачивать колбу, чтобы равномерно распределить 3T3 фибробластные клетки. Этикетка колба с детали клеточной линии, дата, и номер прохождения надлежащим образом.
- Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 и 95% влажности.
ПРИМЕЧАНИЕ: По данным ATCC, время удвоения швейцарской мыши 3T3 составляет 18 ч; при слиянии (контакт ингибируется), плотность составляет около 40000 клеток на см2. Мы используем определенную линию 3T3 в пределах 10-15 проходов после инициализации. Более быстрый рост или наличие шпиндель-образных клеток может произойти на более высоких проходах и, как правило, признак того, что 3T3 не будет выполнять, а также фидерные клетки для взрослых кератиноцитов мыши. При быстром росте лучше инициировать новую линию из нижних клеток прохода. - Изменение носителя после 24 ч, чтобы удалить мертвые клетки и оставшиеся DMSO (криоконсервативный агент), и два раза в неделю после этого. Разрешить клетки размножаться около 80% слияния и использовать T-150 колбы для инициирования культуры. Используйте т-225 для субкультуры после инициализации.
- Для субкультуры 3T3 фибробластных клеток, удалить колбу из инкубатора клеточной культуры и дважды вымыть с холодной стерильной PBS (1x) с гентамицином. Труба 10 мл предварительно подогретого (37 градусов по Цельсию водяной ванны) раствор трипсина (0.25%) в каждую колбу Т-225.
- Поместите колбу на согревающую тарелку на 3-8 мин. Снимите колбу и осторожно используйте ладони, чтобы коснуться стенок колбы, чтобы отсоединить клетки и подтвердить отслоение клеток под перевернутым микроскопом. Раствор трипсина может показаться облачным с отдельными 3T3 ячейками.
- Pipet трипсин решение 3-4x для мытья поверхности роста клетки колбы и передачи трипсинизированной ячейки до 30 мл CGM в 50 мл конической трубки. Перемойте колбу 3-5x с 10 мл CGM-трипсин-клеточной смеси из 50 мл конической трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Содержимое двух колб можно добавить в трубку 50 мл; если используется только одна колба, то поместите 10 мл трипсина/клеток в 20 мл CGM в трубку 50 мл. - Центрифуга 50 мл конической трубки при 160 х г в течение 7 мин при 4 градусах Цельсия.
- Теперь аспирировать супернатант и resuspend клетки гранулы с 5 мл CGM, pipetting мягко 10x, чтобы полностью нарушить клетки гранулы. Добавьте 10 мл CGM, чтобы довести общий объем конической трубки 50 мл до 15 мл.
- Смешайте еще раз 10x и поместите 5 мл клеточной подвески в 3 отдельных t-150 фляги. Соотношение субкультуры 1:3 в т-225 колбы или 1:4 в Т-150 фляги. Добавьте 30 мл предварительно разогретого 3T3 CGM к каждой из колб.
- Пометьте колбу с именем линии ячейки, датой посева клеток и номером прохода.
- Чтобы заморозить 3T3 клетки после центрифугирования в субкультуры шаг, удалить 50 мл трубки из центрифуги и место на ведро со льдом. Приготовьте супернатант и resuspend клеточной гранулы с 1 мл 5% DMSO-DMEM смеси (см. Таблица 1) для каждой колбы собраны.
- Поместите 1 мл смеси DMSO-DMEM с клеточной суспензией в каждую кривиальную (одна кривиальная на 3T3 колбу собрана). Пометьте флакон номером прохода, названием линии ячейки (3T3) и датой замораживания клеток.
- Поместите эти 3T3-клеточные флаконы в банку камер нойколярной камеры (см. Таблица Материалов)и перенесите в морозильную камеру -70 градусов по Цельсию для юэтт;5 ч. Осторожно снимите и перенесите флаконы из банки морозильной камеры и поместите в резервуар для хранения жидкого азота для длительного хранения до следующего использования . Введите информацию о названии линии ячейки, местонахождении в баке и дате в листе инвентаризации жидкого азота в лаборатории.
2. Подготовка 3T3 фидерного слоя для рентгеновского облучения и посева
- Подготовьте 3T3 клетки за неделю до их облучения и позвольте им вырасти на 100% слияние. 3T3 ячейки, как правило, в пределах проходов от 120 до 130.
-
Для успешного клоногенного анализа первичных кератиноцитов, перед посевом 3T3 клеток, поверхность покрывают 60 мм блюда Петри коллагеном.
- Pipet около 2-3 мл раствора коллагенового покрытия в 60 мм Петри блюда, чтобы покрыть нижнюю поверхность и удалить избыток коллагена покрытие жидкости (см. Таблица 1). Перенесите блюда Петри в инкубатор 37 градусов с 5% CO2 минимум на 1 ч. Не дайте блюдам высохнуть в инкубаторе.
- Рентгеновский облучение шаг: Следуйте шагам 1.4-1.6. Используйте 50 мл свежего CGM, чтобы повторно приостановить клеточные гранулы, закрыть коническую трубку и запечатать парафинау уплотнительной пленкой. Чтобы избежать загрязнения, используйте полиэтиленовые пакеты, чтобы удвоить мешок парафин-запечатанной ячейки, содержащей трубку и место на льду. Митомицин на основе альтернативного фидерного слоя могут быть использованы для кератиноцитов культуры7.
-
Облучение фибробласта 3T3 клеток в 50 мл конической трубки с 5000 рад (50 Cgy) дозы с биологическим рентгеновским аппаратом. Излучать эти клетки вместе с CGM средств массовой информации.
- После рентгеновского облучения, центрифуги клетки на 160 х г в течение 7 мин при 4 градусах По Цельсию. Аспирировать супернатант сми и осторожно resuspend клеточной гранулы с 5 мл CGM triturating мягко й 10x. Теперь доведите окончательный объем до 30 мл с дополнительными 25 мл среднего и тритурера 10x. Эти тритуруирующие шаги имеют решающее значение для равномерного 3T3 фибробластного слоя для оценки клоногенности.
- Подсчет жизнеспособных клеток: Подсчитайте кератиноциты с помощью обычного стеклянного гемоцитометра. Возьмите примерно 0,5 мл клеток и поместите в трубку 1,5 мл. Удалить 200 л клеточной смеси и добавить равный объем 0,4% Трипан синий раствор и смесь 3-4x. Передача клеток с гемоситометром и рассчитывать все нуклеидные клетки (маленькие золотые и розовые клетки) в качестве жизнеспособных клеток. Рассчитайте окончательную концентрацию жизнеспособных золотых клеток.
- Pipette 1 х 106 3T3 клеток (минимум 7 х 105) клетки могут быть использованы) в 60 мм коллагена покрытием Петри блюда (шаг 2.2) и аккуратно добавить 4 мл модифицированных высококальция Уильямс E средств массовой информации (см. Таблица 1). Разрешить свежепосеянные 3T3 клетки, чтобы прикрепить в течение 24 ч. На следующий день, урожай свежих первичных кератиноцитов и семян их на вершине прилагается 3T3 фибробластного слоя для клоногенного исследования, как указано ниже.
3. Первичный кератиноцитов сбор и посев
- Эвтаназия от четырех до пяти взрослых самок мышей с помощью вдыхания CO2 в соответствии с утвержденными стандартами животного объекта / IACUC. Тем не менее, этот протокол может также использоваться для одиноких самок / мужчин мышей.
- Клип примерно 9 см2 из донского меха с электрическим животным клипер и поместить все обрезанные мыши в 500 мл банку с достаточным количеством повидйй антисептический раствор (не скраб), чтобы покрыть их в течение 1-2 мин. Встряхните банку хорошо, чтобы равномерно покрыть антисептик решение над мышами.
- Слейте раствор и смыть чистой водой, пока жидкость не прольется. Повторите ту же антисептику с последующим промыть водой. После промывания антисептическим раствором замочите всех мышей в 70% этанола на 5-10 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши со светлым мехом (например, BALB/c) сохранят небольшой желтоватый цвет от антисептического ясли йода, в то время как темные мыши (например, C57BL/6) не будут. Примечательно, что жизнеспособность клеток или рост культуры не влияет из-за желтого цвета.
- Тщательно удалите обрезанную дорсальную кожу с помощью щипцы большого пальца и ножницы в ламинарном капюшоне потока. Поместите вырезанную царную кожу в коническую трубку, наполненную pbS/2x джентамицином. Избегайте использования брюшной боковой кожи для предотвращения заражения клеток молочной железы в культуре.
- Используя автоматические щипцы и скальпель, поместите одну дорсальную кожу в то время, волосатые стороны вниз на тонкую чашку Петри. Начните соскоб всех подкожных тканей, включая жир из брюшной стороны ткани кожи, пока он не полупрозрачный. Старайтесь удалять максимальные следы подкожной ткани, не разрывая кожу (волосяной фолликул). Кроме того, не царапать в течение длительного времени и избежать сушки кожи.
- Храните царапины кожи в растворе PBS до тех пор, пока все остальные шкуры обрабатываются. Используя скальпель, нарежьте шкуры на 0,5 см х 1-1,5 см полосками и поместите волосатую сторону вверх на стерильное блюдо Петри.
- Тщательно пипетка 20 мл раствора PBS/2x Gentamicin, смешанного с трипсином (0.25%) в 100 мм х 20 мм пластиковые Петри блюдо. Используя стерильные щипцы, перенесите шкуры и поместите их волосатой стороной вверх на поверхности раствора трипсина в течение 2 ч в инкубаторе 32 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время трипсинации и температура имеют решающее значение для хорошей урожайности высоко культивируемых первичных кератиноцитов. Хотя другие методы могут обеспечить хорошие урожаи жизнеспособных клеток, виновность кератиноцитов была менее удовлетворительной.- Во время этого времени инкубации 2 ч, пальто блюда с коллагенным покрытием и поместите их на 37 кв. м на 1 ч (см. шаг 3.1.2). Для клоногенных анализов, 60 мм Петри блюда уже были покрыты 24 ч до кератиноцитов уборки, чтобы облученный слой подачи 3T3, чтобы прикрепить к дну и равномерно распределить.
ПРИМЕЧАНИЕ: Покрытие культурных блюд для клоногенной культуры очень важно для правильной привязанности, формирования колонии, и конечной роста / распространения мышей эпидермальных кератиноцитов.
- Во время этого времени инкубации 2 ч, пальто блюда с коллагенным покрытием и поместите их на 37 кв. м на 1 ч (см. шаг 3.1.2). Для клоногенных анализов, 60 мм Петри блюда уже были покрыты 24 ч до кератиноцитов уборки, чтобы облученный слой подачи 3T3, чтобы прикрепить к дну и равномерно распределить.
- Эпидермальный шаг выскабливания: Упорядочить стерильные пластиковые квадратные Петри блюдо и создать поверхность на 30 "наклон для надлежащего эпидермального соскабливания с 15 мл собираения среды (см. Таблица 1). Аккуратно снимите плавающую полоску кожи из раствора трипсина с помощью изогнутых щипков. С новым лезвием скальпеля, соскребать эпидермис и волосы в среду.
- Не используйте чрезмерную силу, но используйте достаточную силу, чтобы очистить эпидермис, или это повлияет на жизнеспособность клетки.
- Во время эпидермиса соскабливания, держать лезвие перпендикулярно части кожи. Если лезвие под углом к движению лезвия, есть больше шансов на разрыв кожи. Если лезвие наклонено от движения лезвия, есть больше шансов на недостаточное удаление эпидермис.
- Тщательно залить собираемой среды, содержащей Царапины эпидермальных клеток в стерильные 60 мл банку (автоматически й и многоразовые) с 1,5 дюйма магнитного перемешать бар. Промыть чашку Петри с дополнительной средой сбора урожая для сбора оставшихся эпидермальных клеток и довести окончательный объем до 30 мл. Используйте магнитный мешалку и перемешайте при 100 об/мин в течение 20 мин при комнатной температуре. Этот процесс будет удалить захваченных эпидермальных клеток из волос.
- Поместите стерильный ситечко 70 мкм на вершине конической трубки 50 мл. Сотовый ситечко помещается поверх конической трубки 50 мл.
- Возьмите банку внутри капюшона биобезопасности. Снимите панель перемешивания и вылейте содержимое в фильтр ситечко, прикрепленный к конической трубке 50 мл. Процедить нежелательные волосы и листы прослойки роговицы.
- Нажмите на волосы вместе с материалами роговицы слоя в ситечко и манипулировать ими, чтобы освободить захваченных волосковых клеток. Используйте 5 мл соцвыки, чтобы позволить оставшимся в ловушке клетки, чтобы освободить и влиться в трубку. Доведите общий объем до 50 мл в конической трубке.
- Cap 50 мл конической трубки с фильтратом клетки и центрифуги на 160 х г в течение 7 мин при 4 c. Далее аспирировать супернатант и добавить 5 мл собираемого среднего. Отрежируйте клеточные гранулы, слегка тритуруируя 20x с трубкой 5 мл.
- На этом этапе держите клетки в холодильнике, чтобы избежать агрегации. Добавить 25 мл сосредней уборки и тритурировать снова (20-25x).
- Чтобы обеспечить точное количество кератиноцитов на этом этапе, возьмите 1 мл клеточной подвески и добавьте 19 мл собираемого средства. Теперь разбавление клеток 1:20 в 50 мл конической трубки. Если кератиноциты собирают из одной мыши, отрегулируйте объем клеточной подвески. Вместо 30 мл используйте 15 мл и сделайте разбавление 1:10 для подсчета клеток.
- Пипетка 0,5 мл разбавленных клеток из 50 мл конической трубки (1:20 разбавления) и передачи на 1,5 мл автоклавированной микроцентрифуговой трубки. Удалите 0,2 мл (200 л) клеточной смеси в другую микроцентрифуговую трубку объемом 1,5 мл и добавьте равный объем (200 л) 0,4% трипанового синего раствора. Аккуратно перемешайте это решение 3x и перенесите клетки в гемоситометр для подсчета нуклеадных кератиноцитов.
- Оценка всех темно-синих клеток положительный для Trypan синий как нежизнеспособные мертвых клеток, и оценка малых золотых и розоватых клеток, как жизнеспособные клетки. Окончательный выход кератиноцитов на мышь должен быть около 30 миллионов жизнеспособных клеток.
- Centrifuge оригинальный 50 мл конической трубки (от шага 3.8) в течение 7 мин при 160 х г при 4 c. На этом этапе, resuspend клетки в желаемой среде и сделать необходимое разбавление для посева клеток.
- Для массовой культуры, семена от 2 до 4 миллионов жизнеспособных золотых клеток в каждом 35 мм Петри блюдо в среде клеточной культуры (KGM-типа среднего - добавки для монослойных культур) (см. Таблица 1). Для клоногенного (образования колонии) асссея, семян 1000 клеток на 60 мм Петри блюдо на рентген облученных швейцарских мышей 3T3 фидер слоев с коллагеновым покрытием и модифицированных Уильяма E среды с добавками и сывороткой.
- Используйте в общей сложности от 2 до 4 мл среды для 35 мм и 60 мм Петри блюда, соответственно. Кроме того, сформулируйте DMEM и Williams E средний закупается от ATCC с пониженным уровнем бикарбоната натрия для использования на 5% CO2.
- Выращивайте культурные клетки (массовые или клоногенные) при 32градусах По цельсии, 95% влажности с 5% CO 2. Изменение средств массовой информации один день после первоначального посева для массовой культуры, а затем 3x еженедельно после этого. Однако, для клональных анализов, первое среднее изменение через 2 дня после посева клетки и 3x еженедельно после этого.
- Для клональной культуры культивировать клетки с интервалом в две и четыре недели. После завершения клональных культур (2 или 4 недели), аспирируем среду. Исправить колоний в 10% буферизированных формалин ночь при комнатной температуре и пятно с 0,5% родамина B в автоклавной воды для 1 ч. Затем удалите пятна родамина B с пипеткой с края посуды.
- Промыть посуду в холодной воде, пока посуда не продлятся. Положите блюда склонны на крышку посуды и дайте им высохнуть для окончательного подсчета колонии. Примечательно, что при выполнении клоногенного культурного ассоциативного ассссе, никогда не пайпета злт;1 мл клеток. Если клетки концентрированы, последовательно разбавляют концентрацию клеток.
Representative Results
Как правило, урожайность эпидермальных кератиноцитов на мышь в диапазоне от 20 х 106 до 30 х 106 Трипан синий исключая клетки получаются 8,9. Выживаемость колеблется от 80%-90%. Типичная эффективность посева составляет около 30% вложения на 24 ч. Формирование колонии на облученных 3T3 фидерных слоев составляет около 60 колоний на 1000 жизнеспособных клеток, посеянных для мышей C57BL/6, и приблизительно 30 колоний на 1000 клеток для мышей швейцарского типа10 ,11. Типичные результаты анализов формирования колонии иллюстрируются на рисунке 1. Количество стволовых клеток волосяного фолликуласоставляет примерно 9% CD34 /CD49f- стволовые клетки для c57BL/6 мышей12. Типичные результаты цитометрии потока приведены на рисунке 2.
Характеристики роста четырех различных носителей иллюстрируются на рисунке 3. Средства массовой информации испытания включают KGM-золото, SFM, Уильямe E среды, и Моррис-2 (снижение кальция среды, разработанной в лаборатории Моррис аналеки на основе Уильямс E).
Рисунок 1: Репрезентативные примеры из асссея на клоногенные кератиноциты взрослых мышей. Эта фотография демонстрирует кератиноцитов колонии формирования из CD-1 самок мышей 54 дней лечение местно с 1) без лечения, 2) ацетон следуют через неделю ацетон два раза в неделю в течение двух недель, 3) DMBA следуют одну неделю спустя ацетон два раза в неделю в течение двух недель, 4) ацетон следуют одну неделю спустя TPA два раза в неделю в течение двух недель, и 5) DMBA следуют одну неделю спустя TPA два раза в неделю в течение двух недель. После их лечения in vivo, кератиноциты были собраны и посеяны по 1000 клеток на блюдо на фидер слоев облученных 3T3, и культивируется в течение двух недель, после чего блюда были зафиксированы с буферным формалином и окрашены родамина B. Блюда в каждой колонке являются репликациями из каждой группы лечения мыши. Обратите внимание, что число крупных колоний увеличилось после лечения ДМБА, а общее число колоний увеличило tPA лечение мышей до сбора кератиноцитов. Аббревиативы: ДМБА: 7,12-диметилбенбенззан; ТПА: 12-О-Тетрейдраканойлгорбол-13-ацетат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Репрезентативный пример цитометрии потока стволовых клеток волосяного фолликула у взрослых мышей. Короче говоря, изолированные первичные кератиноциты были выделены из кожи предстных мышей и фильтруются для клеточного мусора с помощью клеточного фильтра. Изолированная подвеска кератиноцитов была помечена антителами CD49f или No6-итегрин (PE) и CD34 (FITC) вместе с живым мертвым красителем и другими элементами управления. FitC и PE изотип контроля антител (Крыса IgG2akappa) были использованы для компенсации цели (см. Таблица материалов). Стволовые клетки были выбраны с помощью CD49f (PE канал), который признал внешний компонент геми-десмосомы найти на базальных эпидермальных и волосяных фолликуляций клеток, и CD34 (канал FITC), который признал волосяной фолликул стволовых клеток (т.е., CD34-FITC и a6-PE (верхняя правая колонка, всего 5%)). Правая боковая колонка показывает различные популяции кератиноцитов, а именно только CD34-FITC, CD34-FITC и a6-PE-клетки (двойная положительная популяция стволовых клеток), a6-PE только, и неокрашенные клетки. Обратите внимание, что Есть два CD34и стволовых клеток населения, как было сообщено6,14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Сравнение четырех различных носителей первичных культур эпидермальных клеток у взрослых самок мышей. Первичные кератиноциты были выделены из кожи дорсалом мышей и рассчитывали для посева с использованием четырех различных носителей (KGM, SFM, Willem's-E и Morris-2). Равное количество кератиноцитов были посеяны и следуют за их общей морфологии и модели роста. Обратите внимание, что размножающиеся кератиноциты имеют несколько иную морфологию. KGM, SFM и Morris-2, все из которых снижены кальция средств имеют наиболее устойчивый рост после четырнадцати дней. В отличие от этого, клетки не сохраняются, когда культивируется в Уильямс E среды, которая имеет 1,4 мМ кальция и высокое соотношение калия к натрию. Удивительно, Уильямс E среды с добавками и двадцать процентов плода сыворотки крупного рогатого скота поддерживает кератиноцитов клональных культур гораздо лучше, чем любой другой среде испытания, вероятно, потому, что обогащенный Уильямс E среды помогает 3T3 фидерных клеток "кормить" лучше. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Решения и медиа | Комментарии |
| Решения для сбора урожая | |
| 2,5% трипсин (5 мл) | |
| PBS Дульбекко (500 мл) | |
| Гентамицин (2 мл) | |
| PBS с 2x гентамицин (45 мл) | |
| Фосфат-буферный солен (PBS) с 2x гентамицином | |
| Решение trypsin | |
| Решения для клеточной культуры | |
| Решение похотливого покрытия purecol-fibronectin: | |
| 1 M HEPES (1 мл) | |
| 116 мМ CaCl2 (1 мл) | |
| Бовин сывороточный альбомин 1,0 мг/мл (10 мл) | |
| Среда культуры клеток (100 мл) | |
| Фибронектин (1 мг) | |
| Пуркольный коллаген (1 мл) | |
| Решение для замораживания ячеек | |
| DMSO (2 мл) | |
| DMEM с 10% БКС и пером-стрептококком | |
| Урожай Средний | Нужно быть без кальция |
| 2 x гентамицин (1 мл) | |
| FBS (50 мл) | |
| МЭМ (500 мл) | |
| Высоко-Кальций Уильямс 'E Сми с: | |
| EGF (5 мкг/мл) 1 мл | |
| Глутамин 14,5 мл | |
| Гидрокортизон (1 мг/мл) 0,5 мл | |
| Инсулин 1 мл | |
| Линокислота-BSA (0,1 мг/мл) 0,5 мл | |
| MEM Ess AminoAcids 4 мл | |
| MeM Витамины 5 мл | |
| Пенициллин-стрептомицин 5 мл | |
| Трансферрин (5 мг/мл) 1 мл | |
| Вит А (1 мг/1000 л) 57,5 л | |
| Vit E 1 мг/мл (4 градуса) 3,5 л | |
| Vit D2 (10 мг/мл) 50 л | |
| 3T3 фибробластполный средний рост (CGM) | |
| БКС (100 мл) | |
| DMEM (900 мл) | |
| Пенициллин-стрептомицин (10 мл) | |
| Кгм | Средний, используемый для массовой культуры, является уменьшенной средой кальция |
| Моррис 2 среды с теми же добавками, как Уильямс E | Уменьшенный вариант кальция Williams E с добавками |
Таблица 1: Рецепты решения и мультимедиа.
Discussion
Описанный здесь метод сбора кератиноцитов был разработан для получения высоких урожаев высокоурожайных первичных эпидермальных кератиноцитов со спины взрослых самок мышей. Эти кератиноциты подходят для цитометрии потока, применения молекулярной биологии и первичной клеточной культуры, включая клоногенный анализ, о который сообщалось здесь. Этот метод сбора кератиноцитов также был полезен для изучения других аспектов кожного химического канцерогенеза и поощрения опухоли1,13.
В протоколе есть несколько важных шагов. Во-первых, для строгости и воспроизводимости использовались самки мышей в возрасте 54 лет и 2 дня. Это позволило нам выполнять чувствительные и количественные анализы колонии от нескольких штаммов мышей и использовать их в качестве фенотипа в анализе связей, ведущих к выявлению по крайней мере один новый ген регулятивного стволовых клеток10,11. Во-вторых, полезно разрезать шкуры на более мелкие кусочки, так как трипсинизация более эффективна, чем попытка сохранить кожу целиком. В-третьих, время и температура флотации трипсина очень важны для последующей виновности. Кроме того, нужно "тыкать значительно" на волосы, оставшиеся на фильтре, чтобы выбить прикрепленные клетки. Этот шаг важен для получения высоких урожаев клеток. Кроме того, температура инкубатора в 32 градуса имеет важное значение для долгосрочного выращивания кератиноцитов у взрослых мышей. Наконец, в этом протоколе параллельные считывания экспериментов in vitro и in vivo1 основаны на первичных культурах, а не на субкультурах или клеточных линиях. Примечательно, что если сбор первичных кератиноцитов в первый раз с помощью этого протокола, сохранить оставшиеся дермы после соскабливания, чтобы подтвердить полное удаление волосяных фолликулов вместе с эпидермис гистопатологического наблюдения.
Основная сила этого протокола для сбора взрослых кератиноцитов мыши является то, что он производит высокие урожаи виновных клеток, которые подходят для многих приложений вниз по течению. Главным ограничением является то, что некоторые эпитопы поверхности клеток могут быть чувствительны к трипсинизации, что иммуностоирование может быть скомпрометировано. Поэтому при тестировании нового антитела поверхности клетки, это может быть разумным использовать dispase6 или термолизин5 метод для сбора урожая для сравнения. Значение этого протокола является то, что он был тщательно протестирован, количественно, и применяется к таким разнообразным приложениям, как анализы для клоногенных стволовых клеток1,9,10,11, для массовых культур в биохимии8, для сортировки FACS в анализе стволовых клеток3,4, для молекулярной биологии3,12, и для текущего РНК и секвенирования ДНК.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы не имеют подтверждений.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan blue 1x in 0.9% saline | Life Technologies Gibco | 15250-061 | |
| 1 M HEPES Buffer | Sigma | H0887 | Sterile |
| 1.5 inch magnetic stir bar with pivot ring | Bel-Art, Wayne | 371101128 | in 2 oz Nalgene jar |
| 10 mL disposable pipettes | BD Falcon | 357551 | |
| 15 mL sterile conical tube | BD Falcon | 352097 | |
| 150 cm2 (T-150) culture flask | Corning | 430825 | |
| 2 mL Screw Cap Micro Tube Conical | Sarstedt | 72.608 | |
| 2 oz Nalgene jar | Thermo Fisher Scientific | 2118-0002 | 60 mL |
| 2.5% Trypsin solution 10x | Life Technologies Gibco | 15090-046 | |
| 225 cm2 (T-225) culture flask | Corning | 431082 | |
| 32 oz Nalgene Square Storage Bottles: PETG | Thermo Fisher Scientific | 2019-1000 | 1000 mL |
| 35 mm sterile culturing dish | Corning | 430165 | |
| 5 mL disposable pipets | BD Falcon | 357543 | |
| 50 mL sterile conicle tube | BD Falcon | 352098 | |
| 60 mm sterile culturing dish | Corning | 430166 | |
| 70% ethanol | |||
| 90 mm diameter Spectra Mesh filter, 74 µm pore size | Spectrum Laboratories | 145956 | |
| Antibiotics (penicillin-streptomycin) | Life Technologies Gibco | 15140-122 | |
| Bovine calf serum (BCS) | Thermo Fisher Scientific Hyclone | SH30073.03 | |
| Bovine serum albumin | BD Biosciences | 354331 | |
| CD34 Ram34 FITC conjugated antibody | BD Pharmingen | 553733 | |
| CD49f (alpha6-integrin, GOH3) PE conjugated antibody | BD Pharmingen | 555736 | |
| Cell Strainer, 70 µm sterile | BD Discovery Labware | 352350 | |
| Collagen, Bovine, Type I, 30 mg | BD Biosciences | 354231 | |
| CoolCell Economical cell freezing container for 1 or 2 mL cryovials | Biocison | BCS-136PK | |
| Corning 2 mL Polypropylene Cryogenic Vial, Self-Standing with Round Bottom | Corning | 430659 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Distilled Milli-Q water | made fresh; twice distilled reverse osmosis water | ||
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline 1x, Ca2+ and Mg2+ free | Life Technologies Gibco | 14190-144 | Sterile |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Hyclone | SH 300070.03 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-5MG | |
| Fisherbrand 4 oz. Sterile Specimen Container | Fisher Scientific | 16-320-730 | |
| Gentamicin 50 mg/mL 10 | Life Technologies Gibco | 15750-060 | |
| KGM | Lonza | CC-3103 | |
| Nalgene “Mr. Frosty" cell freezer | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| Nalgene PC Straight-Side Wide-Mouth Jars, 16 oz | Thermo Fisher Scientific | 2116-0500 | |
| No. 22 sterile stainless-steel blades | BD Bard-Parker | 371222 | |
| No. 4 scalpel handles | Biomedical Research Instruments | 26-1200 | In a cup with 70% ethanol |
| One pair of full-curve eye dressing forceps | Militex | 18-784 | In a cup with 70% ethanol |
| One pair of scissors | Biomedical Research Instruments | 25-1050 | In a cup with 70% ethanol |
| One pair of thumb dressing forceps | Militex | 6-4 | In a cup with 70% ethanol |
| Oster Pro-Cord/Cordless Trimmer no.40 blade | Jarden Consumer Solutions/Oster | 78997-010 | |
| Plastic Petri dish 100 mm x 20 mm sterile | Corning | 430167 | |
| Pyrex Brand Plain Stemless Glass Funnel | Corning | 6240-75 | |
| Rat IgG2akappa FITC isotype control antibody | BD Pharmingen | 553929 | |
| Rat IgG2akappa PE isotype control antibody | BD Pharmingen | 555844 | |
| SFM | Life Technologies Gibco | 10725-018 | |
| SMEM | Life Technologies Gibco | 11380-037 | |
| SMEM: Ca2+ and Mg2+ free minimal essential medium for suspension culture | Life Technologies Gibco | 11380-037 | |
| Square sterile plastic Petri dishes | BD Falcon | 351112 | |
| Swiss mouse 3T3 fibroblasts | ATCC | CCL-92 | used within 10 passages |
| Triadine; 10% Povidone-Iodine Prep Topical Solution, 16 oz | Triad Group | 10-8216 | |
| VWR Plastic Petri dishes, sterile Space Saver 100 x 10 | VWR | 25384-324 | |
| Williams E Medium | Life Technologies Gibco | 12551-032 | |
| Ziploc bag |
References
- Morris, R. J., Tacker, K. C., Fischer, S. M., Slaga, T. J. Quantitation of primary in vitro clonogenic keratinocytes from normal adult murine epidermis, following initiation, and during promotion of epidermal tumors. Cancer Research. 48 (22), 6285-6290 (1988).
- Tani, H., Morris, R. J., Kaur, P. Enrichment for murine keratinocyte stem cells based on cell surface phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10960-10965 (2000).
- Morris, R. J., et al. Capturing and profiling adult hair follicle stem cells. Nature Biotechnology. 22 (4), 411-417 (2004).
- Trempus, C. S., et al. Enrichment for living murine keratinocytes from the hair follicle bulge with the cell surface marker CD34. Journal of Investigative Dermatology. 120 (4), 501-511 (2003).
- Redvers, R. P., Kaur, P. Serial cultivation of primary adult murine keratinocytes. Methods in Molecular Biology. 289, 15-22 (2005).
- Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis. Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).
- Blacker, K. L., Williams, M. L., Goldyne, M. Mitomycin C-treated 3T3 fibroblasts used as feeder layers for human keratinocyte culture retain the capacity to generate eicosanoids. Journal of Investigative Dermatology. 89 (6), 536-539 (1987).
- Morris, R. J. Procedure for harvesting epidermal cells from the dorsal epidermis of adult mice for primary cell culture in “high calcium” defined medium. , Cambridge University Press. (1994).
- Wu, W. Y., Morris, R. J. Method for the harvest and assay of in vitro clonogenic keratinocytes stem cells from mice. Methods in Molecular Biology. 289, 79-86 (2005).
- Popova, N. V., Teti, K. A., Wu, K. Q., Morris, R. J. Identification of two keratinocyte stem cell regulatory loci implicated in skin carcinogenesis. Carcinogenesis. 24 (3), 417-425 (2003).
- Popova, N. V., Tryson, K. A., Wu, K. Q., Morris, R. J. Evidence that the keratinocyte colony number is genetically controlled. Experimental Dermatology. 11 (6), 503-508 (2002).
- Trempus, C. S., et al. Comprehensive microarray transcriptome profiling of CD34-enriched mouse keratinocyte stem cells. Journal of Investigative Dermatology. 127 (12), 2904-2907 (2007).
- Baer-Dubowska, W., Morris, R. J., Gill, R. D., DiGiovanni, J. Distribution of covalent DNA adducts in mouse epidermal subpopulations after topical application of benzo(a)pyrene and 7,12-dimethylbenz(a)anthracene. Cancer Research. 50 (10), 3048-3054 (1990).
- Blanpain, C., Lowry, W. E., Geoghegan, A., Polak, L., Fuchs, E. Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche. Cell. 118 (5), 635-648 (2004).
