Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

التحديد الكمي لخروج الكريات البيض عن طريق الأوعية اللمفاوية من الجلد مورين والأورام

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58704
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 1,2,3,4
1Department of Cell, Developmental, & Cancer Biology, Oregon Health and Science University, 2Department of Molecular Microbiology & Immunology, Oregon Health and Science University, 3Department of Dermatology, Oregon Health and Science University, 4Knight Cancer Institute, Oregon Health and Science University

Summary

هنا، علينا أن نظهر الأساليب في فيفو التقييم الكمي لخروج الكريات البيض من السذاجة، ملتهبة، والجلد مورين الخبيثة. نقوم بمقارنة وجها لوجه بين نموذجين: فوتوكونفيرسيون التطبيق و في الموقع فيتك عبر الجلد. وعلاوة على ذلك، علينا أن نظهر الأداة المساعدة فوتوكونفيرسيون لتعقب خروج الكريات البيض من الأورام الجلدية.

Abstract

خروج الكريات البيض من الأنسجة المحيطة بالغدد الليمفاوية تجفيف ليس فقط الحرجة لمراقبة محصنة وبدء بل تسهم أيضا في القرار ردود الأنسجة المحيطية. بينما يتم استخدام مجموعة متنوعة من أساليب لقياس خروج الكريات البيض من الأنسجة غير اللمفاوية، والأجهزة الطرفية، والآليات الخلوية والجزيئية التي تنظم خروج تعتمد على السياق تظل غير مفهومة. هنا، نحن تصف الاستخدام في الموقع فوتوكونفيرسيون للتحليل الكمي لخروج الكريات البيض من الجلد مورين والأورام. فوتوكونفيرسيون يسمح بمباشرة العلامات من الكريات البيضاء المقيمين داخل الأنسجة الجلدية. على الرغم من تعرض الجلد للضوء فوق البنفسجي يستحث المحلية التحريضية الردود تتسم تتسرب الكريات البيض ويجتازها الأوعية الدموية، في مقارنة وجها لوجه مع التطبيق عبر الجلد لتتبع الفلورسنت، فوتوكونفيرسيون على وجه التحديد تسمية الخلية الجذعية هجرة السكان، وفي نفس الوقت تمكين التحديد الكمي لخروج النقوي واللمفاوية من ميكرونفيرونمينتس الجلدية والأورام. آليات خروج الكريات البيض تظل عنصرا مفقوداً في فهمنا لتعقيد الكريات البيض إينتراتومورال، وهكذا تطبيق الأدوات المبينة في هذا التقرير سوف توفر فريدة من التبصر في ديناميات الورم ميكرونفيرونمينتس محصنة على حد سواء في استقرار الدولة واستجابة للعلاج.

Introduction

الاستجابات المناعية الأنسجة المحيطية تتشكل ليس فقط بتجنيد الكريات البيض إلى المواقع الالتهاب ولكن أيضا بالآليات التي تنظم الاحتفاظ بها بعد ذلك. وهكذا، تمليه الحصانة الواقية التراكمي الآليات الخلوية والجزيئية التي تحدد عما إذا كان يدخل الكريات البيض، يبقى داخل، أو بالأحرى يهاجر خارج الأنسجة الطرفية عبر الأوعية اللمفاوية. الأهم من ذلك، أن الميل للكريات البيضاء للخروج من الأنسجة عن طريق الأوعية اللمفاوية (يطلق عليها الخروج) مرتبط بوظائفها المتخصصة. الخلايا الجذعية (DC) اكتساب سلوك الهجرة استجابة لإشارات النضج مما يؤدي إلى نقل مستضد والعرض التقديمي في تجفيف الغدد الليمفاوية (دلن)، هي عملية ضرورية لمناعة التكيفية1. مسح الخلايا النقوي، مثل الضامة والعدلات، تعمل على إزالة الأنقاض apoptotic عن طريق البلعمه. خلال العدوى البكتيرية، العَدلات خروج الأنسجة والخضوع في نهاية المطاف للمبرمج في دلنس2 ونموذج لالتهاب القولون المستحثة بمفاجآت صيف دبي، والبيانات تدعم الفرضية القائلة بأن خروج بلعم ضروري لحل التهاب المحلية3. ومع ذلك، ما إذا كان يحدث خروج العَدلات وبلعم في جميع السياقات التحريضية، غير معروف. أدلة اللمفاويات T الخروج من حالة ثابتة4،5،،من67و المصابين8ملتهبة4،،من910، 11،12 الأنسجة الطرفية غير اللمفاوية، ويشير إلى أن أوافيكم بنشاط خلايا تي، على الرغم من الإشارات المستندة إلى الأنسجة التي تدفع هذا الخروج ما زالت غير مفهومة. وقد حددت عدة دراسات خروج الإشارات الضرورية للهجرة الاتجاه نحو تجفيف الشعيرات اللمفاوية واللاحقة بما في ذلك يجند chemokine (عزر ج ج) 21 (CCL21) ولها مستقبلات، CCR7،من411 13, يجند chemokine (عزر ج-س-ج) 12 (CXCL12) ومستقبلات CXCR42،14، وسفينجوسيني-1-فوسفات (S1P)10،،من1516. بيد أن هذه الآليات ليست نشطة في جميع السياقات، وعما إذا كانت هي تحديد الخروج من جميع أنواع الخلايا تبقى مسألة مفتوحة. الأهم من ذلك، يتطلب أعمق للآليات التي تحكم متدفقة وأهميتها الوظيفية في المرض زيادة الكمية في فيفو أساليب التحليل.

وقد استخدمت عدة طرق التحديد الكمي للخروج في عدة نماذج حيوانية في الجسم الحي بما في ذلك كانوليشن مباشرة من الأوعية اللمفاوية، التبني نقل السابقين فيفو المسمى الكريات البيضاء، التطبيق عبر الجلد لتتبع الفلورسنت، حقن الجسيمات المسمى، و في فيفو فوتوكونفيرسيون17،18. كانولاتيون المباشر للأوعية اللمفاوية الماوس الزبائ صعبة ومحدودة في الحيوانات الصغيرة بكميات السوائل التي يمكن جمعها. وبالتالي، إلى حد كبير أداء كانوليشن في الحيوانات الكبيرة (على سبيل المثال.، الأغنام) التي تكون فيها مثل هذه المعالجات الجراحية العملية. وتوفر هذه الدراسات أدلة مباشرة لوجود خلايا اللمفاوية سواء النقوي في الليمفاوية10،،من1920. وعلاوة على ذلك، تكشف نماذج الأغنام أن الالتهاب الحاد والمزمن زاد وجود اللمفاويات في الليمفاوية 100-fold حوالي10،21.

التبني نقل الخلايا الليمفاوية المسماة ومحوره وراثيا كشفت الأهم من ذلك أن CCR7 مطلوب للخروج من خلايا CD4 خلايا+ ر من حدة التهاب الجلد5،11، أثناء المعالجة الأولية للخلايا اللمفية مع جزيء صغير S1P مستقبلات مؤثر، يمنع FTY720، إلا بصورة جزئية عن خروج10. من المثير للاهتمام، الخروج من الخلايا الليمفاوية المحولة من التهاب مزمن في الجلد مستقلة CCR710، لكن قد تتطلب جزئيا CXCR49. تجارب نقل التبني، ومع ذلك، توصيل أرقام غير الفسيولوجية السابقين فيفو لمفاوية المنشط والمسمى إلى الأنسجة عن طريق الحقن، مما يغير البيئة النشاط الحيوي للأنسجة والضغوط السائل الخلالي مرتفعة أن فتح الشعيرات اللمفاوية الأولية، وتغيير خصائص النقل على22. كبديل، تطبيق عبر الجلد من fluorescein isothiocyanate (فيتك) في وجود أو عدم وجود المهيجات الجلدية (مثلاً.، والفثالات الفثالات، دبة) أو العدوى23،24 يسمح بالتتبع خلايا متجولة التي تتراكم الراسم وتهاجر إلى دلنس. وبالمثل، المسمى فلوريسسينتلي الأورام توفر وسيلة لتتبع الخلايا البلعمية التي تجتاح الورم المواد25. ووفرت هذه الأساليب الهامة من التبصر في الآليات التي تحكم العاصمة خروج13،14،17،،من2627 ولكن غير قادر على تتبع غير متجولة الخلايا الليمفاوية، وتفسير يمكن تعقدت اللمفاوي خالية من فيتك القابلة للذوبان وبالتالي وضع العلامات غير المهاجرة، LN المقيم وحدات تحكم المجال Dc.

وبدلاً من ذلك، الفحص المجهري إينترافيتال هو أداة قوية تسمح بتتبع في فيفو السكان الكريات البيض فسيولوجيا ذات الصلة في الوقت الحقيقي28،29. المستخدمة في تركيبة مع مراسل الفئران والقائم على جسم في فيفو إيمونوفلوريسسينت العلامات، إينترافيتال مجهرية كشف المجمع المكاني والزماني ديناميات المناعي الخلية الاتجار بالأشخاص، بما في ذلك الهجرة فراغي30 ، التهجير عبر البطانة اللمفاوية، ومرور داخل التجويف اللمفاوية، والهجرة على LN دخول28،31. محدود بالمصروفات، الخبرة الفنية اللازمة لإعداد، اعتماد واسع النطاق لتقنيات التصوير إينترافيتال ومحدودة الإنتاجية للتحديد الكمي لأنواع متعددة من الخلايا. لا يزال، اقتران الأساليب الكمية أن تحليل الديناميات السكانية الأنسجة مع تصوير إينترافيتال سوف توفر البصيرة ميكانيكية إضافية وهامة فيما يخص آليات حركية والهجرة نحو وداخل الشعيرات الدموية اللمفية 18 , 31 , 32.

ونتيجة لذلك، في فيفو فوتوكونفيرسيون برز كوسيلة تسمح الموقع في وضع العلامات، مستقل لنشاط متجولة، والتحديد الكمي لخروج الكريات البيض الفسيولوجية (عندما يقترن بالتدفق الخلوي) في غياب أو وجود التحدي. مؤثرا عن الفئران كايد تيمبل بروتين المعزولة من المرجان ستوني أن يسلك الفلورية الخضراء (كايد الأخضر) حتى تتعرض للضوء فوق البنفسجي، بعدها أنه يحول لا رجعة فيه للأسفار أحمر (كايد أحمر)33. يمكن تعقب الخلايا فوتوكونفيرتيد كما أنها خروج من مواقع الأنسجة المحيطية، وتتراكم في دلنس. وكشفت هذه وأخرى مماثلة فوتوكونفيرتيبلي الماوس نماذج34،35 البيولوجيا الهامة بما في ذلك خروج المكونة من خلايا تي التنظيمية من الجلد36، تعتمد على CXCR4 خلية بالخروج من البقع في بييير37 , تعبئة خلايا الذاكرة المقيم T عند إعادة تحدي الببتيد38، وخروج الكريات البيض واسعة من ورم ميكرونفيرونمينتس39. هنا، نحن إجراء مقارنة وجها لوجه من فوتوكونفيرسيون مع التطبيق فيتك عبر الجلد في سياق الالتهابات الجلدية والعدوى تسمح بإجراء مقارنة مباشرة للبيانات الموجودة باستخدام أسلوب فوتوكونفيرتيبلي. وعلاوة على ذلك، نحن تثبت فوتوكونفيرسيون في أورام مزروع ووصف كفاءة التحويل وخروج انتقائية من ورم ميكرونفيرونمينتس. على هذا النحو، يمكننا القول بأن تطبيق هذه الأساليب المزيد من توضيح بيولوجيا حاسمة لخروج الكريات البيض من الأورام، والتي سيكون لها آثار كبيرة على تفسير intratumoral الكريات البيض التعقيد، الحصانة المضادة للورم، و واستجابة للعلاج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

كافة البروتوكولات الحيوانية عليها برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة في ولاية أوريغون للصحة والعلوم بجامعة.

1-تنظيم دورات تعريفية لالتهاب وطلاء فيتك بينا الماوس

  1. في غطاء الاندفاق الصفحي، تخدير ماوس C57Bl/6 استخدام إيسوفلوراني المتبخرة (حمل في 3-5% إيسوفلوراني والحفاظ على إيسوفلوراني 1-3%؛ معدل تدفق الأكسجين في 0.5-1.0 لتر/دقيقة). ضمان أنيسثيتيزيشن السليم عن طريق رصد فقدان دواسة العاكسة، حركات لا إرادية، وانخفاض معدل التنفس.
  2. ويكمن إذن شقة مع الجانب البطني من الإذن التي تواجه صعودا. بيبيت 20 ميليلتر محلول فيتك 5% يذوب في الأسيتون 1:1: والفثالات الفثالات (دبة) إلى الجانب البطني من بينا الإذن. يسمح الإذن لتجف لبضع ثوان.
  3. 24 ساعة بعد تطبيق فيتك، euthanize الفئران عن طريق التعرض لغاز ثاني أكسيد الكربون تليها التفكك عنق الرحم. جمع بن الإذن في برنامج تلفزيوني عن طريق يفصل بين الأذنين من الرأس باستخدام مقص. جمع دلنس عنق الرحم ولنس غير استنزاف الآربي في برنامج تلفزيوني استخدام الملقط لفصل في لنس من الأنسجة المحيطة. لنس الآربي غير استنزاف سيكون بمثابة عناصر سلبية لوجود فيتك++ /Kaede الحمراء الكريات البيضاء. التخلص من جثث كل بروتوكول المؤسسية.
    ملاحظة: فوتوكونفيرسيون وظيفة الوقت الأمثل لتحليل سيتوقف على نوع الخلية والسلوكيات الهجرة المعروفة. على سبيل المثال، يمكن اكتشاف الخلايا الجذعية، في دلنس في وقت مبكر كتطبيق افرجا بوست ح 6.

2-تنظيم دورات تعريفية لالتهاب وفوتوكونفيرسيون بينا الماوس

  1. في غطاء الاندفاق الصفحي، تخدير ماوس كايد تيمبل (خلفية C57Bl/6) عن طريق الحقن داخل من الكيتامين 80 ملغ/كغ و 10 مغ/كغ إكسيلازيني الذائبة في المياه المالحة. ضمان أنيسثيتيزيشن المناسب كما هو موضح في "الخطوة 1-1".
  2. ويكمن إذن شقة مع الجانب البطني من الإذن التي تواجه صعودا. بيبيت 20 ميليلتر من 1:1 الأسيتون: دبة إلى الجانب البطني من بينا الإذن. يسمح الإذن لتجف لبضع ثوان.
  3. وبعد تطبيق دبة، قطع فتحه في قطعة من رقائق الألومنيوم وسحب الإذن من خلال الشق لفضح الإذن لمصدر الضوء فوق البنفسجي. وضع الإذن مسطح مع الجانب الظهرية التي تواجه إلى الأعلى باستخدام الشريط على الوجهين للحصول على الإذن لإحباط.
  4. ضع الإذن مباشرة تحت مصدر الضوء، وفوتوكونفيرت لمدة 3 دقيقة باستخدام مصدر ضوء 405 نانومتر في 100 ميغاواط السلطة.
  5. 24 ساعة بعد فوتوكونفيرسيون، euthanize الفئران كايد تيمبل وحصاد بن الإذن وعنق الرحم لنس لنس الاربية كما هو موضح في "الخطوة 1، 3".
    ملاحظة: بالإضافة إلى الاعتبارات المشار إليها في "الخطوة 1، 3"، أن معدلات الانتشار سيحدد توقيت التحليل كما سوف يحدث فقدان الأحمر كايد في سرعة تقسيم الخلايا.

3-اللقاحية العدوى بينا الماوس وتطبيق فيتك

  1. تخدير ماوس C57Bl/6 مع إيسوفلوراني يتبخر كما هو موضح في "الخطوة 1-1".
  2. ويكمن الجانب البطني من الإذن شقة. بيبيت 5 × 106 تشكيل اللوحة (بفو) لوحدات اللقاحية الفيروسات (فاكف) مخفف في 10 ميليلتر من برنامج تلفزيوني على بينا الإذن. باستخدام إبرة قياس 29، كزة بينا مرات 2540.
  3. 24 ساعة بعد الإصابة، تخدير الفئران المصابة فاكف مع إيسوفلوراني كما هو موضح في "الخطوة 1-1" وبيبيت 20 ميليلتر 5% فيتك المذاب في الأسيتون على الجانب البطني من بينا الإذن. يسمح الإذن لتجف لبضع ثوان.
  4. 24 ساعة بعد تطبيق فيتك، euthanize الفئران وجمع بينناي الإذن، لنس عنق الرحم ولنس الاربية كما هو موضح في "الخطوة 1، 3".
    ملاحظة: يمكن تطبيق فيتك في أي وقت نقطة وظيفة العدوى لتحديد DC الاتجار في مختلف فترات ح 24. نحن ذكرت سابقا هو الحفاظ على DC الهجرة إلى دلنس على مستويات مماثلة من العدوى من الرتبة 1 إلى 3 يوم41.

4-اللقاحية العدوى بينا الماوس وفوتوكونفيرسيون.

  1. تخدير ماوس كايد تيمبل مع إيسوفلوراني يتبخر كما هو موضح في "الخطوة 1-1".
  2. تصيب بينا الإذن مع فاكف كما هو موضح في "الخطوة 3-2".
  3. تخدير الفئران المصابة فاكف كايد كما هو موضح في "الخطوة 2، 1" 24 ساعة بعد الإصابة، وتنفيذ فوتوكونفيرسيون كما هو موضح في الخطوات 2.3-2.4.
  4. 24 ساعة بعد فوتوكونفيرسيون، euthanize الفئران وحصاد بن الإذن وعنق الرحم لنس لنس الاربية كما هو موضح في "الخطوة 1، 3".
    ملاحظة: كما هو مذكور أعلاه في "الخطوة 3، 4"، يمكن أن تدار فوتوكونفيرسيون في أي وقت نقطة بعد العدوى.

5-الإذن والعقدة الليمفاوية التجهيز للتدفق الخلوي

  1. إنشاء تعليق خلية مفردة من بن الإذن: قشر بعيداً على الجانبين البطني والظهريه من بينا الإذن باستخدام اثنين من أزواج من ملاقط ومكان مع الإذن أسفل إلى الآبار لصفيحة 24-البئر الذي يحتوي على 1 ملغ/مل كولاجيناز د والدناز يو/مليلتر 80 المخفف في الداخل مخزنة المالحة الحل (هبس في هانك) (التي تحتوي على Ca2 + و Mg2 +). احتضان في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 30 صحفي الأنسجة هضمها من خلال مصفاة خلية نايلون 70 ميكرومتر.
  2. إنشاء تعليق خلية مفردة من لنس: ضع لنس في آبار صفيحة 24-البئر الذي يحتوي على 1 ملغ/مل كولاجيناز د والدناز يو/مليلتر 80 المخفف في حبس. فتح نفش العقدة الليمفاوية كبسولة استخدام اثنين 29-قياس الإبر، واحتضان الليمفاوية في 37 درجة مئوية ل 30 دقيقة ثم اضغط الأنسجة هضمها عبر مصفاة خلية نايلون 70 ميكرومتر.

6-زرع الورم سرطان الجلد الأدمة وفوتوكونفيرسيون.

  1. يحلق الفراء من وسط الجزء الخلفي من ماوس كايد تيمبل يستخدم حلاقة الكهربائية.
  2. ضع إبرة قياس 29 في وسط الظهر بين سكابولاي اليسرى واليمنى العليا، وإينتراديرمالي بحقن الخلايا السرطانية5 5 × 10 (مخففة في 50 ميليلتر من المحلول الملحي) جلد الفئران كايد تيمبل. يجب أن توضع الأورام بعناية لضمان التصريف اللمفاوي إلى العقد الليمفاوية المحددة (أي، اليسار واليمين عضدي لنس لاورام وضعت في منتصف الجزء الأعلى من الظهر). تجنب وضع الورم أعلاه دلن كما يمكن أن ينتج عن هذا فوتوكونفيرسيون مباشرة من لنس عن طريق الجلد/الورم.
  3. السماح للأورام تنمو إلى الحجم المطلوب (100-650 ملم3).
  4. يوم واحد قبل جمع الأنسجة، تخدير كايد تيمبل ماوس كما هو موضح في 2.1 ويحلق أي الفراء ريجروون حديثا حول الورم.
  5. قطع حفرة دائرية في رقائق الألومنيوم وسحب الورم عن طريق تعريض الورم إلى مصدر الضوء. قص الثقب أصغر قليلاً من الورم لمنع الورم من الوقوع مرة أخرى من خلال الثقب والتقليل من تحويل الجلد المجاور، غير الورم.
  6. تحديد موضع الورم مباشرة أسفل مصدر الضوء وفوتوكونفيرت لمدة 5 دقائق باستخدام مصدر ضوء 405 نانومتر في 200 ميغاواط السلطة.
  7. 24 ساعة بعد فوتوكونفيرسيون، euthanize الفئران كما هو موضح في "الخطوة 1، 3". جمع الأورام وعضدي دلنس الاربية لنس غير استنزاف في برنامج تلفزيوني. قطع الأورام بعيداً عن الجلد المحيطة باستخدام مقص وإزالة لنس كما هو موضح في "الخطوة 1، 3".

7-الورم والعقدة الليمفاوية التجهيز للتدفق الخلوي

  1. إنشاء تعليق خلية واحدة من الأورام: فرم الأورام مع مقص إلى الآبار لصفيحة 24-البئر الذي يحتوي على 1 ملغ/مل كولاجيناز د والدناز يو/مليلتر 80 المخفف في حبس. احتضان في 37 درجة مئوية حاء 1 الصحافة هضم الأنسجة من خلال مصفاة نايلون 70 ميكرومتر.
  2. إنشاء تعليق خلية واحدة فقط من العقد الليمفاوية كما هو موضح في "الخطوة 5-2".

8-جسم تلطيخ للتدفق الخلوي

  1. بعد هضم الأنسجة في تعليق خلية مفردة، تنفيذ معيار التدفق الخلوي تقنيات المصبوغة لتسمية الخلايا مع علامات الاهتمام. بإيجاز، بيبيت 2 × 106 خلايا في لوحة 96-جيدا. احتضان العينات مع كتلة Fc (1 ميكروغرام/مل) لمدة 20 دقيقة على الجليد؛ تغسل مرتين مع المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية (ألبومين المصل البقري 1% من برنامج تلفزيوني). إضافة وصمة عار يعيش الميت (مخففة في برنامج تلفزيوني) للعينات واحتضان لمدة 15 دقيقة على الجليد؛ تغسل مرتين مع المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية (جدول المواد) المخفف في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية لمدة 30 دقيقة على الجليد؛ تغسل مرتين مع المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية.
    ملاحظة: كايدى الخضراء وكايدي ومضان أحمر يتداخل مع fluorophores فيتك والمؤسسة العامة؛ وهكذا، لا يمكن استخدام فيتك والأجسام المضادة مترافق PE في تركيبة مع البروتينات كايد.
  2. بعد تلطيخ، تشغيل العينات على سيتوميتير تدفق. وبدلاً من ذلك، إصلاح الخلايا مع 2% منهاج عمل بيجين.

9. التدفق الخلوي التحليل

  1. تعيين فيتك (كايد الأخضر) وقناة PE (كايد الأحمر) الفولتية PMT إلى 70-80% من مجموع النطاق (مركز السكان في حوالي الساعة 104) استخدام السابقين فيفو الأخضر كايد أو كايد حمراء اللون المفرد سبلينوسيتيس أو الدم.
    ملاحظة: لا تعوض عن كايد الأخضر (فيتك) وقنوات كايد أحمر (PE) كهذا سيؤدي إلى إشارة أكبر انتشار.
    1. لإنشاء عناصر تحكم كايد أحادي اللون، جمع من الطحال أو الدم من ماوس كايد تيمبل. خلايا الدم الحمراء مع ACK المخزن المؤقت، ثم تقسيم الخلايا إلى مجموعتين: غير محولة كايد كايد الخضراء وتحويلها أحمر.
    2. للون واحد كايدى ضوابط حمراء، تعليق الخلايا الموجودة في 1 مل من برنامج تلفزيوني وفوتوكونفيرت في صفيحة 24-جيدا لمدة 5 دقائق باستخدام مصادر ضوء 405 من شمال البحر الأبيض المتوسط في طه 100 ميغاواط. تستخدم هذه الخلايا لتعيين كايد الخضراء (فيتك) وكايد الفولتية PMT حمراء على تدفق سيتوميتير (9.1 الخطوة).
  2. بمجرد تم تعيين الفولتية للبروتينات كايد، التعويض عن سائر البقع الأولية جسم واحد-fluorophore المسمى الخرز تعويض كل إرشادات الشركة المصنعة باستخدام.
  3. تشغيل العينات على سيتوميتير تدفق لجمع البيانات.
    ملاحظة: ويجري إنتاج البروتين كايد باستمرار بالخلايا. وهذا يعني أن 24 ساعة بعد فوتوكونفيرسيون، سيتم تحويل الخلايا إيجابية مزدوجة كايد الخضراء وتراكمت البروتين كايد حمراء كالمركبة حديثا كايد (الأخضر) في الخلية.
  4. تحليل البيانات باستخدام برنامج فلووجو أو برامج مماثلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

أولاً سعينا إلى تكرار النتائج فوتوكونفيرسيون نشرت في الأدب لتقييم الكفاءة وتحديد التهاب المرتبطة بها في الجلد الماوس. تعرضت بينا الإذن إلى 100 ميغاواط البنفسجي الخفيف (405 نانومتر) لدقيقة 3 كما تم وصفه سابقا33. واحد تعليق خلية المتولدة من الجلد الإذن أو دلنس عنق الرحم مباشرة عقب التعرض وكشف من كفاءة تحويل 78% من جميع CD45+ ملاحظة الكريات البيضاء في الجلد مع أي من الخلايا المحولة في دلنس (الشكل 1A). لتقييم الاستجابة الالتهابية المرتبطة فوتوكونفيرسيون، نحن كمياً الأرقام من التسلل إلى CD45+ الكريات البيضاء في آذان المحولة 0 وح 24 وظيفة التحويل (الشكل 1B) والتغيرات الحادة في نفاذية الأوعية الدموية كقياس بميل للمقايسة42 (الشكل 1). بإيجاز، حقن 200 ميليلتر من 0.5% كان "الأزرق إيفانز" إينترافاسكولارلي ح 2 بعد فوتوكونفيرسيون. وجمعت الأذان 30 دقيقة بعد الحقن و "الأزرق إيفانز" كان يستخرج مع ميثلامين عن 24 ساعة عند درجة 55 درجة مئوية (امتصاص قراءة في 610 نيوتن متر42). كلا CD45 تتسرب+ (24 ساعة) وتسرب الأوعية الدموية (ح 2) كانت زيادة كبيرة عقب فوتوكونفيرسيون، مشيراً إلى أن فوتوكونفيرسيون نفسها قد تؤثر حتى على هذا التعرض القصير، الاستجابة الخاصة بالانسجة الملتهبة. مقارنة CD45 تتسرب+ (الشكل 1B) وتسرب الأوعية الدموية (1.4 ميكروغرام/الإذن ±0.75) في فاكف المصابة آذان ح 24 وظيفة العدوى41 يوفر سياقا لمدى الالتهاب الناجم عن الضوء فوق البنفسجي (ميكروغرام/الإذن 0.08 ± 0.01).

بينما استخدمت عدة نماذج في دراسات مختلفة لتعقب خروج الكريات البيض من الأنسجة غير اللمفاوية، والأجهزة الطرفية، من غير الواضح كيف يمكن مقارنة هذه الأساليب في قدرتها على تعقب فئات معينة من السكان كما أنها الخروج من الجلد. ونتيجة لذلك، قررنا إجراء مقارنة مباشرة وجها لوجه من اثنين من الأساليب استخداماً لتعقب خروج العاصمة إلى لنس، فوتوكونفيرسيون الطلاء و في فيفو فيتك، بغية تقييم الكفاءة والنوعية لكل أسلوب للكمية تحليل لخروج العاصمة في حالة مستقرة، أثناء الالتهابات الجلدية، ومن إصابة الجلد. لكل تحليل، يتعرضون لتطبيق فيتك عبر الجلد الجلد أو يتعرض إلى 100 ميغاواط 405 نانومتر الضوء لسكان العاصمة LN 3 دقيقة كانت تعرف بأنها CD3ε–CD19–مهسيي+CD11c+ وكذلك طبقات إلى 1) مهسييمرحبا CD11cint DCs، مما يثري للهجرة وحدات تحكم المجال Dc (مدكس) كلا CD103+ BATF3-تعتمد على تقديم عبر وحدات تحكم المجال Dc، و CD11b+ Dc عن طريق الجلد؛ و 2) مهسييintCD11cمرحبا DCs، مما يثري للمقيمين DCs (نسق) بما في ذلك CD8α+ BATF3-تعتمد على الصليب-عرض وحدات تحكم المجال Dc (الشكل 2A). 24 ساعة بعد تطبيق فيتك أو فوتوكونفيرسيون، كانت الخلايا المسماة سهولة الاكتشاف في تجفيف ولكن لا عدم استنزاف لنس (الشكل 2). لتقدير مدى هجرة العاصمة إلى لنس وفي نفس الوقت تحديد خصوصية الأسلوب لوسم ترحيل السكان والسكان LN غير المقيمين، ونحن كمياً المسمى مدكس ونسق في حالة مستقرة، 24 ساعة بعد تطبيق دبة، وبعد 48 ساعة فاكف تشريط (الشكل 2). بينما تسمية كل من فوتوكونفيرسيون (كايد) وفيتك مدكس في جميع الظروف، لاحظنا فيتك المسمى أكثر من المسمى كايد مدكس في دلنس، باستثناء الإصابة فاكف فيها الطريقتين كمياً إلى مستوى مماثل للخروج. وعلاوة على ذلك، في سياق دبة، المسمى فيتك بالإضافة إلى ذلك سكان جمهورية الكونغو الديمقراطية حيث لا يزال فوتوكونفيرسيون محددة على مدكس (الشكل 2). باستخدام كل من هذه الأساليب، لاحظنا خروج البلدان النامية حوالي 200 من فاكف إصابة الجلد، والأهم من ذلك أشار إلى أن هذا المستوى من خروج يلخص النتائج المنشورة سابقا باستخدام تطبيق فيتك عبر الجلد بالحمام et al. 41-وهكذا، تبعاً للسياق التحريضية، تطبيق فيتك عبر الجلد قد زيادة إعداد DCs المسمى الكشف عنها في دلنس والنتيجة في وسم غير محددة من السكان العاصمة LN المقيمة غير المهاجرة، بينما فوتوكونفيرسيون بالتحديد على وحدات تحكم المجال Dc الوقوع في عدد سكان حركة التغيير الديمقراطي.

كايد تيمبل الفئران قد استخدمت لقياس الاحتفاظ الكريات البيض في5،،من3343 والخروج من5،6،،من3538 الجلدية، والأغشية المخاطية، و الأنسجة اللمفاوية تحت ثابت الدولة وملتهبة الشروط وتطبيقها على الأورام في منشور واحد حيث كانت مزروع الأورام الأدمة في آذان الفأر وفوتوكونفيرتيد في كميات صغيرة39فقط. وهكذا، سعينا إلى إجراء تقييم لجدوى في فيفو فوتوكونفيرسيون للتحديد الكمي لخروج الكريات البيض من الأورام الأولية كبيرة وثابتة لتمكين اختبار الفرضية المناعية كذلك. أولاً، نحن زرع الخلايا السرطانية MC38 إينتراديرمالي في الفئران كايد تيمبل بين سكابولاي الأيمن والأيسر. تمكين النماذج القابلة للغرس الورم الموضع الدقيق للأورام لضمان التصريف اللمفاوي إلى لنس المعروفة؛ أورام في الجلد من الجزء العلوي إلى استنزاف أساسا لنس اليسار واليمين عضدي. بعد أن وصلت إلى 100-150 ملم3، كانت الأورام فوتوكونفيرتيد (10 دقيقة، 200 ميغاواط) والأورام وتحصد فور فوتوكونفيرسيون دلنس. وكشف التحليل بالتدفق الخلوي كبيرة تحويل intratumoral CD45+ الخلايا من كايد الأخضر+ إلى كايد الأحمر+ (69 في المائة؛ الشكل 3 ألف)، بينما الأهم من ذلك، ظلت سلبية بالنسبة للخلايا الحمراء كايد+ دلنس. مجهر الفلورة الأورام فوتوكونفيرتيد YUMM 1.7 كشف فوتوكونفيرسيون أن يخترق عمق الورم الأنسجة (> 1 مم؛ الشكل 3). من المثير للاهتمام، الجلد وخلايا الأوعية الدموية التعبير عن مستويات عالية من البروتين كايد مما يؤدي إلى كفاءة عالية فوتوكونفيرسيون من هذه أنواع الخلايا كما هو موضح في الشكل 3 (ب). هذا التعبير كايد حمراء عالية تجعل من الصعب تحديد الخلايا المناعية (غير المحولة وتحويلها على حد سواء) باستخدام مجهر الفلورة.

نظراً لاهتمامنا خاصة في علم المناعة سرطان الجلد، نحن التالية تقييم أثر كل من حجم الورم والميلانين على كفاءة فوتوكونفيرسيون باستخدام مختلف خطوط الخلايا القابلة للغرس الورم مورين: MC38 (الزغب خط سرطان القولون والمستقيم)، B16. المفتاح F10 (خط الميلانوما إنتاج الميلانين)، YUMM 1.1 (الميلانوما أونبيجمينتيد خط) و 1.7 YUMM (خط أونبيجمينتيد الميلانوما)44. كل من هذه الخطوط تم زرعها الأدمة في الفئران كايد تيمبل وفوتوكونفيرتيد، كما هو موضح أعلاه على وحدات التخزين المختلفة الورم (50-650 ملم3). الأورام هي تحصد فورا بعد فوتوكونفيرسيون وتقييمها لوجود CD45 كايد أحمر+ الكريات البيضاء بالتدفق الخلوي. من المثير للاهتمام، كفاءة فوتوكونفيرسيون CD45+ الكريات البيضاء التي اختلفت اختلافاً كبيرا عبر الورم أنواع وأحجام (الشكل 3). CD45+ الكريات البيضاء داخل الصغيرة (50-150 ملم3) أظهرت الأورام YUMM 1.7 و YUMM 1.1 فوتوكونفيرسيون الأكثر كفاءة في 80% و 60%، على التوالي. زيادة وحدات التخزين لهذه الأورام، انخفضت كفاءة التحويل إلى حوالي 50% للأورام الكبيرة (> 600 مم3). الميلانين أثر ضرب على كفاءة فوتوكونفيرسيون: فوتوكونفيرسيون الحد الأقصى ل CD45+ الخلايا داخل الميلانين المنتجة B16. أورام F10 فقط حوالي 30 في المائة وانخفض إلى 10 في المائة كما الأورام بلغت كميات من 400 مم3. من المثير للاهتمام، خلايا تحليل intratumoral CD8+ تي فوتوكونفيرسيون كشف الفعالية لهذه الخلايا في حوالي 80-90% في الأورام الصغيرة بغض النظر عن إنتاج الميلانين (3D الشكل). للأورام أونبيجمينتيد، CD8+ تحويل خلية T ظلت عالية حتى وأن الأورام بلغت كميات كبيرة، ولكن انخفضت إلى حد كبير مع الحجم عندما حضر الميلانين. عليه، فإن فائدة B16. F10 مورين الأورام الخبيثة، وخطوط سرطان الجلد الميلانين المنتجة الأخرى، قد تكون محدودة للأورام الصغيرة (3من 50 مم)، وما يتسق مع الوظيفة البيولوجية الميلانين في امتصاص الضوء. لتقييم الاستجابة الالتهابية المرتبطة فوتوكونفيرسيون للأورام، ونحن كمياً عدد CD45+ الخلايا في الأورام غير المحولة وأورام المحولة ح 24 وظيفة فوتوكونفيرسيون (رقم 3E). رأينا لا يوجد فرق كبير في مجموع إعداد CD45+ الخلايا التي تكتشف في الأورام 24 ساعة عقب فوتوكونفيرسيون مقارنة بالأورام غير محولة.

نحن كمياً بعد خروج الكريات البيض من ورم ميكرونفيرونمينتس باستخدام الفئران كايد تيمبل، الذي يسمح باستجواب سلوك الاتجار بالأشخاص من كلا النوعين النقوي واللمفاوية خلية. تم زرع الخلايا السرطانية MC38 أو YUMM 1.7 إينتراديرمالي في الفئران كايد تيمبل. كانت الأورام فوتوكونفيرتيد مجرد وحدات التخزين التي تم التوصل إليها بين 100-150 ملم3 (5 دقائق، 200 ميغاواط)؛ جمعت دلنس عضدي ولنس الآربي غير تجفيف 24 ساعة بعد فوتوكونفيرسيون. تم قياس كمية السكان الكريات البيض إينتراتومورال من MC38 وأورام YUMM 1.7 مزروع في مكافحة الفئران C57Bl/6 وجمعها مرة واحدة الأورام بلغت 100-150 ملم3. نحن تقييم تعقيد الكريات البيض داخل الأورام والسكان اجريسيد بالتدفق الخلوي: خلايا تي (CD3ε+CD4+/-CD8+/-)، خلايا ب (CD3ε–CD19+)، وحدات تحكم المجال Dc (CD11c+مهسيي+CD11b+/- )، العَدلات (CD11b+مهسيي–Ly6G+)، الضامة (CD11b+مهسيي++F4/80)، والتهاب وحيدات (CD11b+Ly6G–Ly6C+؛ الشكل 4A). استخدام هذا المخطط النابضة نفسه، يمكننا تقييم عن النسبة المئوية لكل السكان الكريات البيض في دلنس التي أعرب عنها كايد الأحمر يشير إلى الإقامة السابقة في ورم ميكرونفيرونمينتس (الشكل 4 باء). من المثير للاهتمام، في حين كلا MC38 (الشكل 4) والأورام YUMM 1.7 (الشكل 4) وقد تسلل أساسا مع الخلايا النقوي (وحيدات، وحدات تحكم المجال Dc، والضامة)، وحوالي 50% الخلايا التي قد اجريسيد من كلا النوعين الورم تي الخلايا الليمفاوية (CD4 كلا+ و CD8+). بالإضافة إلى خلايا تي، لاحظنا أيضا وحدات تحكم المجال Dc، ب الخلايا، وكان لم يتم الكشف عن وحيدات داخل السكان اجريسيد من الأورام ولكن الضامة والعدلات من أي نوع الورم. بالإجمال، يوضح هذه البيانات الأداة المساعدة كايد تيمبل فوتوكونفيرتيبلي الفئران لتتبع الأنساب الكريات البيض متعددة في بيئة محلية. وعلاوة على ذلك، تحليلنا تشير إلى أن خروج عملية انتقائية، النشطة قد تكون لها آثار هامة لتحديد إينتراتومورال الكريات البيض التعقيد.

Figure 1
رقم 1: فوتوكونفيرسيون الكفاءة والمرتبطة التهاب في الجلد مورين. مورين الأدمة وكان فوتوكونفيرتيد لمدة 3 دقائق على 100 ميغاواط (405 نانومتر الضوء). (A) تدفق الممثل مؤامرات تصف فوتوكونفيرتيد (الأحمر كايد+) CD45+ الخلايا من الإذن غير المحولة والمحولة وفور فوتوكونفيرسيون دلن عنق الرحم. السكان كانوا قبل بوابات على العيش، CD45+ واحدة من الخلايا. (ب) بتعداد إجمالي CD45+ الخلايا في آذان غير محولة (-)، وآذان جمعها مباشرة عقب فوتوكونفيرسيون، آذان جمعت 24 ساعة بعد فوتوكونفيرسيون، وآذان جمعت 24 ساعة بعد الإصابة فاكف (n = 3). (ج) أجرى المقايسة "ألف ميل" للتحديد الكمي للأوعية الدموية يجتازها مباشرة بعد التعرض إلى 405 نانومتر الضوء (3 دقيقة، 100 ميغاواط). صورة تمثيلية للتسرب في الإذن الجلد (يسار) والتحديد الكمي لصبغ المستخرجة (يمين) (n = 3). أشرطة الخطأ تمثل sem. *ف< 0.05 و * *ف< 0.01. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: خروج العاصمة من السذاجة، ملتهبة، وإصابة الجلد. (أ) جاتينج مخطط لتحديد وحدات تحكم المجال Dc المهاجرة (مدكس؛ مهسييمرحباCD11cint) والمقيمين DCs (نسق؛ مهسييمرحباCD11cمرحبا). (ب) تدفق الممثل المؤامرات التي تشير إلى فيتك+ أو الأحمر كايد+ وحدات تحكم المجال Dc، بوابات مسبقاً على مدكس، من الفئران المصابين فاكف (دلن) أو LN كونترالاتيرال غير استنزاف عناصر التحكم. (ج) التحديد الكمي لإعداد كايد أحمر+ ومدكس فيتك+ ونسق في دلنس حالة ثابتة وأفرجا ملتهبة (24 ح تطبيق وظيفة)، وفاكف إصابة الجلد (48 ساعة بعد الإصابة). أشرطة الخطأ تمثل sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: فوتوكونفيرسيون الكفاءة في الورم ميكرونفيرونمينتس- كانت الأورام فوتوكونفيرتيد لمدة 10 دقائق في 200 ميغاواط (405 نانومتر الضوء). (أ) قطع تدفق الممثل كايد الخضراء والحمراء في الأورام MC38 غير المحولة والمحولة وعضدي دلن فور فوتوكونفيرسيون كايد. السكان كانوا قبل بوابات على العيش، CD45+ خلايا مفردة. (ب) ميكروكوبي الفلورة المجمدة، وجزءاً لا يتجزأ من أكتوبر YUMM 1.7 الأورام كلا غير المحولة وفوتوكونفيرتيد. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. (ج) كفاءة التحويل من CD45+ الكريات البيضاء و CD8 (د) + الخلايا الليمفاوية في إنتاج الميلانين (B16. F10) والزغب (MC38، YUMM 1.1، YUMM 1.7). وتمثل كل نقطة ماوس واحدة. (ه) بتعداد إجمالي CD45+ الخلايا في الأورام غير المحولة والأورام فوتوكونفيرتيد جمعت 24 ساعة بعد فوتوكونفيرسيون (n = 3). أشرطة الخطأ تمثل sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: خروج الكريات البيض من ورم ميكرونفيرونمينتس ليست انتقائية. (أ) جاتينج مخطط لتحديد السكان النقوي واللمفاوية في دلنس MC38. (ب) يرسم تدفق الممثل تحديد الخلايا كايد أحمر+ بين الخلايا اللمفاوية والنقوي في MC38 دلنس ح 24 بعد فوتوكونفيرسيون. النسب المئوية في قطع تدفق الإشارة إلى تواتر كايدى أحمر+ الخلايا ضمن السكان الكريات البيض الأصل المشار إليه في لنس- (ج، د) نسب intratumoral النسبي (% من CD45+ الخلايا) واجريسيد (الخلايا الحمراء كايدى+ %؛ الكريات البيضاء دلنس عضدي) من MC38 (C، n = 3) و YUMM 1.7 (د، ن = 4) الأورام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

على الرغم من أن خروج الكريات البيض من الأنسجة المحيطية، غير اللمفاوية أمر حاسم لبدء والقرار من الاستجابات المناعية، هي غير مفهومة الآليات الجزيئية التي تنظم متدفقة. هذه الفجوة في المعرفة إلى حد كبير بسبب توفر أدوات للقياس الكمي في فيفو. هنا، يمكننا وصف استخدام الفئران فوتوكونفيرتيبلي (تيراغرام كايد) التحديد الكمي لخروج الكريات البيض الذاتية من الجلد والأورام، وتوفر مقارنة مباشرة وجها لوجه مع الطلاء فيتك في التهابات وعدوى نماذج. وعلينا أن نبرهن أن بينما تتبع كلا النموذجين الذاتية DC السكان، الصرف الحرة فيتك وسوء امتصاص الخلايا غير متجولة يحد من الأداة المساعدة فيتك الطلاء لتحليل واسع النطاق لخروج النقوي والليمفاوي من الأنسجة غير اللمفاوية، والأجهزة الطرفية، بما في ذلك الأورام. وعلاوة على ذلك، نقدم البيانات التي تشير إلى الخروج من الأورام انتقائية بدلاً من العشوائية مما يؤكد الاستنتاجات التي قدمها تورسيلان et al. 39-قد تكشف عن مواصلة التحقيق في الآليات التي تحكم خروج الكريات البيض من الأورام رواية ثاقبة التهاب المرتبطة بورم والحصانة.

نحن أولاً تقييم كفاءة فوتوكونفيرسيون في الجلد مورين وأثره على التهاب المحلية عند استخدام إعدادات ذكرت في الأدبيات. تعرض أذنيه للبنفسجي خفيفة لمدة 3 دقائق في 100 ميغاواط طاقة أسفرت عن كفاءة فوتوكونفيرسيون من CD45+ الخلايا داخل الجلد الإذن (78 في المائة) مع عدم التحويل في دلنس المتلقين للمعلومات. وتبين التقارير في الأدب التعرض دقيقة 3-5 الأمثل للأنسجة الجلدية5،،من3338. بيد أن هذا التعرض أدت إلى زيادة في إعداد CD45+ الخلايا في الإذن بينا 24 ساعة بعد التحويل، ويستحث تسرب الأوعية الدموية مما يشير إلى أن فوتوكونفيرسيون في هذه الإعدادات في جلد الإذن التهاب المحلية، التي ينبغي النظر فيها عند تفسير البيانات. التالي سعينا إلى مقارنة DC الاتجار إلى لنس باستخدام فوتوكونفيرسيون كايدى وأوسع استخداماً فيتك الطلاء المقايسة23،24 في حالة مستقرة، أثناء الالتهابات الناجمة عن دبة، ومن آذان فاكف إصابة مباشرة. لاحظنا العلامات المرتفعة في فيتك معاملة مقارنة بالجلد فوتوكونفيرتيد في حالة مستقرة والمعاملة افرجا التالية. فيتك مجاناً للجلد يمكن أن يسفر تطبيق الصرف المباشر عبر الأوعية اللمفية إلى استنزاف لنس حيث المقيم سكان العاصمة، التي لا يتم ترحيل (مثلاً.، CD8α+ DCs)، عينة فيتك. واتساقا مع ذلك، لاحظنا عددا كبيرا من نسق مع التسمية فيتك عندما تعامل مع دبة مهيجة. على النقيض من ذلك، كايد الأحمر المسمى وحدات تحكم المجال Dc فقط لوحظت في حركة التغيير الديمقراطي في أعقاب السكان فوتوكونفيرسيون مشيراً إلى أن فوتوكونفيرسيون يوفر طريقة أكثر تحديداً لتسمية مدكس. حتى داخل السكان حركة التغيير الديمقراطي، ومع ذلك، لاحظنا مدكس كمياً المسمى أكثر عند استخدام فيتك عبر فوتوكونفيرسيون. في حين قد يفسر هذا أيضا بالحرة فيتك الصرف، فمن الممكن أن الاختلافات في فترة وضع العلامات، حيث فوتوكونفيرسيون يمكن فقط تسمية وحدات تحكم المجال Dc حاليا المقيم في الجلد بينما فيتك يبقى في الجلد لمدة فترة 24 ساعة ، تستأثر بالاختلافات في خروج لوحظت حركة التغيير الديمقراطي. من المثير للاهتمام، في سياق العدوى الفيروسية، فوتوكونفيرسيون وتطبيق فيتك قياس مستويات متساوية نسبيا من خروج حركة التغيير الديمقراطي ونسق فيتك+ القليلة في لنس تجفيف الأذنين المصابين فاكف. ونحن مؤخرا أفادت أن اللمفاوي العدوى فاكف التالية انخفاضا كبيرا، وبالتالي انخفاض الفيروسية الناجمة عن النقل اللمفاوية قد يحسن خصوصية الطلاء فيتك وخفضت وسم LN السكان المقيمين DC31 . الأهم من ذلك، يسلط هذا العمل الضوء أيضا على الحقيقة أن ضمن السكان حركة التغيير الديمقراطي (CD3ε–CD19–مهسييمرحباCD11cint)، هو عدد وحدات تحكم المجال Dc التي تم ترحيلها بنشاط داخل ح 24 سكان البسيطة، وبالتالي إجمالي حركة التغيير الديمقراطي أرقام لا بديل جيد للهجرة النشطة41. وأخيراً، من المثير للاهتمام أن نلاحظ أننا دائماً قياس الخروج حركة التغيير الديمقراطي في حوالي 200 من الخلايا لأي ح 24 المعطى الفترة التالية فاكف العدوى41، أثناء خروج 1500-2000 DCs من ورم ميكرونفيرونمينتس. نظراً لفعالية هائلة من فاكف كمنصة لقاحات، لا سيما عند تطبيقها بتشريط45،،من4647، أنها مثيرة للاهتمام التكهن بأنه من نوعية وحدة تحكم المجال DC وربما نوع DC عرض مستضد، بدلاً من الكمية، التي تحدد قوة الحصانة الواقية.

خروج الكريات البيض من الورم ميكرونفيرونمينتس، خارج وحدات تحكم المجال Dc25،48، ما زال يشكل مجالاً التحقيق سيئة. على الرغم من أن تعتبر الأورام ميكرونفيرونمينتس التهاب مزمن، عما إذا كان تنظيم آليات مماثلة الخلوية الخروج من الأنسجة غير خبيث والخبيث لا يزال غير معروف. وعلاوة على ذلك، ما إذا كان خروج الكريات البيض من الأورام العشوائية انتقائية أو بالأحرى ستترتب عليها آثار كبيرة لتفسير تراكم الكريات البيض والاحتفاظ بها في ميكرونفيرونمينتس الورم. على هذا النحو، قد تكون حاسمة لفهم كيفية التهرب من الأورام مراقبة محصنة ضد خروج الكريات البيض من الأورام ويؤدي إلى استراتيجيات جديدة للعلاج المناعي. هنا نقوم بتطبيق نموذج فوتوكونفيرتيبلي تيراغرام كايدى لدراسة الكريات البيض الخروج من الأورام الجلدية القابلة للغرس، حيث الطلاء فيتك لن تكون كافية لتسمية عامة السكان النقوي واللمفاوية على حد سواء. كشفت الدراسات الأولية أن الكفاءة فوتوكونفيرسيون في أورام مزروع كانت تعتمد على حجم الورم والميلانين على حد سواء. بينما الكفاءة فوتوكونفيرسيون تنخفض سرعة نمو الأورام عند وجود الميلانين (B16. F10)، يحمل خطوط غير مصطبغة الورم مثل الأورام YUMM و MC38 أكثر استقرارا من كفاءة التحويل عبر أحجام الورم اختبارها. من المثير للاهتمام، لاحظنا كفاءة التحويل المحسنة في CD8+ حجرة خلية T بالمقارنة مع CD45+ الخلايا التي انخفضت كزيادة في حجم الأورام. وهناك احتمال عدة عوامل تسهم في هذه الملاحظة. أولاً، سوف تؤثر الموقع داخل ورم التعرض، وبالتالي كفاءة التحويل لأنواع معينة من الخلايا. خلايا تي توجد غالباً ما تقتصر على واجهة الجلد-الأورام في النماذج القابلة للغرس الورم وهكذا قد يكون أكثر سهولة من فوتوكونفيرتيد بالنسبة إلى الخلايا النقوي تسلل حمة الورم. ثانيا، ليس كل الكريات البيضاء التعبير عن نفس مستويات البروتين كايد49 وبالتالي قد لا جميعا على قدم المساواة الكشف عنها بواسطة التدفق الخلوي؛ قد يؤدي هذا إلى انخفاض نسب المشاهدة من فوتوكونفيرسيون عند تحليل سكان خلية غير متجانسة أكثر مثل CD45 جميع+ الخلايا. وأخيراً، من المهم ملاحظة أن البيانات المعروضة في الشكل 3 دقيقة 10 التالية التي تم إنشاؤها من التعرض للضوء فوق البنفسجي. واختير هذا الوقت التعرض الأولى استناداً إلى التقارير في الأدب نقلا عن أوقات فوتوكونفيرسيون للأجهزة المختلفة بما في ذلك الجلد ولنس والأنسجة المخاطية والأورام5،،من633،35 ،،من3943. فقط الدراسة الأخرى تستخدم نظام فوتوكونفيرتيبلي في الأورام، وأجرى فوتوكونفيرسيون عن 20 دقيقة39. وكشف المزيد من التحسين في أيدينا تحسين الكفاءة مع وقت تعرض لتقصير مدة 5 دقائق للكميات الصغيرة والكبيرة على حد سواء. فمن المحتمل أن التعرض لفترة طويلة يؤدي إلى فوتوبليتشينج الأسفار كايد، وعلى هذا النحو، قد يكون لدينا كفاءات التحويل المبلغ عنها حقيقته. التعرض لفترات طويلة قد يؤدي إلى زيادة التهاب المرتبطة فوتوكونفيرسيون أيضا، والخلط بين نتائج الدراسة. الأورام فوتوكونفيرتيد لمدة 5 دقائق أظهرت الخلايا لا يوجد فرق كبير في عدد intratumoral CD45+ 24 ساعة بعد فوتوكونفيرسيون مقارنة بالأورام غير محولة. بالإضافة إلى ذلك، أثبتت فوتوكونفيرتيد الأورام لمدة 5 دقائق خروج قابلة للقياس واستنساخه للسكان النقوي واللمفاوية على حد سواء. ونتيجة لذلك، الأمثل الفردية داخل أنسجة محددة أو الأورام الاهتمام اللازم لتحقيق نتائج مثلى.

وأخيراً، كنا في الموقع فوتوكونفيرسيون التحديد الكمي لخروج الكريات البيض الذاتية من الأورام مزروع في الفئران كايدى تيراغرام. استخدام اثنين من نماذج مختلفة من الأورام القابلة للغرس، وغير مصطبغة لاحظنا خروج كبيرة من وحدات تحكم المجال Dc، خلايا تي، ووحيدات. تمشيا مع العمل المنشورة مؤخرا39، سواء CD4+ و CD8+ تي اجريسيد خلايا من الورم ميكرونفيرونمينتس جنبا إلى جنب مع عدد كبير من النفي المزدوج CD3ε+ تي الخلايا. على الأقل، قد يكون عنصر واحد من هذه الفئة من السكان جاما دلتا تي الخلايا كما هو موضح سابقا39، على الرغم من أهمية هذه الملاحظة الفنية ما زال يتعين تحديد. الأهم من ذلك، عندما قارنا نسب الكريات البيضاء اجريسينج من الأورام إلى الارتفاع النسبي للكريات البيضاء موجودة داخل ميكرونفيرونمينتس الورم، لاحظنا تخصيب الكريات البيض في اجريسيد السكان بالنسبة إلى تجمعات intratumoral في كلا النموذجين تشير إلى خروج الكريات البيض انتقائية. جدير بالذكر أن تغيب الضامة والعدلات في السكان اجريسيد، على الرغم من كل أنواع الخلايا قد وصفت للخروج تحت ظروف ملتهبة والمصابة2،50،،من5152 , 53 , 54 وهي إسهاما كبيرا في intratumoral الكريات البيض مبدع39،،من5556. وهكذا، خروج الكريات البيض من الأورام يمكن قياسها كمياً باستخدام نماذج فوتوكونفيرتيبلي، وليست العشوائية ولكن بدلاً من ذلك عملية تنظيم، ولا يزال علم الأحياء الهامة والمداريين مع آثار هامة لفهم التحريضية و ديناميات محصنة في ميكرونفيرونمينتس ورم في حالة مستقرة، واستجابة للعلاج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب على لا تعارضات بالكشف عن.

Acknowledgments

الكتاب يود أن يشكر الدكتور ماركوس بوثينبيرج لتوفير YUMM 1.1 و YUMM 1.7 الميلانوما مورين خطوط والدكتورة ديبورا ج. فول لتوفير B6. Cg-Tg(CAG-tdKaede) 15Utr الفئران باﻻتفاق مع BRC بتبريد عن طريق بيو الموارد الوطنية من يأمرون، اليابان.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase D Roche 11088866001
DNase Roche 4536282001
Silver-LED-405B light source with optical fiber and collimtor Prizmatix Ltd V8144
Fluorescein isothiocyanate isomer I Sigma-Aldrich F4274
dibutyl phthalate Sigma-Aldrich 524980
acetone Macron Fine Chemicals 2440-02
29-guage syringes Exel International 26029
Evans Blue Sigma-Aldrich E2129
70 um cell strainers VWR 732-2758
paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
HBSS Caisson HBL06
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit Invitrogen L34966
Purified Anti-mouse CD16/CD32 Tonbo Biosciences 70-0161-M001
BV605 CD11c (clone N418) Biolegend 117334
PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2) BD Pharmingen 562363
BV421 CD3e (clone 145-2C11) Biolegend 100341
APC CD8a (clone 53-6.7) TonBo Biosciences 20-0081-u100
APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11) Biolegend 103116
BV650 CD19 (clone 6D5) Biolegend 115541
PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4) Biolegend 128011
Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8) Biolegend 123121
APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8) Biolegend 127623
BV711 CD11b (clone M1/70) Biolegend 101241
BV605 CD45 (clone 30-F11) Biolegend 103155
BV711 CD4 (clone RM4-5) BD Biosciences 563726
Bovine serum albumin (Fraction V) Fisher Scientific BP1600-100
Anit-Rat and Anti-Hamster Igk / Negative Control Compensation Particle Set BD Biosciences 552845
Fortessa Flow Cytometer BD Biosciences
FlowJo v10 Software FlowJo

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
  2. Hampton, H. R., Bailey, J., Tomura, M., Brink, R., Chtanova, T. Microbe-dependent lymphatic migration of neutrophils modulates lymphocyte proliferation in lymph nodes. Nature Communications. 6, 7139 (2015).
  3. D'Alessio, S., et al. VEGF-C-dependent stimulation of lymphatic function ameliorates experimental inflammatory bowel disease. Journal of Clinical Investigation. 124 (9), 3863-3878 (2014).
  4. Debes, G. F., et al. Chemokine receptor CCR7 required for T lymphocyte exit from peripheral tissues. Nature Immunology. 6 (9), 889-894 (2005).
  5. Bromley, S. K., Yan, S., Tomura, M., Kanagawa, O., Luster, A. D. Recirculating memory T cells are a unique subset of CD4+ T cells with a distinct phenotype and migratory pattern. Journal of Immunology. 190 (3), 970-976 (2013).
  6. Tomura, M., et al. Activated regulatory T cells are the major T cell type emigrating from the skin during a cutaneous immune response in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (3), 883-893 (2010).
  7. Tomura, M., Itoh, K., Kanagawa, O. Naive CD4+ T lymphocytes circulate through lymphoid organs to interact with endogenous antigens and upregulate their function. Journal of Immunology. 184 (9), 4646-4653 (2010).
  8. Jennrich, S., Lee, M. H., Lynn, R. C., Dewberry, K., Debes, G. F. Tissue exit: a novel control point in the accumulation of antigen-specific CD8 T cells in the influenza a virus-infected lung. Journal of Virology. 86 (7), 3436-3445 (2012).
  9. Geherin, S. A., Wilson, R. P., Jennrich, S., Debes, G. F. CXCR4 is dispensable for T cell egress from chronically inflamed skin via the afferent lymph. PLoS One. 9 (4), e95626 (2014).
  10. Brown, M. N., et al. Chemoattractant receptors and lymphocyte egress from extralymphoid tissue: changing requirements during the course of inflammation. Journal of Immunology. 185 (8), 4873-4882 (2010).
  11. Bromley, S. K., Thomas, S. Y., Luster, A. D. Chemokine receptor CCR7 guides T cell exit from peripheral tissues and entry into afferent lymphatics. Nature Immunology. 6 (9), 895-901 (2005).
  12. Gomez, D., Diehl, M. C., Crosby, E. J., Weinkopff, T., Debes, G. F. Effector T Cell Egress via Afferent Lymph Modulates Local Tissue Inflammation. Journal of Immunology. 195 (8), 3531-3536 (2015).
  13. Ohl, L., et al. CCR7 governs skin dendritic cell migration under inflammatory and steady-state conditions. Immunity. 21 (2), 279-288 (2004).
  14. Kabashima, K., et al. CXCL12-CXCR4 engagement is required for migration of cutaneous dendritic cells. American Journal of Pathology. 171 (4), 1249-1257 (2007).
  15. Cyster, J. G., Schwab, S. R. Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs. Annual Review of Immunology. 30, 69-94 (2012).
  16. Matloubian, M., et al. Lymphocyte egress from thymus and peripheral lymphoid organs is dependent on S1P receptor 1. Nature. 427 (6972), 355-360 (2004).
  17. Teijeira, A., Rouzaut, A., Melero, I. Initial afferent lymphatic vessels controlling outbound leukocyte traffic from skin to lymph nodes. Frontiers in Immunology. 4, 433 (2013).
  18. Hunter, M. C., Teijeira, A., Halin, C. T Cell Trafficking through Lymphatic Vessels. Frontiers in Immunology. 7, 613 (2016).
  19. Bujdoso, R., Hopkins, J., Dutia, B. M., Young, P., McConnell, I. Characterization of sheep afferent lymph dendritic cells and their role in antigen carriage. Journal of Experimental Medicine. 170 (4), 1285-1301 (1989).
  20. Young, A. J. The physiology of lymphocyte migration through the single lymph node in vivo. Seminars in Immunology. 11 (2), 73-83 (1999).
  21. Seabrook, T., et al. The traffic of resting lymphocytes through delayed hypersensitivity and chronic inflammatory lesions: a dynamic equilibrium. Seminars in Immunology. 11 (2), 115-123 (1999).
  22. Swartz, M. A., et al. Mechanics of interstitial-lymphatic fluid transport: theoretical foundation and experimental validation. Journal of Biomechanics. 32 (12), 1297-1307 (1999).
  23. Macatonia, S. E., Knight, S. C., Edwards, A. J., Griffiths, S., Fryer, P. Localization of antigen on lymph node dendritic cells after exposure to the contact sensitizer fluorescein isothiocyanate. Functional and morphological studies. Journal of Experimental Medicine. 166 (6), 1654-1667 (1987).
  24. Robbiani, D. F., et al. The leukotriene C(4) transporter MRP1 regulates CCL19 (MIP-3beta, ELC)-dependent mobilization of dendritic cells to lymph nodes. Cell. 103 (4), 757-768 (2000).
  25. Roberts, E. W., et al. Critical Role for CD103(+)/CD141(+) Dendritic Cells Bearing CCR7 for Tumor Antigen Trafficking and Priming of T Cell Immunity in Melanoma. Cancer Cell. 30 (2), 324-336 (2016).
  26. Forster, R., et al. CCR7 coordinates the primary immune response by establishing functional microenvironments in secondary lymphoid organs. Cell. 99 (1), 23-33 (1999).
  27. Johnson, L. A., Jackson, D. G. The chemokine CX3CL1 promotes trafficking of dendritic cells through inflamed lymphatics. Journal of Cell Science. 126, 5259-5270 (2013).
  28. Teijeira, A., et al. T Cell Migration from Inflamed Skin to Draining Lymph Nodes Requires Intralymphatic Crawling Supported by ICAM-1/LFA-1 Interactions. Cell Reports. 18 (4), 857-865 (2017).
  29. Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PLoS One. 8 (2), e57135 (2013).
  30. Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin alphaV. Nature Immunology. 14 (9), 949-958 (2013).
  31. Russo, E., et al. Intralymphatic CCL21 Promotes Tissue Egress of Dendritic Cells through Afferent Lymphatic Vessels. Cell Reports. 14 (7), 1723-1734 (2016).
  32. Steven, P., Bock, F., Huttmann, G., Cursiefen, C. Intravital two-photon microscopy of immune cell dynamics in corneal lymphatic vessels. PLoS One. 6 (10), e26253 (2011).
  33. Tomura, M., et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 105 (31), 10871-10876 (2008).
  34. Shand, F. H., et al. Tracking of intertissue migration reveals the origins of tumor-infiltrating monocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (21), 7771-7776 (2014).
  35. Tomura, M., et al. Tracking and quantification of dendritic cell migration and antigen trafficking between the skin and lymph nodes. Scientific Reports. 4, 6030 (2014).
  36. Moran, A. E., et al. T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse. Journal of Experimental Medicine. 208 (6), 1279-1289 (2011).
  37. Schmidt, T. H., Bannard, O., Gray, E. E., Cyster, J. G. CXCR4 promotes B cell egress from Peyer's patches. Journal of Experimental Medicine. 210 (6), 1099-1107 (2013).
  38. Beura, L. K., et al. T Cells in Nonlymphoid Tissues Give Rise to Lymph-Node-Resident Memory T Cells. Immunity. 48 (2), 327-338 (2018).
  39. Torcellan, T., et al. In vivo photolabeling of tumor-infiltrating cells reveals highly regulated egress of T-cell subsets from tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114 (22), 5677-5682 (2017).
  40. Khan, T. N., Mooster, J. L., Kilgore, A. M., Osborn, J. F., Nolz, J. C. Local antigen in nonlymphoid tissue promotes resident memory CD8+ T cell formation during viral infection. Journal of Experimental Medicine. 213 (6), 951-966 (2016).
  41. Loo, C. P., et al. Lymphatic Vessels Balance Viral Dissemination and Immune Activation following Cutaneous Viral Infection. Cell Reports. 20 (13), 3176-3187 (2017).
  42. Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. (73), e50062 (2013).
  43. Morton, A. M., et al. Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (18), 6696-6701 (2014).
  44. Meeth, K., Wang, J. X., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations. Pigment Cell Melanoma Research. 29 (5), 590-597 (2016).
  45. Demkowicz, W. E., Littaua, R. A., Wang, J., Ennis, F. A. Human cytotoxic T-cell memory: long-lived responses to vaccinia virus. Journal of Virology. 70 (4), 2627-2631 (1996).
  46. Stewart, A. J., Devlin, P. M. The history of the smallpox vaccine. Journal of Infection. 52 (5), 329-334 (2006).
  47. Hammarlund, E., et al. Duration of antiviral immunity after smallpox vaccination. Nature Medicine. 9 (9), 1131-1137 (2003).
  48. Lund, A. W., et al. Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).
  49. Tomura, M., Kabashima, K. Analysis of cell movement between skin and other anatomical sites in vivo using photoconvertible fluorescent protein "Kaede"-transgenic mice. Methods in Molecular Biology. , 279-286 (2013).
  50. Bellingan, G. J., Caldwell, H., Howie, S. E., Dransfield, I., Haslett, C. In vivo fate of the inflammatory macrophage during the resolution of inflammation: inflammatory macrophages do not die locally, but emigrate to the draining lymph nodes. Journal of Immunology. 157 (6), 2577-2585 (1996).
  51. Gautier, E. L., Ivanov, S., Lesnik, P., Randolph, G. J. Local apoptosis mediates clearance of macrophages from resolving inflammation in mice. Blood. 122 (15), 2714-2722 (2013).
  52. Abadie, V., et al. Neutrophils rapidly migrate via lymphatics after Mycobacterium bovis BCG intradermal vaccination and shuttle live bacilli to the draining lymph nodes. Blood. 106 (5), 1843-1850 (2005).
  53. Beauvillain, C., et al. CCR7 is involved in the migration of neutrophils to lymph nodes. Blood. 117 (4), 1196-1204 (2011).
  54. Rigby, D. A., Ferguson, D. J., Johnson, L. A., Jackson, D. G. Neutrophils rapidly transit inflamed lymphatic vessel endothelium via integrin-dependent proteolysis and lipoxin-induced junctional retraction. Journal of Leukocyte Biology. 98 (6), 897-912 (2015).
  55. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
  56. Binnewies, M., et al. Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy. Nature Medicine. 24 (5), 541-550 (2018).

Tags

علم الأحياء، العدد 143، الأوعية اللمفاوية، خروج، في الاتجار بالبشر، كايد، فيتك الطلاء، الكريات البيضاء، سرطان الجلد
التحديد الكمي لخروج الكريات البيض عن طريق الأوعية اللمفاوية من الجلد مورين والأورام
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Steele, M. M., Churchill, M. J.,… More

Steele, M. M., Churchill, M. J., Breazeale, A. P., Lane, R. S., Nelson, N. A., Lund, A. W. Quantifying Leukocyte Egress via Lymphatic Vessels from Murine Skin and Tumors. J. Vis. Exp. (143), e58704, doi:10.3791/58704 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter