Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

לכימות ליקוציט היציאה דרך כלי הלימפה מ מאתר עור וגידולים

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58704
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 1,2,3,4
1Department of Cell, Developmental, & Cancer Biology, Oregon Health and Science University, 2Department of Molecular Microbiology & Immunology, Oregon Health and Science University, 3Department of Dermatology, Oregon Health and Science University, 4Knight Cancer Institute, Oregon Health and Science University

Summary

. הנה, נדגים את שיטות ויוו כימות של ליקוציט יציאה מן תמימה, מודלק, והעור מאתר ממאיר. אנו לבצע השוואת עפות בשני דגמים: transdermal FITC יישום, בחיי עיר photoconversion. יתר על כן, נדגים את התועלת של photoconversion עבור מעקב אחר ליקוציט היציאה של גידולים עורית.

Abstract

ליקוציט יציאה מן רקמות היקפיים ניקוז הלימפה אינה קריטית עבור מעקב המערכת החיסונית, חניכה, אך תורם גם הרזולוציה של רקמות היקפיים תגובות. בעוד מגוון שיטות משמשים לכמת ליקוציט יציאה מן הרקמות שאינם הלימפה, ציוד היקפי, המנגנונים תאית ומולקולרית המפקחים על היציאה תלויי-ההקשר נשארים ממעטים להבין. כאן, אנו מתארים את השימוש בבאתרו photoconversion לניתוח כמותי של ליקוציט יציאה מן העור מאתר וגידולים. Photoconversion מאפשר ישיר תיוג וחריגה של תושב תוך עורית. למרות חשיפה העור אור סגול גורם מקומי תגובות דלקתיות מאופיין ליקוציט ולחום, leakiness בכלי הדם, תוך השוואה ראש בראש עם יישום transdermal של קליעים נותבים פלורסנט, photoconversion במיוחד מתויג אוכלוסיות נודדות תא דנדריטי וזמין בו-זמנית כימות של יציאה מיאלואידית ו הלימפה מן microenvironments עורית וגידולים. המנגנון של היציאה ליקוציט רכיב חסר בהבנה שלנו של intratumoral ליקוציט מורכבות וובכך היישום של הכלים המתוארים במסמך זה יספקו תובנה ייחודית הדינמיקה של הגידול מערכת החיסון microenvironments שני בבית יציב המדינה, בתגובה לטיפול.

Introduction

תגובות חיסוניות רקמות היקפיים הם בצורת לא רק על ידי גיוס ליקוציט לאתרים של דלקת, אלא גם על ידי מנגנונים המסדירים השמירה הבאים שלהם. לפיכך, חיסון הגנתי מוכתב על ידי מנגנונים תאית ומולקולרית מצטברים הקובעים אם ליקוציט מזין, נשאר בתוך, או ליתר דיוק נודד מחוץ רקמות היקפיים דרך כלי הלימפה. חשוב, נטיה של לויקוציטים ליציאה רקמות דרך כלי הלימפה (הנקרא היציאה) מקושרת לפונקציות מיוחדות שלהן. תאים דנדריטים (DC) רוכשים התנהגות נודדות בתגובה אותות ההבשלה המוביל אנטיגן תחבורה המצגת ניקוז הלימפה (dLN), תהליך זה הוא הכרחי עבור חסינות מסתגלת1. ניקוי התאים מיאלואידית, כגון מקרופאגים, נויטרופילים, משמשים כדי לנקות פסולת אפופטוטיים להיפגע דרך phagocytosis. במהלך זיהום חיידקי, נויטרופילים רקמה זו אש מרגמות מדויקת בסופו של דבר עוברים אפופטוזיס dLNs2 , במודל של DSS-induced קוליטיס, נתונים תומך את ההשערה כי היציאה מקרופאג הכרחי לפתרון דלקת מקומית3. אם היציאה נויטרופילים, מקרופאג מתרחשת בכל ההקשרים דלקתיות, לעומת זאת, אינו ידוע. ראיות של לימפוציטים-T יציאה מן מצב יציב4,5,6,7, נגוע8ו מודלק4,9,10, 11,12 הפריפריה, שאינם הלימפה ברקמות מציין כי בתאי T recirculate באופן פעיל, על פי האותות רקמות מבוסס כונן היציאה הזאת להישאר ממעטים להבין. מספר מחקרים זיהו אותות הדרושים להעברת כיוונית לעבר ניקוז לימפטי נימים ובעקבות זו אש מרגמות מדויקת כולל ליגנד כימוקין (מוטיב C-C) 21 (CCL21) והקולטן שלו CCR74,11, 13, ליגנד כימוקין (מוטיב C-X-C) 12 (CXCL12) שלו קולטן CXCR42,14, ו sphingosine-1-פוספט (S1P)10,15,16. מנגנונים אלה אינם פעילים בכל ההקשרים, אולם, בין אם הם לקבוע את היציאה של כל סוגי תאים נותרת שאלה פתוחה. חשוב, עוד תובנה המנגנונים המפקחים על היציאה והקשר שלה פונקציונלי במחלה דורש שיטות כמותיות ויוו של ניתוח.

מספר שיטות השתמשו כדי לכמת את היציאה מספר מודלים ויוו כולל תעלות ישיר של כלי הלימפה, העברת המאמצת של ex-vivo שכותרתו לויקוציטים, יישום transdermal של קליעים נותבים פלורסנט, זריקה של חלקיקים שכותרתו, ויוו photoconversion17,18. תעלות ישיר של כלי הלימפה מביא העכבר הוא מוגבל בחיות קטנות על-ידי אמצעי האחסון של נוזלים הניתנים לאיסוף וקשה. לפיכך, תעלות במידה רבה בוצעו חיות גדולות (למשל., כבשים) איפה מעשי כזה מניפולציות כירורגי. מחקרים אלה מספקים עדות ישירה נוכחות של תאי הלימפה והן מיאלואידית הלימפה10,19,20. יתר על כן, מודלים ovine חושפים כי דלקת אקוטי וכרוני מוגבר לימפוציט נוכחות לימפה בגיל10,כמעט 100-fold21.

העברת המאמצת של לימפוציטים שכותרתו, גנטי חשוב חשף כי CCR7 נדרש עבור היציאה של CD4+ T תאים מן העור מודלק בחריפות5,11, ואילו רעלני של לימפוציטים עם מולקולת קטן S1P קולטן אגוניסט, FTY720, מעכב באופן חלקי בלבד שלהם היציאה10. מעניין, היציאה של לימפוציטים שהועברו מן העור דלקתי כרוני הוא תלוי-CCR710, אך עשויים לדרוש חלקית CXCR49. העברת המאמצת ניסויים, עם זאת, לספק מספרים שאינם-פיזיולוגיים של לשעבר vivo מופעל ומתויגים לימפוציטים לתוך רקמות באמצעות הזרקה, אשר כמושפע ביו-מכני של רקמות, לחצים מוגברות של נוזל בין-תאי זה פתח נימי הלימפה הראשונית, לשנות את המאפיינים שלהם תחבורה22. כיישום transdermal חלופית, של fluorescein isothiocyanate (FITC), נוכחות או היעדרות מגירויים עורי (למשל., dibutyl פתלאט, DBP) או זיהום23,24 מאפשר המעקב אחר התאים phagocytic מעקב ולצבור להגר dLNs. באופן דומה, גידולים fluorescently שכותרתו לספק אמצעי כדי לעקוב אחר תאים phagocytic שכילו הגידול גשמי25. שיטות אלה סיפקו חשוב תובנה המנגנונים למשול DC היציאה13,14,17,26,27 , אך אינם מסוגלים לעקוב אחר שאינו-phagocytic יכול להיות מסובך לימפוציטים ופרשנות, ניקוז לימפטי חינם של FITC מסיסים ובכך תיוג עופות נודדים, DCs תושב LN.

לחלופין, מיקרוסקופ intravital הוא כלי רב עוצמה המאפשר מעקב ויוו לאוכלוסיות ליקוציט רלוונטי מבחינה פיזיולוגית בזמן אמת28,29. משתמשים בה בשילוב עם הכתב עכברים, נוגדן מבוססי ויוו immunofluorescent תיוג, intravital מיקרוסקופ חשפה את המתחם המרחבי וסלולרי הדינמיקה הטמפורלי של החיסון ההעברה אינטרסטיציאליות, סחר בבני אדם, לרבות30 , גלגול על פני אנדותל הלימפה, המעבר בתוך לומן הלימפה, ואת ההעברה על בעוד ערך28,31. אימוץ רחב של טכניקות הדמיה intravital מוגבל על ידי הוצאות, המומחיות הנדרשת עבור ערכת, מוגבל תפוקה לכימות תנועת סוגי תאים מרובים. עדיין, צימוד שיטות כמותיות לנתח המלאכותיות רקמות עם הדמיה intravital יספקו תובנה מכניסטית נוספים וחשובים לגבי המנגנונים של תנועתיות והעברה לקראת ובתוך נימי הלימפה 18 , 31 , 32.

כתוצאה מכך, אין ויוו photoconversion התפתחה שיטה המאפשרת בחיי עיר תיוג, עצמאית של הפעילות phagocytic, וגם עבור כימות של היציאה ליקוציט פיזיולוגיים (בשילוב עם cytometry זרימה) ב- היעדרות או נוכחות של אתגר. קאךה-Tg עכברים מביעים צורונים חלבון מבודד אלמוג זה מוצגים ירוק קרינה פלואורסצנטית (קאךה ירוק) עד נחשפים באור סגול, לאחר מכן הוא בלתי הפיך ממיר פלואורסצנטי אדום (קאךה אדום)33. ניתן לעקוב Photoconverted תאים כמו זו הם אש מרגמות מדויקת מאתרי רקמות היקפיים להצטבר dLNs. זה ו אחרים דומים photoconvertible העכבר מודלים34,35 חשפו חשוב ביולוגיה כולל יציאה המכונן של תאי T רגולטוריים מן העור36, תלויי-CXCR4 תא B יציאה מן כתמים של פייה37 , גיוס בתאי T הזיכרון תושב פפטיד לאתגר מחדש38, ועל יציאה רחבה ליקוציט מן הגידול microenvironments39. במסמך זה, אנו מבצעים השוואה ראש בראש של photoconversion עם יישום FITC transdermal בהקשר של עורית דלקת ולדלקת כדי לאפשר השוואה ישירה של נתונים קיימים עם השיטה photoconvertible. יתר על כן, אנו מדגימים photoconversion גידולים מושתל, לתאר את יעילות ההמרה ויציאה סלקטיבי של גידול microenvironments. ככזה, אנו טוענים עוד יישום של שיטות אלה המצריך התירי הביולוגיה קריטי של ליקוציט יציאה מן גידולים, אשר יהיו השלכות משמעותיות על פענוח intratumoral ליקוציט המורכבות, אנטי הגידול חסינות, ו תגובה לטיפול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הפרוטוקולים בעלי חיים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה ב אורגון לבריאות & ומדע באוניברסיטת.

1. אינדוקציה של דלקת FITC ציור של העכבר פינה

  1. ב תא למינארי, עזים ומתנגד עכבר C57Bl/6 באמצעות isofluorane מתאדה (זירוז ב 3-5% isofluorane ולשמור על 1-3% isofluorane; קצב הזרימה חמצן ב 0.5-1.0 L/min). להבטיח ההרדמה המתאים על-ידי פיקוח על האובדן של רפלקס פדלים, תנועות לא רצוניות וקצב נשימה מופחתת.
  2. שכב אוזן שטוח עם הצד הבטני של האוזן כלפי מעלה. Pipet 20 µL של 5% FITC פתרון מומס פתלאט אצטון 1:1: dibutyl (DBP) בצד הגחוני של האוזן פינה. לאפשר את האוזן לייבוש למשך כמה שניות.
  3. 24 שעות לאחר יישום FITC, המתת חסד העכברים בעזרת חשיפה פחמן דו-חמצני ואחריו נקע בצוואר הרחם. לאסוף את האוזן pinnae לתוך PBS על-ידי הפרדת האוזניים מהראש באמצעות מספריים. לאסוף את dLNs צוואר הרחם ואת ההגירה הלא-ניקוז מפשעי לתוך PBS באמצעות פינצטה כדי להפריד בין שירותי ההגירה מן הרקמות הסובבות. ההגירה הלא-ניקוז מפשעי ישמש פקדים שלילי לנוכחות של לויקוציטים /Kaede אדום+ FITC+. תשליך הגוויות לכל פרוטוקול מוסדיים.
    הערה: photoconversion פוסט הזמן האופטימלי לניתוח תלויות סוג התא והתנהגויות נודדות ידוע. תאים דנדריטים, לדוגמה, ניתן להבחין ב- dLNs מוקדם כיישום DBP פוסט 6-אייץ '.

2. אינדוקציה של דלקת Photoconversion של העכבר פינה

  1. ב תא למינארי, עזים ומתנגד עכבר קאךה-Tg (רקע C57Bl/6) על ידי הזרקת בקרום הבטן של קטמין 80 מ"ג/ק"ג ו- 10 מ"ג/ק"ג חריגות השירותים הווטרינריים מומס בתוך תמיסת מלח. ודא ההרדמה המתאים כמתואר ב- 1.1 שלב.
  2. שכב אוזן שטוח עם הצד הבטני של האוזן כלפי מעלה. Pipet 20 µL של 1:1 אצטון: DBP בצידי הגחון פינה האוזן. לאפשר את האוזן לייבוש למשך כמה שניות.
  3. לאחר יישום DBP, לחתוך חתך בתוך פיסת נייר אלומיניום ומשוך את האוזן דרך הסדק לחשוף את האוזן למקור אור סגול. להשתטח האוזן עם הצד הגבי פונה כלפי מעלה באמצעות סרט הדבקה דו-צדדי כדי לאבטח את האוזן רדיד האלומיניום.
  4. מקם את האוזן ישירות תחת מקור האור, ו- photoconvert למשך 3 דקות באמצעות מקור אור 405 ננומטר-100 מגה-וואט חשמל.
  5. 24 שעות לאחר photoconversion, המתת חסד העכברים קאךה-Tg, לקצור את האוזן pinnae ההגירה צוואר הרחם, סוכנות ההגירה מפשעי כפי שמתואר בשלב 1.3.
    הערה: בנוסף שיקולים מצוטט שלב 1.3, שיעור של התפשטות יקבע את התזמון של ניתוח כמו האובדן של אדום קאךה תתרחש במהירות חלוקת תאים.

3. vaccinia זיהום של העכבר פינה ויישום FITC

  1. עזים ומתנגד עכבר C57Bl/6 עם isofluorane מתאדה כפי שמתואר בשלב 1.1.
  2. להניח בצד הגחוני של האוזן שטוח. Pipet 5 x 106 ויוצרים רובד יחידות (PFU) של וירוס vaccinia (VacV) מעורבבת עם µL 10 ל- PBS אל פינה האוזן. באמצעות מחט 29-מד, לתקוע את פינה 25 פעמים40.
  3. 24 שעות לאחר הפגיעה, עזים ומתנגד עכברים נגועים VacV עם isofluorane כפי שמתואר בשלב 1.1 ו- pipet 20 µL 5% FITC מומס אצטון על הצד הבטני של פינה האוזן. לאפשר את האוזן לייבוש למשך כמה שניות.
  4. 24 שעות לאחר יישום FITC, המתת חסד העכברים ולאסוף את pinnae האוזן, סוכנות ההגירה צוואר הרחם, סוכנות ההגירה מפשעי כפי שמתואר בשלב 1.3.
    הערה: FITC ניתן להחיל על כל זיהום פוסט נקודת זמן כדי לקבוע DC סחר במרווחי זמן שונים 24 שעות ביממה. בעבר דיווחנו כי ההעברה DC ל- dLNs נשמרת ברמות דומות מיום 1 עד 3 פוסט זיהום41.

4. vaccinia זיהום של העכבר וגם Photoconversion.

  1. עזים ומתנגד עכבר קאךה-Tg עם isofluorane מתאדה כפי שמתואר בשלב 1.1.
  2. להדביק את פינה האוזן עם VacV כפי שמתואר בשלב 3.2.
  3. 24 שעות לאחר הפגיעה, עזים ומתנגד עכברים נגועים VacV קאךה כפי שמתואר בשלב 2.1 ולבצע photoconversion כמתואר בצעדים 2.3 2.4.
  4. 24 שעות לאחר photoconversion, המתת חסד העכברים, לקצור את האוזן pinnae ההגירה צוואר הרחם, סוכנות ההגירה מפשעי כפי שמתואר בשלב 1.3.
    הערה: כפי שצוין לעיל ב- 3.4 שלב, photoconversion יכול להינתן על זיהום פוסט בכל נקודת זמן.

5. האוזן הלימפה עיבוד עבור Cytometry זרימה

  1. ליצור תא בודד השעיות של האוזן pinnae: לקלף לגזרים את הצדדים הגחון הגבי של פינה האוזן באמצעות שני זוגות פינצטה ומקום עם החלק הפנימי של האוזן כלפי מטה לתוך הבארות של צלחת 24-ובכן המכיל 1 מ"ג/מ"ל collagenase D ו- 80 DNase U/mL מדולל ב Buffered מלוחים פתרון (HBSS של האנק) (מכיל2 + Ca ו- Mg2 +). דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות העיתונות הרקמה מתעכל דרך מסננת תא ניילון 70 מיקרומטר.
  2. ליצור תא בודד המתלים של ההגירה: מקום ההגירה בבארות של צלחת 24-ובכן המכיל 1 מ"ג/מ"ל collagenase D ו- 80 DNase U/mL מעורבבת עם HBSS. פתח מתגרה הצומת לימפה קפסולת באמצעות שתי מחטים 29-מד ולאחר מכן דגירה בלוטות הלימפה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות הקש הרקמה מתעכל דרך מסננת תא ניילון 70 מיקרומטר.

6. intradermal מלנומה הגידול השרשה, Photoconversion.

  1. לגלח את הפרווה מהמרכז של החלק האחורי של עכבר קאךה-Tg באמצעות מכונת גילוח חשמלית.
  2. הצב מחט 29-מד במרכז הגב בין השכם השמאלי ואת הימני העליון, ולאחר intradermally להזריק 5 x 105 תאים סרטניים (מדולל ב- 50 µL של תמיסת מלח) לתוך העור של עכברים קאךה-Tg. גידולים להיות ממוקם היטב כדי להבטיח ניקוז לימפטי שצוין הלימפה (קרי, נחתכו ישר ושמאלה ההגירה עבור גידולים ממוקם באמצע הגב העליון). הימנע מהנחת הגידול מעל dLN כמו התוצאה יכולה להיות ישירה photoconversion של שירותי ההגירה דרך הגידול/העור.
  3. לאפשר הגידולים לגדול לגודל הרצוי (100-650 מ מ3).
  4. יום אחד לפני אוסף רקמה, עזים ומתנגד עכבר קאךה-Tg כמתואר ב- 2.1 ולגלח לשום פרווה regrown לאחרונה סביב הגידול.
  5. לחתוך חור עגול בנייר אלומיניום ומשוך את הגידול לחשוף את הגידול מקור האור. לחתוך את החור מעט קטנה יותר הגידול כדי למנוע את הגידול נופל חזרה דרך החור ולצמצם את ההמרה של סמוך, שאינם סרטניים בעור.
  6. מקם את הגידול ישירות מתחת מקור האור ואת photoconvert במשך 5 דקות באמצעות מקור אור 405 ננומטר ב 200 mW הספק.
  7. 24 שעות לאחר photoconversion, המתת חסד העכברים כפי שמתואר בשלב 1.3. לאסוף את גידולים, dLNs נחתכו, ההגירה הלא-ניקוז מפשעי לתוך PBS. הגידולים מן העור שמסביב באמצעות מספריים לחתוך ולהסיר ההגירה כפי שמתואר בשלב 1.3.

7. הגידול ואת הצומת לימפה עיבוד עבור Cytometry זרימה

  1. ליצור תא בודד המתלים של הגידולים: מינצ הגידולים עם מספריים לתוך בארות של צלחת 24-ובכן המכיל 1 מ"ג/מ"ל collagenase D ו- 80 DNase U/mL מעורבבת עם HBSS. דגירה ב 37 ° C עבור ה 1 לחץ על הרקמה מתעכל דרך מסננת ניילון 70 מיקרומטר.
  2. ליצור תא בודד השעיה של בלוטות הלימפה כפי שמתואר ב- 5.2 שלב.

8. נוגדן צביעת עבור Cytometry זרימה

  1. לאחר מעכל הרקמות לתוך תא בודד המתלים, לבצע טכניקות צביעת cytometry זרימה רגילה לסמן את התאים עם סמנים של עניין. בקצרה, pipet 2 x 106 תאים לתוך צלחת 96-ובכן. דגירה הדגימות עם גוש Fc (1 µg/mL) במשך 20 דקות על הקרח; לשטוף פעמיים עם FACs מאגר (1% שור אלבומין ב- PBS). להוסיף כתם חי/מת (מדולל ב- PBS) הדגימות, תקופת דגירה של 15 דקות על הקרח; לשטוף פעמיים עם מאגר FACs. דגירה עם נוגדנים הראשי (טבלה של חומרים) מדולל במאגר FACs במשך 30 דקות על הקרח; לשטוף פעמיים עם מאגר FACs.
    הערה: קאךה ירוק, קאךה פלואורסצנטי אדום חופף fluorophores FITC ו- PE; לפיכך, FITC ו- PE-מצומדת נוגדנים לא ניתן להשתמש בשילוב עם קאךה חלבונים.
  2. לאחר צביעת, להפעיל את הדגימות cytometer זרימה. לחלופין, לתקן את התאים עם 2% מחברים.

9. לזרום Cytometry ניתוח

  1. הגדר את FITC (קאךה ירוק) ואת PE (קאךה אדום) ערוץ PMT מתח ל- 70-80% של הטווח הכולל (מרכז אוכלוסיה בקירוב 104) באמצעות שמחוץ קאךה ירוק או אדום קאךה חד-צבעי splenocytes או דם.
    הערה: לא תפצה קאךה ירוק (FITC) ולערוצים קאךה אדום (PE) כמו התוצאה תהיה אות רבתי להתפשט.
    1. כדי ליצור פקדים קאךה צבע יחיד, לאסוף של הטחול או דם עכבר קאךה-Tg. Lyse כדוריות דם אדומות עם מאגר ACK, אז התאים מתחלקים לשתי קבוצות: קווקוו ללא המרה קאךה המומר וירוק קאךה אדום.
    2. צבע יחיד קאךה פקדים אדום, להשעות את התאים 1 מ"ל ל- PBS, photoconvert לתוך צלחת 24-טוב עבור 5 דקות באמצעות מקורות אור 405 nm ב כוח של 100 מגה-וואט. השתמש תאים אלה כדי לקבוע את קאךה ירוק (FITC) ואת קאךה המתחים PMT אדום על cytometer הזרימה (שלב 9.1).
  2. ברגע החשמלי של החלבונים קאךה הוגדר, לפצות על כל שאר כתמי נוגדן ראשוני באמצעות יחיד-fluorophore שכותרתו פיצויים חרוזים לפי הוראות היצרן.
  3. להפעיל את הדגימות cytometer זרימה כדי לאסוף נתונים.
    הערה: החלבון קאךה הוא ללא הרף להיות מיוצר על ידי התאים. פירוש הדבר הזה 24 שעות לאחר photoconversion, התאים שהומרו יהיה זוגי חיובית עבור קאךה ירוק, חלבון קאךה אדום כמו שזה עתה מסונתז קאךה (ירוק), צבר בתא.
  4. ניתוח נתונים באמצעות תוכנת FlowJo או תוכנה דומה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אנחנו קודם ביקשו לשכפל את התוצאות photoconversion שפורסמו בספרות כדי להעריך את היעילות ולקבוע המשויכים דלקת בעור העכבר. פינה האוזן נחשף לאור mW סגול 100 (405 ננומטר) במשך 3 דקות כאמור תיאר33. יחיד המתלים התא שנוצר בעור האוזן או צוואר הרחם dLNs מיד בעקבות החשיפה גילה של יעילות המרה 78% של כל CD45+ לויקוציטים של העור עם תאים שעברו המרה לא נצפתה dLNs (איור 1 א'). כדי להעריך את התגובה דלקתית המשויך photoconversion, אנחנו לכמת את המספרים של הסתננות CD45+ לויקוציטים המומר האוזניים 0, 24 שעות ביממה פוסט ההמרה (איור 1B) ושינויים חריפה בחדירות כלי דם כפי שנמדד מיל Assay42 (איור 1C). בקצרה, 200 µL של 0.5% כחול אוונס היה intravascularly מוזרק 2 h לאחר photoconversion. האוזניים נאספו 30 דקות לאחר הזרקה של כחול אוונס היה חילוץ עם formamide במשך 24 שעות ביממה במלון 55° צלזיוס (ספיגת בסדום 610 nm42). שני CD45+ מחלחל (24 שעות), דליפת דם (2h) היו גדל באופן משמעותי בעקבות photoconversion, המציין כי אפילו בשעה זו חשיפה קצרה, photoconversion עצמו עשוי להשפיע את התגובה דלקתית של רקמות ספציפיות. בהשוואה CD45+ מחלחל (איור 1B), דליפת כלי הדם (±0.75 µg/אוזן 1.4) VacV נגוע האוזניים 24 שעות פוסט זיהום41 מספקים הקשר עבור היקף הדלקת הנגרמת על ידי אור סגול (0.08 µg/אוזן ± 0.01).

בעוד מספר מודלים השתמשו במחקרים שונים כדי לאתר את היציאה ליקוציט רקמות-הלימפה, ציוד היקפי, לא ברור איך להשוות שיטות אלה ביכולת שלהם לנהל מעקב אחר אוכלוסיות ספציפיות כשהם יוצאים העור. כתוצאה מכך, החלטנו לבצע השוואה עפות ישירה של שתי השיטות הנפוצות כדי לעקוב אחר היציאה DC ההגירה, photoconversion ' צייר ' ויוו FITC, על מנת להעריך את יעילות וספציפיות של כל שיטה כמותית ניתוח של DC היציאה במצב יציב, בעת דלקת עורית, מתוך העור הנגוע. עבור כל ניתוח, העור היה נתון transdermal FITC יישום או חשוף 100 מגה-וואט 405 ננומטר אור עבור אוכלוסיות LN DC מינימלית 3 הוגדרו CD3ε–CD19–MHCII+CD11c+ , מרובדת יותר 1) MHCIIשלום CD11cint DCs, מעשיר עבור נודדות בקרי קבוצת מחשבים (mDCs) הן CD103+ תלויי-BATF3 קרוס-הצגת בקרי קבוצת מחשבים ולאחר CD11b+ DCs עורי; ו- 2) MHCIIintCD11cשלום DCs, מעשיר עבור תושב בקרי קבוצת מחשבים (rDCs) כולל CD8α+ תלויי-BATF3 קרוס-הצגת בקרי קבוצת מחשבים (איור 2 א). 24 שעות לאחר יישום FITC או photoconversion, התאים עם תוויות היו בקלות לזיהוי בריקון אבל לא שאינם מרוקנות-שירותי ההגירה (איור 2B). כדי לכמת את מידת DC ההעברה לשירותי ההגירה ולקבוע בו זמנית את ייחודה של שיטת תיוג אוכלוסיות נודדים ואוכלוסיות LN לא תושב, אנחנו לכמת שכותרתו mDCs ו- rDCs-מצב יציב, 24 שעות לאחר היישום של DBP. 48 שעות אחרי VacV מצולק (איור 2C). בעוד photoconversion (קאךה) והן FITC הנקרא mDCs בכל תנאי, הבחנו יותר FITC עם התווית מאשר התווית על-ידי קאךה mDCs ב dLNs, מלבד זיהום VacV שבו שתי השיטות לכמת רמה דומה של היציאה. יתר על כן, בהקשר של DBP, FITC תוויות בנוסף אוכלוסיות rDC איפה photoconversion נותרה ספיציפית mDCs (איור 2C). באמצעות שתי השיטות, ראינו היציאה של DCs כ 200 מ VacV נגוע העור, חשוב לציין כי רמה זו של היציאה recapitulates ממצאים שפורסמו בעבר באמצעות יישום FITC transdermal Loo. et al. 41. לפיכך, בהתאם להקשר דלקתיות, transdermal FITC היישום עשוי להגדיל את המספרים של DCs שכותרתו זוהה dLNs ולהוביל שאינם ספציפיים תיוג של אוכלוסיות LN-תושב הבירה עופות נודדים, בעוד photoconversion במיוחד מזהה DCs נופל לתוך אוכלוסיה mDC.

קאךה-Tg עכברים שימשו כדי לכמת את השמירה ליקוציט5,33,43 כניסה ויציאה של5,6,35,38 עורית, הרירית, ו רקמות הלימפה מתחת יציבות המדינה מודלק תנאים, חלה על גידולים רק בפרסום יחיד שבו הגידולים שהיו מושתלים intradermal לתוך אוזני עכבר ו photoconverted אחסון קטן39. לפיכך, אנו ביקשו להעריך את התועלת של ויוו photoconversion עבור כימות של ליקוציט יציאה מן הוותיקים, הגדולים גידולים הראשית כדי לאפשר בדיקת השערות חיסוניות נוספות. ראשית, אנחנו מושתל תאים סרטניים MC38 intradermally לתוך קאךה-Tg עכברים בין השכם ימין ועל שמאל. הגידול מושתלת מודלים לאפשר מיקום מדויק של גידולים כדי להבטיח ניקוז לימפטי כדי ההגירה ידוע; גידולים להציב בעור של העליון חזרה בעיקר ניקוז ההגירה איחתי ישר ושמאלה. כשמגיעים 100-150 מ"מ3, הגידולים היו photoconverted (10 דקות, 200 mW) גידולים ואת dLNs שנקטפו מיד לאחר photoconversion. ניתוח על ידי cytometry זרימה גילה משמעותי המרה של intratumoral CD45+ תאים מירוק קאךה+ לאדום קאךה+ (69%; איור 3 א), בעוד חשוב, dLNs נשאר שלילי עבור תאים קאךה אדום+ . Immunofluorescence מיקרוסקופיה של גידולים photoconverted YUMM 1.7 חשפה photoconversion הזה חודר עמוק לתוך הרקמה הגידול (> 1 מ מ; איור 3B). מעניין, העור, כלי הדם התאים מבטאים את רמות גבוהות של החלבון קאךה מובילה ליעילות גבוהה photoconversion אחד מסוגי התאים כפי שניתן לראות באיור 3B. ביטוי קאךה אדום גבוה זה עושה את זה קשה לזהות את התאים החיסוניים (שניהם קווקוו ללא המרה, המרה) באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence.

בהתחשב שלנו עניין מיוחד מלנומה אימונולוגיה, הערכנו הבא השפעת גודל הגידול והן מלנין על יעילות photoconversion באמצעות שורות תאים סרטניים מאתר מושתלת שונים: MC38 (unpigmented קו סרטן המעי הגס), B16. F10 (מייצרי מלנין מלנומה קו), YUMM 1.1 (מלנומה unpigmented קו), ו- 1.7 YUMM (מלנומה unpigmented קו)44. כל שורות אלה היו מושתלים intradermal קאךה-Tg עכברים, photoconverted, כפי שתואר לעיל בעוצמות הגידול השונים (50-650 מ מ3). הגידולים היו קוצרים מיד לאחר photoconversion ומוערכת לנוכחות של קאךה אדום CD45+ לויקוציטים מאת cytometry זרימה. מעניין, את היעילות photoconversion של CD45+ לויקוציטים מגוונים באופן משמעותי על פני סוגי גידולים הגדלים (איור 3C). CD45+ לויקוציטים בטווח קטן (50-150 מ מ3) גידולים YUMM 1.7 ו- YUMM 1.1 הפגינו את photoconversion היעילה ביותר ב 80% ו- 60%, בהתאמה. ככל אמצעי האחסון עבור גידולים אלה, היעילות ההמרה ירד בסביבות 50% עבור גידולים גדולים (3> 600 מ מ). מלנין הייתה השפעה מרשימה על יעילות photoconversion: photoconversion המרבי עבור CD45+ תאים בתוך מייצרי מלנין B16. F10 גידולים היה רק כ- 30%, ירד ל 10% כמו הגידולים הגיעו אמצעי אחסון של 400 מ3. מעניין, ניתוח של intratumoral CD8+ T תאים photoconversion חשף יעילות עבור תאים אלה כמעט 80-90% בגידולים קטנים בלי קשר ייצור מלנין (דמות תלת-ממד). עבור גידולים unpigmented, CD8+ תא T ההמרה נשאר גבוה גם הגידולים הגיעו כמויות גדולות, אך ירד באופן משמעותי עם הגודל כאשר המלנין היה נוכח. . מעין, התועלת של B16 מלנומה מאתר F10, מייצרי מלנין מלנומה קווים אחרים, עשוי להיות מוגבל גידולים קטנים (50 מ מ3), אשר עולה בקנה אחד עם הפונקציה הביולוגי של מלנין בעור קליטת האור. כדי להעריך את התגובה דלקתית המשויך את photoconversion של גידולים, אנחנו לכמת את מספר CD45+ תאים אשר גידולים, גידולים המומר 24 שעות פוסט photoconversion (איור 3E). ראינו הבדל משמעותי את המספרים הכולל של CD45+ תאים זוהו בגידולים 24 שעות לאחר את photoconversion לעומת גידולים אשר.

אנחנו הבאה לכמת את יציאה ליקוציט מן הגידול microenvironments שימוש בעכברים קאךה-Tg, המאפשר חקירת התנהגות סחר של שני סוגי התאים מיאלואידית ו הלימפה. תאים סרטניים MC38 או YUMM 1.7 היו intradermally מושתל לתוך קאךה-Tg עכברים. הגידולים photoconverted שפעם היו אמצעי האחסון שהושג בין 100-150 מ"מ3 (5 דקות, 200 mW); dLNs הזרוע, ההגירה הלא-ניקוז מפשעי נאספו 24 שעות לאחר photoconversion. Intratumoral ליקוציט אוכלוסיות היו לכמת מן MC38, YUMM 1.7 גידולים מושתל לתוך בקרת עכברים C57Bl/6, שנאספו לאחר שהגעת הגידולים 100-150 מ מ3. הערכנו את המורכבות ליקוציט בתוך גידולים ואוכלוסיות egressed על ידי cytometry זרימה: תאי T (CD3ε+CD4+ /-CD8+ /-), תאים B (CD3ε–CD19+), בקרי קבוצת מחשבים (CD11c+MHCII+CD11b+ /- ), נויטרופילים (CD11b+MHCII–Ly6G+), מקרופאגים (CD11b+MHCII+F4/80+), ומונוציטים דלקתיים (CD11b+Ly6G–Ly6C+; איור 4A). בעזרת ערכה זו המגביל אותו, הערכנו את האחוזים של כל אוכלוסיית ליקוציט dLNs לידי ביטוי קאךה אדום המציין הקודם בית גידול microenvironments (איור 4B). מעניין, בעוד MC38 שני (איור 4C), גידולים YUMM 1.7 (איור 4D) היו בעיקר הסתנן עם התאים מיאלואידית (monocytes, DCs ו מקרופאגים), כ- 50% התאים היו egressed של שני סוגי גידולים היו T לימפוציטים (CD4 בשני+ ו CD8+). בנוסף תאי T, הבחנו גם DCs, בתאי B, ומונוציטים בתוך אוכלוסיות egressed גידולים אבל מקרופאגים, נויטרופילים לא אותרו גם סוג הגידול. בסך הכל, נתונים אלה מדגים את התועלת של עכברים photoconvertible קאךה-Tg למעקב אחר שושלות ליקוציט מרובים באווירה אנדוגני. יתר על כן, הניתוח שלנו מציין כי היציאה היא תהליך סלקטיבי, פעיל ועלולות להיות לה השלכות משמעותיות לקביעת intratumoral ליקוציט המורכבות.

Figure 1
איור 1: Photoconversion יעילות ומקושרת דלקת בעור מאתר- הדרמיס מאתר היה photoconverted למשך 3 דקות ב- 100 מגוואט (405 ננומטר אור). (א) מייצג זרימה מתווה המתאר photoconverted (קאךה אדום+) CD45+ תאים מן האוזן אשר, המרה photoconversion הבאות מיד dLN צוואר הרחם. אוכלוסיות היו מראש מגודרת על חי, CD45+ יחיד תאים. (B) ספירה של CD45 סה כ+ תאים אשר האוזניים (-), אוזניים שנאספו מיד בעקבות photoconversion, אוזניים שנאספו 24 שעות אחרי photoconversion והאוזניים שנאספו 24 שעות לאחר זיהום VacV (n = 3). (ג) assay א מיל בוצעה לכמת leakiness כלי דם מיד לאחר החשיפה לאור 405 ננומטר (3 דקות, 100 מגה-וואט). תמונת הנציגה של זליגת האוזן העור (משמאל), כימות שחולצו צבע (מימין) (n = 3). קווי שגיאה מייצגים ב- SEM *p< 0.05 ו * *p< 0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: DC יציאה מן תמימה, דלקתי, עור נגוע. (א) Gating ערכה לזיהוי נודדות בקרי קבוצת מחשבים (mDCs; MHCIIהייCD11cint) ו- DCs תושב (rDCs; MHCIIשלוםCD11cשלום). (B) זרימה נציג מתווה אנלוגיים FITC+ או קאךה אדום+ DCs, פיקוח מראש על mDCs, מן העכברים נדבק VacV (dLN) או contralateral LN מרוקנות-שאינו שולט. (ג) כימות של מספרי קאךה אדום+ , FITC+ mDCs, rDCs ב dLNs של מצב יציב, DBP דלקתית (24 h פוסט יישום) VacV נגוע בעור (זיהום פוסט 48 שעות). קווי שגיאה מייצגים ב- SEM אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: יעילות הגידול microenvironments Photoconversion. גידולים היו photoconverted 10 דקות ב- 200 mW (405 ננומטר אור). (א) זרימה נציג חלקות קאךה ירוק, קאךה אדום אשר וגידולים MC38 המומר, הזרוע dLN מיד לאחר photoconversion. אוכלוסיות היו מראש מגודרת על חי, CD45+ חד-תאים. Microcopy Immunofluorescence (B) של קפואים, OCT-מוטבע YUMM 1.7 גידולים בשתי קווקוו ללא המרה, photoconverted. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. (ג) יעילות ההמרה של CD45+ לויקוציטים ו CD8 (ד) + לימפוציטים מייצרי מלנין (B16. F10) ו unpigmented (MC38, YUMM 1.1, YUMM 1.7). כל נקודה מייצגת עכבר אחת. (ה) ספירה של CD45 סה כ+ תאים אשר גידולים, גידולים photoconverted שנאספו 24 שעות לאחר photoconversion (n = 3). קווי שגיאה מייצגים ב- SEM אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: יציאה ליקוציט מן הגידול microenvironments היא סלקטיבית. (א) Gating ערכה לזיהוי לאוכלוסייה מיאלואידית הלימפה ב- MC38 dLNs. (B) זרימה נציג חלקות מזהים תאים קאךה אדום+ בין התאים מיאלואידית ו הלימפה MC38 dLNs 24 שעות לאחר photoconversion. אחוזי בתוכנית זרימה חלקות לציין את התדירות של תאים קאךה אדום+ בתוך האוכלוסייה ליקוציט האב המצוין ההגירה. (C, D) כמויות יחסיות של intratumoral (% CD45+ תאים) ו egressed (תאים קאךה אדום+ %; לויקוציטים dLNs איחתי) מ- MC38 (C, n = 3) ו- YUMM 1.7 (D, n = 4) גידולים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

למרות היציאה ליקוציט רקמות היקפיים, שאינם הלימפה הוא קריטי עבור החניכה, ברזולוציה של תגובות חיסוניות, המנגנונים המולקולריים המפקחים על היציאה הם הבינו כהלכה. פער זה הידע נובע במידה רבה מוכן הזמינות של כלים כימות בתוך vivo. כאן, אנו מתארים את השימוש photoconvertible עכברים (קאךה-Tg) לכמת ליקוציט אנדוגני היציאה מן העור גידולים ולספק השוואה ישירה ראש בראש עם FITC צבע בדלקתיות ומודלים זיהום. נדגים בעוד שני הדגמים מעקב אחר אוכלוסיות DC אנדוגני, ניקוז חינם של FITC ואת ספיגת עניים על ידי תאים שאינם phagocytic מגביל את התועלת של צבע FITC לניתוח רחבה של תאים מיאלואידים ו הלימפה יציאה מן הפריפריה, שאינם הלימפה ברקמות כולל גידולים. יתר על כן, אנו מציגים את הנתונים מציין שהיציאה מן הגידולים הוא סלקטיבי ולא סטוכסטי וכך לאשר את הממצאים שהוצגו על-ידי. Torcellan et al. 39. חקירה נוסף של המנגנונים השולטים ליקוציט יציאה מן גידולים עשוי לחשוף את הרומן תובנה דלקת הקשורים וחסינות.

אנחנו קודם להעריך את היעילות של photoconversion מאתר העור ואת השפעתו על דלקת מקומית בעת שימוש בהגדרות שדווחו בספרות. חשיפת האוזניים סגול בהיר למשך 3 דקות על 100 מגה-וואט חשמל, גרמו photoconversion יעיל של CD45+ תאים בתוך העור האוזן (78%) ללא המרה ב- dLNs במורד הזרם. דיווחים בספרות מדגימים שהחשיפה 3-5 דקות הוא אופטימלי רקמות עורית-5,-33,-38. עם זאת, חשיפה זו הובילה מספר רב יותר של CD45+ תאים בפינה האוזן 24 שעות לאחר ההמרה ומשרה בריחת הדם המציין את photoconversion-הגדרות אלה בעור האוזן דלקת מקומית, אשר יש לקחת בחשבון כאשר פענוח נתונים. אנחנו הבאה ביקשו להשוות ישירות DC סחר כדי ההגירה באמצעות קאךה photoconversion והן להפכה שימוש FITC צבע assay23,24 -מצב יציב, בעת דלקת הנגרמת DBP, ואת מהאוזניים VacV נגוע. . הבחנו תיוג מוגברות ב- FITC כאל לעומת העור photoconverted על מצב יציב וטיפול DBP הבאים. יישום של FITC חינם על העור יכול לגרום ניקוז ישירה דרך כלי הלימפה ההגירה המנקזים שבו תושב אוכלוסיות DC, אינן מעבירות (למשל., CD8α+ DCs), לטעום FITC. בקנה אחד עם זה, הבחנו מספרי משמעותי של rDCs עם תווית FITC כאשר שטופלו DBP מגרה. לעומת זאת, קאךה אדום התווית על-ידי בקרי קבוצת מחשבים רק נצפו הבאים האוכלוסייה mDC photoconversion המציין את photoconversion מספק דרך יותר ספציפי התווית mDCs. אפילו בתוך האוכלוסייה mDC, עם זאת, הבחנו באופן כמותי יותר שכותרתו mDCs בעת שימוש FITC על photoconversion. בזמן זה גם יכול להיות מוסבר על ידי ניקוז FITC חינם, זה אפשרי כי ההבדלים בתקופה של תיוג, איפה photoconversion יכול רק תווית DCs כיום תושב בעור בעת FITC נשאר בעור למשך כל תקופת 24 שעות , מסביר ההבדלים mDC שנצפה היציאה. מעניין, בהקשר של זיהום נגיפי, הן photoconversion והן FITC יישום מדדו רמות שווה יחסית של mDC היציאה כמה rDCs FITC+ ב שירותי ההגירה ניקוז נגועה VacV האוזניים. אנחנו לאחרונה דיווחו ניקוז לימפטי הוא זיהום VacV הבאים מופחתת באופן משמעותי, וכך הקטנת ויראלי-induced תחבורה הלימפה עשוי לשפר את ייחודה של FITC צבע האופטימיזציות תיוג של LN תושב DC אוכלוסיות31 . חשוב, עבודה זו גם מדגיש את העובדה כי בתוך האוכלוסייה mDC (CD3ε–CD19–MHCIIהייCD11cint), מספר בקרי תחום שלא נדדו באופן פעיל בתוך 24 שעות הוא מינורי באוכלוסייה, ובכך mDC סה כ המספרים אינם תחליף טוב. לילד העברת פעיל41. בסופו של דבר, זה מעניין לציין כי אנחנו בעקביות לכמת mDC היציאה כ-200 תאים עבור כל נתון במשך 24 שעות ביממה תקופה הבאים VacV זיהום41, תוך יציאה 1500-2000 DCs מן הגידול microenvironments. בהתחשב היעילות אדירה של VacV כפלטפורמה החיסון, במיוחד כאשר שהוחלו על-ידי מצולק45,46,47, זה מעניין לשער שזה האיכות של ה-DC ואת אולי הסוג של DC הצגת אנטיגן, יותר מאשר הכמות, זה קובע חזקה חיסון הגנתי.

ליקוציט יציאה מן הגידול microenvironments, מעבר DCs25,48, נותר אזור לקוי ובדוקים. למרות הגידולים נחשבים microenvironments דלקתי כרוני, מנגנונים דומים לווסת את הסלולר יציאה מן הרקמות שאינם ממאירים וממאירים נותר עלום. יתר על כן, בין אם ליקוציט יציאה מן גידולים סטוכסטי סלקטיבית או בעצם יהיו השלכות משמעותיות על לפרש ליקוציט הצטברות ושמירה על גידול microenvironments. ככזה, ליקוציט יציאה מן גידולים עשויים להיות מכרעת להבנת כמה גידולים להתחמק מעקב המערכת החיסונית, להוביל אסטרטגיות הרומן חיסוני. כאן אנו מיישמים את המודל photoconvertible קאךה-Tg ללמוד ליקוציט יציאה מן מושתלת גידולים עורית, איפה FITC צבע יהיה מספיק כדי בהרחבה תווית מיאלואידית לאוכלוסייה הלימפה. מחקרים ראשוניים חשף כי יעילות photoconversion גידולים מושתל היה תלוי הן על גודל הגידול, מלנין. בעוד photoconversion יעילות במהירות פוחת ככל גידולים גדלים כאשר המלנין קיים (B16. F10), הגידול ללא פיגמנט קווים כמו גידולים YUMM ו- MC38 להפגין יעילות ההמרה יותר יציבה על פני גודל הגידול שנבדקו. מעניין, הבחנו המרה שיפור היעילות CD8+ תא T cell בהשוואה CD45+ תאים, אשר ירדה כמו גידולים גדל בגודל. ישנם מספר גורמים עשויים לתרום התבוננות זו. ראשית, המיקום בתוך הגידול תשפיע על החשיפה ולכן יעילות המרה של סוגי תאים מסוים. תאי T נמצאים לעתים קרובות מוגבל לממשק של העור-גידול במודלים מושתלת הגידול וייתכן וכך בקלות רבה יותר photoconverted ביחס התאים מיאלואידית שחדר parenchyma הגידול. שנית, לא כל לויקוציטים express רמות זהות חלבון קאךה49 וובכך אולי לא את כולם באותה מידה יזוהו על-ידי cytometry זרימה; הדבר עלול לגרום להורדת אחוזי שנצפה photoconversion בעת ניתוח אוכלוסיה הטרוגנית יותר התא כגון CD45 כל+ תאים. לבסוף, חשוב לציין כי הנתונים המוצגים באיור 3 היה שנוצר הבאים 10 דקות של חשיפה אור סגול. הפעם החשיפה הראשונית נבחר בהתבסס על דיווחים בספרות בצטטו photoconversion זמני עבור איברים שונים כולל העור, סוכנות ההגירה, רקמות הרירית של גידולים5,6,33,35 39, ,43. רק המחקר השני העסקת את מערכת photoconvertible גידולים, photoconversion בוצעה עבור 20 דקות39. נוספים מיטוב בידיים שלנו גילה יעילות משופרת עם זמן חשיפה מקוצרת של 5 דקות עבור אמצעי אחסון קטנות כגדולות. סביר כי חשיפה ממושכת מוביל photobleaching של קאךה פלורסצנטיות, ככזה, יעילות ההמרה שדווחה שלנו עשוי להיות מעריך. חשיפה ממושכת עלולה גם להוביל לדלקת גדל הקשורים photoconversion, וחיסול תוצאות המחקר. גידולים photoconverted במשך 5 דקות הראו שהבדל משמעותי במספר intratumoral CD45+ תאים 24 שעות לאחר photoconversion לעומת גידולים אשר. בנוסף, photoconverted גידולים עבור 5 דקות הפגינו היציאה מדיד, לשחזור לאוכלוסיות מיאלואידית והן הלימפה. כתוצאה מכך, אופטימיזציה בודדים בתוך רקמות ספציפיות או גידולים עניין הכרחי להשגת תוצאות אופטימליות.

לבסוף, השתמשנו בבאתרו photoconversion לכמת ליקוציט אנדוגני יציאה מן גידולים מושתל לתוך קאךה-Tg עכברים. שימוש בשני דגמים שונים הגידול מושתלת, ללא פיגמנט הבחנו היציאה משמעותית של בקרי קבוצת מחשבים, תאי T, ומונוציטים. בקנה אחד עם העבודה שפורסמו לאחרונה39, שניהם CD4+ ו CD8+ T תאים egressed מן הגידול microenvironments יחד עם מספר משמעותי של כפול שלילי CD3ε+ T תאים. . לפחות מרכיב אחד של אוכלוסייה זו ייתכן גמא דלתא T תאים כמו שתואר לעיל39, למרות המשמעות הפונקציונלית של התבוננות זו עדיין נקבע. חשוב לציין, כאשר השווינו את הפרופורציות של לויקוציטים egressing של גידולים את יחסי הגודל היחסי של לויקוציטים מתנה בתוך microenvironments הגידול, הבחנו ליקוציט העשרה באוכלוסיות egressed ביחס intratumoral בריכות שני הדגמים המציינת את היציאה ליקוציט סלקטיבי. ראוי לציין, נויטרופילים מאקרופאגים נעדרו באוכלוסיות egressed, למרות שני סוגי תאים היה מתואר לשסתום היציאה תחת תנאי מודלק הנגוע2,50,51,52 , 53 , 54 . והם תורמים משמעותית intratumoral ליקוציט repertoires39,55,56. לפיכך, היציאה ליקוציט מן הגידולים ניתן לכמת באמצעות מודלים photoconvertible, אינה סטוכסטי אלא דווקא תהליך מוסדר, נשאר ביולוגיה understudied וחשובים עם השלכות משמעותיות על ההבנה דלקתיות, דינמיקה המערכת החיסונית גידול microenvironments-מצב יציב, התגובה לטיפול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים לך אין קונפליקטים לחשוף.

Acknowledgments

המחברים רוצה להודות ד ר מרקוס Bosenberg למתן YUMM 1.1, YUMM 1.7 מלנומה מאתר קווים, ד ר דבורה ג'יי Fowell למתן B6. עכברים 15Utr cg-Tg(CAG-tdKaede) מסכים עם RIKEN BRC דרך ביו-משאב לאומי של MEXT, יפן.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase D Roche 11088866001
DNase Roche 4536282001
Silver-LED-405B light source with optical fiber and collimtor Prizmatix Ltd V8144
Fluorescein isothiocyanate isomer I Sigma-Aldrich F4274
dibutyl phthalate Sigma-Aldrich 524980
acetone Macron Fine Chemicals 2440-02
29-guage syringes Exel International 26029
Evans Blue Sigma-Aldrich E2129
70 um cell strainers VWR 732-2758
paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
HBSS Caisson HBL06
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit Invitrogen L34966
Purified Anti-mouse CD16/CD32 Tonbo Biosciences 70-0161-M001
BV605 CD11c (clone N418) Biolegend 117334
PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2) BD Pharmingen 562363
BV421 CD3e (clone 145-2C11) Biolegend 100341
APC CD8a (clone 53-6.7) TonBo Biosciences 20-0081-u100
APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11) Biolegend 103116
BV650 CD19 (clone 6D5) Biolegend 115541
PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4) Biolegend 128011
Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8) Biolegend 123121
APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8) Biolegend 127623
BV711 CD11b (clone M1/70) Biolegend 101241
BV605 CD45 (clone 30-F11) Biolegend 103155
BV711 CD4 (clone RM4-5) BD Biosciences 563726
Bovine serum albumin (Fraction V) Fisher Scientific BP1600-100
Anit-Rat and Anti-Hamster Igk / Negative Control Compensation Particle Set BD Biosciences 552845
Fortessa Flow Cytometer BD Biosciences
FlowJo v10 Software FlowJo

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
  2. Hampton, H. R., Bailey, J., Tomura, M., Brink, R., Chtanova, T. Microbe-dependent lymphatic migration of neutrophils modulates lymphocyte proliferation in lymph nodes. Nature Communications. 6, 7139 (2015).
  3. D'Alessio, S., et al. VEGF-C-dependent stimulation of lymphatic function ameliorates experimental inflammatory bowel disease. Journal of Clinical Investigation. 124 (9), 3863-3878 (2014).
  4. Debes, G. F., et al. Chemokine receptor CCR7 required for T lymphocyte exit from peripheral tissues. Nature Immunology. 6 (9), 889-894 (2005).
  5. Bromley, S. K., Yan, S., Tomura, M., Kanagawa, O., Luster, A. D. Recirculating memory T cells are a unique subset of CD4+ T cells with a distinct phenotype and migratory pattern. Journal of Immunology. 190 (3), 970-976 (2013).
  6. Tomura, M., et al. Activated regulatory T cells are the major T cell type emigrating from the skin during a cutaneous immune response in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (3), 883-893 (2010).
  7. Tomura, M., Itoh, K., Kanagawa, O. Naive CD4+ T lymphocytes circulate through lymphoid organs to interact with endogenous antigens and upregulate their function. Journal of Immunology. 184 (9), 4646-4653 (2010).
  8. Jennrich, S., Lee, M. H., Lynn, R. C., Dewberry, K., Debes, G. F. Tissue exit: a novel control point in the accumulation of antigen-specific CD8 T cells in the influenza a virus-infected lung. Journal of Virology. 86 (7), 3436-3445 (2012).
  9. Geherin, S. A., Wilson, R. P., Jennrich, S., Debes, G. F. CXCR4 is dispensable for T cell egress from chronically inflamed skin via the afferent lymph. PLoS One. 9 (4), e95626 (2014).
  10. Brown, M. N., et al. Chemoattractant receptors and lymphocyte egress from extralymphoid tissue: changing requirements during the course of inflammation. Journal of Immunology. 185 (8), 4873-4882 (2010).
  11. Bromley, S. K., Thomas, S. Y., Luster, A. D. Chemokine receptor CCR7 guides T cell exit from peripheral tissues and entry into afferent lymphatics. Nature Immunology. 6 (9), 895-901 (2005).
  12. Gomez, D., Diehl, M. C., Crosby, E. J., Weinkopff, T., Debes, G. F. Effector T Cell Egress via Afferent Lymph Modulates Local Tissue Inflammation. Journal of Immunology. 195 (8), 3531-3536 (2015).
  13. Ohl, L., et al. CCR7 governs skin dendritic cell migration under inflammatory and steady-state conditions. Immunity. 21 (2), 279-288 (2004).
  14. Kabashima, K., et al. CXCL12-CXCR4 engagement is required for migration of cutaneous dendritic cells. American Journal of Pathology. 171 (4), 1249-1257 (2007).
  15. Cyster, J. G., Schwab, S. R. Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs. Annual Review of Immunology. 30, 69-94 (2012).
  16. Matloubian, M., et al. Lymphocyte egress from thymus and peripheral lymphoid organs is dependent on S1P receptor 1. Nature. 427 (6972), 355-360 (2004).
  17. Teijeira, A., Rouzaut, A., Melero, I. Initial afferent lymphatic vessels controlling outbound leukocyte traffic from skin to lymph nodes. Frontiers in Immunology. 4, 433 (2013).
  18. Hunter, M. C., Teijeira, A., Halin, C. T Cell Trafficking through Lymphatic Vessels. Frontiers in Immunology. 7, 613 (2016).
  19. Bujdoso, R., Hopkins, J., Dutia, B. M., Young, P., McConnell, I. Characterization of sheep afferent lymph dendritic cells and their role in antigen carriage. Journal of Experimental Medicine. 170 (4), 1285-1301 (1989).
  20. Young, A. J. The physiology of lymphocyte migration through the single lymph node in vivo. Seminars in Immunology. 11 (2), 73-83 (1999).
  21. Seabrook, T., et al. The traffic of resting lymphocytes through delayed hypersensitivity and chronic inflammatory lesions: a dynamic equilibrium. Seminars in Immunology. 11 (2), 115-123 (1999).
  22. Swartz, M. A., et al. Mechanics of interstitial-lymphatic fluid transport: theoretical foundation and experimental validation. Journal of Biomechanics. 32 (12), 1297-1307 (1999).
  23. Macatonia, S. E., Knight, S. C., Edwards, A. J., Griffiths, S., Fryer, P. Localization of antigen on lymph node dendritic cells after exposure to the contact sensitizer fluorescein isothiocyanate. Functional and morphological studies. Journal of Experimental Medicine. 166 (6), 1654-1667 (1987).
  24. Robbiani, D. F., et al. The leukotriene C(4) transporter MRP1 regulates CCL19 (MIP-3beta, ELC)-dependent mobilization of dendritic cells to lymph nodes. Cell. 103 (4), 757-768 (2000).
  25. Roberts, E. W., et al. Critical Role for CD103(+)/CD141(+) Dendritic Cells Bearing CCR7 for Tumor Antigen Trafficking and Priming of T Cell Immunity in Melanoma. Cancer Cell. 30 (2), 324-336 (2016).
  26. Forster, R., et al. CCR7 coordinates the primary immune response by establishing functional microenvironments in secondary lymphoid organs. Cell. 99 (1), 23-33 (1999).
  27. Johnson, L. A., Jackson, D. G. The chemokine CX3CL1 promotes trafficking of dendritic cells through inflamed lymphatics. Journal of Cell Science. 126, 5259-5270 (2013).
  28. Teijeira, A., et al. T Cell Migration from Inflamed Skin to Draining Lymph Nodes Requires Intralymphatic Crawling Supported by ICAM-1/LFA-1 Interactions. Cell Reports. 18 (4), 857-865 (2017).
  29. Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PLoS One. 8 (2), e57135 (2013).
  30. Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin alphaV. Nature Immunology. 14 (9), 949-958 (2013).
  31. Russo, E., et al. Intralymphatic CCL21 Promotes Tissue Egress of Dendritic Cells through Afferent Lymphatic Vessels. Cell Reports. 14 (7), 1723-1734 (2016).
  32. Steven, P., Bock, F., Huttmann, G., Cursiefen, C. Intravital two-photon microscopy of immune cell dynamics in corneal lymphatic vessels. PLoS One. 6 (10), e26253 (2011).
  33. Tomura, M., et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 105 (31), 10871-10876 (2008).
  34. Shand, F. H., et al. Tracking of intertissue migration reveals the origins of tumor-infiltrating monocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (21), 7771-7776 (2014).
  35. Tomura, M., et al. Tracking and quantification of dendritic cell migration and antigen trafficking between the skin and lymph nodes. Scientific Reports. 4, 6030 (2014).
  36. Moran, A. E., et al. T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse. Journal of Experimental Medicine. 208 (6), 1279-1289 (2011).
  37. Schmidt, T. H., Bannard, O., Gray, E. E., Cyster, J. G. CXCR4 promotes B cell egress from Peyer's patches. Journal of Experimental Medicine. 210 (6), 1099-1107 (2013).
  38. Beura, L. K., et al. T Cells in Nonlymphoid Tissues Give Rise to Lymph-Node-Resident Memory T Cells. Immunity. 48 (2), 327-338 (2018).
  39. Torcellan, T., et al. In vivo photolabeling of tumor-infiltrating cells reveals highly regulated egress of T-cell subsets from tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114 (22), 5677-5682 (2017).
  40. Khan, T. N., Mooster, J. L., Kilgore, A. M., Osborn, J. F., Nolz, J. C. Local antigen in nonlymphoid tissue promotes resident memory CD8+ T cell formation during viral infection. Journal of Experimental Medicine. 213 (6), 951-966 (2016).
  41. Loo, C. P., et al. Lymphatic Vessels Balance Viral Dissemination and Immune Activation following Cutaneous Viral Infection. Cell Reports. 20 (13), 3176-3187 (2017).
  42. Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. (73), e50062 (2013).
  43. Morton, A. M., et al. Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (18), 6696-6701 (2014).
  44. Meeth, K., Wang, J. X., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations. Pigment Cell Melanoma Research. 29 (5), 590-597 (2016).
  45. Demkowicz, W. E., Littaua, R. A., Wang, J., Ennis, F. A. Human cytotoxic T-cell memory: long-lived responses to vaccinia virus. Journal of Virology. 70 (4), 2627-2631 (1996).
  46. Stewart, A. J., Devlin, P. M. The history of the smallpox vaccine. Journal of Infection. 52 (5), 329-334 (2006).
  47. Hammarlund, E., et al. Duration of antiviral immunity after smallpox vaccination. Nature Medicine. 9 (9), 1131-1137 (2003).
  48. Lund, A. W., et al. Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).
  49. Tomura, M., Kabashima, K. Analysis of cell movement between skin and other anatomical sites in vivo using photoconvertible fluorescent protein "Kaede"-transgenic mice. Methods in Molecular Biology. , 279-286 (2013).
  50. Bellingan, G. J., Caldwell, H., Howie, S. E., Dransfield, I., Haslett, C. In vivo fate of the inflammatory macrophage during the resolution of inflammation: inflammatory macrophages do not die locally, but emigrate to the draining lymph nodes. Journal of Immunology. 157 (6), 2577-2585 (1996).
  51. Gautier, E. L., Ivanov, S., Lesnik, P., Randolph, G. J. Local apoptosis mediates clearance of macrophages from resolving inflammation in mice. Blood. 122 (15), 2714-2722 (2013).
  52. Abadie, V., et al. Neutrophils rapidly migrate via lymphatics after Mycobacterium bovis BCG intradermal vaccination and shuttle live bacilli to the draining lymph nodes. Blood. 106 (5), 1843-1850 (2005).
  53. Beauvillain, C., et al. CCR7 is involved in the migration of neutrophils to lymph nodes. Blood. 117 (4), 1196-1204 (2011).
  54. Rigby, D. A., Ferguson, D. J., Johnson, L. A., Jackson, D. G. Neutrophils rapidly transit inflamed lymphatic vessel endothelium via integrin-dependent proteolysis and lipoxin-induced junctional retraction. Journal of Leukocyte Biology. 98 (6), 897-912 (2015).
  55. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
  56. Binnewies, M., et al. Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy. Nature Medicine. 24 (5), 541-550 (2018).

Tags

ביולוגיה גיליון 143 כלי הלימפה זו אש מרגמות מדויקת סחר בבני אדם קאךה FITC לצבוע לויקוציטים מלנומה
לכימות ליקוציט היציאה דרך כלי הלימפה מ מאתר עור וגידולים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Steele, M. M., Churchill, M. J.,… More

Steele, M. M., Churchill, M. J., Breazeale, A. P., Lane, R. S., Nelson, N. A., Lund, A. W. Quantifying Leukocyte Egress via Lymphatic Vessels from Murine Skin and Tumors. J. Vis. Exp. (143), e58704, doi:10.3791/58704 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter