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Biology

백혈구 탈출구 Murine 피부 및 종양 림프 혈관을 통해 측정

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58704

Summary

여기, 우리는 순 진, 염증된에서 백혈구 탈출구의 정량화 vivo에서 악성 murine 피부에 대 한 방법을 보여 줍니다. 두 모델의 머리 비교를 수행 하는 우리: 경 피 FITC 응용과 현장에서 photoconversion. 또한, 피부 종양에서 백혈구 탈출구를 추적 하기 위한 photoconversion 유틸리티를 설명 합니다.

Abstract

고갈 림프절 주변 조직에서 백혈구 탈출구만 면역 감시 및 시작에 대 한 중요 하지 않습니다 하지만 또한 주변 조직 응답의 해상도에 기여. 다양 한 방법은 비 림프, 주변 조직에서 백혈구 탈출구를 계량 하는 데 사용 됩니다, 세포질이 고 분자 메커니즘을 맞는 탈출구를 제어 하는 불완전 하 게 이해 남아 있다. 여기, 우리는 murine 피부와 종양에서 백혈구 탈출구의 정량 분석에 대 한 현장에서 photoconversion 사용 하 여를 설명합니다. Photoconversion는 직접 라벨 백혈구의 피부 조직 내에서 거주 할 수 있습니다. 보라색 빛에 피부 노출 유도 로컬 하지만 선 동적인 응답 특징 백혈구 침투와 혈관 시키는 형광 추적기의 경 피 응용 프로그램 머리 비교에서 photoconversion 특히 철새 수지상 세포 인구를 분류 하 고 동시에 피부 microenvironments 및 종양에서 골수성과 림프 탈출구의 정량화를 사용. 백혈구 탈출구의 메커니즘 intratumoral 백혈구 복잡성에 대 한 우리의 이해에 누락 된 구성 요소를 유지 고 따라서 여기에 설명 된 도구 응용 프로그램 제공할 것 이다 종양의 역학에 대 한 독특한 통찰력 모두 면역 microenvironments 안정 된 상태와 치료에 대 한 응답에서

Introduction

주변 조직 면역 반응 염증의 사이트에 백혈구 신규 모집에 의해 뿐만 아니라 그들의 후속 보존 규제 메커니즘에 의해 형성 된다. 따라서, 보호 면역 체류 시간, 또는 오히려 림프 혈관을 통해 말 초 조직에서 마이그레이션합니다는 백혈구 입력 여부를 결정 하는 누적 세포 및 분자 메커니즘에 의해 결정 됩니다. 중요 한 것은, 백혈구 림프 혈관 (탈출구 되 나)을 통해 조직의 종료에 대 한 성향은 그들의 특수 기능에 연결 된다. 수지상 세포 (DC) 취득 성숙 신호 항 전송 및 배출 림프절 (dLN), 적응 면역1에 필요한 프로세스에서 프레 젠 테이 션에 대 한 응답에서 철새 행동. 청소 골수성 세포, 대 식 세포와 호 중구, 식 균 작용을 통해 apoptotic 파편을 취소를 제공 합니다. 세균 감염 시 호 중구 탈출구 조직 및 궁극적으로 apoptosis와 DSS 유도 colitis의 모델 dLNs2 에서 받게, 데이터 지원 macrophage 탈출구는 지역의 염증3를 해결 하는 데 필요한 가설. 그러나 Neutrophil 및 대 식 세포 출구 모든 염증 상황에서 발생 하는 여부, 불명 하다. 정상 상태4,5,,67,8감염된 및 염증된4,,910, 에서 T 림프 구 출구에 대 한 증거 11,12 주변, 비 림프 조직은 T 세포는 활발히 recirculate, 조직 기반 신호 운전이 출구를 제대로 이해 남아 있지만 나타냅니다. 여러 연구 결과 확인 21 (CCL21)와 그것의 수용 체 CCR74,11, chemokine (C C 모티브) 리간드를 포함 하 여 신호 배출 림프 모 세관 쪽으로 방향 마이그레이션에 필요한 후속 탈출구 13, 12 (CXCL12) chemokine (C X C 모티브) ligand 수용 체 CXCR42,14및 sphingosine 1 인산 염 (S1P)10,,1516. 그러나, 이러한 메커니즘은 모든 컨텍스트에서 활성 그리고 미결 문제에 남아 있다 여부 그들은 모든 종류의 세포 출구 결정. 중요 한 것은, 더 출구와 질병에서 기능적인 관련성을 제어 하는 메커니즘에 대 한 통찰력 필요 양적 vivo에서 분석의 방법을 합니다.

여러 가지 방법은 출구 여러 동물 모델에 vivo에 직접 cannulation 림프 혈관의 입양 전송 ex vivo 라는 백혈구, 형광 추적기의 경 피 응용 프로그램을 포함 하 여 계량 하는 데 사용 되었습니다. 레이블이 지정 된 입자, 그리고 photoconversion17,18 vivo에서 주입 구심 마우스 림프 혈관의 직접 cannulation 어렵고 작은 동물에서 수집 될 수 있는 액체의 양에 의해 제한 이다. 따라서, cannulation 크게 큰 동물에서 수행 되었습니다 (., 양) 수술 조작 등은 실용적. 이러한 연구는 림프10,,1920에 림프 및 골수성 세포의 존재에 대 한 직접 증거를 제공합니다. 또한, 양 모델 공개는 급성 및 만성 염증 림프에 림프 구 존재 거의 10010,21증가.

중요 한 것은 분류 하 고 유전자 조작 세포의 입양 전송 공개 하 고 CCR7는 CD4의 탈출구 필요 심하게 염증이 피부5,11, 림프 톨의 전처리 하는 동안+ T 세포 작은 분자 S1P 수용 체 길 항 제, FTY720, 부분적 으로만 그들의 출구10를 억제. 흥미롭게도, 만성 염증이 피부에서 전송 된 림프 톨의 출구 CCR7 독립적인10, 이지만 부분적으로 CXCR49필요할 수 있습니다. 그러나 입양 전송 실험,, 제공 비 생리 적인 수 전 비보 의 활성화 및 레이블이 세포 주입, 조직 및 높은 중간 유체 압력의 biomechanical 환경 변경 통해 조직으로 그 초기 림프 모 세관 열고22그들의 전송 속성 변경 합니다. Fluorescein isothiocyanate (FITC) 피부 irritants의 유무에 한 대안, 경 피 응용 프로그램으로 (., 틸 프 탈 레이트, DBP) 또는 감염23,24 의 추적에 대 한 수 추적 프로그램을 축적 하 고 dLNs를 마이그레이션할 phagocytic 세포. 마찬가지로, 붙일 레이블된 종양 종양 소재25잠겼습니다 있다 phagocytic 세포를 추적 하는 수단을 제공 합니다. 이러한 메서드는 DC 출구13,14,17,,2627 지배 하지만 비 phagocytic 추적할 수 있습니다 메커니즘에 대 한 중요 한 통찰력을 제공 림프 톨 그리고, 해석 성 FITC 따라서 철새, 라벨 LN 거주 Dc의 무료 림프 배수 하 여 복잡 한 수 있습니다.

또는, intravital 현미경 실시간으로,2829순수 관련 백혈구 인구의 비보에 추적을 허용 하는 강력한 도구입니다. 함께 사용 기자 마우스 및 생체 내에서 항 체 기반 immunofluorescent이 라벨, intravital 현미경 복잡 한 공간을 계시 했다 및 면역의 일시적인 역동성 셀 밀매, 포함 중간 마이그레이션30 , 림프 endothelium, 림프 루멘 및 마이그레이션 LN 항목28,31시 내 통로 환생. Intravital 이미징 기술의 광범위 한 채택 비용, 설정, 위해 필요한 전문 기술에 의해 제한 하 고 여러 세포 유형 측정 처리량 제한. 아직도, 인구 역학을 분석 하는 양적 방법 커플링 intravital 이미징 조직 것입니다 통찰력을 제공 추가 하 고 중요 한 기계 운동 성 및 마이그레이션 그리고 림프 모 세관 내에서 메커니즘에 관하여 18 , 31 , 32.

따라서, vivo에서 photoconversion 나왔다 제자리에 라벨, 허용 하는 방법으로 생리 적 백혈구 출구 (함께 사용할 경우 cytometry)의 정량화 및 phagocytic 활동의 독립은 부재 또는 도전의 존재입니다. 단풍나무-Tg 마우스 constitutively 후 레스터 변환 빨간색 형광 (빨강 단풍나무)33보라색 빛에 노출 될 때까지 녹색 형광 (가 그린)를 전시 하는 돌 산호에서 고립 된 단백질을 표현 한다. 그들은 주변 조직 사이트에서 탈출구로 Photoconverted 세포를 추적할 수 있습니다 dLNs에 축적. 이것 및 다른 유사한 photoconvertible 마우스 모델34,35 피부36에서 규정 하는 T 세포의 제정 탈출구, Peyer의 패치37에서에서 CXCR4 종속 B 세포 출구를 포함 하 여 중요 한 생물학을 계시 했다 , 펩 티 드 다시 도전38, 그리고 종양 microenvironments39에서 광범위 한 백혈구 송신 시 상주 메모리 T 세포의 동원. 여기, 우리는 피부 염증 및 photoconvertible 메서드를 사용 하면 기존 데이터의 직접적인 비교에 대 한 있도록 감염의 맥락에서 경 피 FITC 응용 프로그램 photoconversion의 머리 비교를 수행 합니다. 또한, 우리 이식된 종양에서 photoconversion를 설명 하 고 변환 효율 및 종양 microenvironments에서 선택적 탈출구를 기술 한다. 따라서, 우리는 더 이러한 방법의 응용 프로그램 필요 백혈구 출구 intratumoral 백혈구 복잡성, 항 종양 면역, 해석에 대 한 중요 한 영향을 미칠 것 이다, 종양에서의 중요 한 생물학을 명료 하 주장 하 고 치료에 응답입니다.

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Protocol

모든 동물 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회는 오 레 곤 건강 & 과학 대학에 의해 승인 되었습니다가지고.

1. 염증 및 마우스 Pinna의 FITC 그림의 유도

  1. 층 류 흐름 후드에서 C57Bl/6 마우스 증발된 isofluorane를 사용 하 여 anesthetize (3-5 %isofluorane 유발 하 고 1-3 %isofluorane;에서 0.5-1.0에서 산소 유량 L/분). 페달 반사의 손실 모니터링 하 여 적절 한 anesthetization를 위해 무의식적인 움직임과 감소 호흡 속도.
  2. 귀 위쪽으로 향하게 하는 복 부 측으로 편평 하다. 피펫으로 20 µ L 5 %FITC 솔루션의 귀 pinna의 복 부 측에 1:1 아세톤: 틸 프 탈 레이트 (DBP)에 녹아. 몇 초 동안 말리에 귀를 하실 수 있습니다.
  3. FITC 신청 후 24 시간 이산화탄소 노출 뒤에 자 궁 경부 전위를 통해 마우스를 안락사. 가 위를 사용 하 여 머리에서 귀를 구분 하 여 PBS에 귀 pinnae를 수집 합니다. 자 궁 경부 dLNs와 사 타 구니 비 배수 LNs는 LNs 주위 조직에서 분리를 핀셋을 사용 하 여 PBS에 수집 합니다. 사 타 구니 비 배수 LNs FITC+/Kaede 빨간+ 백혈구의 존재에 대 한 부정적인 컨트롤 될 것입니다. 기관 프로토콜 당 시체의 처분.
    참고: 분석을 위한 최적의 시간 게시물 photoconversion 세포 유형 및 알려진된 철새 동작에 따라 달라 집니다. 수지상 세포, 예를 들어 6 h 게시물 DBP 응용 프로그램으로 이른 dLNs에서 검색할 수 있습니다.

2. 염증 및 마우스 Pinna의 Photoconversion의 유도

  1. 층 류 두건에서 80 mg/kg 케 타 민 및 염 분에 녹아 10 mg/kg xylazine의 복 주사가-Tg 마우스 (C57Bl/6 배경) anesthetize. 1.1 단계에에서 설명 된 대로 적절 한 anesthetization를 확인 합니다.
  2. 귀 위쪽으로 향하게 하는 복 부 측으로 편평 하다. 피펫으로 20 µ L 귀 pinna의 복 부 측에 1:1 아세톤: DBP의. 몇 초 동안 말리에 귀를 하실 수 있습니다.
  3. DBP 신청 후 알루미늄 호 일의 조각에 슬릿을 절단 하 고 보라색 광원에 귀를 노출 하는 슬릿을 통해 귀를 당겨. 등 쪽 면이 위쪽으로 양면 테이프를 사용 하 여 호 일에 귀를 보호 귀를 평평 하다.
  4. 3 분 100 mW 전력에서 405 nm 광원을 사용 하 여 직접 광원, photoconvert 아래 귀 위치.
  5. photoconversion, 후 24 h가-Tg 마우스를 안락사 고 1.3 단계에서에서 설명한 대로 귀 pinnae, 자 궁 경부 LNs, 사 타 구니 LNs를 수확.
    참고: 1.3 단계에서에서 언급 한 고려 사항 외에도 확산의 속도 결정 분석의 타이밍으로 급속 하 게 세포 분할에서 단풍나무 레드의 손실이 발생 합니다.

3. vaccinia 감염 마우스 Pinna의 FITC 응용 프로그램

  1. 1.1 단계에에서 설명 된 대로 증발된 isofluorane와 C57Bl/6 마우스를 anesthetize.
  2. 이의 복 부 측 평평 하다. 피펫으로 5 x 106 플 라크 형성 단위 (PFU) 귀 pinna에 PBS의 10 µ L에 희석 vaccinia 바이러스 (VacV)의. 29 게이지 바늘을 사용 하 여, pinna 25 번40구멍.
  3. 감염 된 후 24 h, 단계 1.1 그리고 피펫으로 20 µ L 5% 귀 pinna의 복 부 측에 아세톤에 녹아 있는 FITC에서에서 설명한 isofluorane와 VacV에 감염 된 쥐를 anesthetize. 몇 초 동안 말리에 귀를 하실 수 있습니다.
  4. FITC 신청 후 24 시간에서 마우스를 안락사 고 1.3 단계에서에서 설명한 대로 귀 pinnae, 자 궁 경부 LNs 및 사 타 구니 LNs를 수집 합니다.
    참고: FITC DC 다양 한 24 시간 간격으로 매매를 결정 하기 위해 시간 포인트 게시물 감염에 적용할 수 있습니다. 우리는 이전 dLNs에 DC 마이그레이션 하루 1 ~ 3 게시물 감염41에서 비슷한 수준에서 유지 됩니다 보고.

4. vaccinia 감염 마우스 Pinna Photoconversion

  1. 1.1 단계에에서 설명 된 대로 증발된 isofluorane와 단풍나무-Tg 마우스를 anesthetize.
  2. 3.2 단계에에서 설명 된 대로 VacV와 귀 pinna 감염.
  3. 감염 된 후 24 h, anesthetize가 VacV에 감염 된 쥐 단계 2.1에 설명 된 대로 고 2.3-2.4 단계에서 설명한 대로 photoconversion를 수행 합니다.
  4. photoconversion, 후 24 h는 마우스를 안락사 고 1.3 단계에서에서 설명한 대로 귀 pinnae, 자 궁 경부 LNs, 사 타 구니 LNs를 수확.
    참고: 단계 3.4에서 위에서 언급 한, photoconversion 시간 포인트 게시물 감염에서 관리 수 있습니다.

5. 귀 및 림프 노드 Cytometry에 대 한 처리

  1. 단일 셀 정지 귀 pinnae의 만들기: 껍질 떨어져 귀를 1 mg/mL 콜라 D 80 U/mL DNase에서 희석을 포함 하는 24-잘 접시의 우물에 아래로 향하게의 내부는 두 쌍의 족집게와 장소를 사용 하 여 귀 pinna의 복 부와 등 쪽 면 행 크의 버퍼링 식 염 수 솔루션 (HBSS) (캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +포함). 70 µ m 나일론 셀 스 트레이너를 통해 30 분 보도 소화 조직에 대 한 37 ° C에서 품 어.
  2. LNs에서 단일 셀 정지를 만들기: 1 mg/mL 콜라 D 80 U/mL DNase HBSS에 희석을 포함 하는 24-잘 접시의 우물에서 LNs 장소. 애타게 오픈 림프 노드 두 29 게이지 바늘을 사용 하 여 캡슐을 30 분 동안 37 ° C에서 림프절을 품 어 70 µ m 나일론 셀 스 트레이너를 통해 소화 조직을 누릅니다.

6. 피부 흑색 종 종양 이식 및 Photoconversion입니다.

  1. 전기 면도기를 사용 하 여 장난-Tg 마우스 뒷면의 센터에서 모피를 면도.
  2. 왼쪽 및 오른쪽 상단 견 사이 뒤쪽의 센터에서 29 게이지 바늘을 놓고 intradermally가-Tg 마우스의 피부에 주입 5 x 105 종양 세포 (식 염 수의 50 µ L에 희석). 종양 (, 왼쪽 및 오른쪽 상 완 LNs 종양에 대 한 상단 뒷면 중앙 배치) 지정 된 림프절 림프 배수 되도록 신중 하 게 배치 해야 합니다. DLN 위에 종양이 피부/종양 통해 LNs의 직접 photoconversion에서 발생할 수 있습니다 배치 하지 마십시오.
  3. 원하는 크기 (100-650 m m3) 종양을 허용 합니다.
  4. 2.1에 설명 된 대로 조직 컬렉션 이전 1 일 장난-Tg 마우스 anesthetize 하 고 종양 주변의 모든 새로 regrown 모피를 면도.
  5. 알루미늄 호 일에 원형 구멍을 삭감 하 고 광원을 종양을 노출 하는 종양을 이겨낼. 다시 구멍을 통해 떨어지는에서 종양을 방지 하기 위해 종양 보다 약간 작은 구멍을 삭감 하 고 인접, 비 종양 피부의 변환 최소화 합니다.
  6. 광원 및 5 분 200 mW 전력에서 405 nm 광원을 사용 하 여 photoconvert 바로 아래 종양 위치.
  7. 1.3 단계에서에서 설명한 대로 photoconversion, 후 24 h 쥐 안락사. PBS에는 종양, 상 완 dLNs, 및 사 타 구니 비 배수 LNs를 수집 합니다. 가 위를 사용 하 여 주변 피부에서 종양을 잘라 고 1.3 단계에서에서 설명한 대로 LNs를 제거 합니다.

7. 종양 및 림프절 Cytometry에 대 한 처리

  1. 종양에서 단일 셀 정지를 만들기: 1 mg/mL 콜라 D 80 U/mL DNase HBSS에 희석을 포함 하는 24-잘 접시의 우물으로가 위 종양을 말하다. 70 µ m 나일론 여과기를 통해 1 h. 보도 소화 조직에 대 한 37 ° C에서 품 어.
  2. 5.2 단계에에서 설명 된 대로 림프절의 단일 세포 현 탁 액을 만듭니다.

8입니다. 항 체 Cytometry에 대 한 얼룩

  1. 단일 셀 정지에 조직을 소화, 후 관심의 표식이 있는 셀을 표준 흐름 cytometry 얼룩 기법을 수행 합니다. 간단히, 96 잘 접시에 피펫으로 2 x 106 셀. Fc 블록 (1 µ g/mL) 얼음; 20 분에 대 한 샘플을 품 어 FACs 버퍼 (1% 소 혈 청 알 부 민 PBS에) 두 번 씻어. 라이브/죽은 얼룩 (PBS에 희석) 샘플에 추가 하 고 얼음;에 15 분 동안 품 어 FACs 버퍼 두 번 씻어. 1 차 항 체 (테이블의 재료) 얼음; 30 분 FACs 버퍼에 희석 된 품 어 FACs 버퍼 두 번 씻어.
    참고: 녹색가 고 빨간 형광 FITC와 PE fluorophores;와 겹치는 데 따라서, FITC와 PE 활용 된 항 체는 데 단백질을 함께 사용할 수 없습니다.
  2. 얼룩, 후 교류 cytometer에서 샘플을 실행 합니다. 또는 2% 셀 수정 PFA.

9. 교류 Cytometry 분석

  1. FITC (가 그린)와 PE (빨강 단풍나무) 채널을 70-80%의 전체 범위에 PMT 전압 설정 (약 10에서 인구 센터4)가 그린 비보 전 또는 빨간 단색 splenocytes 또는 혈액을 사용 하 여.
    참고:이 큰 신호 확산에서 발생 장난 (FITC) 녹색과 빨강 단풍나무 (PE) 채널에 대 한 보상 하지 마십시오.
    1. 단색이 컨트롤을 만들려면 장난-Tg 마우스에서 비장 또는 혈액을 수집 합니다. ACK 버퍼, 붉은 혈액 세포를 lyse 다음 셀 두 그룹으로 나누어:가 녹색 및 변환가 빨간색 없이.
    2. 단일 색상가 빨간색 컨트롤 중단 1 mL의 PBS에 셀과 100의 힘에는 405 nm 광원을 사용 하 여 5 분에 대 한 24-잘 접시에 photoconvert mW. 이러한 세포를 사용 하 여 설정 하는 데 녹색 (FITC)와 빨간 PMT 전압 교류 cytometer (단계 9.1)에.
  2. 가 단백질에 대 한 전압을 설정 되 면 단일 fluorophore 보상 구슬 제조 업체의 지시 당 분류를 사용 하 여 다른 모든 기본 항 체 얼룩에 대 한 보상.
  3. 데이터를 수집 하는 교류 cytometer에서 샘플을 실행 합니다.
    참고: 데 단백질 세포에 의해 생산 되 고 지속적으로. 즉 그 24 h photoconversion, 후 변환 된 셀이 녹색에 대 한 두 배 긍정적인 되며 새로 합성된 장난 (녹색)으로 붉은 단풍나무 단백질 셀에 축적 했다.
  4. FlowJo 소프트웨어 또는 비슷한 소프트웨어를 사용 하 여 데이터를 분석 합니다.

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Representative Results

우리는 먼저 photoconversion 결과 효율성을 평가 하 고 결정 마우스 피부에 관련 된 염증에 문학에 발표 된 복제 하고자 했다. 귀 pinna 100 mW 보라색 빛에 노출 되었다 (405 nm) 이전33을 설명 하는 3 분. 단일 셀 정지 모든 CD45의 78% 변환 효율을 공개 노출 다음 즉시 귀 피부 또는 자 궁 경부 dLNs에서 생성 된+ dLNs (그림 1A)에서 변환 된 셀으로 피부에 백혈구 관찰. Photoconversion와 관련 된 염증 반응 평가, 하 우리 계량 CD45 침투의 숫자+ 변환된 귀 0에 24 h 백혈구 변환 (그림 1B) 및 급성 변화에에서 게시 혈관 침투성 측정 의해 마일의 분석 결과42 (그림 1C). 간단히, 0.5% 에반스 블루 했다 intravascularly의 200 µ L photoconversion 후 2 h를 주입. 귀 주사와 에반스 블루 55 ° C (610 nm42에서 읽이 되는 흡 광도)에서 24 h에 대 한 formamide와 추출 된 후 30 분을 수집 했다. 두 CD45+ (24 시간) 침투와 혈관 누출 (2 시간)이 짧은 노출에도 자체 photoconversion 수 있습니다 조직 관련 염증 반응을 영향을 나타내는 photoconversion에 따라 크게 증가 했다. CD45 비교+ (그림 1B) 침투와 혈관 누출 (1.4 µ g/귀 ± 0.75) VacV 감염 귀 24 시간 게시물 감염41 에 보라색 빛 (0.08 µ g/귀 ± 0.01)에 의해 발생 하는 염증의 정도 대 한 컨텍스트를 제공 합니다.

몇 가지 모델 비 림프, 주변 조직에서 백혈구 탈출구를 추적 하기 위해 다양 한 연구에 사용 되었다, 그들은 피부를 나와 특정 인구를 추적 하는 그들의 능력에 이러한 메서드를 비교 하는 방법 명확 하지 않습니다. 따라서, 우리는 DC 탈출구 LNs, 추적 하 두 일반적으로 사용 되는 방법의 직접 머리 비교를 수행 하기로 특이성에 대 한 각 방법의 효율성을 평가 하기 위해 FITC 페인트 그리고 vivo에서 photoconversion 양적 정상 상태, 감염 된 피부와 피부 염증, 동안에 DC 탈출구의 분석. 각 분석에 대 한 피부 경 피 FITC 응용 프로그램을 복종 되었다 또는 3 분 LN DC 인구는 CD3ε로 정의 된에 대 한 100 mW 405 nm 빛에 노출-CD19-MHCII+CD11c+ 더 1으로 층 화와) MHCII안녕하세요 CD11cint Dc, 풍요롭게 철새 Dc (mDCs)를 위한 둘 다 CD103는+ BATF3 종속 간 제시 DCs, 및 CD11b+ 피부 Dc; 그리고 2) MHCIIintCD11c안녕하세요 Dc, CD8α를 포함 하 여 거주 Dc (rDCs)에 대 한 풍요롭게는+ BATF3 종속 간 제시 Dc (그림 2A). FITC 응용 프로그램 또는 photoconversion 후 24 h, 레이블이 셀 했지만 쉽게 배출에서 감지 하지 비 배수 LNs (그림 2B). LNs DC 마이그레이션의 범위를 계량 하 고 동시에 마이그레이션 인구와 상주 하지 LN 인구를 라벨에 대 한 방법의 특이성을 결정, 우리 레이블이 mDCs 및 정상 상태, DBP, 응용 프로그램을 다음 24 시간에서 rDCs 계량 그리고 48 h 다음 VacV 혹 (그림 2C). Photoconversion (가)와 FITC mDCs 모든 조건에 표시 되어 있다, 하는 동안 dLNs, VacV 감염 어디 두 가지 방법을 계량 탈출구의 비슷한 수준의 예외에서 mDCs가 표시 보다 더 FITC 표시 관찰 합니다. 또한, DBP의 맥락, FITC 또한 분류 rDC 인구 photoconversion mDCs (그림 2C)에 남아 있었다. 이러한 두 가지이 방법 사용 하 여, 우리가 관찰 VacV에서 약 200 Dc의 탈출구 피부 감염 출구의이 수준은 화장실 외. 여 경 피 FITC 응용 프로그램을 사용 하 여 이전에 게시 발견이 중요 한 것은 지적 41. 따라서, 염증 컨텍스트에 따라 경 피 FITC 응용 프로그램 레이블이 Dc dLNs에 photoconversion 동안 비 철새 LN 상주 DC 인구의 일반적인 라벨에서 결과 검색의 숫자를 늘릴 수 있습니다 특히 Dc mDC 인구로 떨어지는 식별 합니다.

단풍나무-Tg 마우스5,,33435,6,,3538 피부, 점 막에서 출구에 백혈구 보존 척도를 사용 하 고 림프 조직 아래 안정 상태 조건 염증이 고 어디 종양 마우스 귀와 작은 볼륨39photoconverted 피부 이식 했다 단일 게시에만 종양에 적용. 따라서, 우리 추가 면역 가설 수 있도록 설립, 큰 1 차 종양에서 백혈구 탈출구의 정량화에 대 한 vivo에서 photoconversion 유틸리티를 평가 하고자 했다. 첫째, 우리 이식 MC38 종양 세포 intradermally가-Tg 마우스 왼쪽 및 오른쪽 견 사이. 삽입형 종양 모델 활성화 림프 알려진된 LNs;를 위해 종양의 정확한 위치 종양의 위 피부에 다시 주로 드레인 왼쪽 및 오른쪽 상 완 LNs. 100-150 m m3에 도달, 후 종양 했다 photoconverted (10 분, 200 mW) 종양과 dLNs photoconversion 후 즉시 수확. 분석 cytometry 공개+ intratumoral CD45의 중요 한 변환 세포가 그린+ 가 빨간색+ (69%; 그림 3A), 그러나 중요 한 것은, dLNs가 빨간+ 세포에 대 한 부정적인 유지. 면역 형광 검사 현미경 검사 법 photoconverted YUMM 1.7 종양의 종양 조직에 깊이 침투 하는 그 photoconversion 공개 (> 1 밀리미터; 그림 3B)입니다. 흥미롭게도, 피부와 혈관 세포가 단백질이 세포 유형의 그림 3B에서 보듯이 높은 photoconversion 효율성 선도 높은 수준의 표현. 이 높은 붉은 단풍나무 식 어려운 (둘 다 없이 하 고 변환) 면역 세포를 식별 하 면역 형광 검사 현미경 검사 법을 사용 하 여.

흑색 종 면역학에 우리의 특별 한 관심을 감안할 때, 우리는 다음 다양 한 이식 murine 종양 세포 선을 사용 하 여 photoconversion 효율성에 종양 크기와 멜 라 닌의 효과 평가: MC38 (대 장 암 선 unpigmented) B16. F10 (멜 라 닌 생산 흑색 선), YUMM 1.1 (unpigmented 흑색 선), 그리고 YUMM 1.7 (unpigmented 흑색 선)44. 이 라인의 각 다양 한 종양 볼륨 (50-650 m m3) 위에서 설명한 대로 장난-Tg 마우스 및 photoconverted, 피부 이식 했다. 종양은 photoconversion 즉시 다음 수확 되었고가 빨간 CD45의 존재에 대 한 평가+ cytometry에 의해 백혈구. 흥미롭게도, CD45의 photoconversion 효율+ 백혈구 종양 종류와 크기 (그림 3C)에서 크게 변화. CD45+ 백혈구 내 작은 (50-150 m m3) YUMM 1.7와 YUMM 1.1 종양 각각 80%와 60%, 가장 효율적인 photoconversion 시연. 이 종양에 대 한 볼륨 증가, 변환 효율 큰 종양 (> 600 m m3) 약 50% 감소. 멜 라 닌 photoconversion 효율성에 눈에 띄는 영향을 미쳤다: CD45에 대 한 최대 photoconversion+ 세포 내 멜 라 닌 생산 B16. F10 종양만 약 30% 이었고, 종양 도달 400 m m3의 볼륨을 10%로 떨어졌다. 흥미롭게도,+ T intratumoral CD8의 분석 세포를 멜 라 닌 생산 (그림 3D)에 작은 종양에 거의 80-90%에서 이러한 셀에 대 한 계시 photoconversion 효율. CD8 unpigmented 종양에 대 한+ T 세포 변환 남아 있었다 높은 종양 큰 볼륨에 도달 하지만 크기와 크게 감소 때 멜 라 닌이 존재 했다. 으로 이러한 B16의 유틸리티. F10 murine 정면을, 그리고 다른 멜 라 닌 생산 흑색 라인 제한 될 수도 작은 종양 (50 m m3)에 있는 멜 라 닌에 흡수 하는 빛의 생물 학적 기능와 일치 하는. 종양의 photoconversion와 관련 된 염증 반응 평가, 하 우리 CD45 수 정량 비전향된 종양 및 변환된 종양 24 시간 게시물 photoconversion (그림 3E)+ 세포. 우리 CD45의 전체 숫자에 큰 차이 보았다+ 세포 종양 비전향된 종양에 비해 photoconversion 다음 24 시간에서에서 발견.

우리는 다음 두 골수성과 림프 세포 유형의 밀매 동작의 심문에 대 한 수 있는-Tg 마우스를 사용 하 여 종양 microenvironments에서 백혈구 탈출구를 측정할. MC38 또는 YUMM 1.7 종양 세포 intradermally가-Tg 마우스에 이식 했다. 종양은 photoconverted 볼륨 100-150 m m3 사이 면 (5 분, 200 mW); 상 완 dLNs와 사 타 구니 비 배수 LNs는 photoconversion 후 24 h를 수집 했다. Intratumoral 백혈구 인구 MC38에서 계량 했다 YUMM 1.7 종양 C57Bl/6 마우스 컨트롤에 이식 하 고 종양에 도달 하면 100-150 m m3를 수집. 우리 cytometry에 의해 종양 및 egressed 인구 내의 백혈구 복잡성을 평가: T 세포 (CD3ε CD4+CD8++), B 세포 (CD3ε-CD19+), Dc (CD11c++CD11b MHCII+ ), 호 중구 (CD11b+MHCII-Ly6G+), 대 식 세포 (CD11b+MHCII++F4/80), 그리고 염증 성 monocytes (CD11b+Ly6G-Ly6C+; 그림 4A)입니다. 이 같은 제어 구조를 사용 하 여, 우리 각 백혈구가 종양 microenvironments (그림 4B)에 이전 거주를 나타내는 빨간색을 표현 하는 dLNs의 비율을 평가 합니다. 흥미롭게도, 둘 다 MC38 동안 (그림 4C)와 YUMM 1.7 (그림 4D) 종양은 주로 골수성 세포 (monocytes, Dc, 그리고 대 식 세포)와 침투, 두 종양 종류에서 egressed 했다 셀의 약 50 %T 림프 톨 (두 CD4+ 와 CD8+). T 세포, 뿐만 아니라 우리는 또한 Dc, B 세포을 관찰 하 고 종양 하지만 대 식 세포와 호 중구에서 egressed 인구 이내 monocytes 종양 유형 중에서 검색 되지. 모두,이 데이터 생 환경에서 여러 개의 백혈구 계보를 추적 하기 위한 데 Tg photoconvertible 마우스 유틸리티를 보여 줍니다. 또한, 우리의 분석 출구 intratumoral 백혈구 복잡도 결정 하기 위한 중요 한 의미를 가질 수 있습니다 선택적 활성 프로세스 임을 나타냅니다.

Figure 1
그림 1: Photoconversion 효율성 murine 피부에 염증 관련. Murine 진 피는 100에 3 분 photoconverted mW (405 nm 빛). (A) 대표적인 흐름 묘사 photoconverted (데 레드+) 플롯 CD45 비전향된 변환된 귀 및 자 궁 경부 dLN 즉시 다음 photoconversion+ 세포. 인구 중 문이 했다에 살고, CD45+ 단일 셀. (B) 열거 총 CD45 비전향된 귀 (-)+ 세포, 귀 귀 photoconversion, 다음 즉시 수집 photoconversion, 후 24 시간 수집 및 귀 VacV 감염 후 24 시간 수집 (n = 3). (C) A 마일의 분석 결과 바로 다음 405 nm 빛에 노출 혈관 시키는 척도를 수행 했다 (3 분, 100 mW). 귀 피부 (왼쪽)와 추출 된 염료 (오른쪽)의 정량화에 누설의 대표 이미지 (n = 3). 오차 막대를 나타내는 SEM. *p< 0.05와 * *p< 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 순진한에서 DC 탈출구, 염증과 피부 감염. (A) Gating 구성표 철새 Dc (mDCs;을 식별 하 MHCII안녕하세요CD11cint) 및 거주 Dc (rDCs; MHCII안녕하세요CD11c안녕). (B) 대표적인 흐름 플롯 나타내는 FITC+ 또는 단풍나무 붉은+ Dc, 미리 생쥐에서 mDCs에 문이 VacV (dLN) 또는 감염 contralateral 비 배수 LN 컨트롤. (C) + 가 빨간색의 숫자의 정량화와 FITC+ mDCs rDCs 안정 상태, DBP 염증이 (24 h 게시물 응용 프로그램), 및 VacV의 dLNs에 감염 피부 (48 시간 게시물 감염). 오차 막대를 나타내는 SEM. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: Photoconversion 효율성 종양 microenvironments. 종양은 200에서 10 분 동안 photoconverted mW (405 nm 빛). (A)가 녹색 그리고 데 비전향과 변환 MC38 종양과 상 완 dLN photoconversion 직후에 빨간색의 대표적인 흐름 플롯 합니다. 인구 중 문이 했다에 살고, CD45+ 단일-셀. 냉동, 10 월 임베디드 YUMM 1.7 종양 두 없이 photoconverted의 (B) 면역 형광 microcopy. 눈금 막대 200 µ m. (C) 변환 효율의 CD45 =+ 백혈구 및 (D) CD8+ (B16 멜 라 닌 생산 세포. F10) unpigmented (MC38, YUMM 1.1 YUMM 1.7) 및. 각 포인트는 단일 마우스를 나타냅니다. 총 CD45 (E) 열거+ 비전향된 종양 세포와 photoconverted 종양 photoconversion 후 24 h를 수집 (n = 3). 오차 막대를 나타내는 SEM. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 백혈구 탈출구 종양 microenvironments에서 선택적 이다. (A) MC38 dLNs에 골수성과 림프 인구 식별 Gating 체계. (B) 대표적인 흐름 photoconversion 후 MC38 dLNs 24 h에에서 골수성과 림프 세포 중 식별가 빨간+ 셀을 플롯합니다. 흐름 플롯에 백분율 LNs. (C, D) intratumoral의 상대적 비율에 지정 된 부모 백혈구 인구 내의 빨간+ 세포의 주파수를 나타냅니다 (CD45의 %+ 세포)와 egressed (%가 빨간+ 세포; MC38에서 상 완 dLNs) 백혈구 (C, n = 3)와 YUMM 1.7 (D, n = 4) 종양. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

주변, 비 림프 조직에서 백혈구 탈출구는 개시 및 면역 반응의 해결에 대 한 중요 한, 탈출구를 제어 하는 분자 메커니즘 이해 가난 하 게 된다. 지식에이 격차는 주로 정량화 비보에 대 한 도구의 준비 가용성 예정 이다. 여기, 우리 photoconvertible 마우스 (단풍나무-Tg) 피부와 종양에서 내 생 백혈구 탈출구를 계량 하 고 염증에 FITC 페인트로 직접 머리 비교를 제공 하 고 감염 모델의 사용을 설명 합니다. 두 모델 모두 생 DC 인구를 추적 하는 동안 FITC와 비 phagocytic 세포에 의해 빈약한 통풍 관의 무료 배수 제한 FITC 골수성과 림프 출구 주변, 비 림프 조직 등에서 광범위 한 분석에 대 한 페인트의 유틸리티 설명 종양입니다. 또한, 우리를 나타내는 종양에서 출구 확률적 결과 제시한 Torcellan 그 외 여러분 확인 보다는 선택적 데이터 제시 39. 종양에서 백혈구 출구 제어 메커니즘의 추가 조사 종양 관련 된 염증 및 면역에 새로운 통찰력을 공개 수 있습니다.

문학에서 보고 된 설정을 사용 하 여 때 우리는 먼저 murine 피부와 지역의 염증에 미치는 영향에 photoconversion의 효율성을 평가 합니다. 바이올렛 100 mW 전력에서 3 분을 위한 빛에 귀의 노출 결과 CD45의 효율적인 photoconversion+ 세포 내에서 아무런 변환 없이 다운스트림 dLNs에서 귀 피부 (78%). 문학에서 보고서 3-5 분 노출은 피부 조직5,,3338가장 적합 하는 방법을 보여 줍니다. 그러나이 노출 CD45의 증가 수를 지도 하는,+ 귀 pinna 변환 다음 24 시간에서에서 세포 및 귀 피부에서 이러한 설정에는 photoconversion을 나타내는 혈관 누설 유도 로컬 염증 때 고려 되어야 한다 데이터 해석 우리는 다음 직접 DC LNs DBP 유도 된 염증 동안 그리고 VacV 감염 귀에서가 photoconversion와 더 광범위 하 게 사용된 FITC 페인트 분석 결과23,정상 상태에서24 를 사용 하 여 매매를 비교 하고자 했다. 정상 상태 및 다음 DBP 치료에서 photoconverted 피부에 비해 처리 상승 된 라벨 FITC에서 관찰 합니다. 무료 FITC 피부에 적용 될 수 있습니다 림프 혈관을 통해 직접 배수 배출 LNs 어디 거주 마이그레이션되지 않습니다 DC 인구 (., CD8α+ Dc), FITC 샘플. 이 일치, FITC 레이블 자극성 DBP로 치료 하면 rDCs의 상당한 숫자 관찰 합니다. 대조적으로, 빨간색 표시 된 Dc가이 그 photoconversion을 나타내는 photoconversion 레이블 mDCs 하는 좀 더 구체적인 방법을 제공 mDC 인구 다음에서 관찰 되었다. 그러나 MDC 인구 내 에서도, 우리는 관찰 양적 더 레이블이 mDCs FITC photoconversion에 사용 하는 경우. 이 또한 FITC 배수 무료에 의해 설명 될 수 있습니다, 하는 동안 그것은 그 라벨의 기간 차이, 어디는 photoconversion만 레이블을 적용할 수 있습니다 Dc 현재 FITC 동안 피부에 남아 피부에 24 시간 기간 동안 가능 관찰된 mDC 탈출구에 차이 대 한 계정. 흥미롭게도, 바이러스 성 감염의 맥락에서 photoconversion와 FITC 응용 프로그램에 mDC 출구 및 VacV 감염 귀 배출 LNs에서 몇 FITC+ rDCs 상대적으로 동등한 수준의 측정. 우리가 최근 보고 그 림프 배수는 크게 감소 다음 VacV 감염, 그리고 따라서 림프 교통에서 유발 바이러스 감소 FITC 페인트의 특이성을 향상 시킬 수 있습니다 그리고 LN 거주 DC 인구31의 라벨을 감소 . 중요 한 것은,이 작품 또한 사실 하이라이트는 mDC 인구 내의 (CD3ε-CD19-MHCII안녕하세요CD11cint), 24 시간 이내 적극적으로 마이그레이션한 Dc의 수는 작은 인구와 따라서 총 mDC 번호는 활성 마이그레이션41좋은 대리 아닙니다. 마지막으로, 그것은 우리가 일관 되 게 어떤 주어진된 24 시간 기간 다음 VacV 감염41, 종양 microenvironments에서 1500-2000 Dc 진출 하면서 약 200 셀에 mDC 탈출구 계량 흥미로운. 혹45,,4647에 의해 적용 될 때 특히 백신 플랫폼으로 VacV의 엄청난 효능을 감안할 때, 그것은 아마도 유형의 DC는 DC의 품질 임을 추측 흥미로운 항 원, 보다는 오히려 수량을 제시, 그 강력한 보호 면역을 결정 합니다.

백혈구 탈출구 종양 microenvironments, Dc25,48, 저쪽에서 제대로 조사 지역에 남아 있다. 종양은 만성 염증이 microenvironments 간주 됩니다, 하지만 알 수 없는 남아 여부 유사한 메커니즘 규제 비 악성 및 악성 조직에서 세포 출구. 또한, 종양에서 백혈구 탈출구 확률 인지 또는 오히려 선택적 해야한다 백혈구 축적과 보존 종양 microenvironments에서 해석에 대 한 중요 한 의미. 따라서, 종양에서 백혈구 탈출구 종양 면역 감시를 회피 하는 방법을 이해 하는 중요 한 수 고 immunotherapy 위한 새로운 전략으로 이어질 수 있습니다. 여기 우리 백혈구 탈출구 이식할 피부 종양, FITC 페인트 어디에 충분 한 것을 공부 하 photoconvertible가 Tg 모델 적용 광범위 하 게 라벨 골수성과 림프 인구. 초기 연구 밝혀 이식된 종양에서 photoconversion 효율성 모두 종양 크기와 멜 라 닌에 의존 했다. Photoconversion 효율성 종양 성장 멜 라 닌 있으면 빠르게 drops 동안 (B16. F10) YUMM 및 MC38 종양 등 비 색소 종양 라인 종양 크기 테스트 보다 안정적인 변환 효율을 전시 한다. 흥미롭게도, 우리는 CD8에서 향상 된 변환 효율을 관찰+ T 세포 구획 CD45에 비해+ 셀, 크기에서 증가 하는 종양으로 거부 했다. 이 관측에 기여 가능성이 몇 가지 요인이 있다. 첫째, 종양 내의 위치 노출과 따라서 특정 셀의 변환 효율에 영향을 것입니다. T 세포 삽입형 종양 모델에 피부 종양 인터페이스에 제한에 자주 발견 되 고 따라서 수 있습니다 더 쉽게 골수성 세포 침투 종양 실질 기준으로 photoconverted. 둘째, 모든 백혈구가 단백질49 의 동일한 수준을 표현 하 고 따라서 모든 검색 될 수 있습니다 동등 하 게 cytometry;에 의해 이 모든 CD45 같은 더 많은 다른 유형의 세포 인구를 분석할 때 photoconversion의 관찰 된 비율을 낮출으로 이어질 수 있습니다+ 세포. 마지막으로, 그것은 그림 3 에 표시 하는 데이터 생성된 다음 10 분 자외선 빛 노출의 않았습니다. 이 초기 노출 시간 photoconversion 시간 피부, LNs, 점 막 조직, 및 종양5,,633,35 포함 하 여 다양 한 장기에 대 한 인용 문헌에는 보고서에 따라 선정 되었다 ,,3943. 만 다른 연구 종양에 photoconvertible 시스템을 채용, photoconversion 20 분39수행 되었다. 우리의 손에서 더 최적화 모두 크고 작은 볼륨에 대 일 분의 짧은 노출 시간으로 향상 된 효율성을 밝혔다. 그것은 장기간된 노출 Kaede 형광의 photobleaching에 이르게 되 고 따라서, 우리의 보고 변환 효율 수 있습니다 underestimates. 장기간된 노출 또한 photoconversion 연관 된 염증 증가에 지도 하 고 연구 결과 혼동 수 있습니다. 5 분 동안 종양 photoconverted 시연+ intratumoral CD45의 숫자에 큰 차이 photoconversion 비전향된 종양에 비해 후 24 h 세포. 또한, 5 분 동안 종양 photoconverted 골수성과 림프 성 인구에 대 한 측정 및 재현성 탈출구를 시연 했다. 따라서, 특정 조직 또는 관심의 종양 내에서 개별 최적화는 최적의 결과 달성 하는 데 필요한입니다.

마지막으로, 우리 생 백혈구 탈출구가-Tg 마우스에 이식 종양에서 계량을 제자리에 photoconversion를 사용. Dc의 중요 한 탈출구 관찰 두 가지 다른 이식, 착 비 종양 모델을 사용 하 여 T 세포, 및 monocytes. 최근에 출판 된 작품39, 두 CD4 일치+ 와 CD8+ T 세포 egressed 상당수의 이중 부정 CD3ε+ T 함께 종양 microenvironments에서 셀. 적어도,이 인구에의 한 구성 요소가 있을 수 있습니다 감마 델타 T 세포 앞에서 설명한39이 관찰의 기능적 중요성 결정 남아 있지만. 중요 한 것은, 우리가 종양에서 종양 microenvironments 내의 백혈구의 상대적 비율을 egressing 하는 백혈구의 비율 비교, intratumoral 풀을 기준으로 egressed 인구 우라늄 농축 백혈구 관찰 선택적 백혈구 출구를 나타내는 두 모델. 특히, 대 식 세포와 호 중구 결 석 했다 egressed 인구에 비록 두 종류 되어 염증 및 감염 조건2,50,,5152 에서 탈출구를 설명 , 53 , intratumoral 백혈구 레파토리39,,5556에 중요 한 기여자 54 와 따라서, 종양에서 백혈구 출구 photoconvertible 모델을 사용 하 여 측정할 수 있다, 오히려 규제 프로세스, 하지만 확률적 이며 염증 성 이해에 대 한 중요 한 영향으로 중요 하 고 understudied 생물학을 유지 하 고 면역 역학 안정 상태에서 종양 microenvironments 및 치료에 대 한 응답.

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Disclosures

저자는 공개 충돌이 있다.

Acknowledgments

저자 박사 마커 스 Bosenberg YUMM 1.1 및 YUMM 1.7 murine 흑색 라인 및 박사 데보라 J. Fowell b 6를 제공 하기 위한 제공 하는 것을 감사 하 고 싶습니다. RIKEN BRC 통해 국가 바이오-리소스 문 부 과학성, 일본의와 cg Tg(CAG-tdKaede) 15Utr 쥐.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase D Roche 11088866001
DNase Roche 4536282001
Silver-LED-405B light source with optical fiber and collimtor Prizmatix Ltd V8144
Fluorescein isothiocyanate isomer I Sigma-Aldrich F4274
dibutyl phthalate Sigma-Aldrich 524980
acetone Macron Fine Chemicals 2440-02
29-guage syringes Exel International 26029
Evans Blue Sigma-Aldrich E2129
70 um cell strainers VWR 732-2758
paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
HBSS Caisson HBL06
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit Invitrogen L34966
Purified Anti-mouse CD16/CD32 Tonbo Biosciences 70-0161-M001
BV605 CD11c (clone N418) Biolegend 117334
PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2) BD Pharmingen 562363
BV421 CD3e (clone 145-2C11) Biolegend 100341
APC CD8a (clone 53-6.7) TonBo Biosciences 20-0081-u100
APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11) Biolegend 103116
BV650 CD19 (clone 6D5) Biolegend 115541
PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4) Biolegend 128011
Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8) Biolegend 123121
APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8) Biolegend 127623
BV711 CD11b (clone M1/70) Biolegend 101241
BV605 CD45 (clone 30-F11) Biolegend 103155
BV711 CD4 (clone RM4-5) BD Biosciences 563726
Bovine serum albumin (Fraction V) Fisher Scientific BP1600-100
Anit-Rat and Anti-Hamster Igk / Negative Control Compensation Particle Set BD Biosciences 552845
Fortessa Flow Cytometer BD Biosciences
FlowJo v10 Software FlowJo

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References

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생물학 문제점 143 림프 혈관 탈출구 밀매 장난 FITC 페인트 백혈구 흑색 종
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Steele, M. M., Churchill, M. J., Breazeale, A. P., Lane, R. S., Nelson, N. A., Lund, A. W. Quantifying Leukocyte Egress via Lymphatic Vessels from Murine Skin and Tumors. J. Vis. Exp. (143), e58704, doi:10.3791/58704 (2019).

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