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Biology

小鼠皮肤和肿瘤淋巴血管白细胞出口的定量

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58704
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 1,2,3,4
1Department of Cell, Developmental, & Cancer Biology, Oregon Health and Science University, 2Department of Molecular Microbiology & Immunology, Oregon Health and Science University, 3Department of Dermatology, Oregon Health and Science University, 4Knight Cancer Institute, Oregon Health and Science University

Summary

在这里, 我们展示了在体内定量的方法,白细胞出口从天真, 发炎, 恶性小鼠皮肤。我们对两种模型进行了面对面的比较: 透皮 fitc 应用和原位光转换。此外, 我们还论证了光转换在跟踪皮肤肿瘤白细胞出口方面的作用。

Abstract

白细胞从外周组织进入排淋巴结不仅对免疫监测和启动至关重要, 而且有助于外周组织反应的解决。虽然使用了多种方法来量化白细胞从非淋巴, 外周组织, 细胞和分子机制, 控制上下文依赖的出口仍然了解甚少。在这里, 我们描述了使用原位光转换定量分析白细胞出口从小鼠皮肤和肿瘤。光转换允许直接标记白细胞居住在皮肤组织内。虽然皮肤暴露在紫罗兰色的光导致局部炎症反应的特点是白细胞浸润和血管泄漏, 在头部与透皮应用荧光示踪剂的比较, 光转换专门标记迁移树突状细胞群, 同时使骨髓和淋巴出口从皮肤微环境和肿瘤的量化。白细胞出口的机制仍然是我们对肿瘤内白细胞复杂性的理解中缺失的组成部分, 因此本文所述工具的应用将为肿瘤免疫微环境的动态提供独特的见解。在稳定的状态和对治疗的反应。

Introduction

外周组织免疫反应不仅是由白细胞招募到炎症部位, 但也由机制, 调节其随后的保留。因此, 保护性免疫是由累积的细胞和分子机制决定的, 这些机制决定白细胞是进入、停留在内, 还是通过淋巴血管从外周组织中迁移出去。重要的是, 白细胞通过淋巴血管 (称为出口) 退出组织的倾向与它们的专门功能有关。树突状细胞 (dc) 获取迁移行为, 以响应成熟信号, 导致抗原转运和在排水淋巴结 (dln) 中的表现, 这是适应性免疫1所必需的一个过程。清除骨髓细胞, 如巨噬细胞和中性粒细胞, 有助于清除凋亡的碎片, 通过吞噬。在细菌感染期间, 中性粒细胞退出组织, 并最终在 dln 2 和 dss诱导结肠炎模型中发生凋亡, 数据支持巨噬细胞出口是解决局部炎症3所必需的假设。然而, 中性粒细胞和巨噬细胞的退出是否发生在所有炎症环境中尚不清楚。t 淋巴细胞出口的证据,从稳定状态 4,5,6, 7, 感染8, 并发炎4,9,10 ,11,12个外周, 非淋巴组织表明 t 细胞积极循环, 虽然基于组织的信号, 推动这一出口仍然很少了解。几项研究确定了定向迁移以排出淋巴毛细血管和随后的出口所必需的信号, 包括趋化因子 (c-c 母题) 配体 21 (ccl21) 及其受体 ccr7 4,11, 13、趋化因子 (c-x-c 母题) 配体 12 (cxcl12) 及其受体 cxcr42、14和 sphingosine-1-phosphate-磷酸 (s1p)10、15、16。然而, 这些机制并不是在所有情况下都很活跃, 它们是否决定了所有细胞类型的出口仍然是一个悬而未决的问题。重要的是, 要进一步深入了解控制出口的机制及其在疾病中的功能相关性, 需要定量的体内分析方法。

在体内多个动物模型中, 有几种方法被用来量化出口, 包括淋巴血管的直接插管、体内标记白细胞的采用转移、荧光示踪剂的透皮应用,注射标记颗粒, 并在体内光转换17,18。直接插管的外发小鼠淋巴管是困难的, 并限制在小动物的液体量, 可以收集。因此, 插管主要是在大型动物 (如绵羊), 在那里这种手术操作是可行的。这些研究为淋巴 10、19、20中存在淋巴和骨髓细胞提供了直接证据。此外, 卵巢模型显示, 急性和慢性炎症增加淋巴细胞在淋巴中的存在近 100倍 10,21。

通过转移标记和基因操纵的淋巴细胞, 重要地表明 ccr7 是 cd4+ t 细胞从剧烈发炎的皮肤5,11, 而淋巴细胞的预处理所必需的用小分子 s1p 受体激动剂 f其次 720, 仅部分抑制他们的出口10。有趣的是, 从慢性发炎的皮肤转移的淋巴细胞是 ccr7 独立10, 但可能部分需要 cxcr49。然而, 采用转移实验通过注射将体外活化淋巴细胞和标记为组织的非生理数量传递给组织, 从而改变组织的生物力学环境和间质液体压力升高打开最初的淋巴毛细血管, 改变它们的运输特性22。作为替代办法, 在存在或不存在皮肤刺激物 (如邻苯二甲酸二丁酯、dbp) 或感染23、24的情况下, 荧光素异硫氰酸酯 (fitc) 的透皮应用允许跟踪积累示踪剂并迁移到 dln 的吞噬细胞。同样, 荧光标记的肿瘤提供了一种方法来追踪吞噬细胞, 这些细胞已经吞没了肿瘤物质 25。这些方法为指导直流出口 13、14、17、26、27的机制提供了重要的见解, 但无法跟踪非吞噬细胞淋巴细胞和, 解释可以复杂的可溶性 fitc 的游离淋巴引流, 从而标记非迁移, ln 居民 dc。

另外, 体内显微镜是一个强大的工具, 允许在体内实时跟踪与生理相关的白细胞群 28,29.体内显微镜与报告小鼠和抗体联合使用, 在体内进行免疫荧光标记, 揭示了免疫细胞贩运的复杂时空动态, 包括间质迁移30, 在淋巴内皮细胞中的迁移, 在淋巴腔内的通道,以及在 ln 进入 28,31时的迁移。广泛采用的体内成像技术受到费用、设置所需专业知识以及用于量化多种细胞类型的有限吞吐量的限制。尽管如此, 将分析种群动力学组织的定量方法与生命内成像结合起来, 将为淋巴毛细血管的运动和迁移机制提供额外而重要的机械洞察18,31,32岁

因此,体内光转换已成为一种方法, 允许原位标记, 独立于吞噬活性, 并定量生理白细胞出口 (当与流式细胞术结合)没有或存在的挑战。kaede-tg 小鼠本组织地表达从石珊瑚中分离出的一种蛋白质, 这种蛋白质表现出绿色荧光 (kaede 绿色), 直到暴露在紫罗兰色的光线下, 之后它不可逆转地转化为红色荧光 (kaede 红色)33。光转换细胞可以被跟踪, 因为他们从周围组织部位退出和积累在 dln。这和其他类似的光敞篷车模型34,35揭示了重要的生物学, 包括从皮肤的调节 t 细胞的本构出口 36, cxcr4 依赖 b 细胞出口从 peyer 的补丁37在多肽后动员常驻记忆 t 细胞重新挑战38, 从肿瘤微环境中动员广泛的白细胞出口39。在此, 我们对皮肤炎症和感染情况下的光转换与透皮 fitc 应用进行了面对面的比较, 以便将现有数据与光转换方法直接比较。此外, 我们还演示了植入肿瘤的光转换, 并描述了肿瘤微环境中的转化效率和选择性出口。因此, 我们认为, 需要进一步应用这些方法来阐明肿瘤白细胞出口的关键生物学, 这将对解释骨髓内白细胞复杂性、抗肿瘤免疫和对治疗的反应。

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Protocol

所有动物协议都已获得俄勒冈州健康 & 科学大学动物护理和使用机构委员会的批准。

1. 小皮纳炎症和 fitc 绘画的归纳

  1. 在层流罩中, 使用蒸发异氟烷麻醉 c57bl6 小鼠 (诱导为3-5% 异氟烷, 并保持在1-3% 异氟烷; 氧气流量为 0.5-1.0 lmmin)。通过监测踏板反射的损失、非自愿的运动和呼吸速率的降低, 确保适当的麻醉。
  2. 将耳朵扁平, 耳朵的腹侧朝上。将 5% fitc 溶液的 p0μl 溶解在1:1 丙酮中: 邻苯二甲酸二丁酯 (dbp) 到耳朵 pinna 的腹侧。让耳朵干燥几秒钟。
  3. 在 fitc 应用后 24小时, 通过接触二氧化碳对小鼠进行安乐死, 然后进行宫颈脱位。用剪刀将耳朵与头部分离, 将耳针收集到 pbs 中。收集宫颈 dln 和腹股沟非排水 ln 到 pbs 使用推子, 以分离 ln 从周围的组织。腹股沟非排水 ln 将作为 fitc+/kaede 红色+白细胞存在的负控制。根据机构协议处理尸体。
    注意: 用于分析的最佳拍摄后时间将取决于细胞类型和已知的迁移行为。例如, 树突状细胞最早可以在 dbp 应用后6小时内在 dln 中检测到。

2. 小鼠平纳的炎症和光转换的诱导

  1. 在层流罩中, 用腹腔注射 80 mg kg 的氯胺酮和溶解在盐水中的 10 mg/kg xylazine 麻醉一个 kaede-tg 小鼠 (背景 c57bl6)。确保正确的麻醉, 如步骤1.1 中所述。
  2. 将耳朵扁平, 耳朵的腹侧朝上。将11:1 丙酮的液滴20μl 连接到耳针的腹侧。让耳朵干燥几秒钟。
  3. 应用 dbp 后, 在一片铝箔中切割一个缝隙, 然后将耳朵通过缝隙, 将耳朵暴露在紫罗兰色光源上。将耳朵平放, 背侧朝向上, 使用双面胶带将耳朵固定在铝箔上。
  4. 将耳朵直接放置在光源下方, 并在 100 mw 功率下使用 405 nm 光源进行3分钟的光转换。
  5. 在光转换24小时后, 对 kaede-tg 小鼠进行安乐死, 并按照步骤1.3 中的描述收获耳朵的羽状、宫颈 ln 和腹股沟 ln。
    注: 除了步骤1.3 中提到的考虑因素外, 增殖率将决定分析的时间, 因为凯德红的损失将发生在快速分裂的细胞中。

3. 小鼠平纳疫苗感染及 fitc 应用

  1. 如步骤1.1 所述, 将 c57bl6 小鼠与汽化异氟烷进行麻醉。
  2. 将耳朵的腹侧平铺。圆环 5 x 10 6形成斑块的装置 (pfu) 的疫苗病毒 (vacv) 稀释在10μl 的 pbs 到耳朵 pinna。用29规格的针头, 戳到松果 40次。
  3. 24小时感染后, 麻醉感染真空的小鼠与异氟烷如步骤1.1 和移液 20μl 5% fitc 溶解在丙酮到内侧侧的耳朵 pinna。让耳朵干燥几秒钟。
  4. 在 fitc 申请后 24小时, 对小鼠实施安乐死, 并收集耳针、颈椎 ln 和腹股沟 ln, 如步骤1.3 所述。
    注: fitc 可在感染后的任何时间点适用, 以确定不同24小时间隔的直流贩运。我们以前报告说, dc 迁移到 dln 的水平从第1天到第3天的感染后41保持在类似的水平。

4. 小鼠平娜和光的感染。

  1. 如步骤1.1 中所述, 用汽化的异氟烷对 kaede-tg 鼠标进行麻醉。
  2. 如步骤3.2 中所述, 用真空 v 感染耳朵粉红。
  3. 感染24小时后, 麻醉感染真空的 kaede 小鼠, 如步骤2.1 中所述, 并执行第 2.3-2.4 步中所述的光转换。
  4. 光转换24小时后, 对小鼠进行安乐死, 并按照步骤1.3 中所述, 收获耳朵的羽鼻、颈 ln 和腹股沟 ln。
    注意: 如上文第3.4 步所述, 可在感染后的任何时间点进行光转换。

5. 流式细胞术的耳与淋巴结处理

  1. 创建单个细胞悬浮液的耳朵 pinnae: 剥开腹侧和背侧的耳朵 pinna 使用两对推子和地方与耳朵的内部面朝下进入一个24孔板的井, 其中 1 mgml 胶原酶 d 和 80 u/ml pinnae 稀释 汉克缓冲盐水 (hbss) (含 ca2 +和 mg2 +)。在37°c 下孵化 30分钟, 通过70μm 尼龙电池过滤器按下消化过的组织。
  2. 从 ln 中建立单细胞悬浮液: 将 ln 放置在一个24孔板的井中, 其中含有在 hbss 中稀释的 1 mgmml 胶原酶 d 和 80 uml dnase。用两个29规格的针头打开淋巴结囊, 然后在37°c 孵育淋巴结 30分钟, 通过70μm 尼龙细胞过滤器按下消化过的组织。

6. 真皮内黑色素瘤肿瘤植入术和光转换。

  1. 用电动剃须刀把凯德-塔格老鼠背部中央的毛刮掉。
  2. 将29规格的针放置在左、右上肩骨之间的背部中心, 并在皮内将 5 x10 5个肿瘤细胞 (在50μl 盐水中稀释) 注射到 kaede-tg 小鼠的皮肤中。肿瘤必须仔细定位, 以确保淋巴引流到指定的淋巴结 (即, 左和右臂 ln 的肿瘤放置在中背部)。避免将肿瘤置于 dln 之上, 因为这会导致 ln 通过皮肤肿瘤直接光转换。
  3. 允许肿瘤生长到所需的大小 (0-650 毫米3)。
  4. 在组织采集前一天, 麻醉一个 kaede-tg 小鼠, 如2.1 中所述, 并剃光肿瘤周围新再生的毛皮。
  5. 在铝箔上切开一个圆形的洞, 然后将肿瘤拉过, 将肿瘤暴露在光源上。将孔切成比肿瘤稍小的切口, 防止肿瘤从孔中回落, 最大限度地减少相邻、非肿瘤皮肤的转化。
  6. 将肿瘤直接置于光源下方, 并在200mw 功率下使用 405 nm 光源进行5分钟的光转换。
  7. 光转换24小时后, 对小鼠进行安乐死, 如步骤1.3 中所述。收集肿瘤, 臂部 dln, 腹股沟非排水 ln 到 pbs。按照步骤1.3 中的描述, 用剪刀将肿瘤从周围皮肤上剪掉, 并取出 ln。

7. 流式细胞术的肿瘤和淋巴结处理

  1. 从肿瘤中创建单个细胞悬浮液: 用剪刀将肿瘤切割成一个24孔板的井, 其中含有 1 mgml 胶原酶 d 和 80 uml dnase 稀释在 hbss 中。在37°c 下培养 1小时. 通过70μm 尼龙过滤器压住消化过的组织。
  2. 如步骤5.2 中所述, 创建淋巴结的单个细胞悬浮液。

8. 流式细胞仪抗体染色

  1. 在将组织消化成单个细胞悬浮液后, 执行标准的流式细胞术染色技术, 用感兴趣的标记标记细胞。简单地说, 将 2 x 106个细胞放入96孔板中。用 fc 块 (1μgml) 在冰上加用样品 20分钟;用 fac 缓冲液清洗两次 (pbs 中1% 的牛血清白蛋白)。在样品中加入活的/死的污渍 (在 pbs 中稀释), 在冰上孵育 15分钟;用 mac 缓冲液清洗两次。用原生抗体 (材料表) 在 fac 缓冲液中稀释30分钟在冰上进行;用 mac 缓冲液清洗两次。
    注: kaede green 和 kaede 红色荧光与 fitc 和 pe 荧光重叠;因此, fitc 和 pe 共轭抗体不能与 kaede 蛋白结合使用。
  2. 染色后, 在流式细胞仪上运行样品。或者, 使用2% 的 pfa 固定单元格。

9. 流式细胞仪分析

  1. 使用前体内kaede green 或 kaede 红色单色花细胞或血液将 fitc (kaede green) 和 pe (kaede red) 通道 pmt 电压设置为总范围的 70-80% (中心人口约为 104)。
    注意: 不要补偿凯德绿色 (fitc) 和 kaede 红色 (pe) 通道, 因为这将导致更大的信号传播。
    1. 要创建单色凯德控制, 收集脾脏或血液从凯德-tg 鼠标。用 ack 缓冲液将红血球分开, 然后将细胞分成两组: 未转换的 kaede 绿色和转换的 kaede 红色。
    2. 对于单色 kaede 红色控制, 悬挂 pbs 1 毫升中的细胞, 并在24孔板中使用 405 nm 光源, 以 100 mL 的功率进行5分钟的光转换。使用这些单元在流式细胞仪上设置 kaede green (fitc) 和 kaede 红色 pmt 电压 (步骤 9.1)。
  2. 一旦凯德蛋白的电压设置好, 就可以根据制造商的说明, 使用带有补偿珠标签的单荧光机标记来补偿所有其他主要抗体污渍。
  3. 在流式细胞仪上运行样本以收集数据。
    注意: 凯德蛋白是由细胞不断产生的。这意味着光转换后 24小时, 转换后的细胞将是双阳性的凯德绿色和凯德红色新合成的凯德 (绿色) 蛋白已在细胞中积累。
  4. 使用 flowjo 软件或类似软件分析数据。

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Representative Results

我们首先试图复制发表在文献中的光转换结果, 以评估效率, 并确定相关的炎症在小鼠皮肤。耳朵 pinna 暴露在 100 mw 紫罗兰色光 (405 nm) 3分钟之前所述的 33.暴露后立即从耳皮或宫颈 dln 产生的单个细胞悬浮液显示, 皮肤中所有 cd45+白细胞的转化效率为 78%, 在 dln 中没有观察到转化细胞 (图 1a)。为了评估与光转换相关的炎症反应, 我们量化了转换后0和 24小时 (图 1b) 中浸润的 cd45 + 白细胞的数量 (图 1b) 和血管通透性的急性变化由米莱的检测42 (图 1c)。简单地说, 200μl 的0.5% 埃文斯蓝被注射膜外注射2小时后的光转换。注射30分钟后收集耳朵, 用甲酰胺在55°C 下提取埃文斯蓝 24小时 (吸收率为 610nm 42)。cd45+浸润 (24小时) 和血管泄漏 (2小时) 在光转换后显著增加, 这表明即使在这种短暂的曝光下, 光转换本身也可能影响组织特异性炎症反应。与 nd45+浸润 (图 1b) 和血管泄漏 (1.4μg/e±0.75) 在感染41后24小时提供了紫罗兰色光引起的炎症程度的背景 (0.08μg/e22±0.01)。

虽然在各种研究中使用了几个模型来跟踪非淋巴、外周组织的白细胞出口, 但目前尚不清楚这些方法在跟踪特定种群时跟踪其离开皮肤的能力方面如何进行比较。因此, 我们决定对两种常用的方法进行直接面对面的比较, 以跟踪 ln、fitc 涂料和体内光转换的直流出口, 从而评估每种定量方法的效率和特异性。分析直流出口在稳定状态, 在皮肤炎症期间, 并从感染的皮肤。每次分析时, 皮肤都接受了经皮 fitc 的应用, 或暴露在 100 mw 405 nm 光下 3分钟, ln dc 种群被定义为 cd3-cd19-mhcii+ cd11c+ , 并进一步分层为 1) mhciihi cd11cint dc,它为迁移 dc (mdc) 提供丰富的 cd103+ batf3 依赖的交叉呈现 dc 和 cd11b+真皮 dc;mhciiintcd11chi 的 dc , 它丰富了居民 dc (rdc), 包括 cd8α + batf3 依赖的交叉呈现 dc (图 2 a).在 fitc 应用或光转换24小时后, 标记的单元在排水过程中很容易检测到, 但不是非排水的 ln (图 2b)。为了量化 dc 迁移到 ln 的程度, 同时确定标记迁移人口和非居民 ln 种群的方法的特异性, 我们在应用 dbp 24小时后, 对处于稳定状态的 mdc 和 rdc 进行了标记,和48小时后, 真空 v 的破坏 (图 2c)。虽然光转换 (kaede) 和 fitc 在所有条件下都标记了 mdc, 但我们观察到, 在 dln 中, fitc 标记的 fitc 比 kaede-stedd 标记的 mdc 要多, 但 vacv 感染除外, 这两种方法量化了类似的出口水平。此外, 在 dbp 的情况下, fitc 还标记了 rdc 群体, 其中光转换仍然是 mdc 特有的 (图 2c)。使用这两种方法, 我们观察到大约 200个 dc 从 vacv 感染皮肤的出口, 重要的是指出, 这一程度的出口重述了以前公布的调查结果使用透皮性 fitc 应用程序由loo 等人。41. 因此, 根据炎症情况, 经皮 fitc 的应用可能会增加在 dln 中检测到的标记 dc 的数量, 并导致非迁移性 ln 居民 dc 人群的非特异性标记, 同时进行光转换特别确定 dc 属于 mdc 种群。

kaede-tg 小鼠被用来量化5、33、43和5、6、35、38 皮肤、黏膜和淋巴组织在稳定状态和发炎条件下, 只适用于肿瘤在一个单一的出版物, 其中肿瘤植入皮内进入小鼠耳朵, 并在小体积39的光转换。因此, 我们试图评估体内光转换的效用, 定量白细胞出口从已建立的, 大的原发肿瘤, 以实现进一步的免疫假设测试。首先, 我们在左肩骨和右肩周炎之间的凯德-tg 小鼠体内植入 mc38 肿瘤细胞。植入肿瘤模型使肿瘤能够精确定位, 以确保淋巴引流到已知的 ln;放置在上背部皮肤的肿瘤主要向左、右臂 ln 排出。达到100-150 毫米3后, 肿瘤被光转化 (10分钟, 200 mw), 肿瘤和 dln 在光转换后立即被收获。流式细胞术分析显示, 肿瘤内 cd45+ 细胞从 kaedegreen +向 kaede红色 +显著转换 (69%;图 3a), 但重要的是, dln 对 kaede 红色+细胞保持负数。光转换 yumm1.7 肿瘤的免疫荧光显微镜显示, 光转换深入肿瘤组织 (& gt;1 mm;图 3b)。有趣的是, 皮肤和血管细胞表达高水平的 kaede 蛋白导致这些细胞类型的高光转换效率, 如图3b 所示。这种高凯德红色表达使它很难识别免疫细胞 (既未转换和转换) 使用免疫荧光显微镜。

鉴于我们对黑色素瘤免疫学的特别兴趣, 我们接下来使用各种植入小鼠肿瘤细胞系评估了肿瘤大小和黑色素对光转化效率的影响: mc38 (无色素的结直肠癌系), b16。f10 (产生黑色素瘤的线), yumm 1.1 (无色素黑色素瘤线) 和 yumm 1.7 (无色素黑色素瘤线)44。如上文所述, 这些线中的每一条都被植入凯德-tg 小鼠体内并进行了光转换, 并在各种肿瘤体积 (50-650 毫米3) 中进行了光转。这些肿瘤是在光转换后立即被采集的, 并通过流式细胞仪评估了凯德红色 cd45+白细胞的存在。有趣的是, cd45+白细胞的光转换效率在肿瘤类型和大小之间差异显著 (图 3c)。小 ( 50-150 毫米3) yumm 1.7 和 yumm 1.1 肿瘤内的 cd45 + 白细胞分别显示出最有效的光转换率, 分别为80% 和60%。随着这些肿瘤体积的增加, 大肿瘤的转化效率下降到50% 左右 (> 600 毫米3)。黑色素对光转换效率有显著影响: 在产生黑色素的 b16 中, cd45+细胞的最大光转换。f10 肿瘤仅在30% 左右, 下降到 10%, 因为肿瘤的体积达到400毫米3。有趣的是, 对肿瘤内 cd8+ t 细胞的分析显示, 在小肿瘤中, 这些细胞的光转换效率接近 80-90%, 而不考虑黑色素的产生 (图 3d)。对于未着色的肿瘤, cd8+ t 细胞转化率仍然很高, 即使肿瘤达到大体积, 但随着黑色素存在时的大小明显下降。因此, b16 的效用。f10 小鼠黑色素瘤, 和其他产生黑色素瘤的线, 可能仅限于小肿瘤 (50 毫米3), 这与黑色素在吸收光的生物学功能是一致的。为了评估与肿瘤光转换相关的炎症反应, 我们量化了未转化肿瘤和转化肿瘤光转换24小时后 cd45+细胞的数量 (图 3e)。与未转化的肿瘤相比, 光转换24小时后在肿瘤中检测到的 cd45+细胞总数没有显著差异。

接下来, 我们用 kaede-tg 小鼠对肿瘤微环境中的白细胞出口进行量化, 从而可以询问骨髓和淋巴细胞类型的贩运行为。mc38 或 yumm 1.7 肿瘤细胞在皮内植入开德-tg 小鼠体内。肿瘤被光转换了一旦容量到达100-150 毫米3 (5分钟, 200 mw);光转换24小时后采集臂部 dln 和腹股沟非排水 ln。从 mc38 和 yumm1.7 肿瘤中进行定量, 将其植入对照 c57bl变6小鼠体内, 并在肿瘤达到 100-150 mm3后采集。我们通过流式细胞术评估肿瘤和诱导人群中的白细胞复杂性: t 细胞 (cd3 +cd4 +/cd8+/)、b 细胞 (cd3-cd19 +)、dc (cdsd1c+mhcii + cd11b+/)、中性粒细胞 (cd11b+mhci-ly6g+)、巨噬细胞 (cd11b+mhcii+ fne/80+) 和炎性单核细胞 (cd11b+ly6g-ly6c+);图 4 a)。使用同样的门控方案, 我们评估了 dln 中表示 kaede 红色的每个白细胞群的百分比, 表明以前居住在肿瘤微环境中 (图 4b)。有趣的是, 虽然 mc38 (图 4c) 和 yumm 1.7 (图 4C) 肿瘤主要与骨髓细胞 (单核细胞、dc 和巨噬细胞) 浸润, 但从两种肿瘤类型中支持的细胞中, 约有50% 是 t淋巴细胞 (cd4+和 cd8+)。除了 t 细胞, 我们还观察到 dc, b 细胞和单核细胞在偏离脂肪的人群中从肿瘤, 但巨噬细胞和中性粒细胞没有检测到从这两种肿瘤类型。总之, 这一数据表明了 kaede-tg 光可转换小鼠在内源性环境中跟踪多个白细胞谱系的效用。此外, 我们的分析表明, 出口是一个选择性的, 积极的过程, 可能有重要的意义, 以确定肿瘤内白细胞的复杂性。

Figure 1
图 1: 小鼠皮肤的光转换效率和相关炎症.小鼠真皮在 100 mw (405 nm 光) 下被光转换3分钟。 (a)具有代表性的流图, 描绘光转换 (kaedered +) cd45+细胞, 在光转换后立即从未转换和转换的耳朵和宫颈 dln。种群被预先设定在活的 cd45+单细胞上。(b)未转化的耳朵 (-)、光转换后立即采集的耳朵、光转换后24小时采集的耳朵和真空病毒感染后24小时采集的耳朵 (n = 3) 中 cd45+细胞总数的枚举。(c)在暴露于405纳米光 (3分钟, 100 mw) 后, 立即进行了 mile 检测, 以量化血管泄漏。耳皮渗漏的代表性图像 (左) 和提取染料的定量 (右) (n=3 3)。错误条表示 sem. *p & lt;0.05 和 * *p & lt;0.01。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 来自天真、发炎和受感染皮肤的直流出口。(a)确定移民区的分证计划;mhciihicd11cint) 和常驻 dc (rdc;mhciihicd11chih)。(b)具有代表性的流量图, 表明在 mdc 上预先注明的 fitc+或 kaede 红色+ dc, 来自感染了 vacv (dln) 或对侧非排水 ln 控制的小鼠。(c)在稳态 dln、dbp 发炎 (24小时后申请) 和真空病毒感染皮肤 (48小时后感染) 的情况下, 对 kaede + 和 fitc + mdc 和 rdc 的数量进行量化。错误条表示 sem. 请点击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 肿瘤微环境中的光转换效率.肿瘤在 200 mw (405 nm 光) 下被光转换10分钟。(a)在光转换后立即在未转换和转换的 mc38 肿瘤和臂部 dln 中绘制 kaede green 和 kaede 红色的代表性流图。种群被预先设定在活的, cd45 + 单细胞.(b)冷冻、oct 嵌入 yumm 1.7 肿瘤的免疫荧光显微拷贝既未转化又光转化。结垢 = 200μm. (c) cd45 + 白细胞和(d) cd8+淋巴细胞在黑色素产生中的转化效率 (b16)。f10) 和无色素 (mc38, yumm 1.1, yumm 1.7)。每个点表示一个鼠标。(e)未转化肿瘤和光转形成肿瘤光转换24小时后 (n = 3) 中 cd45+细胞总数的计数。错误条表示 sem. 请点击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 肿瘤微环境中的白细胞出口是选择性的。(a)识别 mc38 dln 中的骨髓和淋巴群的分型方案。(b)在 mc38 dln 光转换24小时后, 在 mc38 dln 中识别骨髓和淋巴细胞中 kaede 红色+细胞的代表性流图。流动图中的百分比表示在 ln ( c, d)指示的父白细胞群中, kaede 红色+细胞的频率 (c, d) 表达了肿瘤内 (占 cd45 + 细胞的百分比) 和支持的人 (% kaede红色 +细胞);来自 mc38 (c, n = 3) 和 yumm 1.7 (d, n = 4) 肿瘤的白细胞。请点击这里查看此图的较大版本.

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Discussion

尽管外周、非淋巴组织的白细胞出口对免疫反应的启动和解决至关重要, 但控制出口的分子机制却鲜为人知。这种知识差距在很大程度上是由于可随时提供在体内进行量化的工具。在这里, 我们描述了使用光敞篷小鼠 (kaed-tg) 量化皮肤和肿瘤的白细胞出口, 并提供了一个直接的面对面比较与 fitc 油漆在炎症和感染模型。我们证明, 虽然这两种模型跟踪内源性 dc 种群, fitc 的自由引流和非吞噬细胞的吸收不良限制了 fitc 涂料的效用, 广泛分析骨髓和淋巴出口从外周, 非淋巴组织, 包括肿瘤。此外, 我们提出的数据表明, 从肿瘤的出口是选择性的, 而不是随机的, 从而证实了由 torcelan等人提出的发现。39. 对控制肿瘤白细胞出口机制的进一步研究可能会揭示对肿瘤相关炎症和免疫的新见解。

我们首先评估了小鼠皮肤的光转换效率及其对局部炎症的影响时, 使用的设置报道的文献。在 100 mw 功率下, 耳朵暴露在紫罗兰色的光线下 3分钟, 可有效地在耳皮 (78%) 内实现 cd45+细胞的光转换, 而下游 dln 中不会进行转换。文献中的报告表明, 3-5分钟的接触对皮肤组织是最佳的5,33,38。然而, 这种暴露导致更多的 cd45 + 细胞在耳朵 pinna 24小时后的转换和血管泄漏表明, 在这些设置下, 在这些设置的光转换引起局部炎症,这应该考虑当解释数据。接下来, 我们试图使用 kaede 光转换和更广泛使用的 fitc 油漆检测 23,24在稳态, 在 dbp 引起的炎症, 并从真空 v 感染的耳朵直接比较 dc 贩运与 ln。我们观察到, 与在 dbp 治疗后的光转化皮肤相比, fitc 治疗的标签较高。对皮肤应用免费的 fitc 可导致通过淋巴管直接排水, 以排出不迁移的居民直流人口 (例如cd8 α+ dc) 样本 fitc 的 ln。与此相一致的是, 我们观察到大量带有 fitc 标签的 rdc, 当使用刺激性 dbp 处理时。相反, 在光转换后的 mdc 群体中只观察到了 kaede 红色标记的 dc, 这表明光转换为标记 mdc 提供了一种更具体的方法。然而, 即使在 mdc 群体中, 我们在使用 fitc 而不是光转换时, 也在数量上观察到更多的标记 mdc。虽然这也可以用免费的 fitc 排水来解释, 但标签期间的差异有可能, 在标签期间, 光转换只能给目前居住在皮肤中的 dc 贴上标签, 而 fitc 在24小时期间一直留在皮肤中, 说明了观察到的 mdc 出口的差异。有趣的是, 在病毒感染的情况下, 光转换和 fitc 应用测量了相对相等的 mdc 出口水平, 在排水感染了真空的耳朵的 ln 中很少有 fitc + rdc.我们最近报告说, 在真空 v 感染后, 淋巴引流显著减少, 因此, 病毒诱导的淋巴转运减少可能会提高 fitc 涂料的特异性, 并减少 ln 居民 dc 人群的标签 31.重要的是, 这项工作还突出表明, 在 mdc 人口中 (cd3-cd19-mhciihi hi cd11c int), 在24小时内积极迁移的 dc 数量是一个较小的群体, 因此整个 mdc 数量也是如此.数字不是主动迁移的好替代品41。最后, 值得注意的是, 在 vacv 感染41后的任何24小时内, 我们都会持续量化大约200个细胞的 mdc 出口, 而 1500-2000 dc 则从肿瘤微环境中退出。鉴于 vacv 作为疫苗平台的巨大功效, 特别是在通过45、46、47的恐吓应用时, 可以说是 dc 的质量, 也许还有 dc 的类型提出抗原, 而不是数量, 这决定了强大的保护性免疫。

在 dc25,48 之外, 肿瘤微环境中的白细胞出口仍然是一个调查不力的地区。虽然肿瘤被认为是慢性炎症微环境, 类似的机制是否调节细胞出口从非恶性和恶性组织仍然是未知的。此外, 肿瘤中的白细胞出口是随机的还是选择性的, 对解释肿瘤微环境中白细胞的积累和保留具有重要意义。因此, 白细胞从肿瘤中退出可能是关键, 了解肿瘤如何逃避免疫监测, 并导致新的免疫治疗策略。在这里, 我们应用光转换 kaed-tg 模型来研究白细胞出口从植入皮肤肿瘤, 其中 fitc 油漆将不足以广泛标记骨髓和淋巴种群。初步研究表明, 植入肿瘤的光转换效率取决于肿瘤大小和黑色素。而光转换效率迅速下降, 随着肿瘤的生长, 当黑色素存在 (b16。f10), 非色素肿瘤线, 如 yumm 和 mc38 肿瘤表现出更稳定的转换效率, 在肿瘤大小测试。有趣的是, 我们观察到 cd8+ t 细胞室的转化效率提高, 而 cd45+细胞随着肿瘤大小的增加而下降。可能有几个因素促成了这一观察。首先, 肿瘤内的位置会影响接触, 从而影响特定细胞类型的转化效率。在植入肿瘤模型中, t 细胞经常被局限于皮肤肿瘤界面, 因此相对于浸润肿瘤实质的骨髓细胞, t 细胞可能更容易光转换。其次, 并非所有白细胞都表达了相同水平的 kaede 蛋白49 , 因此流式细胞仪可能并不都能同样检测到;这可能会导致在分析更异质的细胞群 (如所有 cd45+ 细胞)时观察到的光转换百分比降低。最后, 需要注意的是, 图 3中显示的数据是在紫罗兰色光照射10分钟后生成的。这最初的接触时间是根据文献中引用皮肤、ln、粘膜组织和肿瘤5, 6、33、35的各种器官的光转换时间的报告选择的 ,39,43。唯一的其他研究使用光转换系统在肿瘤, 光转换进行了 20分钟 39.我们手中的进一步优化显示, 无论是小批量还是大批量, 曝光时间都缩短了 5分钟, 从而提高了效率。长时间接触很可能会导致凯德荧光的光漂白, 因此, 我们报告的转化效率可能被低估了。长时间接触也可能导致与光转换相关的炎症增加和混淆的研究结果。与未转化的肿瘤相比, 光转换24小时后肿瘤光转换的肿瘤光转换在肿瘤内 cd45 + 细胞数量无显著性差异。此外, 肿瘤光转换5分钟显示可测量和可重现的出口为骨髓和淋巴群。因此, 在特定组织或感兴趣的肿瘤内进行单独优化是必要的, 以获得最佳结果。

最后, 我们使用原位光转换来量化植入开德-tg 小鼠的肿瘤的内源性白细胞出口。利用两种不同的植入、非色素化肿瘤模型, 我们观察到 dc、t 细胞和单核细胞的显著出口。与最近发表的工作39一致, cd4+和 cd8+ t 细胞都来自肿瘤微环境, 同时还有大量的双阴性 cd3 + t 细胞.至少, 如前面所述, 这一种群的一个组成部分可能是伽玛三角洲t 细胞, 尽管这一观测的功能意义仍有待确定。重要的是, 当我们比较从肿瘤中诱导的白细胞的比例与肿瘤微环境中白细胞的相对比例时, 我们观察到, 在这两种模型都表明选择性白细胞退出。值得注意的是, 在被隔离的人群中, 巨噬细胞和中性粒细胞是不存在的, 尽管这两种细胞类型都被描述为在发炎和感染的条件下出口 2,50,51,52,53,54是细胞内白细胞前只的重要贡献者 39, 55,56.因此, 白细胞从肿瘤出口可以量化使用光可转换模型, 不是随机的, 而是一个调节的过程, 仍然是一个重要的和研究不足的生物学, 具有重要的意义, 了解炎症和免疫动力学在肿瘤微环境中处于稳定状态, 并对治疗做出反应。

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Disclosures

提交人没有冲突可供披露。

Acknowledgments

作者感谢 marcus bosenberg 博士提供 yumm 1.1 和 yumm 1.7 小鼠黑色素瘤线, 并感谢 deborah j. fell 博士提供 b6。cg-tg (cag-g-tdKaede)15Utr 小鼠通过日本 mext 的国家生物资源与 riken brc 达成一致。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase D Roche 11088866001
DNase Roche 4536282001
Silver-LED-405B light source with optical fiber and collimtor Prizmatix Ltd V8144
Fluorescein isothiocyanate isomer I Sigma-Aldrich F4274
dibutyl phthalate Sigma-Aldrich 524980
acetone Macron Fine Chemicals 2440-02
29-guage syringes Exel International 26029
Evans Blue Sigma-Aldrich E2129
70 um cell strainers VWR 732-2758
paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
HBSS Caisson HBL06
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit Invitrogen L34966
Purified Anti-mouse CD16/CD32 Tonbo Biosciences 70-0161-M001
BV605 CD11c (clone N418) Biolegend 117334
PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2) BD Pharmingen 562363
BV421 CD3e (clone 145-2C11) Biolegend 100341
APC CD8a (clone 53-6.7) TonBo Biosciences 20-0081-u100
APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11) Biolegend 103116
BV650 CD19 (clone 6D5) Biolegend 115541
PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4) Biolegend 128011
Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8) Biolegend 123121
APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8) Biolegend 127623
BV711 CD11b (clone M1/70) Biolegend 101241
BV605 CD45 (clone 30-F11) Biolegend 103155
BV711 CD4 (clone RM4-5) BD Biosciences 563726
Bovine serum albumin (Fraction V) Fisher Scientific BP1600-100
Anit-Rat and Anti-Hamster Igk / Negative Control Compensation Particle Set BD Biosciences 552845
Fortessa Flow Cytometer BD Biosciences
FlowJo v10 Software FlowJo

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生物学 第143期 淋巴血管 出口 贩运 凯德 fitc 油漆 白细胞 黑色素瘤
小鼠皮肤和肿瘤淋巴血管白细胞出口的定量
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