Summary
Aquí, demostramos los métodos de cuantificación en vivo de la salida de leucocitos de ingenuo, inflamado y mala piel murina. Realizamos una comparación directa de dos modelos: photoconversion de aplicación y en situ FITC transdérmica. Además, demostramos la utilidad de photoconversion para el seguimiento de salida de leucocitos de tumores cutáneos.
Abstract
Salida de leucocitos de tejidos periféricos a los ganglios linfáticos drenantes no sólo es fundamental para la vigilancia inmune e iniciación sino también contribuye a la resolución de las respuestas del tejido periférico. Mientras que una variedad de métodos se utilizan para cuantificar la salida de leucocitos de tejidos no-linfoides, periféricos, los mecanismos celulares y moleculares que rigen la salida dependiente del contexto siguen siendo mal entendidos. Aquí, describimos el uso de photoconversion en situ para el análisis cuantitativo de la salida de leucocitos de piel murina y tumores. Photoconversion permite la directa etiquetado de leucocitos residente dentro del tejido cutáneo. Aunque la exposición a luz ultravioleta induce local las respuestas inflamatorias caracterizan por infiltrados de leucocitos y filtración vascular, en una comparación directa con aplicación transdérmica de trazadores fluorescentes, photoconversion específicamente etiquetado las poblaciones migratorias dendrítico de la célula y al mismo tiempo permitió la cuantificación de salida mieloide y linfoide de microambientes cutáneas y tumores. Los mecanismos de salida de leucocitos siguen siendo un componente faltante en nuestra comprensión de la complejidad de leucocito intratumoral, y así la aplicación de las herramientas descritas en este documento proporcionará una visión única en la dinámica de tumor inmunes microambientes ambos en constante estado y en respuesta a la terapia.
Introduction
Las respuestas inmunitarias de tejido periférico están conformadas no sólo por el reclutamiento de leucocitos a los sitios de inflamación, sino también por los mecanismos que regulan su retención posterior. Por lo tanto, inmunidad protectora es dictada por acumulativos mecanismos celulares y moleculares que determinan si entra a un leucocito, permanece dentro, o más bien emigra de tejido periférico vía los recipientes linfáticos. Lo importante es la propensión de leucocitos al tejido a través de vasos linfáticos (denominada salida) la salida está ligada a sus funciones especializadas. Las células dendríticas (DC) adquieran comportamiento migratorio en respuesta a señales de maduración conduce al transporte del antígeno y presentación en el drenaje de los ganglios linfáticos (dLN), un proceso que es necesario para la inmunidad adaptativa1. Barrido de las células mieloides, tales como los macrófagos y neutrófilos, sirven para limpiar escombros de apoptosis a través de la fagocitosis. Durante una infección bacteriana, neutrófilos salida del tejido y en última instancia sufren apoptosis en dLNs2 y en un modelo de colitis inducida por DSS, datos apoyan la hipótesis de que la salida de macrófagos es necesaria para resolver la inflamación local3. Si se produce la salida de neutrófilos y macrófagos en todos los contextos inflamatorios, sin embargo, se desconoce. Evidencia de la salida de linfocitos T de estado estacionario4,5,6,7, infectados8y inflamada4,9,10, 11,12 los tejidos no-linfoides, periférico indica que las células T se recirculan activamente, aunque mal entendidas las señales basadas en el tejido que esta salida. Varios estudios han identificado las señales necesarias para la migración direccional hacia los capilares linfáticos de drenaje y posterior salida incluyendo chemokine (C-C motif) ligando 21 (CCL21) y su receptor CCR74,11, 13, ligando de chemokine (adorno de C-X-C) 12 (CXCL12) y su receptor CXCR42,14y esfingosina-1-fosfato (S1P)10,15,16. Sin embargo, estos mecanismos no están activos en todos los contextos, y si determinan la salida de todos los tipos de la célula sigue siendo una incógnita. Lo importante, más penetración en los mecanismos que rigen la salida y su relevancia funcional en la enfermedad requiere cuantitativa en vivo métodos de análisis.
Varios métodos se han utilizado para cuantificar la salida en varios modelos animales en vivo , incluyendo la canulación directa de los vasos linfáticos, transferencia adoptiva de ex vivo etiquetados leucocitos, aplicación transdérmica de trazadores fluorescentes, inyección de partículas marcadas y en vivo photoconversion17,18. La canulación directa de los vasos linfáticos aferentes ratón es difícil y limitado en pequeños animales por los volúmenes de líquido que puede ser acumulado. Así, la canalización se ha realizado en gran parte en grandes animales (e.g., ovejas) donde tales manipulaciones quirúrgicas son prácticas. Estos estudios proporcionan evidencia directa de la presencia de células linfoides y mieloides en linfa10,19,20. Además, ovinos modelos revelan que la inflamación aguda y crónica incrementaron la presencia de linfocitos en los ganglios linfáticos casi 100-fold10,21.
Transferencia adoptiva de linfocitos genéticamente manipulados y etiquetados ha revelado lo importante que CCR7 se requiere para la salida de CD4+ T de las células de la piel agudo inflamada5,11, mientras que el tratamiento previo de los linfocitos con la pequeña molécula agonista de receptor de S1P, FTY720, inhibe parcialmente su salida10. Curiosamente, la salida de linfocitos transferidos de piel crónicamente inflamada es CCR7-independiente10, pero puede requerir parcialmente CXCR49. Experimentos de transferencia adoptiva, sin embargo, entregan a números no fisiológica de ex vivo los linfocitos activados y etiquetados en tejido a través de la inyección, que altera el ambiente biomecánico de los tejidos y elevadas presiones de fluido intersticiales abrir los capilares linfáticos iniciales y alterar sus propiedades de transporte22. Como alternativa, aplicación transdérmica de isotiocianato de fluoresceína (FITC) en la presencia o ausencia de irritantes cutáneos (por ej., ftalato de dibutilo, DBP) o infección23,24 permite el seguimiento de los células fagocíticas que acumulan tracer y migran a dLNs. Del mismo modo, fluorescencia etiquetados tumores proporcionan un medio para rastrear las células fagocíticas que han engullido tumor material25. Estos métodos han proporcionado importante información sobre los mecanismos que gobiernan DC salida13,14,17,26,27 pero son incapaces de seguir no fagocíticas los linfocitos y, la interpretación se pueden complicar por drenaje linfático libre de FITC soluble así etiquetado no migratorias, DCs residente LN.
Por otra parte, la microscopia intravital es una poderosa herramienta que permite el seguimiento en vivo de las poblaciones de leucocitos fisiológicamente relevante en tiempo real28,29. Se usa en combinación con los ratones de reportero y basados en anticuerpos en vivo inmunofluorescente etiquetado intravital microscopía ha puesto de manifiesto el complejo espacial y dinámica temporal de inmune celular trata de personas, incluyendo migración intersticial30 , transmigración a través del endotelio linfático, pasaje dentro de la luz linfática y la migración a LN entrada28,31. Amplia adopción de técnicas de imagen intravital está limitado por el costo, conocimientos necesarios para la instalación y limitado rendimiento para la cuantificación de múltiples tipos de células. Todavía, acoplamiento de métodos cuantitativos que analizan la dinámica de la población los tejidos con la proyección de imagen intravital proporcionará visión mecanicista adicional e importante con respecto a los mecanismos de la movilidad y la migración hacia y dentro de los capilares linfáticos 18 , 31 , 32.
En consecuencia, photoconversion en vivo se ha convertido en un método que permite en situ etiquetado, independiente de la actividad fagocítica y para la cuantificación de la salida de leucocitos fisiológica (cuando está juntado con citometría de flujo) en el ausencia o presencia de desafío. Ratones de Kaede-Tg constitutivamente expresan una proteína aislada de corales pétreos que exhibe fluorescencia verde (Kaede verde) hasta que se expone a la luz violeta, después de lo cual convierte irreversiblemente a fluorescencia roja (Kaede rojo)33. Las células Photoconverted pueden ser rastreadas como que salida de sitios de tejido periférico y se acumulan en dLNs. Esto y otros similares photoconvertible ratón modelos34,35 han revelado importante biología incluyendo salida constitutiva de las células T reguladoras de piel36, salida de la célula de B de CXCR4-dependiente de placas de Peyer37 , movilización de las células T de memoria residente péptido nuevo reto38y salida amplia del leucocito de tumor microambientes39. En este documento, realizamos una comparación directa de photoconversion con aplicación de FITC transdérmica en el contexto de la inflamación cutánea e infección para permitir la comparación directa de los datos existentes con el método photoconvertible. Además, demostrar photoconversion en tumores implantados y describir la eficiencia de conversión y salida selectiva de microambientes de tumor. Por lo tanto, sostenemos que más aplicación de estos métodos es necesario dilucidar la biología fundamental de salida de leucocitos de tumores, que tendrá implicaciones significativas para interpretar la complejidad del leucocito de intratumoral, inmunidad antitumoral y respuesta a la terapia.
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Protocol
Animales todos los protocolos han sido aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso en la Oregon Health & Science University.
1. inducción de la inflamación y FITC pintura del pabellón de oreja de ratón
- En campana de flujo laminar, anestesiar un ratón C57Bl/6 con isofluorane vaporizado (inducir en el isofluorane 3-5% y se mantiene a 1-3% isofluorane; tasa de flujo de oxígeno en 0.5-1.0 L/min). Asegurar adecuada anestesia mediante el control de la pérdida del reflejo pedal, movimientos involuntarios y la reducción de la frecuencia respiratoria.
- Pone una oreja con el lado ventral de la oreja hacia arriba. Pipetear 20 μl de solución de FITC 5% disuelto en acetona 1:1: dibutil ftalato (DBP) en el lado ventral del pabellón auricular del oído. Permitir que el oído se seque durante unos segundos.
- 24 h después de la aplicación de FITC, eutanasia a los ratones mediante exposición de dióxido de carbono, seguido por dislocación cervical. Recoger el sistema del oído en PBS separando las orejas de la cabeza con unas tijeras. Recoge las dLNs cervical y LNs no drenaje inguinal en PBS con unas pinzas para separar el LNs de los tejidos circundantes. LNs no drenaje inguinal servirá como controles negativos para la presencia de leucocitos de /Kaede rojo+ +de FITC. Dispone de canales según el protocolo institucional.
Nota: El tiempo óptimo post photoconversion para el análisis dependerá el tipo de células y comportamientos migratorios conocidos. Las células dendríticas, por ejemplo, pueden detectarse en dLNs tan pronto como la aplicación de 6 h post DBP.
2. inducción de la inflamación y Photoconversion del pabellón de oreja de ratón
- En campana de flujo laminar, anestesiar un ratón de Kaede-Tg (fondo C57Bl/6) por inyección intraperitoneal de 80 mg/kg ketamina y xilacina de 10 mg/kg disuelta en solución salina. Asegurar adecuada anestesia como se describe en el paso 1.1.
- Pone una oreja con el lado ventral de la oreja hacia arriba. Pipetear 20 μl de un 1:1 acetona: DBP al lado ventral de la oreja del oído. Permitir que el oído se seque durante unos segundos.
- Después de la aplicación de la DBP, corte una ranura en un trozo de papel de aluminio y tire de la oreja a través de la ranura para exponer el oído a la fuente de luz violeta. Pone la oreja plana con el lado dorsal hacia arriba usando cinta de doble cara para asegurar el oído a la hoja.
- Coloque el oído directamente debajo de la fuente de luz y photoconvert de 3 minutos utilizando una fuente de luz de 405 nm en potencia de 100 mW.
- 24 h después de la photoconversion, eutanasia a los ratones de Kaede-Tg y cosechar los pabellones de la oreja, LNs cervical y LNs inguinal como se describe en el paso 1.3.
Nota: Además de consideraciones citadas en el paso 1.3, las tasas de proliferación determinará el tiempo de análisis como la pérdida de Kaede rojo ocurrirá en rápidamente dividir las células.
3. vacuna infección de oreja de ratón y aplicación de FITC
- Anestesiar un ratón C57Bl/6 con isofluorane vaporizado como se describe en el paso 1.1.
- Coloque el lado ventral de la oreja plana. Pipeta 5 x 106 unidades de placa-formación (PFU) del virus vaccinia (VacV) diluido en 10 μl de PBS en el pabellón de la oreja. Utilizando una aguja de calibre 29, asoman la oreja 25 veces40.
- infección después de 24 h, anestesiar ratones infectados VacV con isofluorane como se describe en el paso 1.1 y pipetee 20 μl 5% FITC disuelto en acetona en el lado ventral de la oreja del oído. Permitir que el oído se seque durante unos segundos.
- 24 h después de la aplicación de FITC, eutanasia a los ratones y recoger los pabellones del oído, LNs cervical y LNs inguinal como se describe en el paso 1.3.
Nota: FITC se puede aplicar en cualquier momento punto post infección determinar DC tráfico a diferentes intervalos de 24 h. Hemos divulgado previamente que migración de DC a dLNs se mantiene en niveles similares desde el día 1 a 3 post infección41.
4. vacuna infección de oreja de ratón y Photoconversion.
- Anestesiar un ratón de Kaede-Tg con isofluorane vaporizado como se describe en el paso 1.1.
- Infectar la oreja oreja con VacV como se describe en el paso 3.2.
- 24 h post infección, anestesiar ratones infectados VacV Kaede como se describe en el paso 2.1 y realizar photoconversion como se describe en los pasos 2.3-2.4.
- 24 h después de la photoconversion, eutanasia a los ratones y los pabellones de la oreja, LNs cervical y LNs inguinal de la cosecha como se describe en el paso 1.3.
Nota: Como se mencionó anteriormente en el paso 3.4, photoconversion puede ser administrada en cualquier infección de post de punto de tiempo.
5. oído y nodo de linfa por citometría de flujo
- Crear las suspensiones celulares solo de pabellones de la oreja: aparte pelar los lados dorsales y ventrales de la oreja del oído con dos pares de pinzas y el lugar en el interior de la oreja hacia abajo en los pocillos de una placa de 24 pocillos que contienen colagenasa 1 mg/mL D y 80 DNasa U/mL diluido en Tampón salino solución (HBSS de Hank) (contiene Ca2 + y Mg2 +). Incubar a 37 ° C durante 30 minutos Presione el tejido digerido a través de un colador de célula de nylon de 70 μm.
- Crear las suspensiones celulares solo de LNs: colocar LNs en pocillos de una placa de 24 pocillos que contienen colagenasa 1 mg/mL D y 80 DNasa U/mL diluido en HBSS. Tease Abra el nodo de linfa la cápsula usando dos agujas de calibre 29 y luego incubar los nodos de linfa a 37 ° C durante 30 minutos Presione el tejido digerido a través de un colador de célula de nylon de 70 μm.
6. intradérmica Melanoma Tumor implantación y Photoconversion.
- Afeitarse la piel desde el centro de la espalda de un ratón de Kaede-Tg use una afeitadora eléctrica.
- Coloque una aguja de calibre 29 en el centro de la espalda entre los omóplatos de la izquierda y superiores derecha e inyectar por vía intradérmica 5 x 105 células del tumor (diluidas en 50 μl de solución salina) en la piel de ratones de Kaede-Tg. Los tumores deben colocarse cuidadosamente para asegurar drenaje linfático a los ganglios especificados (es decir, izquierda y derecha braquial LNs para tumores colocado en medio de la espalda). Evite colocar el tumor encima de dLN como esto puede resultar en photoconversion directo del LNs a través del piel, tumor.
- Permitir que los tumores a crecer al tamaño deseado (100-650 mm3).
- Un día antes de la recogida de tejido, anestesiar un ratón de Kaede-Tg como se describe en 2.1 y afeite cualquier recién regrown piel alrededor del tumor.
- Corte un agujero circular en papel de aluminio y sacar el tumor a través de exponer el tumor a la fuente de luz. Corte el agujero ligeramente más pequeño que el tumor para evitar que el tumor de volver a caer por el agujero y minimizar la conversión de la piel adyacente, no tumor.
- Coloque el tumor directamente debajo de la fuente de luz y photoconvert durante 5 minutos usando una fuente de luz de 405 nm en potencia de 200 mW.
- 24 h después de la photoconversion, eutanasia los ratones como se describe en el paso 1.3. Recoger el LNs no drenaje inguinal, tumores y dLNs braquial en PBS. Corte los tumores de la piel circundante con unas tijeras y retire LNs como se describe en el paso 1.3.
7. tumor y ganglios linfáticos por citometría de flujo
- Crear las suspensiones celulares solo de los tumores: picar los tumores con las tijeras en los pocillos de una placa de 24 pocillos que contienen colagenasa 1 mg/mL D y 80 DNasa U/mL diluido en HBSS. Incubar a 37 ° C por 1 h. Presione el tejido digerido a través de un filtro de nylon de 70 μm.
- Crear suspensión unicelular de los ganglios linfáticos como se describe en el paso 5.2.
8. anticuerpos para citometría de flujo
- Después de digerir los tejidos en suspensiones celulares individuales, realizar técnicas de tinción estándar flujo cytometry para etiquetar las células con marcadores de interés. Brevemente, pipeta 2 x 106 células en una placa de 96 pocillos. Incubar las muestras con el bloque Fc (1 μg/mL) durante 20 min sobre hielo; lavar dos veces con tampón FACs (1% albúmina de suero bovino en PBS). Añadir mancha live/dead (diluida en PBS) a las muestras e incubar durante 15 min en hielo; lavar dos veces con tampón FACs. Incubar con anticuerpos primarios (Tabla de materiales) diluidos en tampón FACs durante 30 min en hielo; lavar dos veces con tampón FACs.
Nota: Kaede verde y Kaede fluorescencia roja se superpone con fluoróforos FITC y PE; por lo tanto, FITC y anticuerpos conjugados con PE no pueden utilizarse en combinación con proteínas de Kaede. - Después de la tinción, ejecutar las muestras en un citómetro de flujo. Por otra parte, fijar las células con 2% PDA.
9. Análisis de citometría de flujo de
- Establece el FITC (Kaede verde) y PE (Kaede rojo) canal voltajes PMT en 70-80% de la escala total (centro de población en aproximadamente 104) utilizando ex vivo Kaede verde o rojo de Kaede solo color esplenocitos o sangre.
Nota: No compensan el Kaede verde (FITC) y canales de Kaede rojo (PE) ya que ello en señal de mayor extensión.- Para crear controles de Kaede solo-color, recoger un bazo o sangre de un ratón de Kaede-Tg. Lisar los glóbulos rojos con tampón de ACK, entonces las células se dividen en dos grupos: instruido Kaede Kaede verde y se convierte rojo.
- Para el solo color Kaede controles rojo, suspender las células en 1 mL de PBS y photoconvert en una placa de 24 pocillos para 5 min utilizando las fuentes de luz a 405 nm con una potencia de 100 mW. Utilizar estas células para establecer el Kaede verde (FITC) y Kaede rojo voltajes PMT en el citómetro de flujo (paso 9.1).
- Una vez las tensiones para las proteínas de Kaede, compensar todas las otras manchas de anticuerpo primario utilizando solo-fluoróforo etiquetado como cuentas de compensación por las instrucciones del fabricante.
- Ejecutar los ejemplos en un citómetro de flujo para recopilar datos.
Nota: La proteína de Kaede continuamente está siendo producida por las células. Esto significa que 24 h después de photoconversion, se puede convertir células será doble positivo para Kaede verde y Kaede rojo como Kaede recién sintetizada (verde) proteína ha acumulado en la celda. - Analizar los datos mediante software FlowJo o un software similar.
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Representative Results
Primero intentamos replicar los resultados photoconversion publicados en la literatura para evaluar la eficacia y determinar la inflamación asociada en la piel de ratón. El pabellón de la oreja fue expuesto a la luz 100 de mW violeta (405 nm) para 3 minutos como se ha descrito33. Solo suspensiones celulares generados a partir de la piel del oído o dLNs cervical inmediatamente después de la exposición revelaron una eficiencia de conversión del 78% de CD45 todos+ leucocitos en la piel sin las células se observan en dLNs (figura 1A). Para evaluar la respuesta inflamatoria asociada a photoconversion, cuantificamos la cantidad de infiltración CD45+ leucocitos en oídos convertidas 0 y 24 h post conversión (figura 1B) y los cambios agudos en la permeabilidad vascular como medida de milla ensayo42 (figura 1). Brevemente, 200 μL de 0.5% de azul de Evans fue intravascularly inyectado 2 h después de photoconversion. Las orejas se recolectaron 30 min después de la inyección y el azul de Evans se extrajo con formamida durante 24 h a 55° C (absorbancia leer a 610 nm42). Ambos CD45+ (24 h) se infiltra y fuga vascular (2 h) se incrementaron significativamente después de la photoconversion, que indica que incluso en este corto de la exposición, photoconversion sí mismo puede afectar la respuesta inflamatoria de tejidos específicos. Comparación a CD45 (figura 1B) se infiltra en+ y fuga vascular (1,4 μg/oreja ±0.75) en VacV infectado oídos 24 horas post infección41 proporciona contexto para la extensión de la inflamación causada por la luz ultravioleta (0,08 μg/oreja ± 0.01).
Mientras que varios modelos se han utilizado en diversos estudios a la salida de leucocitos de tejidos no-linfoides, periférico, no está claro cómo estos métodos comparan en su capacidad de seguimiento de poblaciones específicas como que salen de la piel. Por lo tanto, decidimos realizar una comparación directa cara a cara de los dos métodos utilizados para realizar un seguimiento de salida de DC a LNs, FITC en vivo y pintura photoconversion, con el fin de evaluar la eficacia y la especificidad de cada método para cuantitativa Análisis de salida de DC en estado estacionario, durante la inflamación cutánea y de la piel infectada. Para cada análisis, la piel fue objeto de aplicación de FITC transdérmica o expuesta a 100 mW 405 nm la luz por las poblaciones de LN DC de 3 minutos se definieron como CD3ε–CD19–MHCII+CD11c+ y estratificó adicionalmente en 1) MHCIIHola CD11cint DCs, que enriquece de DCs migratorias (mDCs) ambos CD103+ BATF3-dependiente de la Cruz-presentación de DCs y CD11b+ DCs cutáneos; y 2) MHCIIintCD11cHola DCs, que enriquece de residente DCs (rDCs) incluyendo CD8α+ BATF3-dependiente de la Cruz-presentación DCs (figura 2A). 24 h después de la aplicación de FITC o photoconversion, las células marcadas eran fácilmente detectables en el drenaje pero no no drena LNs (figura 2B). Para cuantificar el grado de migración de DC a LNs y simultáneamente determinar la especificidad del método para el etiquetado de las poblaciones migratorias y las poblaciones no residentes de LN, cuantificamos etiquetados mDCs y rDCs en estado estacionario, 24 h después de la aplicación de DBP, y 48 h después de la escarificación de VacV (figura 2). Mientras que photoconversion (Kaede) y FITC etiquetan mDCs en todas las condiciones, observamos más marcado con FITC de Kaede-labeled mDCs en dLNs, con excepción de infección VacV donde los dos métodos cuantifican un nivel similar de salida. Además, en el contexto de DBP, FITC había etiquetado además las poblaciones de la rDC donde photoconversion seguía siendo específicos de mDCs (figura 2). Usando estos métodos, observamos la salida de aproximadamente 200 DCs de VacV infectan la piel y lo que es importante señala que este nivel de salida recapitula los resultados previamente publicados mediante aplicación de FITC transdérmica de Loo et al. 41. por lo tanto, dependiendo del contexto inflamatorio, aplicación de FITC transdérmica puede incrementar el número de etiqueta DCs en dLNs y resultado en las no específicas de las poblaciones no migratorias de DC LN-residente, mientras photoconversion identifica específicamente DCs caer en una población de mDC.
Ratones de Kaede-Tg se han utilizado para cuantificar la retención de leucocitos en5,33,43 y salida de5,6,35,38 cutánea, mucosa, y tejidos linfoides en constante estado inflamaron condiciones y aplicación a los tumores en una sola publicación donde los tumores se les implantó intradérmico en la orejas de ratón y photoconverted en pequeños volúmenes39. Así, se intentó evaluar la utilidad de photoconversion en vivo para la cuantificación de la salida de leucocitos de los tumores primarios grandes, establecidos para comprobar otras hipótesis inmunológica. En primer lugar, hemos implantado las células del tumor MC38 por vía intradérmica en ratones de Kaede-Tg entre la escápula izquierda y derecha. Modelos de tumor implantables permiten un posicionamiento preciso de los tumores para drenaje linfático a LNs conocido; tumores en la piel de la parte superior hacia izquierdo y derecha braquial LNs principalmente drenaje. Después de llegar a 100-150 m m3, los tumores eran photoconverted (10 min., 200 mW) y los tumores y dLNs cosechadas inmediatamente después de photoconversion. Análisis por citometría de flujo reveló importante conversión de intratumoral CD45+ células de Kaede verde+ a Kaede rojo+ (69%; Figura 3A), mientras que lo importante, dLNs seguía siendo negativo para células de Kaede rojo+ . Microscopia de la inmunofluorescencia de photoconverted YUMM 1.7 tumores reveló que photoconversion penetra profundamente en el tejido del tumor (> 1 mm; Figura 3B). Curiosamente, la piel y las células vasculares expresan altos niveles de la proteína de Kaede que conduzca a la eficiencia de alta photoconversion de estos tipos de celulares como se ve en la figura 3B. Esta expresión Kaede rojo alta hace que sea difícil identificar las células inmunes (ambos instruido y convertido) usando microscopia de la inmunofluorescencia.
Dado nuestro interés particular en la inmunología del melanoma, luego evaluamos el efecto del tamaño del tumor y de la melanina en photoconversion eficacia usando varias líneas celulares de tumor murino implantables: MC38 (unpigmented línea de cáncer colorrectal), B16. F10 (línea de melanoma productoras de melanina), YUMM 1.1 (línea de melanoma no pigmentado) y YUMM 1.7 (línea de melanoma no pigmentado)44. Cada una de estas líneas se implantó intradérmico en ratones de Kaede-Tg y photoconverted, como se describe anteriormente en varios volúmenes del tumor (50-650 mm3). Los tumores fueron cosechados inmediatamente después de la photoconversion y evaluados para la presencia de CD45 Kaede rojo+ leucocitos por citometría de flujo. Curiosamente, la eficacia de la photoconversion de CD45+ leucocitos variaron significativamente a través de los tipos de tumor y tamaños (figura 3). CD45+ leucocitos dentro pequeño (50-150 mm3) YUMM 1.7 y 1.1 YUMM los tumores demostraron la photoconversion más eficaz en el 80% y 60%, respectivamente. Aumento de los volúmenes de estos tumores, la eficiencia de conversión se redujo a alrededor del 50% para tumores grandes (> 600 mm3). Melanina tuvo un impacto sorprendente sobre la eficiencia de la photoconversion: photoconversion máxima para CD45+ de las células a producir melanina de B16. Los tumores F10 era solamente cerca de 30% y disminuyó a 10% como los tumores alcanzaron volúmenes de 400 mm3. Curiosamente, análisis de intratumoral CD8+ T células reveló photoconversion eficiencia de estas células en casi el 80-90% en tumores pequeños sin importar la producción de melanina (figura 3D). Para los tumores no pigmentados, CD8+ conversión de la célula de T se mantuvo alta así como los tumores alcanzaron grandes volúmenes, pero disminuida significativamente con el tamaño cuando la melanina estaba presente. Como tal, la utilidad de B16. Melanomas murinos F10 y otras líneas de melanoma productoras de melanina, pueden limitarse a pequeños tumores (50 m m3), que es consistente con la función biológica de la melanina en la absorción de luz. Para evaluar la respuesta inflamatoria asociada a la photoconversion de tumores, cuantificamos el número de CD45+ de las células en tumores no convertidos y tumores convertido 24 h post photoconversion (figura 3E). No vimos ninguna diferencia significativa en el número total de CD45+ las células detectadas en los tumores 24 h después de la photoconversion en comparación con tumores.
A continuación cuantificamos la salida de leucocitos de microambientes tumor utilizando ratones de Kaede-Tg, que permite la interrogación del comportamiento trata de ambos tipos de células mieloides y linfoides. Las células del tumor MC38 o YUMM 1.7 por vía intradérmica se implantaron en ratones de Kaede-Tg. Los tumores eran photoconverted una vez lleguen a los volúmenes entre 100-150 mm3 (5 min, 200 mW); dLNs braquial y LNs no drenaje inguinal se recolectaron 24 h después de la photoconversion. Se cuantificaron las poblaciones de leucocitos intratumoral de MC38 y YUMM 1.7 tumores implantan en el control de ratones C57Bl/6 y recogidos los tumores alcanzado 100-150 m m3. Se evaluó la complejidad de leucocitos dentro de los tumores y las poblaciones haya retirado por citometría de flujo: las células T (CD3ε+CD4+-CD8+-), las células de B (CD3ε–CD19+), DCs (CD11c++CD11b MHCII+- ), neutrófilos (CD11b+MHCII–Ly6G+), macrófagos (CD11b+++de F4/80 de MHCII) y monocitos inflamatorios (CD11b+Ly6G–Ly6C+; Figura 4A). Utilizando este mismo esquema bloquea, evaluamos el porcentaje de cada población de leucocitos en dLNs que Kaede rojo indicando la residencia anterior en microambientes de tumor (Figura 4B). Curiosamente, mientras ambos MC38 (figura 4) y tumores YUMM 1.7 (figura 4) fueron principalmente infiltrados con las células mieloides (monocitos, DCs y macrófagos), aproximadamente el 50% de las células que habían haya retirado de ambos tipos de tumores T linfocitos (ambos CD4+ y CD8+). Además de las células T, también observamos DCs, las células de B y monocitos dentro de las poblaciones haya retirado de los tumores, pero los macrófagos y neutrófilos no fueron detectadas de cualquier tipo de tumor. En conjunto, estos datos muestra la utilidad de los ratones photoconvertible Kaede-Tg para el seguimiento de múltiples linajes de leucocitos en un ambiente endógeno. Además, nuestro análisis indica que la salida es un proceso selectivo y activo que puede tener implicaciones significativas para determinar la complejidad de leucocito intratumoral.
Figura 1: eficiencia de la Photoconversion y asociada a inflamación en la piel murina. Dermis murino fue photoconverted durante 3 min a 100 mW (luz de 405 nm). Diagramas de flujo representativo (A) que representan photoconverted (Kaede rojo+) CD45+ las células de un oído convertido y no convertido y dLN cervical inmediatamente después photoconversion. Las poblaciones fueron previamente cerradas por vivir, CD45+ células. (B) enumeración de CD45 total+ de las células en los oídos (-), orejas recogidas inmediatamente después de photoconversion, orejas recogidas 24 h después de photoconversion y orejas recogidas 24 h después de la infección VacV (n = 3). (C) análisis de una milla fue realizado para cuantificar la filtración vascular inmediatamente después de la exposición a la luz de 405 nanómetro (3 min, 100 mW). Imagen representativa de salida en la piel del oído (izquierda) y cuantificación de tinte extraído (derecha) (n = 3). Barras de error representan SEM. *p< 0.05 y **p< 0.01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: salida DC de ingenuo, inflamada e infectadas de la piel. (A) esquema de Gating identificar migratorias DCs (MDC; MHCIIHolaCD11cint) y residente (rDCs; MHCIIHolaCD11cHola). (B) flujo representativo parcelas indicando FITC+ o Kaede rojo+ DCs, pre-gated en MDC, de los ratones infectados con VacV (dLN) o LN no drenaje contralateral controles. (C) la cuantificación de los números de Kaede rojo+ y FITC+ MDC y rDCs en dLNs de estado estacionario, inflamado de DBP (24 h post aplicación) y VacV infectados (48 h post infección) cutánea. Barras de error representan SEM. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: eficiencia de Photoconversion en microambientes tumor. Los tumores fueron photoconverted durante 10 min a 200 mW (luz de 405 nm). (A) flujo representativo parcelas de Kaede verde y rojo en tumores MC38 convertidos y no convertidos y dLN braquial inmediatamente después de la photoconversion de Kaede. Las poblaciones fueron previamente cerradas por vivir, CD45+ solo células. (B) Microcopia de inmunofluorescencia de congelados, embebido en OCT YUMM 1.7 tumores tanto instruidos y photoconverted. Barra de escala = 200 μm. (C) eficiencia de conversión de CD45+ leucocitos y CD8 (D) + los linfocitos en la producción de melanina (B16. F10) y unpigmented (MC38, 1.1 YUMM YUMM 1.7). Cada punto representa un solo ratón. (E) enumeración de CD45 total+ de las células en los tumores no convertidos y photoconverted tumores recogido 24 h después de photoconversion (n = 3). Barras de error representan SEM. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: salida de leucocitos de microambientes tumor es selectiva. (A) Gating esquema para la identificación de las poblaciones linfoides y mieloides en MC38 dLNs. (B) flujo representativo parcelas identificación de Kaede rojo+ de células, entre células mieloides y linfoides en MC38 dLNs 24 h después de photoconversion. Porcentajes en diagramas de flujo indican la frecuencia de células Kaede rojo+ dentro de la población de leucocitos primario indicado en LNs (C, D) proporciones relativas de intratumoral (% de CD45+ las células) y haya retirado (células de Kaede rojo+ %; dLNs braquial) leucocitos de MC38 (C, n = 3) y YUMM 1.7 (D, n = 4) tumores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aunque la salida de leucocitos de los tejidos periféricos, no-linfoides es crítica para la iniciación y resolución de la respuesta inmune, los mecanismos moleculares que rigen la salida son poco conocidos. Esta brecha en el conocimiento es en gran parte debido a la disponibilidad lista de herramientas para la cuantificación in vivo. Aquí, describimos el uso de ratones photoconvertible (Kaede-Tg) para cuantificar la salida de leucocitos endógena de la piel y tumores y proporcionar una comparación directa cara a cara con pintura FITC en inflamatoria y modelos de infección. Demostramos que si bien ambos modelos de seguimiento de poblaciones endógenas de DC, drenaje libre de pobre absorción por las células no fagocíticas y FITC limita la utilidad de la pintura FITC para análisis amplio de salida mieloide y linfoide de los tejidos periféricos, no-linfoides, incluyendo tumores. Además, presentamos los datos que indica que la salida de los tumores es selectivo y no estocásticos confirmando hallazgos presentados por Torcellan et al. 39. para investigación de los mecanismos que regulan la salida de leucocitos de tumores puede revelar nuevos insight en la inmunidad y la inflamación asociada a tumor.
Primero evaluamos la eficiencia de photoconversion en la piel murina y su efecto sobre la inflamación local cuando parámetros divulgan en literatura. La exposición de orejas a violeta luz durante 3 minutos a potencia de 100 mW dio lugar a la photoconversion eficiente de CD45+ de las células dentro de la piel del oído (78%) sin conversión en dLNs aguas abajo. Informes en la literatura demuestran que la exposición de 3-5 min es óptima para los tejidos cutáneos5,33,38. Sin embargo, esta exposición condujo a un mayor número de CD45+ de las células en el pabellón de la oreja oreja 24 h después de la conversión y salida vascular indicando que photoconversion con estas posiciones en piel oído induce inflamación local, que debe ser considerada cuando interpretación de datos. A continuación intentamos comparar directamente DC tráfico a LNs con Kaede photoconversion y el más ampliamente utilizado FITC pintura ensayo23,24 en estado estable, durante la inflamación inducida por DBP y de orejas VacV infectado. Se observó elevada etiquetado en FITC tratados en comparación con photoconverted la piel en estado estacionario y el siguiente tratamiento de DBP. Aplicación de FITC libre a la piel puede resultar en descarga vía los recipientes linfáticos a LNs drenaje donde residente poblaciones de DC, que no migran (e.g., CD8α+ DCs), FITC de la muestra. De acuerdo con esto, se observó un número significativo de rDCs con etiqueta FITC con DBP irritante. Por el contrario, Kaede DCs marcado con rojo sólo se observaron en la siguiente población de mDC photoconversion indicando photoconversion proporciona una forma más específica de etiqueta mDCs. Incluso dentro de la población de mDC, sin embargo, observamos mDCs cuantitativamente más marcadas cuando se usa FITC sobre photoconversion. Mientras que esto puede explicarse también por drenaje FITC libre, es posible que las diferencias en el período de las etiquetas, donde el photoconversion puede sólo etiqueta DCs actualmente residente en la piel mientras FITC permanece en la piel para la duración del periodo de 24 h , representa las diferencias en la salida observada del mDC. Curiosamente, en el contexto de la infección viral, photoconversion y aplicación de FITC medición relativamente iguales niveles de salida de mDC y pocos rDCs FITC+ en LNs drenaje VacV-infección de oídos. Nos informó recientemente que drenaje linfático es significativamente menor infección VacV siguiente, y así la reducción viral inducida de transporte linfático puede mejorar la especificidad de la pintura FITC y reducido el etiquetado de las poblaciones residentes de DC LN31 . Lo importante, este trabajo destaca también el hecho de que dentro de la población de mDC (CD3ε–CD19–MHCIIHolaCD11cint), el número de DCs que activamente han migrado dentro de 24 h es una población menor y así total mDC los números no son un buen sustituto para migración activa41. Por último, es interesante notar que constantemente nos cuantificar mDC salida a alrededor de 200 células por cualquier dado 24 h período siguiente VacV infección41, mientras que la salida de 1500-2000 DCs de microambientes de tumor. Dada la tremenda eficacia de VacV como plataforma de la vacuna, particularmente cuando se aplica por escarificación45,46,47, es interesante especular que es la calidad de la DC y tal vez el tipo de DC presentación de antígenos, en lugar de la cantidad, que determina inmunidad protectora robusta.
Salida de leucocitos de microambientes de tumor, más allá de DCs25,48, sigue siendo un área poco investigada. Aunque los tumores se consideran microambientes crónicamente inflamados, si mecanismos similares regulan salida celular de los tejidos malignos y no malignos sigue siendo desconocido. Además, si la salida de leucocitos de tumores es estocástica o más bien selectivo tendrá implicaciones significativas para la interpretación de la acumulación de leucocitos y la retención en microambientes de tumor. Como tal, salida de leucocitos de tumores puede ser crucial para entender cómo los tumores evaden vigilancia inmune y conducir a nuevas estrategias de inmunoterapia. Aquí aplicamos el modelo de photoconvertible Kaede-Tg para estudiar salida de leucocitos de tumores cutáneos implantables, donde pintura FITC sería insuficiente para etiqueta amplia población mieloide y linfoide. Estudios iniciales revelaron que photoconversion eficacia en tumores implantados era dependiente tanto en melanina y tamaño del tumor. Mientras que, photoconversion eficiencia se cae rápidamente a medida que los tumores crecen cuando hay melanina (B16. F10), líneas tumorales no pigmentadas como los tumores YUMM y MC38 exhiben eficacia de conversión más estable a través de tamaños de tumor probados. Curiosamente, se observó eficacia de conversión mejorada en los CD8+ compartimiento de la célula de T en comparación con el CD45+ las células, que se negó como tumores aumentados de tamaño. Hay probablemente varios factores que contribuyen a esta observación. En primer lugar, la ubicación dentro de un tumor impactará la exposición y por lo tanto la eficiencia de conversión de tipos de la célula particular. Las células T se encuentran con frecuencia limitado a la interfaz de tumor de piel en modelos de tumores implantables y así pueden ser más fácilmente photoconverted en relación con las células mieloides que infiltran el parénquima del tumor. En segundo lugar, no todos los leucocitos expresan los mismos niveles de la proteína de Kaede49 y así puede no ser igualmente detectado por citometría de flujo; Esto puede conducir a un menor porcentajes observados de photoconversion al analizar una población más heterogénea de células como CD45 todos+ las células. Finalmente, es importante tener en cuenta que los datos presentados en la figura 3 fue generado siguientes a 10 min de exposición a la luz violeta. Este tiempo de exposición inicial fue elegido en base a informes en la literatura citando tiempos de photoconversion para varios órganos incluyendo la piel, LNs, tejidos mucosa y tumores5,6,33,35 ,39,43. El sólo otro estudio empleando el sistema de photoconvertible en los tumores, photoconversion fue realizada por 20 min39. Mayor optimización en nuestras manos reveló una eficacia mejorada con un tiempo de exposición acortado de 5 minutos para volúmenes pequeños y grandes. Es probable que la exposición prolongada conduce al fotoblanqueo de fluorescencia de Kaede, y como tal, nuestra eficiencia de conversión reportados puede ser subestimaciones. La exposición prolongada también puede llevar a mayor inflamación asociada a photoconversion y confundir los resultados del estudio. Tumores photoconverted 5 minutos demostró que ninguna diferencia significativa en el número de intratumoral CD45+ células 24 h después de photoconversion en comparación con los tumores sin convertir. Además, la photoconverted de tumores durante 5 minutos demostró salida mensurable y reproducible para población mieloide y linfoide. En consecuencia, optimización individual en tejidos específicos o tumores de interés es necesario para lograr resultados óptimos.
Por último, se utilizó en situ photoconversion para cuantificar la salida de leucocitos endógenos de tumores implantados en ratones de Kaede-Tg. Con dos modelos diferentes implantable, no pigmentadas del tumor se observó significativa salida de DCs, células T y monocitos. Coherente con el trabajo recientemente publicado39, ambos CD4+ y CD8+ T las células haya retirado de microambientes tumor junto con un número significativo de doble negativo CD3ε+ T las células. Por lo menos, uno de los componentes de esta población puede ser células de delta T gamma como se describió anteriormente39, aunque la significación funcional de esta observación queda por determinarse. Lo importante, cuando se compararon las proporciones de leucocitos egressing de tumores a las proporciones relativas de los leucocitos presentes en los microambientes del tumor, se observó enriquecimiento del leucocito en poblaciones haya retirado en relación a piscinas de intratumoral en ambos modelos indicando salida selectiva de leucocitos. En particular, los macrófagos y los neutrófilos eran ausentes en las poblaciones haya retirado, aunque ambos tipos de células se han descrito a la salida bajo condiciones inflamadas e infectadas2,50,51,52 , 53 , 54 y son colaboradores importantes intratumoral del leucocito repertorios39,55,56. Por lo tanto, la salida de leucocitos de los tumores puede ser cuantificada usando modelos de photoconvertible no es estocástica pero más bien un proceso regulado y sigue siendo una importante y estudiada biología con implicaciones importantes para la comprensión inflamatoria y dinámica inmunológica en microambientes de tumor en estado estacionario y en respuesta a la terapia.
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Disclosures
Los autores no tienen de revelar los conflictos.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Dr. Marcus Bosenberg por prever líneas de melanoma murino YUMM 1.7 y 1.1 YUMM y Dr. Deborah J. Fowell proporcionando B6. CG-Tg(CAG-tdKaede) ratones 15Utr acuerdo con RIKEN BRC a través de los Bio-recursos nacionales de MEXT, Japón.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DNase | Roche | 4536282001 | |
| Silver-LED-405B light source with optical fiber and collimtor | Prizmatix Ltd | V8144 | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I | Sigma-Aldrich | F4274 | |
| dibutyl phthalate | Sigma-Aldrich | 524980 | |
| acetone | Macron Fine Chemicals | 2440-02 | |
| 29-guage syringes | Exel International | 26029 | |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | |
| 70 um cell strainers | VWR | 732-2758 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| HBSS | Caisson | HBL06 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L34966 | |
| Purified Anti-mouse CD16/CD32 | Tonbo Biosciences | 70-0161-M001 | |
| BV605 CD11c (clone N418) | Biolegend | 117334 | |
| PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2) | BD Pharmingen | 562363 | |
| BV421 CD3e (clone 145-2C11) | Biolegend | 100341 | |
| APC CD8a (clone 53-6.7) | TonBo Biosciences | 20-0081-u100 | |
| APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
| BV650 CD19 (clone 6D5) | Biolegend | 115541 | |
| PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4) | Biolegend | 128011 | |
| Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8) | Biolegend | 123121 | |
| APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8) | Biolegend | 127623 | |
| BV711 CD11b (clone M1/70) | Biolegend | 101241 | |
| BV605 CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103155 | |
| BV711 CD4 (clone RM4-5) | BD Biosciences | 563726 | |
| Bovine serum albumin (Fraction V) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Anit-Rat and Anti-Hamster Igk / Negative Control Compensation Particle Set | BD Biosciences | 552845 | |
| Fortessa Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10 Software | FlowJo |
References
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