Summary
Her viser vi metodene for i vivo kvantifisering av leukocytter egress fra naiv, betent, og ondartet murine hud. Vi utfører en head-to-head sammenligning av to modeller: transdermal FITC programmet og i situ photoconversion. Videre viser vi nytten av photoconversion for å spore leukocytter egress fra kutan svulster.
Abstract
Leukocytter egress fra perifere vev til drenering lymfeknuter er ikke bare avgjørende for immun overvåking og innvielse, men bidrar også til oppløsningen av eksterne tissue svar. Mens en rekke metoder er brukt om å kvantifisere leukocytter egress fra ikke-lymfoide, perifere vev, fortsatt mobilnettet og molekylære mekanismer som styrer kontekst-avhengige egress dårlig forstått. Her beskriver vi bruk av i situ photoconversion for kvantitativ analyse av leukocytter egress fra murine hud og svulster. Photoconversion tillater direkte merkingen av leukocytter bosatt innen kutan vev. Om huden eksponering for voldsomhet lyset induserer lokale preget inflammatorisk svar av leukocytter infiltrerer og vaskulær leakiness, i en head-to-head sammenligning med transdermal applikasjon av fluorescerende tracers, photoconversion spesielt merket vandrende dendrittiske celle populasjoner og samtidig aktivert kvantifisering av lymfoide og myeloide egress fra kutan microenvironments og tumorer. Mekanismer av leukocytter egress fortsatt mangler en komponent i vår forståelse av intratumoral leukocytter kompleksitet, og dermed bruk av verktøyene som beskrives her gir innblikk i dynamikken i svulst immun microenvironments både på stødig statlige og svar på terapi.
Introduction
Eksterne tissue immunreaksjoner er formet ikke bare av leukocytter rekruttering til områder av betennelse, men også av mekanismer som regulerer deres påfølgende oppbevaring. Dermed er beskyttende immunitet diktert av kumulativ cellulære og molekylære mekanismer som bestemmer om en leukocytter inn, opphold, eller snarere overfører av eksterne tissue via lymfekar. Viktigst, er hang for leukocytter avslutte vev gjennom lymfekar (kalt egress) knyttet til sine spesialiserte funksjoner. Dendrittiske celler (DC) erverve vandrende atferd svar på modning signaler som fører til antigen transport og presentasjon i drenering lymfeknuter (dLN), en prosess som er nødvendig for adaptiv immunitet1. Scavenging myeloide celler, som makrofager og nøytrofile, tjene til å fjerne apoptotisk rester gjennom fagocytose. Under bakteriell infeksjon, nøytrofile egress vev og til slutt gjennomgår apoptose-programmert i dLNs2 og en modell av DSS-indusert kolitt, dataene støtter hypotesen at macrophage egress er nødvendig for å løse lokal betennelse3. Om nøytrofile og macrophage egress oppstår i alle inflammatorisk sammenhenger, men er ukjent. Bevis for T lymfocytt egress fra steady state4,5,6,7, infiserte8og betent4,9,10, 11,12 perifer, ikke-lymfoid vev angir at recirculate aktivt T celler, men vev-basert signaler som driver denne utkjørselen fortsatt dårlig forstått. Flere studier har identifisert signaler nødvendig for retningsbestemt overføring mot drenering lymfatisk kapillærene og påfølgende egress inkludert chemokine (C-C motiv) ligand 21 (CCL21) og dens reseptoren CCR74,11, 13, chemokine (C-X-C motiv) ligand 12 (CXCL12) og reseptor CXCR42,14, og sphingosine-1-fosfat (S1P)10,15,16. Disse mekanismene er ikke aktive i alle sammenhenger, men og om de bestemmer egress av alle celletyper fortsatt et åpent spørsmål. Viktigere, krever innsikt i mekanismer som styrer egress og relevansen fungerende sykdom kvantitative i vivo metoder for analyse.
Flere metoder har blitt brukt om å kvantifisere egress i flere dyremodeller i vivo inkludert direkte cannulation av lymfekar, adopsjon overføring av ex vivo merket leukocytter, transdermal applikasjon av fluorescerende tracers, injeksjon av merket partikler og i vivo photoconversion17,18. Direkte cannulation av afferente musen lymfekar er vanskelig og begrenset i små dyr av volumet av væske som kan samles. Dermed cannulation er hovedsakelig utført i store dyr (f.eks., sau) hvor slike kirurgisk manipulasjoner er praktisk. Disse studiene gir direkte bevis for tilstedeværelsen av både lymfoide og myeloide celler i lymfe10,19,20. Videre avslører ovine modeller at akutt og kronisk betennelse økt lymfocytt tilstedeværelse i lymfe med nesten 100-fold10,21.
Adopsjon overføring av merket og genetisk manipulerte lymfocytter har viktigere avslørt at CCR7 kreves for egress av CD4+ T celler fra akutt betent hud5,11, mens forbehandling av lymfocytter med de små molekylet S1P reseptor Agonistiske hemmer FTY720, bare delvis deres egress10. Interessant, egress av overførte lymfocytter fra kronisk betent hud er uavhengig av CCR710, men krever delvis CXCR49. Adopsjon overføring eksperimenter, men gir ikke-fysiologiske antall ex vivo aktivert og merket lymfocytter i vevet gjennom injeksjon, som endrer biomekaniske miljøet i vev og forhøyet interstitiell væsketrykk under driften det åpne første lymfatisk kapillærene og endre deres transport egenskaper22. Som et alternativ, transdermal applikasjon av fluorescein isothiocyanate (FITC) i tilstedeværelse eller fravær av dermal irritanter (f.eks., Dibutylftalat, DBP) eller infeksjon23,24 tillater sporing av phagocytic celler som akkumuleres tracer og overfører til dLNs. Tilsvarende gir fluorescently merket svulster betyr å spore phagocytic celler som har engulfed svulst materiale25. Disse metodene har gitt viktig innsikt i mekanismer som styrer DC egress13,14,17,26,27 , men ikke å spore ikke-phagocytic lymfocytter og tolkning kan kompliseres av gratis lymfedrenasje av løselig FITC dermed merking ikke-trekkfugler og LN bosatt DCs.
Eventuelt er intravital mikroskopi et kraftig verktøy som gir i vivo sporing av fysiologisk relevante leukocytter populasjoner i sanntid28,29. Brukt i kombinasjon med reporter mus og antistoff-basert i vivo immunofluorescent merking, intravital mikroskopi har avslørt komplekset romlige og timelige dynamikken i immun celle menneskehandel, inkludert interstitiell overføring30 , transmigration over den lymfatiske endotelet, passering i lymfatisk lumen og overføring på LN oppføring28,31. Omfattende bruk av intravital Bildeteknikker begrenses av utgifter, nødvendig ekspertise for satt opp, og begrenset gjennomstrømming for kvantifisering flere celletyper. Likevel vil kopling kvantitative metoder som analyserer populasjonsdynamikk vev med intravital bildebehandling gi ekstra og viktig mekanistisk innsikt med hensyn til mekanismer for motilitet og migrering mot og lymfatiske kapillærene 18 , 31 , 32.
Derfor i vivo photoconversion har dukket opp som en metode som tillater i situ merking, uavhengig av phagocytic aktivitet, og for kvantifisering av fysiologiske leukocytter egress (kombinert med flowcytometri) i den fravær eller tilstedeværelse av utfordringen. Kaede-vs mus uttrykke constitutively et protein isolert fra steinete korallrev som viser grønne fluorescens (Kaede grønne) til utsatt for violet lys, hvoretter den irreversibelt konverterer til rød fluorescens (Kaede rød)33. Photoconverted celler kan spores som de egress fra eksterne tissue nettsteder og akkumuleres i dLNs. Dette og andre lignende photoconvertible musen modeller34,35 har åpenbart viktig biologi inkludert konstituerende egress av regulatoriske T celler fra huden36, CXCR4-avhengige B celle egress fra Peyers oppdateringer37 , mobilisering av bosatt minne T celler peptid re utfordre38og bred leukocytter egress fra svulst microenvironments39. Her, utfører vi en head-to-head sammenligning av photoconversion med transdermal FITC programmet i forbindelse med kutan inflammation og infeksjon å tillate direkte sammenligning av eksisterende data med metoden photoconvertible. Videre vi vise photoconversion i implantert svulster og beskrive konvertering effektivitet og selektiv egress fra svulst microenvironments. Slik vi hevde at ytterligere anvendelse av disse metodene er nødvendig å belyse kritiske biologi leukocytter egress fra svulster, som vil ha for å tolke intratumoral leukocytter kompleksitet, anti-tumor immunitet, og svar på terapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr protokoller har blitt godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen på Oregon Health & Science University.
1. Innledning betennelse og FITC maleri av musen Pinna
- I laminær strømning hette, bedøve C57Bl/6 mus med fordampede isofluorane (indusere på 3-5% isofluorane og opprettholde på 1-3% isofluorane; oksygen flow rate på 0,5-1.0 L/min). Sikre riktig anesthetization ved å overvåke tap av pedal refleks, ufrivillige bevegelser og redusert respirasjonsfrekvens.
- Lå øre flatt med ventral side av øret vendt oppover. Pipetter 20 µL av 5% FITC løsning oppløst i 1:1 aceton: dibutyl ftalat (DBP) på ventral side av øret høydepunkt. Gi øret tørke i noen sekunder.
- 24 timer etter FITC søknad, euthanize musene via karbondioksid eksponering etterfulgt av cervical forvridning. Samle øret pinnae i PBS ved å skille ørene fra hodet med saks. Samle cervical dLNs og lysken ikke-drenering LNs i PBS ved hjelp av pinsett skille kaller vi LNs fra omkringliggende vev. Lysken ikke-drenering LNs vil tjene som negative kontroller for tilstedeværelse av FITC+/Kaede røde+ leukocytter. Kast skrotter per institusjonelle protokollen.
Merk: Det optimale tidspunktet innlegget photoconversion for analyse avhenger celle type og kjente vandrende atferd. Dendrittiske celler, for eksempel kan påvises i dLNs så tidlig som 6 h DBP Etterutligne.
2. induksjon av betennelse og Photoconversion av musen Pinna
- I laminær strømning hette, bedøve Kaede-vs mus (bakgrunn C57Bl/6) av intraperitoneal injeksjon av 80 mg/kg ketamin og 10 mg/kg xylazine oppløst i saltvann. Sikre riktig anesthetization som beskrevet i trinn 1.1.
- Lå øre flatt med ventral side av øret vendt oppover. Pipetter 20 µL av en 1:1 aceton: DBP på ventral side av det øre høydepunkt. Gi øret tørke i noen sekunder.
- Etter DBP program, klippe en rift i en stykke aluminiumsfolie og dra i øret gjennom slit å avsløre øret til fiolett lyskilden. Lå øret flatt med dorsal side vender oppover med dobbeltsidig tape for å sikre øret til folie.
- Plasser øret direkte under lyskilde og photoconvert for 3 min bruker 405 nm lyskilde på 100 mW effekt.
- 24 timer etter photoconversion, euthanize Kaede-vs mus og høste det øre pinnae, cervical LNs og lysken LNs som beskrevet i trinn 1.3.
Merk: I tillegg til hensyn i trinn 1.3, satsene for spredning avgjør tidspunktet for analyse som tap av Kaede rød vil oppstå i hurtig deler celler.
3. vaccinia infeksjon i musen høydepunkt og FITC program
- Bedøve C57Bl/6 mus med fordampede isofluorane som beskrevet i trinn 1.1.
- Lå på ventral side av øret flat. Pipetter 5 x 106 plakk-forming enheter (PFU) vaccinia virus (VacV) fortynnet i 10 µL av PBS på det øre høydepunkt. Bruker en 29-gauge nål, poke høydepunkt 25 ganger40.
- 24 timer etter infeksjon, bedøve VacV-infiserte mus med isofluorane som beskrevet i trinn 1.1 og Pipetter 20 µL 5% FITC oppløst i aceton ved ventrale siden av det øre høydepunkt. Gi øret tørke i noen sekunder.
- 24 timer etter FITC søknad, euthanize mus og samle øret pinnae, cervical LNs og lysken LNs som beskrevet i trinn 1.3.
Merk: FITC kan brukes på noen gang punkt innlegget infeksjon å bestemme DC handel på ulike 24 h intervaller. Vi har tidligere rapportert at DC migrasjon til dLNs opprettholdes på lignende nivåer fra dag 1 til 3 innlegg infeksjon41.
4. vaccinia infeksjon i musen høydepunkt og Photoconversion.
- Bedøve Kaede-vs mus med fordampede isofluorane som beskrevet i trinn 1.1.
- Infisere det øre høydepunkt med VacV som beskrevet i trinn 3.2.
- 24 timer etter infeksjon, bedøve VacV-infiserte Kaede mus som beskrevet i trinn 2.1 og utfør photoconversion som beskrevet i trinnene 2.3-2,4.
- 24 timer etter photoconversion, euthanize mus og høste det øre pinnae, cervical LNs og lysken LNs som beskrevet i trinn 1.3.
Merk: Som nevnt ovenfor i trinn 3.4, photoconversion kan administreres på noen gang punkt innlegget infeksjon.
5. øret og lymfeknute behandling for flowcytometri
- Opprette enkeltcelle suspensjoner av øret pinnae: Skrell hverandre ventrale og dorsal sidene av det øre høydepunkt med to par pinsett og sted med innsiden av øret vender ned i brønnene av en 24-vel plate som inneholder 1 mg/mL collagenase D og 80 U/mL DNase fortynnet i Hanks bufret saltholdig løsning (HBSS) (inneholder Ca2 + og Mg2 +). Ruge på 37 ° C for 30 min. Trykk fordøyd vev gjennom en 70 µm nylon celle sil.
- Opprette enkeltcelle suspensjoner fra LNs: plassere LNs i brønner av en 24-vel plate som inneholder 1 mg/mL collagenase D og 80 U/mL DNase fortynnet i HBSS. Tease åpne lymfeknute kapsel over to 29-måle pinner og deretter ruge lymfeknutene ved 37 ° C i 30 min. Trykk fordøyd vev gjennom en 70 µm nylon celle sil.
6. intradermal melanom svulst implantasjon og Photoconversion.
- Barbere fur fra midten av baksiden av en Kaede-vs mus ved hjelp av en elektrisk barberhøvel.
- Plasser en 29-gauge nål i midten av ryggen mellom venstre og høyre øvre scapulae, og intradermally injisere 5 x 105 kreftceller (utvannet i 50 µL saltoppløsning) i huden av Kaede-vs mus. Svulster må være nøye plassert slik lymfedrenasje til angitte lymfeknuter (dvs., venstre og høyre brachialis LNs for svulster plassert i øvre rygg). Unngå å plassere svulsten over dLN som kan dette medføre direkte photoconversion av kaller vi LNs gjennom huden/svulsten.
- Tillate svulster å vokse til ønsket størrelse (100-650 mm3).
- Én dag før vev samling, bedøve Kaede-vs mus som beskrevet i 2.1 og barbering alle nylig regrown pels rundt svulsten.
- Klipp runde hull i aluminiumsfolie og tre svulsten for å avsløre svulsten til lyskilden. Klippe hull litt mindre enn svulsten å hindre svulsten falle tilbake gjennom hullet og minimere konvertering av tilstøtende, ikke-svulst hud.
- Plasser svulsten direkte under lyskilde og photoconvert i 5 min med en 405 nm lyskilde på 200 mW effekt.
- 24 timer etter photoconversion, euthanize musene som beskrevet i trinn 1.3. Samle den tumorer, brachialis dLNs og lysken ikke-drenering LNs i PBS. Skjær tumorer fra den omkringliggende huden ved hjelp av saks og fjern LNs som beskrevet i trinn 1.3.
7. svulsten og lymfeknute behandling for flowcytometri
- Opprette enkeltcelle suspensjoner fra svulstene: hakke svulstene med saks i brønner av en 24-vel plate som inneholder 1 mg/mL collagenase D og 80 U/mL DNase fortynnet i HBSS. Inkuber ved 37 ° C i 1 h. Trykk fordøyd vev gjennom en 70 µm nylon sil.
- Opprette enkeltcelle suspensjon av lymph noder som beskrevet i trinn 5.2.
8. antistoff flekker for flowcytometri
- Etter fordøyer vev i én celle suspensjoner, utføre standard flyt cytometri flekker teknikker for å merke cellene med indikatorer rundt. Kort, Pipetter 2 x 106 celler i en 96-brønns plate. Inkuber prøvene med Fc blokk (1 µg/mL) for 20 min på is; vask to ganger med FACs buffer (1% bovin serum albumin i PBS). Legg live/dead flekk (utvannet i PBS) til prøvene og ruge i 15 min på is; vask to ganger med FACs buffer. Inkuber med primære antistoffer (Tabell for materiale) fortynnet i FACs buffer for 30 min på is; vask to ganger med FACs buffer.
Merk: Kaede grønne og Kaede rød fluorescens overlapper med FITC og PE fluorophores; Dermed kan ikke FITC og PE-konjugerte antistoffer brukes i kombinasjon med Kaede proteiner. - Etter kjøre prøver på en flyt cytometer. Alternativt, fikse cellene med 2% PFA.
9. flyt cytometri analyse
- Angi FITC (Kaede grønne) og PE (Kaede rød) kanal avdrag spenninger 70-80% av det totale området (sentrum befolkning på ca 104) bruker ex vivo Kaede grønt eller Kaede rød én farge splenocytes eller blod.
Merk: Ikke kompensere for Kaede green (FITC) og Kaede rød (PE) kanaler som dette vil resultere i større signal spredt.- For å opprette én farge Kaede kontroller, samle en milt eller blod fra en Kaede-vs-mus. Lyse røde blod celler med ACK buffer, deretter dele cellene i to grupper: uomvendte Kaede grønne og konverterte Kaede rød.
- For én farge Kaede røde kontroller, suspendere cellene i 1 mL av PBS og photoconvert i en 24-vel plate i 5 min med en 405 nm-lyskilder på en strøm av 100 mW. Bruk disse cellene til å angi Kaede grønne (FITC) og Kaede rød avdrag spenninger på flyt cytometer (trinn 9.1).
- Når spenninger for Kaede proteiner er angitt, kompensere for alle andre primære antistoff flekker med single-fluorophore merket kompensasjon perler henhold til produsentens anvisninger.
- Kjøre prøver på en flyt cytometer å samle inn data.
Merk: Kaede protein er stadig produsert av cellene. Dette betyr at 24 timer etter photoconversion, konverterte cellene blir dobbelt positivt for Kaede grønne og Kaede rød som nylig syntetisk Kaede (grønn) protein er akkumuleres i cellen. - Analysere dataene med FlowJo programvare eller en lignende programvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi først forsøkte å gjenskape photoconversion resultater publisert i litteraturen å vurdere effektiviteten og bestemme tilknyttet betennelse i huden musen. Det øre høydepunkt var utsatt for 100 mW violet lys (405 nm) for 3 min som tidligere beskrevet33. Enkelt celle suspensjoner generert fra øre hud eller cervical dLNs umiddelbart etter eksponering avslørte en 78% konvertering effektivitet av alle CD45+ leukocytter i huden med ingen konverterte cellene observert i dLNs (figur 1A). For å evaluere betennelsesreaksjon forbundet med photoconversion, vi kvantifisert antall infiltrere CD45+ leukocytter konverterte ører 0 og 24 h legge konvertering (figur 1B) og akutte endringer i vaskulær permeabilitet målt ved miles analysen42 (figur 1 c). Kort, 200 µL på 0,5% Evans blå var intravascularly injisert 2t etter photoconversion. Ørene ble samlet 30 min etter injeksjon og Evans blå ble hentet med formamide 24 h ved 55° C (absorbansen lese på 610 nm42). Begge CD45+ infiltrerer (24 timer) og vaskulær lekkasje (2t) var betydelig økt etter photoconversion, som indikerer at selv i dette korte eksponering, photoconversion selv kan påvirke vev-spesifikke betennelsesreaksjon. Sammenligning CD45+ infiltrerer (figur 1B) og vaskulær lekkasje (1,4 µg/øre ±0.75) i VacV infiserte ører 24 h innlegget infeksjon41 gir kontekst for omfanget av betennelse forårsaket av fiolett lys (0,08 µg/øre ± 0,01).
Mens flere modeller har vært brukt i ulike studier spore leukocytter egress fra ikke-lymfoide, perifere vev, er det uklart hvordan disse metodene i å spore spesifikke populasjoner som de kommer ut huden. Derfor har vi besluttet å utføre en direkte head-to-head sammenligning av to vanlige metoder for å spore DC egress til LNs, FITC maling og i vivo photoconversion, for å vurdere effektiviteten og spesifisitet av hver metode for kvantitative analyse av DC egress på steady state, under kutan betennelse og infisert hud. For hver analyse, huden var utsatt for transdermal FITC applikasjon eller utsatt for 100 mW 405 nm lys for 3 min. LN DC bestander ble definert som CD3ε-CD19-MHCII+CD11c+ og videre lagdelt i 1) MHCIIHei CD11cint DCs, beriker for trekkfugler DCer (mDCs) begge CD103+ BATF3-avhengige kryss-presentere DCs, og CD11b+ dermal DCs; og 2) MHCIIintCD11cHei DCs, beriker for bosatt DCer (rDCs) inkludert CD8α+ BATF3-avhengige kryss-presentere DCs (figur 2A). 24 timer etter FITC program eller photoconversion, merket cellene var lett synlig i drenering men ikke ikke-drenering LNs (figur 2B). For å kvantifisere omfanget av DC migrasjon til LNs og samtidig se spesifisiteten av metode for merking overføre bestander og ikke bosatt LN bestander, kvantifisert vi merket mDCs og rDCs på steady state, 24 timer etter anvendelsen av DBP, og 48 timer etter VacV markberedning (figur 2C). Mens både photoconversion (Kaede) og FITC merket mDCs under alle forhold, observerte vi mer FITC-merket enn Kaede-merket mDCs i dLNs, med unntak av VacV infeksjon der de to metodene kvantifisert nivå av utgående. Videre, i forbindelse med DBP, FITC i tillegg merket rDC bestander hvor photoconversion var spesifikke for mDCs (figur 2C). Bruker begge disse metodene, observerte vi egress av ca 200 DCs fra VacV infisert hud og viktigere bemerket at dette nivået av egress viser publisert tidligere funn ved hjelp av transdermal FITC applikasjon av Loo et al. 41. dermed avhengig av inflammatoriske sammenheng, transdermal FITC applikasjon kan øke antall merket DCs oppdaget i dLNs og resultere i ikke-spesifikk merking av ikke-vandrende LN-resident DC populasjoner, mens photoconversion spesielt identifiserer DCs falle i mDC innbyggere.
Kaede-vs mus har blitt brukt om å kvantifisere leukocytter oppbevaring i5,33,43 og egress fra5,6,35,38 kutan, slimhinnene, og lymfoid vev under steady state og betent forhold og brukt svulster i en enkelt publikasjon der svulstene ble implantert intradermal i mus ører og photoconverted på små volumer39. Derfor søkt vi å vurdere nytten av i vivo photoconversion for kvantifisering av leukocytter egress fra etablerte, store primære svulster aktivere ytterligere immunologiske hypotesetesting. Først implantert vi MC38 kreftceller intradermally i Kaede-vs mus mellom venstre og høyre scapulae. Implanterbare svulst modeller aktiverer nøyaktig posisjonering av tumorer å sikre lymfedrenasje til kjente LNs; svulster i huden av øvre tilbake primært avløp til venstre og høyre brachialis LNs. Etter å ha nådd 100-150 mm3, ble svulstene photoconverted (10 min, 200 mW) og svulster og dLNs høstet umiddelbart etter photoconversion. Analyse av flowcytometri viste betydelige konvertering av intratumoral CD45+ celler fra Kaede green+ Kaede rødt+ (69%; Figur 3A), mens viktigere, dLNs forble negativ for Kaede røde+ celler. Immunofluorescence mikroskopi av photoconverted YUMM 1.7 svulster avslørt at photoconversion trenger dypt inn i tumor vev (> 1 mm; Figur 3B). Interessant, uttrykke hud og vaskulære celler høye nivåer av Kaede protein fører til høye photoconversion effektiviteten av disse celletyper som vist i figur 3B. Høy Kaede rød uttrykket gjør det vanskelig å identifisere immunceller (både uomvendte og konvertert) bruker immunofluorescence mikroskopi.
Gitt våre særlig interesse melanom immunologi, vi neste vurdert effekten av både tumor størrelse og melanin på photoconversion effektivitet med ulike implanterbare murine svulst cellelinjer: MC38 (unpigmented tykktarmskreft linje), B16. F10 (melanin-produserende melanom linje), YUMM 1.1 (unpigmented melanom linje) og YUMM 1.7 (unpigmented melanom linje)44. Hver av disse linjene ble implantert intradermal i Kaede-vs mus og photoconverted, som beskrevet over i ulike svulst volumer (50-650 mm3). Svulstene ble høstet umiddelbart etter photoconversion og evalueres etter Kaede rød CD45+ leukocytter av flowcytometri. Interessant, photoconversion effektiviteten av CD45+ leukocytter variert betydelig over svulst typer og størrelser (Figur 3 c). CD45+ leukocytter i små (50-150 mm3) YUMM 1,7 og YUMM 1.1 svulster vist den mest effektive photoconversion på 80% og 60%, henholdsvis. Som volumene økte for disse svulstene, redusert konvertering effektiviteten til rundt 50% for store svulster (> 600 mm3). Melanin hadde en slående innvirkning på photoconversion effektivitet: maksimal photoconversion for CD45+ celler i melanin-produserende B16. F10 svulster var bare ca 30% og falt 10% som tumorer nådd av 400 mm3. Interessant, analyse av intratumoral CD8+ T celler avslørt photoconversion effektivitet for disse cellene på nesten 80-90% i små svulster uansett produksjonen av melanin (figur 3D). For unpigmented svulster, CD8+ T celle konvertering forble høy som tumorer nådd store volumer, men redusert betydelig med størrelsen når melanin var til stede. Som sådan, nytten av B16. F10 murine melanomer og andre melanin-produserende melanom linjer, kan være begrenset til små svulster (50 mm3), hvilke er gjennomført med biologiske funksjonen av melanin i absorbere lys. For å evaluere betennelsesreaksjon forbundet med photoconversion av svulster, vi kvantifisert antall CD45+ celler i uomvendte svulster og konverterte svulster 24 h innlegget photoconversion (figur 3E). Vi så ingen signifikant forskjell i det totale antallet CD45+ celler i tumorer 24 timer etter photoconversion forhold til uomvendte svulster.
Vi deretter kvantifisert leukocytter egress fra svulst microenvironments med Kaede-vs mus, som tillater avhør av menneskehandel virkemåten til begge lymfoide og myeloide celletyper. MC38 eller YUMM 1.7 kreftceller ble intradermally implantert i Kaede-vs mus. Ble svulstene photoconverted når volumene nådd mellom 100-150 mm3 (5 min, 200 mW); brachialis dLNs og lysken ikke-drenering LNs ble samlet 24 timer etter photoconversion. Intratumoral leukocytter bestander kvantifisert fra MC38 og YUMM 1.7 svulster implantert i kontrollen C57Bl/6 mus og samlet når svulstene nådd 100-150 mm3. Vi vurdert leukocytter kompleksiteten i svulster og egressed bestander av flowcytometri: T-celler (CD3ε+CD4+ /-CD8+/-), B-celler (CD3ε-CD19+), DCs (CD11c+MHCII+CD11b+/- ), nøytrofile (CD11b+MHCII-Ly6G+), makrofager (CD11b+MHCII+F4/80+), og provoserende monocytter (CD11b+Ly6G-Ly6C+; Figur 4A). Bruker denne samme gating ordningen, vurdert vi prosent av hver leukocytter befolkningen i dLNs som uttrykt Kaede røde viser tidligere residens i svulst microenvironments (figur 4B). Interessant, mens både MC38 (figur 4C) og YUMM 1.7 (Figur 4 d) svulster var hovedsakelig infiltrere med myeloide celler (monocytter, DCs og makrofager), ca 50% av cellene som hadde egressed fra både svulst typer T lymfocytter (begge CD4+ og CD8+). T-celler, vi også observert DCs, B-celler og monocytter i egressed bestander svulster men makrofager og nøytrofile ble ikke oppdaget fra enten svulst type. Sammen viser disse dataene verktøyet Kaede vs photoconvertible mus for å spore flere leukocytter linjene i endogene omgivelser. Videre viser vår analyse at utgående er en selektiv, aktiv prosess som kan ha betydelige konsekvenser for å bestemme intratumoral leukocytter kompleksitet.
Figur 1: Photoconversion effektivitet og tilhørende betennelse i murine huden. Murine dermis var photoconverted for 3 min 100 mW (405 nm lys). (A) representant flyt tomter som viser photoconverted (Kaede rød+) CD45+ celler fra en uomvendte og konverterte øre og cervical dLN umiddelbart photoconversion. Bestander var pre gated på live, CD45+ single celler. (B) opplisting av totale CD45+ celler i uomvendte ører (-), ører samlet inn umiddelbart etter photoconversion, ører samlet 24 timer etter photoconversion og ører samlet 24 timer etter VacV infeksjon (n = 3). (C) en Mile analysen ble utført for å kvantifisere vaskulær leakiness umiddelbart etter eksponering for 405 nm lys (3 min, 100 mW). Representativt bilde av lekkasje i øre hud (venstre) og måling av utdraget fargestoff (høyre) (n = 3). Feilfelt representerer SEM. *p< 0,05 og **p< 0,01. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: DC egress fra naiv, betent og infisert hud. (A) Gating ordningen til å identifisere vandrende DCs (mDCs; MHCIIHeiCD11cint) og bosatt DCs (rDCs; MHCIIHeiCD11cHei). (B) representant flyt tomter som angir FITC+ eller Kaede røde+ DCs, pre gated på mDCs, fra mus infisert med VacV (dLN) eller kontralateral ikke-drenering LN kontroller. (C) kvantifisering av antall Kaede røde+ og FITC+ mDCs og rDCs i dLNs steady state, DBP-betent (24 h innlegg program) og VacV infisert hud (48t innlegget infeksjon). Feilfelt representerer SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Photoconversion effektivitet i svulst microenvironments. Svulst ble photoconverted i 10 min 200 mW (405 nm lys). (A) representant flyt tegnes Kaede grønne og Kaede rødt uomvendte og konverterte MC38 svulster og brachialis dLN umiddelbart etter photoconversion. Bestander var pre gated på live, CD45+ single-celler. (B) Immunofluorescence microcopy av frosne, OCT-embedded YUMM 1.7 svulster både uomvendte og photoconverted. Skala bar = 200 µm. (C) konvertering effektiviteten til CD45+ leukocytter og (D) CD8+ lymfocytter i melanin-produserende (B16. F10) og unpigmented (MC38, YUMM 1.1, YUMM 1.7). Hvert punkt representerer et enkelt museklikk. (E) opplisting av totale CD45+ celler i uomvendte svulster og photoconverted svulster samlet 24 timer etter photoconversion (n = 3). Feilfelt representerer SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: leukocytter egress fra svulst microenvironments er selektive. (A) Gating ordningen for å identifisere myelogen og lymfoide bestander i MC38 dLNs. (B) representant flyt tomter identifiserende Kaede røde+ celler blant lymfoide og myeloide celler i MC38 dLNs 24 timer etter photoconversion. Prosenter flyt tomter angi frekvensen for Kaede røde+ celler innenfor den angitte overordnede leukocytter befolkningen i LNs. (C, D) Relative proporsjonene i intratumoral (% av CD45+ celler) og egressed (% Kaede røde+ celler. brachialis dLNs) leukocytter fra MC38 (C, n = 3) og YUMM 1.7 (D, n = 4) svulster. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om leukocytter egress fra eksterne, ikke-lymfoid vev er kritisk for initiering og oppløsning på immunreaksjoner, er molekylære mekanismer som styrer egress dårlig forstått. Dette gapet i kunnskap skyldes klare tilgjengelighet av verktøy for kvantifisering i vivo. Her beskriver vi bruk av photoconvertible mus (Kaede-Tg) å kvantifisere endogene leukocytter egress fra huden og svulster og gi en direkte head-to-head sammenligning FITC maling i provoserende og infeksjon modeller. Vi viser at mens begge modellene spore endogene DC populasjoner, gratis drenering av FITC og dårlig opptak av ikke-phagocytic celler begrenser verktøyet FITC maling for bred analyse av lymfoide og myeloide egress fra eksterne, ikke-lymfoid vev inkludert svulster. Dessuten, presenterer vi data som viser egress fra tumorer er selektiv i stedet for Stokastisk dermed bekrefter funnene presentert av Torcellan et al. 39. videre undersøkelse av mekanismene som styrer leukocytter egress fra svulster kan avsløre romanen innsikt i svulst-assosiert betennelse og immunitet.
Vi først vurdert effektiviteten av photoconversion i murine huden og dens effekt på lokal betennelse da bruke innstillinger rapportert i litteraturen. Eksponering for ørene violet lys for 3 min på 100 mW effekt resulterte i effektiv photoconversion av CD45+ celler innenfor det øre hud (78%) med ingen konvertering i nedstrøms dLNs. Rapporter i litteraturen viser 3-5 minutter eksponering er optimal for cutaneous vev5,33,38. Denne eksponering førte til økt antall CD45+ celler i det øre høydepunkt 24 timer etter konverteringen og vaskulær lekkasje indikerer at photoconversion på disse innstillingene i øre hud induserer lokal betennelse, som bør vurderes når tolke data. Vi søkte neste direkte sammenligne DC smuglingen til LNs bruker både Kaede photoconversion og videre benyttet FITC maling analysen23,24 på stabil, under DBP-indusert betennelser og fra VacV infiserte ører. Vi observerte opphøyet merking i FITC behandlet som sammenlignet med photoconverted huden på steady state og følgende DBP behandling. Bruk av gratis FITC på huden kan føre til direkte drenering via lymfekar drenering LNs hvor bosatt DC populasjoner, som ikke overfører (f.eks., CD8α+ DCs), prøve FITC. I samsvar med dette, observerte vi betydelig antall rDCs med FITC etikett behandlet med den irriterende DBP. Derimot Kaede rød-merket DCs ble i bare observert i mDC befolkningen følgende photoconversion som angir at photoconversion kan mer spesifikke etiketten mDCs. Selv innenfor mDC befolkningen, men observerte vi kvantitativt mer merket mDCs ved FITC over photoconversion. Mens dette kan også forklares med gratis FITC drenering, er det mulig at forskjellene i perioden merking, hvor photoconversion kan bare merke DCs for tiden bosatt i huden mens FITC fortsatt i huden for hele 24 timer perioden , utgjør forskjellene i observerte mDC egress. Interessant, i forbindelse med viral infeksjon målt både photoconversion og FITC programmet relativt lik nivåer av mDC egress og få FITC+ rDCs i kaller vi LNs drenering VacV-infiserte ører. Vi nylig rapportert at lymfedrenasje er betydelig redusert følgende VacV infeksjon, og dermed viral-indusert reduksjon i lymfatisk transport kan forbedre spesifisiteten FITC maling og redusert merking av LN bosatt DC bestander31 . Viktigere, dette arbeidet også fremhever faktum at innen befolkningen mDC (CD3ε-CD19-MHCIIHeiCD11cint), DCs som aktivt overført innen 24 timer er en mindre befolkningen og dermed totalt mDC tallene er ikke en god surrogat for aktive migrasjon41. Endelig er det interessant å merke seg at vi konsekvent kvantifisere mDC egress på rundt 200 celler for en gitt 24 timer perioden følgende VacV infeksjon41, mens 1500-2000 DCs egress fra svulst microenvironments. Gitt enorm effekten av VacV som vaksine plattform, spesielt når av markberedning45,46,47, er det interessant å spekulere at det er kvaliteten på DC og kanskje type DC presentere antigen, snarere enn antallet, bestemmer som robust beskyttende immunitet.
Leukocytter egress fra svulst microenvironments, utover DCs25,48, forblir et dårlig undersøkt område. Selv om svulstene anses kronisk betent microenvironments, fortsatt om lignende mekanismer regulere cellular egress fra ikke-ondartet og ondartet vev ukjent. Videre om leukocytter egress fra svulster er Stokastisk vil eller snarere selektiv ha for å tolke leukocytter akkumulering og oppbevaring i svulst microenvironments. Som sådan, kan leukocytter egress fra svulster være avgjørende for å forstå hvordan svulster unngå immun overvåking og føre til romanen strategier for immunterapi. Her bruker vi photoconvertible Kaede-vs-modellen for å studere leukocytter egress fra implanterbare kutan svulster, hvor FITC maling vil være tilstrekkelig til å merke bredt både myelogen og lymfoide bestander. Første studier avslørte at photoconversion effektivitet i implantert svulster avhengig av tumor størrelse og melanin. Mens photoconversion effektivitet raskt faller av som svulster vokser når melanin (B16. F10), ikke-pigmented svulst linjer som den YUMM og MC38 svulst utstilling mer stabil konvertering effektivitet over svulst størrelser testet. Interessant, observerte vi forbedret konvertering effektivitet i CD8+ T celle kupé sammenlignet CD45+ celler, som falt som svulster økt i størrelse. Det er trolig flere faktorer bidrar til denne observasjonen. Først påvirker plassering i en svulst eksponeringen og dermed konvertering effektiviteten av bestemt celletyper. T-celler finnes ofte begrenset til huden-svulst grensesnittet i implanterbare svulst modeller og dermed kan være mer photoconverted i forhold til myeloide celler infiltrere svulst parenchyma. For det andre, ikke alle leukocytter express samme nivå av Kaede protein49 og dermed kan ikke alle like oppdages av flowcytometri; Dette kan føre til lavere observert prosenter av photoconversion når du analyserer en mer heterogen celle befolkningen som alle CD45+ celler. Endelig, er det viktig å merke seg at dataene som vises i Figur 3 var genererte følgende 10 min violet lys eksponering. Denne første eksponeringstid ble valgt basert på rapporter i litteraturen siterer photoconversion tider for ulike organer inkludert hud, LNs, mucosal vev og svulster5,6,33,35 ,39,43. Bare andre studien ansette photoconvertible systemet i svulster, ble photoconversion utført for 20 min39. Ytterligere optimalisering i våre hender viste økt effektivitet med en kortere eksponeringstid 5 min for både små og store volumer. Det er sannsynlig at langvarig eksponering fører til photobleaching av Kaede fluorescens, og som sådan, våre rapporterte konvertering effektivitet kan være undervurderer. Langvarig eksponering kan også føre til økt photoconversion-assosiert betennelse og forvirre studere resultatene. Svulster photoconverted for 5 min viste ingen signifikant forskjell i antall intratumoral CD45+ celler 24 timer etter photoconversion forhold til uomvendte svulster. I tillegg viste svulster photoconverted for 5 min målbare og reproduserbar egress for både myelogen og lymfoide bestander. Derfor er personlige optimalisering bestemt vev eller svulster av interesse nødvendig for å oppnå optimale resultater.
Til slutt, vi brukte i situ photoconversion å kvantifisere endogene leukocytter egress fra svulster implantert i Kaede-vs mus. Bruke to forskjellige implanterbare, ikke-pigmented svulst modeller vi observerte betydelig egress av DCs, T celler og monocytter. Samsvar med nylig publisert arbeid39, begge CD4+ og CD8+ T celler egressed fra svulst microenvironments sammen med et betydelig antall dobbel negative CD3ε+ T celler. Minst kan en del av denne befolkningen være gamma delta T celler som beskrevet tidligere39, men funksjonell betydningen av denne observasjonen er fortsatt skal bestemmes. Viktigere, når vi sammenlignet andelen leukocytter egressing fra svulster til de relative proporsjonene av leukocytter stede i svulst microenvironments, observerte vi leukocytter berikelse egressed bestander i forhold til intratumoral bassengene i begge modeller som angir selektiv leukocytter egress. Spesielt, makrofager og nøytrofile var fraværende egressed bestander, skjønt begge celletyper har blitt beskrevet å egress under betent og infiserte2,50,51,52 , 53 , 54 og er viktige bidragsytere til intratumoral leukocytter repertoar39,55,56. Dermed leukocytter egress fra svulstene kan kvantifiseres bruker photoconvertible modeller, er ikke Stokastisk men heller en regulert prosess, og er fortsatt en viktig og lite studert biologi med viktige implikasjoner for forståelse provoserende og immun dynamikk i svulst microenvironments på steady state og svar på terapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Dr. Marcus Bosenberg for å gi YUMM 1.1 og YUMM 1.7 murine melanom linjer og Dr. Deborah J. Fowell for å gi B6. CG-Tg(CAG-tdKaede) 15Utr mus med RIKEN BRC gjennom nasjonale Bio-ressursen av MEXT, Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DNase | Roche | 4536282001 | |
| Silver-LED-405B light source with optical fiber and collimtor | Prizmatix Ltd | V8144 | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I | Sigma-Aldrich | F4274 | |
| dibutyl phthalate | Sigma-Aldrich | 524980 | |
| acetone | Macron Fine Chemicals | 2440-02 | |
| 29-guage syringes | Exel International | 26029 | |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | |
| 70 um cell strainers | VWR | 732-2758 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| HBSS | Caisson | HBL06 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L34966 | |
| Purified Anti-mouse CD16/CD32 | Tonbo Biosciences | 70-0161-M001 | |
| BV605 CD11c (clone N418) | Biolegend | 117334 | |
| PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2) | BD Pharmingen | 562363 | |
| BV421 CD3e (clone 145-2C11) | Biolegend | 100341 | |
| APC CD8a (clone 53-6.7) | TonBo Biosciences | 20-0081-u100 | |
| APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
| BV650 CD19 (clone 6D5) | Biolegend | 115541 | |
| PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4) | Biolegend | 128011 | |
| Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8) | Biolegend | 123121 | |
| APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8) | Biolegend | 127623 | |
| BV711 CD11b (clone M1/70) | Biolegend | 101241 | |
| BV605 CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103155 | |
| BV711 CD4 (clone RM4-5) | BD Biosciences | 563726 | |
| Bovine serum albumin (Fraction V) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Anit-Rat and Anti-Hamster Igk / Negative Control Compensation Particle Set | BD Biosciences | 552845 | |
| Fortessa Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10 Software | FlowJo |
References
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Hampton, H. R., Bailey, J., Tomura, M., Brink, R., Chtanova, T. Microbe-dependent lymphatic migration of neutrophils modulates lymphocyte proliferation in lymph nodes. Nature Communications. 6, 7139 (2015).
- D'Alessio, S., et al. VEGF-C-dependent stimulation of lymphatic function ameliorates experimental inflammatory bowel disease. Journal of Clinical Investigation. 124 (9), 3863-3878 (2014).
- Debes, G. F., et al. Chemokine receptor CCR7 required for T lymphocyte exit from peripheral tissues. Nature Immunology. 6 (9), 889-894 (2005).
- Bromley, S. K., Yan, S., Tomura, M., Kanagawa, O., Luster, A. D. Recirculating memory T cells are a unique subset of CD4+ T cells with a distinct phenotype and migratory pattern. Journal of Immunology. 190 (3), 970-976 (2013).
- Tomura, M., et al. Activated regulatory T cells are the major T cell type emigrating from the skin during a cutaneous immune response in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (3), 883-893 (2010).
- Tomura, M., Itoh, K., Kanagawa, O. Naive CD4+ T lymphocytes circulate through lymphoid organs to interact with endogenous antigens and upregulate their function. Journal of Immunology. 184 (9), 4646-4653 (2010).
- Jennrich, S., Lee, M. H., Lynn, R. C., Dewberry, K., Debes, G. F. Tissue exit: a novel control point in the accumulation of antigen-specific CD8 T cells in the influenza a virus-infected lung. Journal of Virology. 86 (7), 3436-3445 (2012).
- Geherin, S. A., Wilson, R. P., Jennrich, S., Debes, G. F. CXCR4 is dispensable for T cell egress from chronically inflamed skin via the afferent lymph. PLoS One. 9 (4), e95626 (2014).
- Brown, M. N., et al. Chemoattractant receptors and lymphocyte egress from extralymphoid tissue: changing requirements during the course of inflammation. Journal of Immunology. 185 (8), 4873-4882 (2010).
- Bromley, S. K., Thomas, S. Y., Luster, A. D. Chemokine receptor CCR7 guides T cell exit from peripheral tissues and entry into afferent lymphatics. Nature Immunology. 6 (9), 895-901 (2005).
- Gomez, D., Diehl, M. C., Crosby, E. J., Weinkopff, T., Debes, G. F. Effector T Cell Egress via Afferent Lymph Modulates Local Tissue Inflammation. Journal of Immunology. 195 (8), 3531-3536 (2015).
- Ohl, L., et al. CCR7 governs skin dendritic cell migration under inflammatory and steady-state conditions. Immunity. 21 (2), 279-288 (2004).
- Kabashima, K., et al. CXCL12-CXCR4 engagement is required for migration of cutaneous dendritic cells. American Journal of Pathology. 171 (4), 1249-1257 (2007).
- Cyster, J. G., Schwab, S. R. Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs. Annual Review of Immunology. 30, 69-94 (2012).
- Matloubian, M., et al. Lymphocyte egress from thymus and peripheral lymphoid organs is dependent on S1P receptor 1. Nature. 427 (6972), 355-360 (2004).
- Teijeira, A., Rouzaut, A., Melero, I. Initial afferent lymphatic vessels controlling outbound leukocyte traffic from skin to lymph nodes. Frontiers in Immunology. 4, 433 (2013).
- Hunter, M. C., Teijeira, A., Halin, C. T Cell Trafficking through Lymphatic Vessels. Frontiers in Immunology. 7, 613 (2016).
- Bujdoso, R., Hopkins, J., Dutia, B. M., Young, P., McConnell, I. Characterization of sheep afferent lymph dendritic cells and their role in antigen carriage. Journal of Experimental Medicine. 170 (4), 1285-1301 (1989).
- Young, A. J. The physiology of lymphocyte migration through the single lymph node in vivo. Seminars in Immunology. 11 (2), 73-83 (1999).
- Seabrook, T., et al. The traffic of resting lymphocytes through delayed hypersensitivity and chronic inflammatory lesions: a dynamic equilibrium. Seminars in Immunology. 11 (2), 115-123 (1999).
- Swartz, M. A., et al. Mechanics of interstitial-lymphatic fluid transport: theoretical foundation and experimental validation. Journal of Biomechanics. 32 (12), 1297-1307 (1999).
- Macatonia, S. E., Knight, S. C., Edwards, A. J., Griffiths, S., Fryer, P. Localization of antigen on lymph node dendritic cells after exposure to the contact sensitizer fluorescein isothiocyanate. Functional and morphological studies. Journal of Experimental Medicine. 166 (6), 1654-1667 (1987).
- Robbiani, D. F., et al. The leukotriene C(4) transporter MRP1 regulates CCL19 (MIP-3beta, ELC)-dependent mobilization of dendritic cells to lymph nodes. Cell. 103 (4), 757-768 (2000).
- Roberts, E. W., et al. Critical Role for CD103(+)/CD141(+) Dendritic Cells Bearing CCR7 for Tumor Antigen Trafficking and Priming of T Cell Immunity in Melanoma. Cancer Cell. 30 (2), 324-336 (2016).
- Forster, R., et al. CCR7 coordinates the primary immune response by establishing functional microenvironments in secondary lymphoid organs. Cell. 99 (1), 23-33 (1999).
- Johnson, L. A., Jackson, D. G. The chemokine CX3CL1 promotes trafficking of dendritic cells through inflamed lymphatics. Journal of Cell Science. 126, 5259-5270 (2013).
- Teijeira, A., et al. T Cell Migration from Inflamed Skin to Draining Lymph Nodes Requires Intralymphatic Crawling Supported by ICAM-1/LFA-1 Interactions. Cell Reports. 18 (4), 857-865 (2017).
- Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PLoS One. 8 (2), e57135 (2013).
- Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin alphaV. Nature Immunology. 14 (9), 949-958 (2013).
- Russo, E., et al. Intralymphatic CCL21 Promotes Tissue Egress of Dendritic Cells through Afferent Lymphatic Vessels. Cell Reports. 14 (7), 1723-1734 (2016).
- Steven, P., Bock, F., Huttmann, G., Cursiefen, C. Intravital two-photon microscopy of immune cell dynamics in corneal lymphatic vessels. PLoS One. 6 (10), e26253 (2011).
- Tomura, M., et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 105 (31), 10871-10876 (2008).
- Shand, F. H., et al. Tracking of intertissue migration reveals the origins of tumor-infiltrating monocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (21), 7771-7776 (2014).
- Tomura, M., et al. Tracking and quantification of dendritic cell migration and antigen trafficking between the skin and lymph nodes. Scientific Reports. 4, 6030 (2014).
- Moran, A. E., et al. T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse. Journal of Experimental Medicine. 208 (6), 1279-1289 (2011).
- Schmidt, T. H., Bannard, O., Gray, E. E., Cyster, J. G. CXCR4 promotes B cell egress from Peyer's patches. Journal of Experimental Medicine. 210 (6), 1099-1107 (2013).
- Beura, L. K., et al. T Cells in Nonlymphoid Tissues Give Rise to Lymph-Node-Resident Memory T Cells. Immunity. 48 (2), 327-338 (2018).
- Torcellan, T., et al. In vivo photolabeling of tumor-infiltrating cells reveals highly regulated egress of T-cell subsets from tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114 (22), 5677-5682 (2017).
- Khan, T. N., Mooster, J. L., Kilgore, A. M., Osborn, J. F., Nolz, J. C. Local antigen in nonlymphoid tissue promotes resident memory CD8+ T cell formation during viral infection. Journal of Experimental Medicine. 213 (6), 951-966 (2016).
- Loo, C. P., et al. Lymphatic Vessels Balance Viral Dissemination and Immune Activation following Cutaneous Viral Infection. Cell Reports. 20 (13), 3176-3187 (2017).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. (73), e50062 (2013).
- Morton, A. M., et al. Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (18), 6696-6701 (2014).
- Meeth, K., Wang, J. X., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations. Pigment Cell Melanoma Research. 29 (5), 590-597 (2016).
- Demkowicz, W. E., Littaua, R. A., Wang, J., Ennis, F. A. Human cytotoxic T-cell memory: long-lived responses to vaccinia virus. Journal of Virology. 70 (4), 2627-2631 (1996).
- Stewart, A. J., Devlin, P. M. The history of the smallpox vaccine. Journal of Infection. 52 (5), 329-334 (2006).
- Hammarlund, E., et al. Duration of antiviral immunity after smallpox vaccination. Nature Medicine. 9 (9), 1131-1137 (2003).
- Lund, A. W., et al. Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).
- Tomura, M., Kabashima, K. Analysis of cell movement between skin and other anatomical sites in vivo using photoconvertible fluorescent protein "Kaede"-transgenic mice. Methods in Molecular Biology. , 279-286 (2013).
- Bellingan, G. J., Caldwell, H., Howie, S. E., Dransfield, I., Haslett, C. In vivo fate of the inflammatory macrophage during the resolution of inflammation: inflammatory macrophages do not die locally, but emigrate to the draining lymph nodes. Journal of Immunology. 157 (6), 2577-2585 (1996).
- Gautier, E. L., Ivanov, S., Lesnik, P., Randolph, G. J. Local apoptosis mediates clearance of macrophages from resolving inflammation in mice. Blood. 122 (15), 2714-2722 (2013).
- Abadie, V., et al. Neutrophils rapidly migrate via lymphatics after Mycobacterium bovis BCG intradermal vaccination and shuttle live bacilli to the draining lymph nodes. Blood. 106 (5), 1843-1850 (2005).
- Beauvillain, C., et al. CCR7 is involved in the migration of neutrophils to lymph nodes. Blood. 117 (4), 1196-1204 (2011).
- Rigby, D. A., Ferguson, D. J., Johnson, L. A., Jackson, D. G. Neutrophils rapidly transit inflamed lymphatic vessel endothelium via integrin-dependent proteolysis and lipoxin-induced junctional retraction. Journal of Leukocyte Biology. 98 (6), 897-912 (2015).
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Binnewies, M., et al. Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy. Nature Medicine. 24 (5), 541-550 (2018).
