Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Quantifizierung der Leukozyten Egress über Lymphgefäße aus murinen Haut und Tumoren

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58704
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 1,2,3,4
1Department of Cell, Developmental, & Cancer Biology, Oregon Health and Science University, 2Department of Molecular Microbiology & Immunology, Oregon Health and Science University, 3Department of Dermatology, Oregon Health and Science University, 4Knight Cancer Institute, Oregon Health and Science University

Summary

Hier zeigen wir die Methoden zur in Vivo Quantifizierung der Leukozyten Ausstieg aus naiv, entzündet, und bösartigen murinen Haut. Wir führen einen direkten Vergleich der beiden Modelle: transdermale FITC Anwendung und in Situ Ladungszustand. Darüber hinaus zeigen wir den Nutzen der Ladungszustand für die Verfolgung von Leukozyten Egress von kutanen Tumoren.

Abstract

Leukozyten-Ausstieg aus den peripheren Geweben, Lymphknoten ist nicht nur wichtig für die Immunüberwachung und Einleitung, sondern trägt auch zur Lösung der peripheren Gewebe Antworten. Während eine Vielzahl von Methoden werden verwendet, um die Leukozyten Ausstieg aus den nicht-lymphatischen, peripheren Geweben zu quantifizieren, bleiben die zellulären und molekularen Mechanismen, die Kontext-abhängige ausgehenden Regeln schlecht verstanden. Hier beschreiben wir die Verwendung von in Situ Ladungszustand für Quantitative Analyse der Leukozyten Ausstieg aus murinen Haut und Tumoren. Ladungszustand ermöglicht die direkte Kennzeichnung von Leukozyten in Hautgewebe aufhalten. Obwohl die Exposition der Haut gegenüber UV-Licht induziert lokale Entzündungsreaktionen Leukozyten Infiltrate und geprägt vaskulären Undichtigkeit in einem Direktvergleich mit transdermalen Anwendung von fluoreszierenden Tracern Ladungszustand speziell wandernde dendritische Zellenbevölkerungen beschriftet und aktiviert gleichzeitig die Quantifizierung der myeloischen und lymphatischen Egress von kutanen Mikroumgebungen und Tumoren. Die Mechanismen der Leukozyten Egress bleiben eine fehlende Komponente in unserem Verständnis der intratumorale Leukozyten Komplexität und damit die Anwendung der hier beschriebenen Tools bieten einzigartige Einblicke in die Dynamik der Tumor immun Mikroumgebungen beide im Steady State und im Ansprechen auf die Therapie.

Introduction

Periphere Gewebe Immunantworten sind geprägt durch Leukozyten Einstellung zu den Standorten von Entzündungen, sondern auch durch Mechanismen, die ihre spätere Aufbewahrung zu Regeln. Somit richtet sich schützende Immunität durch kumulative zellulären und molekularen Mechanismen, die bestimmen, ob ein Leukozyten eingibt, Aufenthalte innerhalb, oder besser gesagt aus peripheren Gewebe über Lymphgefäße migriert. Wichtig ist, ist die Neigung für Leukozyten Gewebe durch Lymphgefäße (genannt Egress) beenden ihre speziellen Funktionen verbunden. Dendritische Zellen (DC) erwerben Wanderungsverhalten in Reaktion auf Reifung Signale führt zu Antigen-Transport und Präsentation in Entleerung Lymphknoten (dLN), ein Prozess, der für adaptive Immunität1erforderlich ist. Aufräumvorgang myeloische Zellen wie Makrophagen und Neutrophilen, dienen der Apoptotic Rückstand durch Phagozytose zu löschen. Während der bakteriellen Infektion Neutrophilen Brandschutzzeichen Gewebe und letztlich Apoptose in dLNs2 und in einem Modell der DSS-induzierte Kolitis, Daten unterstützen die Hypothese, dass Makrophagen Egress lokale Entzündung3lösen muss. Ob Neutrophilen und Makrophagen Egress Auftritt in allen entzündlichen zusammenhängen, ist allerdings unbekannt. Beweise für die T-Lymphozyten Egress von Steady-State4,5,6,7, infizierte8und entzündeten4,9,10, 11,12 periphere, nicht-lymphatischen Gewebe zeigt, dass T-Zellen aktiv umwälzen, obwohl die gewebebasierten Signale, die diese Ausfahrt fahren schlecht verständlich bleiben. Mehrere Studien identifizierten Signale für gerichtete Migration in Richtung Entwässerung lymphatische Kapillaren und die anschließende Brandschutzzeichen einschließlich Chemokin (C-C-Motiv) Liganden 21 (CCL21) und seines Rezeptors CCR74,11, 13, Chemokin (C-X-C Motiv) Liganden 12 (CXCL12) und sein Rezeptor CXCR42,14, sowie Sphingosine-1-Phosphat (S1P)10,15,16. Diese Mechanismen sind nicht in allen Kontexten tätig, und ob sie Ausgang alle Zelltypen bestimmen, bleibt eine offene Frage. Wichtig ist, bedarf weiterer Einblick in die Mechanismen, die für Ausstieg und seine funktionelle Relevanz bei der Krankheit gelten quantitative in-Vivo -Methoden der Analyse.

Verschiedene Methoden wurden verwendet, um Ausstieg in mehreren Tiermodellen in Vivo einschließlich direkter Kanülierung der Lymphgefäße, Adoptiv Transfer von ex-Vivo mit der Bezeichnung Leukozyten, transdermale Anwendung von fluoreszierenden Tracer zu quantifizieren, Einspritzung der beschriftete Partikel und in Vivo Ladungszustand17,18. Direkte Kanülierung der afferenten Maus Lymphgefäße ist schwierig und Kleintiere begrenzt durch die Menge an Flüssigkeit, die gesammelt werden können. So Kanülierung vor allem bei großen Tieren durchgeführt wurde (zB., Schafe) wo solche chirurgischen Manipulationen sind praktisch. Diese Studien liefern direkte Hinweise auf das Vorhandensein des lymphatischen und myeloischen Zellen in Lymphknoten10,19,20. Darüber hinaus zeigen Schafe Modelle, dass akute und chronische Entzündungen Lymphozyten Präsenz in Lymphe durch fast 100-fold10,21 erhöht.

Adoptiveltern Übertragung von beschrifteten und genetisch manipulierter Lymphozyten hat vor allem ergeben, dass CCR7 für den Ausstieg von CD4 benötigt+ T-Zellen von akut entzündeten Haut5,11, während der Vorbehandlung von Lymphozyten mit dem kleinen Molekül S1P-Rezeptor-Agonist hemmt FTY720, nur teilweise ihren Ausgang10. Interessanterweise der Egress von übertragenen Lymphozyten von chronisch entzündete Haut ist CCR7-unabhängige10, aber erfordern teilweise CXCR49. Adoptiv-Transfer Experimente, liefern jedoch physiologisch Zahlen von Ex-Vivo aktivierte und beschriftete Lymphozyten in das Gewebe durch Injektion, die biomechanische Umwelt von Geweben und erhöhten interstitiellen Fluiddrücke verändert das erste lymphatische Kapillaren öffnen und ändern ihre Transport-Eigenschaften-22. Als alternative, transdermale Anwendung von Fluorescein erfolgt (FITC) in das Vorhandensein oder Fehlen von dermalen Reizstoffe (zB., Dibutyl Phthalat, DBP) oder Infektion23,24 ermöglicht die Verfolgung von phagocytic Zellen, die Tracer zu sammeln und zu dLNs migrieren. In ähnlicher Weise können Eindringmittel beschriftete Tumoren phagocytic Zellen zu verfolgen, die Tumor Material25verschlungen haben. Diese Methoden haben wichtige Einblicke in die Mechanismen zur Verfügung gestellt, die regieren DC Ausgang13,14,17,26,27 , aber sind nicht in der Lage, nicht-phagocytic verfolgen Lymphozyten und Interpretation können durch kostenlose Lymphdrainage des löslichen FITC so Kennzeichnung nicht migrierend LN ansässige DCs erschwert werden.

Alternativ ist intravitalen Mikroskopie ein leistungsfähiges Werkzeug, das in Vivo Verfolgung von physiologisch relevanten Leukozyten Populationen in Echtzeit28,29ermöglicht. In Kombination mit dem Reporter Mäuse und Antikörper-basierten in Vivo immunofluorescent Kennzeichnung intravitalen Mikroskopie ergab die komplexe räumliche und zeitliche Dynamik der immunen Zellen des Drogenhandels, einschließlich interstitielle Migration30 , Seelenwanderung über das lymphatische Endothel, Passage innerhalb der lymphatischen Lumen und Migration auf LN Eintrag28,31. Breite Akzeptanz der intravitalen bildgebenden Verfahren wird durch Kosten, notwendige Know-how zum Einrichten, begrenzt und beschränkt Durchsatz zur Quantifizierung der mehrere Zelltypen. Dennoch werden Kupplung quantitative Methoden, die Populationsdynamik analysieren Gewebe mit intravitalen Bildgebung zusätzliche und wichtige mechanistischen in Bezug auf die Mechanismen der Motilität und Migration in Richtung und im lymphatischen Kapillaren Einblick 18 , 31 , 32.

Infolgedessen in Vivo Ladungszustand entstanden als eine Methode, die in Situ zu etikettieren, erlaubt unabhängig von phagocytic Tätigkeit und für die Quantifizierung der physiologischen Leukozyten Ausgang (wenn in Verbindung mit Durchflusszytometrie) in der fehlen oder Vorhandensein von Herausforderung. Kaede-Tg Mäuse express konstitutiv ein Protein isoliert von Stony Coral, die grüne Fluoreszenz (Kaede grün) aufweist, bis UV-Licht ausgesetzt nach denen es irreversibel zu rote Fluoreszenz (Kaede rot)33umwandelt. Photoconverted Zellen können verfolgt werden, wie sie von Seiten der peripheren Gewebe Brandschutzzeichen und reichern sich in dLNs. Dies und andere ähnliche Photoconvertible Maus Modelle34,35 ergaben sich wichtige Biologie einschließlich konstitutive Egress von regulatorischen T-Zellen von Haut36, CXCR4-abhängige B Zelle Austritt von Peyer Patches37 , Mobilisierung von Residenten Speicher T-Zellen auf Peptid erneut herausfordern38und breiten Leukozyten Egress von Tumor Mikroumgebungen39. Hier führen wir einen direkten Vergleich der Ladungszustand mit transdermalen FITC Anwendung im Rahmen der kutanen Entzündung und Infektion mit der Photoconvertible-Methode zum direkten Vergleich der vorhandenen Daten zu ermöglichen. Wir zeigen Ladungszustand im implantierten Tumoren und beschreiben die Umwandlungs-Leistungsfähigkeit und selektive Egress von Tumor Mikroumgebungen. So, wir argumentieren, dass die weitere Anwendung dieser Methoden benötigt wird, um die kritische Biologie der Leukozyten Egress von Tumoren, aufzuklären, die erhebliche Auswirkungen auf die Interpretation intratumorale Leukozyten Komplexität, anti-Tumor Immunität haben wird und Ansprechen auf die Therapie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle tierischen Protokolle wurden von den institutionellen Animal Care und Use Committee an der Oregon Health & Science University genehmigt.

1. Induktion von Entzündungen und FITC Malerei der Maus Pinna

  1. In einem Laminar-Flow-Haube, betäuben Mausklick C57Bl/6 mit verdampftem Isofluorane (bei 3-5 % Isofluorane induzieren und pflegen auf 1-3 % Isofluorane; Sauerstoff Durchflussmenge bei 0,5-1,0 L/min). Richtige Anesthetization zu gewährleisten, durch die Überwachung des Verlust Pedal-Reflex, unwillkürliche Bewegungen und reduzierte Atemfrequenz.
  2. Legen Sie ein Ohr flach mit der Bauchseite das Ohr nach oben. Pipettieren 20 µL 5 % FITC Lösung aufgelöst in 1:1 Aceton: Dibutyl Phthalat (DBP) auf die ventrale Seite des Ohr Ohrmuschel. Lassen Sie das Ohr ein paar Sekunden trocknen.
  3. 24 h nach dem Auftragen FITC einschläfern die Mäuse über CO2-Exposition durch zervikale Dislokation gefolgt. Sammeln Sie das Ohr Ohrmuschel in PBS durch die Ohren vom Kopf mit einer Schere zu trennen. Sammeln Sie die zervikalen dLNs und leisten--Entwässerung LNs in PBS mit einer Pinzette die LNs getrennt vom umgebenden Gewebe. Leisten--Entwässerung LNs dient als negative Kontrollen auf das Vorhandensein von FITC+/Kaede rot+ Leukozyten. Entsorgen Sie Kadaver pro institutionelle Protokoll.
    Hinweis: Die optimale Zeit Post Ladungszustand zur Analyse hängt von Zelltyp und bekannte wandernde Verhalten. Dendritische Zellen können beispielsweise in dLNs bereits als 6 h Post DBP-Anwendung erkannt werden.

(2) Induktion von Entzündungen und Ladungszustand der Maus Pinna

  1. Betäuben Sie in einem Laminar-Flow-Haube Kaede-Tg Maus (Hintergrund C57Bl/6) durch intraperitoneale Injektion von 80 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin in Kochsalzlösung aufgelöst. Richtige Anesthetization zu gewährleisten, wie in Schritt 1.1 beschrieben.
  2. Legen Sie ein Ohr flach mit der Bauchseite das Ohr nach oben. Pipettieren 20 µL einer 1:1 Aceton: DBP auf der ventralen Seite des Ohr Pinna. Lassen Sie das Ohr ein paar Sekunden trocknen.
  3. Schneiden Sie nach Anwendung der DBP einen Schlitz in ein Stück Alufolie und ziehen Sie das Ohr durch den Schlitz, das Ohr auf die violetten Lichtquelle aussetzen. Legen Sie das Ohr flach mit der dorsalen Seite nach oben mit doppelseitigem Klebeband, um das Ohr an der Folie zu sichern.
  4. Positionieren Sie das Ohr direkt unter der Lichtquelle und Photoconvert für 3 min mit einer 405 nm Lichtquelle mit 100 mW Leistung.
  5. 24 h nach Ladungszustand, einschläfern Kaede-Tg-Mäuse und das Ohr Ohrmuschel, zervikale LNs und inguinalen LNs zu ernten, wie in Schritt 1.3 beschrieben.
    Hinweis: Neben Überlegungen in Schritt 1.3 zitiert, die Rate der Verbreitung bestimmt den Zeitpunkt der Analyse wie der Verlust von Kaede rot in sich schnell teilenden Zellen auftreten wird.

(3) Vaccinia Infektion der Maus Pinna und FITC Anwendung

  1. Eine C57Bl/6-Maus mit verdampftem Isofluorane zu betäuben, wie in Schritt 1.1 beschrieben.
  2. Die Bauchseite des Ohres flach zu legen. Pipettieren 5 x 106 Plaque bilden Einheiten (PFU) des Vaccinia Virus (VacV) in 10 µL PBS auf Ohr Pinna verdünnt. Mit einer 29-Gauge-Nadel, stechen Sie die Ohrmuschel 25 Mal40.
  3. 24 h nach der Infektion, VacV-infizierte Mäuse mit Isofluorane zu betäuben, wie unter Schritt 1.1 und Pipettieren 20 µL 5 % FITC in Aceton auf der Bauchseite der Ohr-Pinna gelöst. Lassen Sie das Ohr ein paar Sekunden trocknen.
  4. 24 h nach dem Auftragen FITC einschläfern die Mäuse und das Ohr Ohrmuschel, zervikale LNs und inguinalen LNs zu sammeln, wie in Schritt 1.3 beschrieben.
    Hinweis: FITC kann zu jeder Zeitpunkt Post Infektion DC Menschenhandel in verschiedenen 24 h Abständen bestimmen angewendet werden. Wir berichteten bereits, dass DC-Migration auf dLNs auf ähnlichem Niveau von Tag 1 bis 3 Post-Infektion41aufrechterhalten wird.

4. Vaccinia Infektion der Maus Pinna und Ladungszustand.

  1. Kaede-Tg Maus mit verdampftem Isofluorane zu betäuben, wie in Schritt 1.1 beschrieben.
  2. Das Ohr Ohrmuschel mit VacV zu infizieren, wie in Schritt 3.2 beschrieben.
  3. 24 h nach der Infektion, Kaede VacV-infizierten Mäusen wie in Schritt 2.1 beschrieben zu betäuben und Ladungszustand durchführen, wie 2.3-2.4 beschrieben.
  4. 24 h nach Ladungszustand, einschläfern die Mäuse und das Ohr Ohrmuschel, zervikale LNs und inguinalen LNs zu ernten, wie in Schritt 1.3 beschrieben.
    Hinweis: Wie bereits erwähnt in Schritt 3.4 kann Ladungszustand bei jeder Zeitpunkt Post Infektion verabreicht werden.

(5) Ohr und Lymphknoten Verarbeitung für Durchflusszytometrie

  1. Erstellen Sie einzelne Zellsuspensionen von Ohr Ohrmuschel: schälen auseinander ventralen und dorsalen Rand mit zwei paar Pinzette und Ort mit der Innenseite nach unten in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit 1 mg/mL Kollagenase D und 80 U/mL DNase verdünnt im Ohr Ohr Pinna Hank es gepuffert salzhaltige Lösung (HBSS) (mit Ca2 + und Mg2 +). Inkubation bei 37 ° C für 30 min. Presse das verdaute Gewebe durch ein 70 µm Nylon Zelle Sieb.
  2. Erstellen Sie einzelne Zellsuspensionen von LNs: Brunnen von einer 24-Well-Platte mit 1 mg/mL Kollagenase D und 80 U/mL DNase verdünnt in HBSS LNs entgegenbringen. Öffnen Sie den Lymphknoten Kapsel mit zwei 29-Gauge Nadeln und inkubieren Sie die Lymphknoten bei 37 ° C für 30 min. Presse das verdaute Gewebe durch ein 70 µm Nylon Zelle Sieb zu necken.

6. intrakutane Melanom Tumor Implantation und Ladungszustand.

  1. Rasieren Sie das Fell von der Mitte des Rückens Mausklick Kaede-Tg mit einen elektrischen Rasierapparat.
  2. Positionieren Sie eine 29-Gauge-Nadel in der Mitte des Rückens zwischen der linken und rechten oberen Scapulae und Mikrodialysemembranen injizieren Sie 5 x 105 Tumorzellen (in 50 µL Kochsalzlösung verdünnt) in die Haut von Mäusen, Kaede-Tg. Tumoren müssen sorgfältig positioniert werden, um Lymphdrainage zu bestimmten Lymphknoten (alsolinks und rechts brachial LNs für Tumoren in der Mitte des oberen Rückens platziert) zu gewährleisten. Vermeiden Sie den Tumor über dLN, da direkte Ladungszustand der LNs durch die Hauttumor führen kann.
  3. Die Tumoren wachsen auf gewünschte Größe (100-650 mm3) zu ermöglichen.
  4. Betäuben Sie einen Tag vor der Entnahme von Gewebe, Kaede-Tg Maus zu, wie unter 2.1 beschrieben und Rasieren Sie jede neu nachgewachsene Fell rund um den Tumor zu.
  5. Schneiden Sie ein kreisrundes Loch in Alufolie und durchziehen Sie den Tumor, den Tumor auf die Lichtquelle aussetzen. Schneiden Sie das Loch etwas kleiner als der Tumor zu verhindern, dass den Tumor wieder durch das Loch zu fallen, und minimieren Sie die Umwandlung der benachbarten, keinen Tumor Haut.
  6. Positionieren Sie den Tumor direkt unterhalb der Lichtquelle und Photoconvert für 5 min mit einer 405 nm Lichtquelle mit 200 mW Leistung.
  7. 24 h nach Ladungszustand, einschläfern die Mäuse, wie in Schritt 1.3 beschrieben. Sammeln Sie die Tumoren, brachial dLNs und leisten--Entwässerung LNs in PBS. Schneiden Sie die Tumoren von der umgebenden Haut mit einer Schere und entfernen Sie LNs zu, wie in Schritt 1.3 beschrieben.

(7) Tumor und Lymphknoten Verarbeitung für Durchflusszytometrie

  1. Erstellen Sie einzelne Zellsuspensionen von Tumoren: Tumoren mit einer Schere in Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit 1 mg/mL Kollagenase D und 80 U/mL DNase verdünnt in HBSS Blatt vor den Mund. Inkubation bei 37 ° C für 1 h Presse das verdaute Gewebe durch ein 70 µm Nylon Sieb.
  2. Erstellen Sie einzelne Zelle Aussetzung der Lymphknoten, wie im Schritt 5.2 beschrieben.

(8) Antikörper für die Durchflusszytometrie Färbung

  1. Führen Sie nach verdauen das Gewebe in einzelnen Zellsuspensionen, standard Flow Cytometry befleckenden Techniken um die Zellen mit Markierungen von Interesse zu beschriften. Kurz, Pipettieren 2 x 106 Zellen in einer 96-Well-Platte. Inkubieren Sie die Proben mit Fc-Block (1 µg/mL) für 20 min auf Eis; Waschen Sie sich zweimal mit FACs-Puffer (1 % Rinderserumalbumin mit PBS-Puffer). Den Proben lebenden/Toten Fleck (verdünnt mit PBS-Puffer) hinzugefügt und inkubieren Sie für 15 min auf Eis; Waschen Sie sich zweimal mit FACs-Puffer. Brüten Sie mit Primärantikörpern (Table of Materials) in FACs Puffer für 30 min auf Eis verdünnt; Waschen Sie sich zweimal mit FACs-Puffer.
    Hinweis: Kaede grüne und rote Fluoreszenz zu mit FITC und PE Fluorophore Überschneidungen Kaede; Somit können nicht in Kombination mit Kaede Proteine FITC und PE-konjugierten Antikörpern verwendet werden.
  2. Laufen Sie nach der Färbung die Proben auf einem Durchflusszytometer. Alternativ, befestigen Sie die Zellen mit 2 % PFA.

9. Flow Cytometry Analysis

  1. Legen Sie die FITC (Kaede grün) und PE (Kaede rot) Kanal PMT Spannungen auf 70-80 % des gesamten Bereichs (zentrieren Bevölkerung um ungefähr 104) mit ex-Vivo Kaede grün oder rot Kaede einfarbige Splenocyten oder Blut.
    Hinweis: Kompensieren Sie nicht die Kaede grün (FITC) und Kaede rot (PE) Kanäle wie dadurch größere Signal verteilt wird.
    1. Um einfarbige Kaede Steuerelemente erstellen, eine Milz oder Blut aus Kaede-Tg Maus zu sammeln. Lyse der roten Blutkörperchen mit ACK-Puffer, dann die Zellen in zwei Gruppen unterteilen: unbekehrt Kaede grün und konvertierte Kaede rot.
    2. Für einfarbig Kaede auszusetzen rot-Steuerelemente, die Zellen in 1 mL PBS und Photoconvert in einer 24-Well-Platte für 5 min mit einem 405 nm Lichtquellen mit einer Leistung von 100 mW. Verwenden Sie diese Zellen einstellen von Kaede grün (FITC) und Kaede rote PMT Spannungen auf das Durchflusszytometer (Schritt 9.1).
  2. Sobald die Spannungen für die Kaede Proteine eingestellt wurde, für alle anderen Primärantikörper Flecken mit Single-Fluorophore beschriftet Entschädigung Perlen pro des Herstellers zu kompensieren.
  3. Laufen Sie die Proben auf einem Durchflusszytometer, Daten zu sammeln.
    Hinweis: Das Protein Kaede wird kontinuierlich durch die Zellen produziert. Dies bedeutet, dass 24 h nach Ladungszustand, umgebaute Zellen werden doppelt positiv für Kaede grün und Kaede rot wie neu synthetisierte Kaede (grün) Protein in der Zelle angesammelt hat.
  4. Analysieren Sie die Daten mithilfe von FlowJo Software oder eine ähnliche Software.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Zuerst wollten wir replizieren Ladungszustand Ergebnisse veröffentlicht in der Literatur zu bewerten die Effizienz und die damit verbundenen Entzündung in der Maus Haut festzulegen. Der Ohr-Pinna 100 mW UV-Licht ausgesetzt war (405 nm) für 3 min33wie zuvor beschrieben. Einzelne Zellsuspensionen generiert aus dem Ohr Haut oder zervikalen dLNs unmittelbar nach der Exposition einen 78 % Wirkungsgrad von allen CD45 offenbart+ Leukozyten in der Haut mit keine umgewandelten Zellen beobachtet in dLNs (Abbildung 1A). Um die entzündliche Reaktion zugeordneten Ladungszustand zu bewerten, haben wir die Zahlen der Infiltration CD45 quantifiziert+ Leukozyten im umgebauten Ohren 0 und 24 h post Umwandlung (Abbildung 1 b) und akute Veränderungen im vaskulären Permeabilität gemessen von Mile Assay42 (Abbildung 1). Kurz, injiziert 200 µL 0,5 % war Evans Blue intravascularly 2 h nach Ladungszustand. Die Ohren wurden 30 min gesammelt, nachdem die Injektion und Evans Blue mit Formamid 24 h bei 55° C (Absorption bei 610 nm42lesen) extrahiert wurde. Beide CD45+ infiltriert (24 h) und vaskuläre Leck (2 h) wurden deutlich erhöht, nach der Ladungszustand, darauf hinweist, dass auch bei dieser kurzen Exposition Ladungszustand selbst die gewebespezifischen entzündliche Reaktion beeinflussen kann. Vergleich zu CD45+ infiltriert (Abbildung 1 b) und vaskuläre Leck (1,4 µg/Ohr ±0.75) in VacV infiziert Ohren 24 h Post Infektion41 bietet Kontext für das Ausmaß der Entzündung verursacht durch UV-Licht (0,08 µg/Ohr ± 0,01).

Während mehrere Modelle in verschiedenen Studien verwendet wurden, um der Leukozyten Egress von nicht-lymphatischen, peripheren Geweben zu verfolgen, ist unklar, wie diese Methoden in ihrer Fähigkeit, bestimmte Bevölkerungsgruppen zu verfolgen, wie sie aus die Haut zu vergleichen. Daher haben wir beschlossen, einen direkte Direktvergleich der beiden gängigen Methoden zum Nachverfolgen von DC Ausgang an LNs, durchzuführen FITC Farbe und in Vivo Ladungszustand, für die Beurteilung der Effizienz und Spezifität der einzelnen Methoden für quantitative Analyse der DC-Ausgang im Steady-State, während einer kutanen Entzündung und von infizierten Haut. Für jede Analyse war die Haut ausgesetzt transdermale FITC Anwendung oder dem Licht ausgesetzt ist 100 mW 405 nm für 3 min. LN DC Populationen als CD3ε definiert wurden–CD19–ARBEITSPLATZAUSSTATTUNG+CD11c+ und weitere geschichtet in 1) ARBEITSPLATZAUSSTATTUNGHallo CD11cInt DCs, die für wandernde DCs (mDCs) beide CD103 bereichert+ BATF3-abhängige Kreuz-präsentierenden DCs und CD11b+ dermalen DCs; und 2) ARBEITSPLATZAUSSTATTUNGIntCD11cHallo DCs, die bereichert für ansässige DCs (rDCs) einschließlich CD8α+ BATF3-abhängige Kreuz-präsentierenden DCs (Abbildung 2A). 24 h nach FITC Anwendung oder Ladungszustand der markierten Zellen waren leicht nachweisbaren in Entleerung aber nicht ablassen LNs (Abb. 2 b). Um das Ausmaß der DC-Migration auf LNs zu quantifizieren und gleichzeitig bestimmen die Spezifität der Methode zur Kennzeichnung von wandernden Populationen und LN nicht Wohnbevölkerung, quantifizierte wir beschrifteten mDCs und RVGs im Steady-State, 24 h nach der Anwendung des DBP, und 48 h nach VacV Scarification (Abbildung 2). Während Ladungszustand (Kaede) und FITC mDCs unter allen Bedingungen gekennzeichnet, beobachteten wir mehr FITC-markierte als Kaede beschriftet mDCs in dLNs, mit Ausnahme des VacV Infektion, wo die beiden Methoden ein ähnliches Niveau der Egress quantifiziert. Darüber hinaus im Rahmen der DBP beschriftet FITC zusätzlich rDC Populationen Ladungszustand dort speziell für mDCs (Abbildung 2 blieb). Mit beiden Methoden, beobachteten wir den Ausstieg von rund 200 DCs von VacV infizierte Haut und vor allem darauf hingewiesen, dass dieses Niveau der Austritt zuvor veröffentlichten Ergebnisse mit transdermalen FITC Anwendung, indem Loo Et Al. rekapituliert 41. so je nach entzündlichen Kontext transdermale FITC Anwendung erhöht die Nummern der beschrifteten DCs in dLNs und führen zu unspezifischen Kennzeichnung nicht migrierend LN-Resident DC Populationen, während Ladungszustand erkannt speziell identifiziert DCs in einer mDC-Bevölkerung fallen.

Kaede-Tg Mäuse wurden verwendet, um die Leukozyten-Aufbewahrung in5,33,43 und Egress von5,6,35,38 Haut-, Schleimhaut, zu quantifizieren und lymphatischen Gewebe unter steady State und Bedingungen entzündet und für Tumoren nur in einer einzigen Publikation, wo die Tumoren in der Mouse-Ohren und Photoconverted bei Kleinmengen39intradermale implantiert wurden. So haben wir versucht, den Nutzen von in Vivo Ladungszustand für die Quantifizierung von Leukozyten Ausstieg aus etablierten, großen Primärtumoren ermöglichen weitere immunologische Hypothesentests bewerten. Erstens implantiert wir MC38 Tumorzellen Mikrodialysemembranen in Kaede-Tg Mäuse zwischen der linken und rechten Schulterblatt. Implantierbare Tumor Modelle ermöglichen eine präzise Positionierung der Tumoren, Lymphdrainage, bekannte LNs zu gewährleisten; Tumoren in der Haut des oberen platziert zurück in erster Linie Abfluss nach links und rechts brachial LNs. Nach erreichen der 100-150 mm-3, die Tumoren waren Photoconverted (10 min, 200 mW) und die Tumoren und dLNs sofort nach Ladungszustand geerntet. Analyse von Durchflusszytometrie ergab signifikante Umwandlung von intratumorale CD45+ Zellen aus Kaede Grün+ , Kaede rot+ (69 %; Abbildung 3A), während vor allem dLNs blieb negativ für Kaede rote+ Zellen. Immunfluoreszenz-Mikroskopie von Photoconverted YUMM 1.7 Tumoren ergab, dass Ladungszustand dringt tief in das Tumorgewebe (> 1 mm; Abb. 3 b). Interessant ist, Ausdruck der Haut und vaskuläre Zellen hohe Niveau des Kaede Proteins führt zu hohen Ladungszustand Effizienz dieser Zelltypen wie in Abb. 3 bzu sehen. Dieser hohe Kaede rote Ausdruck macht es schwierig, die Immunzellen (beide unbekehrt und konvertiert) identifizieren mit Immunfluoreszenz-Mikroskopie.

Unser besondere Interesse an Melanom Immunologie gegeben, wir als nächstes bewertet die Wirkung der Tumorgröße und Melanin auf Ladungszustand Effizienz mit verschiedenen implantierbaren murinen Tumor-Zelllinien: MC38 (nichtpigmentierte Darmkrebs-Linie), B16. F10 (Melanin produzierenden Melanom Linie), YUMM 1.1 (nichtpigmentierte Melanom-Linie) und YUMM 1,7 (nichtpigmentierte Melanom Linie)44. Jede dieser Linien wurden intradermale in Kaede-Tg Mäuse und Photoconverted, implantiert, wie oben beschrieben bei verschiedenen Lautstärken Tumor (50-650 mm3). Die Tumoren wurden unmittelbar nach der Ladungszustand geerntet und auf das Vorhandensein von Kaede rote CD45 ausgewertet+ Leukozyten durch Durchflusszytometrie. Interessanterweise, der Ladungszustand Effizienz von CD45+ Leukozyten sehr unterschiedlich über die Tumortypen und Größen (Abbildung 3). CD45+ Leukozyten in kleinen (50-150 mm3) demonstriert YUMM 1,7 und YUMM 1.1 Tumoren die effizienteste Ladungszustand bei 80 % und 60 %, beziehungsweise. Da die Bände für diese Tumoren erhöht, verringert die Wirkungsgrade zu rund 50 % bei großen Tumoren (> 600 mm-3). Melanin hatte einen markanten Einfluss auf Ladungszustand Effizienz: maximale Ladungszustand für CD45+ Zellen innerhalb von Melanin produzierenden B16. F10 Tumoren war nur etwa 30 % und 10 % gesunken, da die Tumoren Volumen von 400 mm3erreicht. Analyse der intratumorale CD8+ T Zellen Interessanterweise offenbarten Ladungszustand Effizienz für diese Zellen bei fast 80-90 % in kleinen Tumoren unabhängig von Melanin-Produktion (Abbildung 3D). Für nichtpigmentierte Tumoren, CD8+ T-Zell-Konvertierung blieb hoch, auch wenn die Tumoren große Mengen erreicht, aber verringerte signifikant mit der Größe, wenn das Melanin vorhanden war. Als solcher, den Nutzen der B16. F10 murinen Melanome und anderen Melanin produzierenden Melanom Linien möglicherweise beschränkt sich auf kleine Tumoren (50 mm3), die steht im Einklang mit der biologischen Funktion von Melanin im Licht absorbieren. Um die entzündliche Reaktion der Ladungszustand der Tumoren zugeordnet zu bewerten, haben wir die Anzahl der CD45 quantifiziert+ Zellen in unkonvertierte Tumoren und konvertierte Tumoren 24 h Post Ladungszustand (Abbildung 3E). Wir sahen keinen signifikanten Unterschied in der Gesamtzahl der CD45+ Zellen in Tumoren 24 h nach der Ladungszustand gegenüber unkonvertierte Tumoren entdeckt.

Wir als nächstes quantifiziert der Leukozyten Egress von Tumor Mikroumgebungen mit Kaede-Tg-Mäusen, die für die Abfrage des Drogenhandels Verhalten der beiden myeloischen und lymphatischen Zelltypen ermöglicht. MC38 oder YUMM 1.7 Tumorzellen waren Kaede-Tg Mäuse Mikrodialysemembranen implantiert. Die Tumoren wurden Photoconverted, sobald die Volumina zwischen 100-150 mm3 erreicht (5 min, 200 mW); brachial dLNs und leisten--Entwässerung LNs wurden 24 h nach der Ladungszustand gesammelt. Intratumorale Leukozyten Populationen wurden von MC38 quantifiziert und YUMM 1.7 Tumoren in Kontrolle C57Bl/6 Mäusen implantiert und gesammelt, wenn die Tumoren 100-150 mm3erreicht. Wir bewerten die Leukozyten Komplexität innerhalb der Tumoren und egressed Bevölkerungen durch Durchflusszytometrie: T-Zellen (CD3ε CD4+ /CD8+ /+), B-Zellen (CD3ε–CD19+), DCs (CD11c++CD11b ARBEITSPLATZAUSSTATTUNG+ /- ), Neutrophile (CD11b+ARBEITSPLATZAUSSTATTUNG–Ly6G+), Makrophagen (CD11b+++F4/80 ARBEITSPLATZAUSSTATTUNG), und entzündliche Monozyten (CD11b+Ly6G–Ly6C+; Abbildung 4A). Dieses gleiche gating Schema verwenden, haben wir die Prozent der Bevölkerung jedes Leukozyten dLNs, die Kaede Rot zeigt frühere Wohnsitz im Tumor Mikroumgebungen (Abbildung 4 b) ausgedrückt ausgewertet. Interessanterweise, während beide MC38 (Abbildung 4) YUMM 1,7 (Abbildung 4) Tumoren waren vor allem mit den myeloiden Zellen (DCs, Monozyten und Makrophagen) infiltriert wurden etwa 50 % der Zellen, die von beiden Tumorarten egressed hatte T Lymphozyten (beide CD4+ und CD8+). Neben T-Zellen beobachteten wir auch DCs, B-Zellen und Monozyten innerhalb egressed Populationen von Tumoren aber Makrophagen und Neutrophile wurden aus beiden Tumorart nicht erkannt. Insgesamt zeigt diese Daten das Dienstprogramm Kaede-Tg Photoconvertible Mäuse für die Verfolgung von mehreren Leukozyten-Linien in einer endogenen. Unserer Analyse zufolge darüber hinaus Egress ist eine gezielte, aktive Prozess, der erhebliche Auswirkungen auf die Bestimmung intratumorale Leukozyten Komplexität haben können.

Figure 1
Abbildung 1: Ladungszustand Effizienz und die damit verbundenen Entzündungen in murinen Haut. Murine Lederhaut war Photoconverted für 3 min bei 100 mW (405 nm Licht). (A) repräsentative Fluss Grundstücke abbildenden Photoconverted (Kaede rot+) CD45+ Zellen aus einer nicht konvertierten und konvertierte Ohr und zervikalen dLN unmittelbar nach Ladungszustand. Populationen waren bereits geschlossenen Leben weiter, CD45+ einzelne Zellen. (B) Aufzählung der gesamten CD45+ Zellen in unkonvertierte Ohren (-), Ohren erfasst sofort folgende Ladungszustand, Ohren 24 h nach Ladungszustand gesammelt und Ohren 24 h nach VacV Infektion gesammelt (n = 3). (C) A Mile Test wurde durchgeführt, um die vaskuläre Undichtigkeit sofort nach der Belichtung 405 nm zu quantifizieren (3 min, 100 mW). Repräsentatives Bild von Leckagen im Ohr Haut (links) und Quantifizierung der extrahierten Farbstoff (rechts) (n = 3). Fehlerbalken darzustellen SEM. *p< 0,05 und **p< 0,01. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: DC Ausgang von naiv, entzündet, und infizierte Haut. (A) Gating Schema zu identifizieren, wandernde DCs (mDCs; ARBEITSPLATZAUSSTATTUNGHalloCD11cInt) und resident DCs (rDCs; ARBEITSPLATZAUSSTATTUNGHalloCD11cHallo). (B) repräsentative Fluss Grundstücke anzeigenden FITC+ oder Kaede rote+ DCs, Pre-gated auf mDCs, von den Mäusen mit VacV (dLN) oder kontralateralen nicht-Entwässerung LN Steuerelemente infiziert. (C) Quantifizierung der Zahl von roten Kaede+ und FITC+ mDCs und RVGs in dLNs Steady-State, DBP entzündet (24 h post Anwendung) und VacV infizierten Haut (48 h Post Infektion). Fehlerbalken darzustellen SEM Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Ladungszustand Effizienz im Tumor Mikroumgebungen. Tumoren wurden Photoconverted für 10 min bei 200 mW (405 nm Licht). (A) repräsentative Fluss Grundstücke aus Kaede grün und Kaede in nicht konvertierten und konvertierte MC38 Tumoren und brachial dLN unmittelbar nach Ladungszustand rot. Populationen waren bereits geschlossenen Leben weiter, CD45+ Einzel-Zellen. (B) Immunfluoreszenz von gefrorenen, OCT eingebettet YUMM 1.7 Tumoren sowohl unbekehrt und Photoconverted Microcopy. Maßstabsleiste 200 µm. (C) Wirkungsgrad von CD45 =+ Leukozyten und CD8 (D) + Lymphozyten bei der Melanin-Produktion (B16. F10) und nichtpigmentierte (MC38, 1.1 YUMM YUMM 1,7). Jeder Punkt entspricht einen einzigen Mausklick. (E) Aufzählung der gesamten CD45+ Zellen in unkonvertierte Tumoren und Photoconverted Tumoren 24 h nach Ladungszustand gesammelt wurden (n = 3). Fehlerbalken darzustellen SEM Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Leukozyten Egress von Tumor Mikroumgebungen ist selektiv. (A) Gating Schema myeloische und lymphatischen Bevölkerungsgruppen in MC38 dLNs identifiziert. (B) repräsentative Fluss Grundstücke zur Identifizierung Kaede rote+ Zellen unter myeloischen und lymphatischen Zellen in MC38 dLNs 24 h nach Ladungszustand. Prozentsätze in Fluss Parzellen geben die Häufigkeit aus Kaede rote+ Zellen innerhalb der angegebenen übergeordneten Leukozyten Bevölkerung in LNs. (C, D) relativen Anteile der intratumorale (% von CD45+ Zellen) und egressed (% Kaede rote+ Zellen; brachial dLNs) Leukozyten aus MC38 (C, n = 3) und YUMM 1.7 (D, n = 4) Tumoren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Obwohl der Leukozyten Egress von peripheren, nicht-lymphatischen Geweben für die Initiierung und Auflösung der Immunantwort ankommt, sind die molekularen Mechanismen, die ausgehenden Regeln kaum erforscht. Diese Wissenslücke ist vor allem auf hohe Verfügbarkeit von Werkzeugen für die Quantifizierung in Vivo. Hier beschreiben wir die Verwendung von Photoconvertible Mäusen (Kaede-Tg) zu quantifizieren endogenen Leukozyten Austritt aus der Haut und Tumoren eine direkte Direktvergleich mit FITC-Lack in entzündliche und Infektionsmodelle. Wir zeigen, dass während beide Modelle endogenen DC Bevölkerung verfolgen, freie Entwässerung der FITC und schlechte Aufnahme von nicht-phagocytic Zellen begrenzt das Dienstprogramm FITC Farbe für breit angelegten Analyse der myeloischen und lymphatischen Ausstieg aus den peripheren, nicht-lymphatischen Geweben einschließlich Tumoren. Darüber hinaus präsentieren wir Ihnen die Daten, die zeigt an, dass der Ausstieg aus der Tumore selektiv als stochastische und bestätigt damit die Ergebnisse präsentiert von Torcellan Et al. 39. weitere Untersuchung der Mechanismen für die Leukozyten Egress von Tumoren kann sich herausstellen, neuartige Einblicke in Tumor-assoziierte Entzündung und Immunität.

Zuerst die Effizienz der Ladungszustand in murinen Haut und deren Auswirkungen auf lokale Entzündung wird ausgewertet, wenn Einstellungen in der Literatur berichtet. Die Belichtung der Ohren bis violett Licht für 3 min bei 100 mW Leistung führte zu effizienten Ladungszustand der CD45+ Zellen innerhalb der Ohr Haut (78 %) ohne Konvertierung in nachgelagerten dLNs. Berichte in der Literatur zeigen, dass die 3-5 min Belichtung optimal für kutanen Gewebe5,33,38ist. Diese Ausstellung führte jedoch zu erhöhten Anzahlen von CD45+ Zellen in der Ohr-Pinna 24 h nach der Umwandlung und vaskuläre Leckage, die darauf hinweist, dass Ladungszustand bei diesen Einstellungen im Ohr Haut induziert lokalen Entzündung, wenn berücksichtigt werden sollten Interpretation der Daten. Als nächstes wollten wir DC handeln in LNs mit Kaede Ladungszustand und die allgemein genutzten FITC Farbe Assay23,24 im Steady State während der DBP-induzierte Entzündung und vom VacV infiziert Ohren direkt miteinander vergleichen. Wir beobachteten, dass erhöhte Kennzeichnung in FITC behandelt, im Vergleich zu Photoconverted Haut im Steady State und folgenden DBP-Behandlung. Anwendung des freien FITC Haut kann führen direkte Entwässerung über Lymphgefäße Entwässerung LNs wo resident DC Populationen, die nicht migrieren (zB., CD8α+ DCs), FITC probieren. Einklang mit diesem, beobachteten wir bedeutende Zahlen von rDCs mit FITC-Label, wenn mit der reizenden DBP behandelt. Im Gegensatz dazu Kaede rot-markierten DCs nur beobachtet im folgenden mDC-Bevölkerung, die darauf hinweist, dass Ladungszustand Ladungszustand bietet eine genauere Möglichkeit, Label mDCs. Auch innerhalb der mDC-Bevölkerung beobachteten wir quantitativ mehr beschrifteten mDCs wenn FITC über Ladungszustand verwendet wurde. Während dies auch durch kostenlose FITC Entwässerung erklärt werden kann, ist es möglich, dass die Unterschiede in der Periode des Benennens, wo der Ladungszustand nur DCs derzeit beschriften kann Bewohner in der Haut während der FITC in der Haut für die Dauer der 24 h bleibt , die Unterschiede in der beobachteten mDC Egress entfallen. Interessant ist, im Rahmen einer Virusinfektion, Ladungszustand und FITC Anwendung gemessen relativ gleiches Niveau der mDC Ausstieg und paar FITC+ RVGs in der LNs Trockenlegung VacV-infizierten Ohren. Wir berichteten kürzlich, dass Lymphdrainage deutlich reduzierten folgende VacV Infektion ist, und damit die viral bedingte Rückgang der lymphatischen Transport kann die Spezifität der FITC Farbe verbessern und reduziert, Kennzeichnung von LN DC Wohnbevölkerung31 . Wichtig ist, diese Arbeit unterstreicht auch die Tatsache, dass innerhalb der mDC-Bevölkerung (CD3ε–CD19–ARBEITSPLATZAUSSTATTUNGHalloCD11cInt), die Anzahl der DCs, die innerhalb von 24 h aktiv migriert haben ist eine kleinere Bevölkerung und damit insgesamt mDC Zahlen sind kein guter Ersatz für aktive Migration41. Schließlich ist es interessant festzustellen, dass wir konsequent mDC Ausstieg bei rund 200 Zellen für jede gegebene 24 h Zeitraum folgende VacV Infektion41, bei 1500-2000 DCs Egress von Tumor Mikroumgebungen quantifizieren. Die enorme Wirksamkeit des VacV als ein Impfstoff-Plattform gegeben, besonders wenn durch Scarification45,46,47, ist es interessant zu spekulieren, dass es die Qualität der DC und vielleicht die Art von DC präsentieren Antigen, als auf die Quantität, der bestimmt, robuste schützende Immunität.

Leukozyten Egress von Tumor Mikroumgebungen über DCs25,48, bleibt ein schlecht untersuchten Gebiet. Obwohl die Tumoren chronisch entzündete Mikroumgebungen gelten, bleibt ob ähnliche Mechanismen regulieren zelluläre Ausstieg aus dem nicht-malignen und malignen Gewebe unbekannt. Darüber, ob Leukozyten Egress von Tumoren stochastische wird oder eher selektive erhebliche Auswirkungen auf die Interpretation von Leukozyten Anhäufung und Speicherung im Tumor Mikroumgebungen haben. Als solche kann Leukozyten Egress von Tumoren entscheidend für das Verständnis, wie Tumoren Immunüberwachung umgehen werden und führen zu neuen Strategien für die Immuntherapie. Hier wenden wir das Photoconvertible Kaede-Tg-Modell, um die Leukozyten Egress von implantierbaren kutanen Tumoren zu studieren, wo FITC Farbe, um ausreichen würde im großen und ganzen myeloische und lymphatischen Populationen zu kennzeichnen. Erste Studien ergab, dass Ladungszustand Effizienz in implantierten Tumoren angewiesen, sowohl bei der Größe des Tumors und Melanin. Während Ladungszustand Wirkungsgrad rapide abfällt, wie Tumoren wachsen wenn Melanin vorhanden ist (B16. (F10), nicht pigmentierten Tumor Linien wie die YUMM und MC38 Tumoren weisen stabiler Wirkungsgrad über Tumor Größen getestet. Interessanterweise beobachtet wir verbesserten Wirkungsgrad in der CD8+ T Zellkompartiment im Vergleich zu CD45+ Zellen, die als Tumoren erhöhte in der Größe zurückgegangen. Es gibt wahrscheinlich mehrere Faktoren, die diese Beobachtung. Erstens wird die Lage innerhalb eines Tumors die Belichtung und damit der Wirkungsgrad von bestimmten Zelltypen auswirken. T-Zellen findet man häufig auf der Haut-Tumor-Schnittstelle in implantierbare Tumormodellen beschränkt und somit möglicherweise leichter Photoconverted im Verhältnis zu myeloische Zellen infiltriert der Tumor Parenchym. Zweitens nicht alle Leukozyten zum Ausdruck bringen das gleiche Niveau der Kaede Protein49 und somit möglicherweise nicht alle gleichermaßen durch Durchflusszytometrie nachgewiesen werden; Dies kann, um beobachtet Prozentsätze der Ladungszustand zu senken, wenn eine mehr heterogene Zellpopulation wie alle CD45 analysiert+ Zellen. Zu guter Letzt ist es wichtig zu beachten, dass die in Abbildung 3 dargestellten Daten generierte folgenden 10 min von violettem Licht ausgesetzt war. Diese anfängliche Belichtungszeit wurde ausgewählt anhand der Berichte in der Literatur zitiert Ladungszustand Zeiten für verschiedene Organe, einschließlich Haut, LNs, Schleimhaut-Gewebe und Tumoren5,6,33,35 ,39,43. Die nur andere Studie beschäftigt das Photoconvertible System in Tumoren, war Ladungszustand für 20 min39durchgeführt. Eine weitere Optimierung in unseren Händen zeigte verbesserte Effizienz durch eine verkürzte Belichtungszeit von 5 min für kleine und große Mengen. Es ist wahrscheinlich, dass über längere Zeit zu Immunofluoreszenz Fluoreszenz Kaede führt, und als solche unsere gemeldeten Wirkungsgrade möglicherweise unterschätzt. Über längere Zeit kann auch führen zu erhöhten Ladungszustand verbundenen Entzündungen und Studienergebnisse zu verwirren. Tumoren Photoconverted für 5 min zeigte keinen signifikanten Unterschied in der Anzahl der intratumorale CD45+ 24 h nach Ladungszustand gegenüber unkonvertierte Tumoren Zellen. Darüber hinaus demonstriert die Tumoren Photoconverted für 5 min messbar und reproduzierbar Ausstieg für myeloischen und lymphatischen Populationen. Individuelle Optimierung in bestimmten Geweben oder Tumoren von Interesse sind deshalb notwendig, um optimale Ergebnisse zu erzielen.

Zu guter Letzt haben wir in Situ Ladungszustand endogenen Leukozyten Ausstieg aus Kaede-Tg Mäusen eingepflanzt Tumoren zu quantifizieren. Mit zwei verschiedenen implantierbaren, nicht pigmentiert Tumormodellen beobachteten wir erhebliche Egress von DCs, T-Zellen und Monozyten. Einklang mit kürzlich veröffentlichtes Werk39, beide CD4+ und CD8+ T Zellen egressed von Tumor Mikroumgebungen sowie eine beträchtliche Anzahl von Double Negative CD3ε+ T Zellen. Zumindest kann eine Komponente dieser Bevölkerung Gamma Delta T-Zellen als zuvor beschriebenen39, sein, obwohl die funktionelle Bedeutung dieser Beobachtung bleibt bestimmt werden. Wichtig ist, beim Vergleich der Anteile der Leukozyten, die egressing von Tumoren, die relativen Anteile der Leukozyten in den Tumor Mikroumgebungen beobachteten wir Leukozyten Bereicherung in egressed Populationen relativ intratumorale Pools im Beide Modelle, selektive Leukozyten Egress angibt. Vor allem Makrophagen und Neutrophilen waren abwesend in egressed Populationen, obwohl beide Zelltypen beschrieben worden, Ausstieg unter entzündeten und infizierten Bedingungen2,50,51,52 , 53 , 54 und sind wesentlich zum intratumorale Leukozyten Repertoire39,55,56. So der Leukozyten Egress von Tumoren mit Photoconvertible Modellen quantifiziert werden kann, ist nicht aber eher einem geregelten Prozess stochastische und bleibt eine wichtige und erforschten Biologie mit erheblichen Auswirkungen für entzündliche Verständnis und immun-Dynamik im Tumor Mikroumgebungen im Steady-State und im Ansprechen auf die Therapie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben keine Konflikte offenzulegen.

Acknowledgments

Die Autoren möchten Dr. Marcus Bosenberg danken für die Bereitstellung YUMM 1.1 und 1.7 YUMM murinen Melanom Linien und Dr. Deborah J. Fowell für die Bereitstellung von B6. CG-Tg(CAG-tdKaede) 15Utr Mäuse im Einvernehmen mit RIKEN BRC durch nationale Bio-Ressource des MEXT, Japan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase D Roche 11088866001
DNase Roche 4536282001
Silver-LED-405B light source with optical fiber and collimtor Prizmatix Ltd V8144
Fluorescein isothiocyanate isomer I Sigma-Aldrich F4274
dibutyl phthalate Sigma-Aldrich 524980
acetone Macron Fine Chemicals 2440-02
29-guage syringes Exel International 26029
Evans Blue Sigma-Aldrich E2129
70 um cell strainers VWR 732-2758
paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
HBSS Caisson HBL06
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit Invitrogen L34966
Purified Anti-mouse CD16/CD32 Tonbo Biosciences 70-0161-M001
BV605 CD11c (clone N418) Biolegend 117334
PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2) BD Pharmingen 562363
BV421 CD3e (clone 145-2C11) Biolegend 100341
APC CD8a (clone 53-6.7) TonBo Biosciences 20-0081-u100
APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11) Biolegend 103116
BV650 CD19 (clone 6D5) Biolegend 115541
PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4) Biolegend 128011
Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8) Biolegend 123121
APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8) Biolegend 127623
BV711 CD11b (clone M1/70) Biolegend 101241
BV605 CD45 (clone 30-F11) Biolegend 103155
BV711 CD4 (clone RM4-5) BD Biosciences 563726
Bovine serum albumin (Fraction V) Fisher Scientific BP1600-100
Anit-Rat and Anti-Hamster Igk / Negative Control Compensation Particle Set BD Biosciences 552845
Fortessa Flow Cytometer BD Biosciences
FlowJo v10 Software FlowJo

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
  2. Hampton, H. R., Bailey, J., Tomura, M., Brink, R., Chtanova, T. Microbe-dependent lymphatic migration of neutrophils modulates lymphocyte proliferation in lymph nodes. Nature Communications. 6, 7139 (2015).
  3. D'Alessio, S., et al. VEGF-C-dependent stimulation of lymphatic function ameliorates experimental inflammatory bowel disease. Journal of Clinical Investigation. 124 (9), 3863-3878 (2014).
  4. Debes, G. F., et al. Chemokine receptor CCR7 required for T lymphocyte exit from peripheral tissues. Nature Immunology. 6 (9), 889-894 (2005).
  5. Bromley, S. K., Yan, S., Tomura, M., Kanagawa, O., Luster, A. D. Recirculating memory T cells are a unique subset of CD4+ T cells with a distinct phenotype and migratory pattern. Journal of Immunology. 190 (3), 970-976 (2013).
  6. Tomura, M., et al. Activated regulatory T cells are the major T cell type emigrating from the skin during a cutaneous immune response in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (3), 883-893 (2010).
  7. Tomura, M., Itoh, K., Kanagawa, O. Naive CD4+ T lymphocytes circulate through lymphoid organs to interact with endogenous antigens and upregulate their function. Journal of Immunology. 184 (9), 4646-4653 (2010).
  8. Jennrich, S., Lee, M. H., Lynn, R. C., Dewberry, K., Debes, G. F. Tissue exit: a novel control point in the accumulation of antigen-specific CD8 T cells in the influenza a virus-infected lung. Journal of Virology. 86 (7), 3436-3445 (2012).
  9. Geherin, S. A., Wilson, R. P., Jennrich, S., Debes, G. F. CXCR4 is dispensable for T cell egress from chronically inflamed skin via the afferent lymph. PLoS One. 9 (4), e95626 (2014).
  10. Brown, M. N., et al. Chemoattractant receptors and lymphocyte egress from extralymphoid tissue: changing requirements during the course of inflammation. Journal of Immunology. 185 (8), 4873-4882 (2010).
  11. Bromley, S. K., Thomas, S. Y., Luster, A. D. Chemokine receptor CCR7 guides T cell exit from peripheral tissues and entry into afferent lymphatics. Nature Immunology. 6 (9), 895-901 (2005).
  12. Gomez, D., Diehl, M. C., Crosby, E. J., Weinkopff, T., Debes, G. F. Effector T Cell Egress via Afferent Lymph Modulates Local Tissue Inflammation. Journal of Immunology. 195 (8), 3531-3536 (2015).
  13. Ohl, L., et al. CCR7 governs skin dendritic cell migration under inflammatory and steady-state conditions. Immunity. 21 (2), 279-288 (2004).
  14. Kabashima, K., et al. CXCL12-CXCR4 engagement is required for migration of cutaneous dendritic cells. American Journal of Pathology. 171 (4), 1249-1257 (2007).
  15. Cyster, J. G., Schwab, S. R. Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs. Annual Review of Immunology. 30, 69-94 (2012).
  16. Matloubian, M., et al. Lymphocyte egress from thymus and peripheral lymphoid organs is dependent on S1P receptor 1. Nature. 427 (6972), 355-360 (2004).
  17. Teijeira, A., Rouzaut, A., Melero, I. Initial afferent lymphatic vessels controlling outbound leukocyte traffic from skin to lymph nodes. Frontiers in Immunology. 4, 433 (2013).
  18. Hunter, M. C., Teijeira, A., Halin, C. T Cell Trafficking through Lymphatic Vessels. Frontiers in Immunology. 7, 613 (2016).
  19. Bujdoso, R., Hopkins, J., Dutia, B. M., Young, P., McConnell, I. Characterization of sheep afferent lymph dendritic cells and their role in antigen carriage. Journal of Experimental Medicine. 170 (4), 1285-1301 (1989).
  20. Young, A. J. The physiology of lymphocyte migration through the single lymph node in vivo. Seminars in Immunology. 11 (2), 73-83 (1999).
  21. Seabrook, T., et al. The traffic of resting lymphocytes through delayed hypersensitivity and chronic inflammatory lesions: a dynamic equilibrium. Seminars in Immunology. 11 (2), 115-123 (1999).
  22. Swartz, M. A., et al. Mechanics of interstitial-lymphatic fluid transport: theoretical foundation and experimental validation. Journal of Biomechanics. 32 (12), 1297-1307 (1999).
  23. Macatonia, S. E., Knight, S. C., Edwards, A. J., Griffiths, S., Fryer, P. Localization of antigen on lymph node dendritic cells after exposure to the contact sensitizer fluorescein isothiocyanate. Functional and morphological studies. Journal of Experimental Medicine. 166 (6), 1654-1667 (1987).
  24. Robbiani, D. F., et al. The leukotriene C(4) transporter MRP1 regulates CCL19 (MIP-3beta, ELC)-dependent mobilization of dendritic cells to lymph nodes. Cell. 103 (4), 757-768 (2000).
  25. Roberts, E. W., et al. Critical Role for CD103(+)/CD141(+) Dendritic Cells Bearing CCR7 for Tumor Antigen Trafficking and Priming of T Cell Immunity in Melanoma. Cancer Cell. 30 (2), 324-336 (2016).
  26. Forster, R., et al. CCR7 coordinates the primary immune response by establishing functional microenvironments in secondary lymphoid organs. Cell. 99 (1), 23-33 (1999).
  27. Johnson, L. A., Jackson, D. G. The chemokine CX3CL1 promotes trafficking of dendritic cells through inflamed lymphatics. Journal of Cell Science. 126, 5259-5270 (2013).
  28. Teijeira, A., et al. T Cell Migration from Inflamed Skin to Draining Lymph Nodes Requires Intralymphatic Crawling Supported by ICAM-1/LFA-1 Interactions. Cell Reports. 18 (4), 857-865 (2017).
  29. Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PLoS One. 8 (2), e57135 (2013).
  30. Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin alphaV. Nature Immunology. 14 (9), 949-958 (2013).
  31. Russo, E., et al. Intralymphatic CCL21 Promotes Tissue Egress of Dendritic Cells through Afferent Lymphatic Vessels. Cell Reports. 14 (7), 1723-1734 (2016).
  32. Steven, P., Bock, F., Huttmann, G., Cursiefen, C. Intravital two-photon microscopy of immune cell dynamics in corneal lymphatic vessels. PLoS One. 6 (10), e26253 (2011).
  33. Tomura, M., et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 105 (31), 10871-10876 (2008).
  34. Shand, F. H., et al. Tracking of intertissue migration reveals the origins of tumor-infiltrating monocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (21), 7771-7776 (2014).
  35. Tomura, M., et al. Tracking and quantification of dendritic cell migration and antigen trafficking between the skin and lymph nodes. Scientific Reports. 4, 6030 (2014).
  36. Moran, A. E., et al. T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse. Journal of Experimental Medicine. 208 (6), 1279-1289 (2011).
  37. Schmidt, T. H., Bannard, O., Gray, E. E., Cyster, J. G. CXCR4 promotes B cell egress from Peyer's patches. Journal of Experimental Medicine. 210 (6), 1099-1107 (2013).
  38. Beura, L. K., et al. T Cells in Nonlymphoid Tissues Give Rise to Lymph-Node-Resident Memory T Cells. Immunity. 48 (2), 327-338 (2018).
  39. Torcellan, T., et al. In vivo photolabeling of tumor-infiltrating cells reveals highly regulated egress of T-cell subsets from tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114 (22), 5677-5682 (2017).
  40. Khan, T. N., Mooster, J. L., Kilgore, A. M., Osborn, J. F., Nolz, J. C. Local antigen in nonlymphoid tissue promotes resident memory CD8+ T cell formation during viral infection. Journal of Experimental Medicine. 213 (6), 951-966 (2016).
  41. Loo, C. P., et al. Lymphatic Vessels Balance Viral Dissemination and Immune Activation following Cutaneous Viral Infection. Cell Reports. 20 (13), 3176-3187 (2017).
  42. Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. (73), e50062 (2013).
  43. Morton, A. M., et al. Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (18), 6696-6701 (2014).
  44. Meeth, K., Wang, J. X., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations. Pigment Cell Melanoma Research. 29 (5), 590-597 (2016).
  45. Demkowicz, W. E., Littaua, R. A., Wang, J., Ennis, F. A. Human cytotoxic T-cell memory: long-lived responses to vaccinia virus. Journal of Virology. 70 (4), 2627-2631 (1996).
  46. Stewart, A. J., Devlin, P. M. The history of the smallpox vaccine. Journal of Infection. 52 (5), 329-334 (2006).
  47. Hammarlund, E., et al. Duration of antiviral immunity after smallpox vaccination. Nature Medicine. 9 (9), 1131-1137 (2003).
  48. Lund, A. W., et al. Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).
  49. Tomura, M., Kabashima, K. Analysis of cell movement between skin and other anatomical sites in vivo using photoconvertible fluorescent protein "Kaede"-transgenic mice. Methods in Molecular Biology. , 279-286 (2013).
  50. Bellingan, G. J., Caldwell, H., Howie, S. E., Dransfield, I., Haslett, C. In vivo fate of the inflammatory macrophage during the resolution of inflammation: inflammatory macrophages do not die locally, but emigrate to the draining lymph nodes. Journal of Immunology. 157 (6), 2577-2585 (1996).
  51. Gautier, E. L., Ivanov, S., Lesnik, P., Randolph, G. J. Local apoptosis mediates clearance of macrophages from resolving inflammation in mice. Blood. 122 (15), 2714-2722 (2013).
  52. Abadie, V., et al. Neutrophils rapidly migrate via lymphatics after Mycobacterium bovis BCG intradermal vaccination and shuttle live bacilli to the draining lymph nodes. Blood. 106 (5), 1843-1850 (2005).
  53. Beauvillain, C., et al. CCR7 is involved in the migration of neutrophils to lymph nodes. Blood. 117 (4), 1196-1204 (2011).
  54. Rigby, D. A., Ferguson, D. J., Johnson, L. A., Jackson, D. G. Neutrophils rapidly transit inflamed lymphatic vessel endothelium via integrin-dependent proteolysis and lipoxin-induced junctional retraction. Journal of Leukocyte Biology. 98 (6), 897-912 (2015).
  55. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
  56. Binnewies, M., et al. Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy. Nature Medicine. 24 (5), 541-550 (2018).

Tags

Biologie Ausgabe 143 Lymphgefäße Brandschutzzeichen Menschenhandel Kaede FITC malen Leukozyten Melanom
Quantifizierung der Leukozyten Egress über Lymphgefäße aus murinen Haut und Tumoren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Steele, M. M., Churchill, M. J.,… More

Steele, M. M., Churchill, M. J., Breazeale, A. P., Lane, R. S., Nelson, N. A., Lund, A. W. Quantifying Leukocyte Egress via Lymphatic Vessels from Murine Skin and Tumors. J. Vis. Exp. (143), e58704, doi:10.3791/58704 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter