Summary
Hier tonen we de methoden voor in vivo kwantificering van leukocyten egress van naïef, ontstoken, en kwaadaardige lymfkliertest huid. Wij voeren een head-to-head vergelijking van twee modellen: transdermaal FITC toepassing en in situ photoconversion. Bovendien tonen wij het nut van photoconversion voor het bijhouden van leukocyten egress van cutane tumoren.
Abstract
Leukocyten egress uit perifere weefsels naar zuig lymfeklieren is niet alleen cruciaal voor immuun toezicht en inleiding maar draagt ook bij aan de resolutie van de perifere weefsel reacties. Hoewel een verscheidenheid van methoden worden gebruikt om te kwantificeren leukocyte egress uit niet-lymfoïde, perifere weefsels, blijven de cellulaire en moleculaire mechanismen die context-afhankelijke egress regeren slecht begrepen. Hier beschrijven we het gebruik van in situ photoconversion voor kwantitatieve analyse van leukocyten egress van lymfkliertest huid en tumoren. Photoconversion zorgt voor de directe etikettering van leukocyten woonachtig binnen cutane weefsel. Hoewel de blootstelling van de huid aan violet licht lokale induceert inflammatoire reacties gekenmerkt door leukocyten infiltreert en vasculaire leakiness, in een head-to-head vergelijking met transdermale toepassing van fluorescente verklikstoffen, photoconversion specifiek Label trekkende dendritische cel populaties en gelijktijdig ingeschakeld de kwantificering van myeloïde en lymfoïde egress van cutane microenvironments en tumoren. De mechanismen van leukocyten egress blijven een ontbrekende onderdeel in ons begrip van intratumoral leukocyten complexiteit zal, en aldus de toepassing van de instrumenten die hierin worden beschreven uniek inzicht in de dynamiek van tumor immuun microenvironments beide bij steady state en in reactie op de therapie.
Introduction
Perifere weefsel immuunresponsen zijn gevormd, niet alleen door leukocyten aanwerving aan de sites van ontsteking, maar ook door mechanismen die hun latere retentie regelen. Dus, beschermende immuniteit is ingegeven door cumulatieve cellulaire en moleculaire mechanismen die bepalen of een leukocyte invoert, blijft binnen, of liever gezegd migreert is uit perifere weefsel via de lymfevaten. Nog belangrijker is, is de neiging voor leukocyten om af te sluiten van weefsel via de lymfevaten (zogenaamde egress) gekoppeld aan hun gespecialiseerde functies. Dendritische cellen (DC) verwerven trekgedrag in reactie op signalen van de rijping leidt tot antigeen vervoer en presentatie in het aftappen lymfklieren (dLN), een proces dat nodig is voor adaptieve immuniteit1. Opruiming myeloïde cellen, zoals macrofagen en neutrofielen, dienen apoptotic puin door fagocytose te wissen. Tijdens de bacteriële infectie, neutrofielen egress weefsel en uiteindelijk ondergaan apoptosis in dLNs2 en een model van DSS-geïnduceerde colitis, gegevens ondersteunt de hypothese dat de macrofaag egress is noodzakelijk om te lossen lokale ontsteking3. Of neutrofiele en macrofaag egress plaatsvindt in alle inflammatoire contexten, is echter onbekend. Bewijs voor T lymfocyten uitgang uit de steady-state4,,5,,6,7, besmette8en ontstoken4,9,10, 11,12 perifere, niet-lymfoïde weefsels geeft aan dat T-cellen actief recirculate, hoewel de weefsel gebaseerde signalen die deze afslag rijden blijven slecht begrepen. Verschillende studies hebben geïdentificeerd signalen nodig voor de directionele overgang naar het aftappen van lymfatische haarvaten en latere egress inclusief chemokine (C-C motief) ligand 21 (CCL21) en de receptor CCR74,11, 13, chemokine (C-X-C motief) ligand 12 (CXCL12) en de receptor CXCR42,14, en sphingosine-1-fosfaat (S1P)10,15,16. Deze mechanismen zijn niet actief in alle contexten, echter, en of ze bepalen uitgang van alle celtypes blijft een open vraag. Nog belangrijker is, verder vereist inzicht in de mechanismen die egress en haar functionele relevantie in ziekte regeren kwantitatieve in-vivo analysemethoden.
Verschillende methoden zijn gebruikt om het kwantificeren van de uitgang in meerdere diermodellen in vivo met inbegrip van directe cannulation van lymfevaten, adoptief overdracht van ex vivo label leukocyten, transdermale toepassing van fluorescente verklikstoffen, injectie van gelabelde deeltjes, en in vivo photoconversion17,18. Directe cannulation van de lymfevaten afferent muis is moeilijk en kleine dieren beperkt door de hoeveelheid vloeistof die kunnen worden verzameld. Dus cannulation is grotendeels uitgevoerd in grote dieren (bv., schapen) waar dergelijke chirurgische manipulaties zijn praktische. Deze studies leveren direct bewijs voor de aanwezigheid van zowel lymfoïde en myeloïde cellen in lymfe10,19,20. Bovendien, schapen modellen onthullen dat acute en chronische ontsteking lymfocyt aanwezigheid in lymfe steeg met bijna 100-fold10,-21.
Adoptief overdracht van gelabelde en genetisch gemanipuleerde lymfocyten belangrijker is gebleken dat CCR7 vereist voor de uitgang van CD4 is+ T cellen van acuut ontstoken huid5,11, terwijl de voorbehandeling van lymfocyten met het kleine molecuul S1P receptor agonist remt FTY720, slechts gedeeltelijk hun egress-10. Interessant is dat de uitgang van overgedragen lymfocyten van chronisch ontstoken huid is CCR7-onafhankelijke10, maar kan gedeeltelijk CXCR49vereisen. Adoptief overdracht experimenten, leveren niet-fysiologische aantal ex vivo echter geactiveerd en gelabelde lymfocyten in weefsel via injectie, dat de biomechanische omgeving van weefsels en een verhoogde interstitiële vloeistof druk verandert dat opent eerste lymfatische haarvaten en veranderen hun vervoer eigenschappen22. Als een alternatieve, transdermale toepassing van fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) in de aanwezigheid of afwezigheid van dermale irriterende stoffen (bv., dibutylftalaat, DBP) of infectie23,24 voorziet in het bijhouden van fagocytische cellen die accumuleren tracer en migreren naar dLNs. Evenzo fluorescently geëtiketteerde tumoren een manier bieden waarmee bijhouden fagocytische cellen die tumor materiële25hebben opgeslokt. Deze methoden hebben verstrekt belangrijk inzicht verschaffen in de mechanismen die regeren DC uitgang13,14,17,26,27 , maar zijn niet in staat om bij te houden van niet-fagocytische lymfocyten en interpretatie kunnen worden bemoeilijkt door gratis lymfedrainage van oplosbare FITC dus labeling niet-trekvogels, LN resident DCs.
U kunt ook is intravital microscopie een krachtig hulpmiddel waarmee voor in vivo bijhouden van fysiologisch relevante leukocyte populaties in real-time28,29. Gebruikt in combinatie met de verslaggever muizen en antilichaam gebaseerde in vivo immunefluorescentie labeling, intravital microscopie is gebleken dat de complexe ruimtelijke en temporele dynamiek van immuun cel mensenhandel, waaronder interstitiële migratie30 , zielsverhuizing over de lymfatische endotheel, passage binnen de lymfatische lumen en migratie op LN vermelding28,31. Brede goedkeuring van intravital beeldvormingstechnieken wordt beperkt door de kosten, de nodige expertise voor instellen, en doorvoer voor het kwantificeren van meerdere celtypen beperkt. Nog steeds, koppeling van de kwantitatieve methodes die het analyseren van de populatiedynamiek weefsels met intravital imaging geven extra en belangrijk mechanistische inzicht met betrekking tot de mechanismen van de motiliteit en migratie naar en binnen lymfatische haarvaten 18 , 31 , 32.
Bijgevolg, in vivo photoconversion heeft ontpopt als een methode voor het in situ labelen, waarmee onafhankelijk van fagocytische activiteit, en voor de kwantificering van fysiologische leukocyte egress (wanneer in combinatie met stroom cytometry) in de afwezigheid of aanwezigheid van uitdaging. Constitutively express Kaede-Tg muizen een proteïne van stony koraal dat groene fluorescentie (Kaede groene) vertoont totdat blootgesteld aan violet licht, waarna het onomkeerbaar wordt omgezet in rode fluorescentie (Kaede rode)33geïsoleerd. Photoconverted cellen kunnen worden getraceerd als zij egress van perifere weefsel sites en zich ophopen in de dLNs. Dit en andere soortgelijke photoconvertible muis modellen34,35 is gebleken dat belangrijke biologie met inbegrip van constituerende egress van regulatoire T-cellen van huid36, CXCR4-afhankelijke B-cel egress van Peyer van patches37 , mobilisatie van resident T geheugencellen op peptide opnieuw uitdaging38, en brede leukocyte egress tumor microenvironments €39. Hierin, voeren wij een head-to-head vergelijking van photoconversion met transdermaal FITC toepassing in het kader van cutane ontsteking en infectie te voorzien in rechtstreekse vergelijking van bestaande gegevens met de photoconvertible-methode. Bovendien, we tonen photoconversion geïmplanteerde tumoren en beschrijven van de omzettingsefficiëntie en selectieve egress van tumor microenvironments. Zo, we stellen dat verdere toepassing van deze methoden is nodig om te verhelderen van de kritische biologie van leukocyten egress van tumoren, die aanzienlijke gevolgen voor de interpretatie van intratumoral leukocyten complexiteit, anti-tumor immuniteit, zal hebben en respons op therapie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke protocollen zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité bij de Oregon Health & Science University.
1. de inductie van ontsteking en FITC schilderij van muis Pinna
- In een laminaire flow-kap, anesthetize een C57Bl/6-muis met behulp van gevaporiseerde isofluorane (induceren bij 3-5% isofluorane en zorg ervoor dat u 1-3% isofluorane; zuurstof debiet op 0.5-1.0 L/min). Zorgen voor goede afstomping door controle op het verlies van pedaal reflex, onwillekeurige bewegingen en respiratoire tarief.
- Leg een oor plat met de ventrale zijde van het oor naar boven. Pipetteer 20 µL van 5% FITC-oplossing opgelost in 1:1 aceton: dibutylftalaat (DBP) aan de ventrale zijde van oor pinna. Het toestaan van het oor te drogen voor een paar seconden.
- 24 h na FITC toepassing, euthanaseren de muizen via kooldioxide blootstelling gevolgd door cervicale dislocatie. De veervormige oor in PBS verzamelen door het scheiden van de oren van het hoofd met behulp van schaar. De cervicale dLNs en inguïnale niet-drainage LNs in PBS met pincet te scheiden van de LNs van omringende weefsels verzamelen. Lies niet-drainage LNs zal dienen als negatieve controles op de aanwezigheid van FITC+/Kaede rode+ leukocyten. Verwijdering van karkassen per institutionele protocol.
Opmerking: De optimale tijd post photoconversion voor analyse zal afhangen van het celtype en bekende trekkende gedrag. Dendritische cellen, kunnen bijvoorbeeld worden opgespoord in dLNs als vroeg als 6 h post DBP toepassing.
2. de inductie van ontsteking en Photoconversion van muis Pinna
- Anesthetize in de kap van een laminaire flow, een Kaede-Tg muis (achtergrond C57Bl/6) door intraperitoneale injectie van 80 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine, opgelost in een zoutoplossing. Zorg ervoor u juiste afstomping zoals beschreven in stap 1.1.
- Leg een oor plat met de ventrale zijde van het oor naar boven. Pipetteer 20 µL van een 1:1 aceton: DBP aan de ventrale zijde van de pinna oor. Het toestaan van het oor te drogen voor een paar seconden.
- Na toepassing van de DBP, Knip een spleet in een stuk aluminiumfolie en hecht van het oor door de gleuf aan het blootstellen van het oor naar de violet licht bron. Leg het oor plat met de dorsale zijde naar omhoog met behulp van dubbelzijdige tape teneinde het oor aan de folie.
- Plaats het oor direct onder de lichtbron, alsmede de photoconvert gedurende 3 minuten met behulp van een 405 nm lichtbron op 100 mW kracht.
- 24u na photoconversion, euthanaseren de Kaede-Tg muizen en de oogst van het oor veervormige, cervicale LNs en inguïnale LNs zoals beschreven in stap 1.3.
Opmerking: Naast overwegingen aangehaald in stap 1.3, de tarieven van proliferatie bepalend zijn voor de timing van de analyse als het verlies van Kaede rood optreden zal in de cellen snel te verdelen.
3. "vacciniavirus" infectie van muis Pinna en FITC-toepassing
- Anesthetize een C57Bl/6 muis met gevaporiseerde isofluorane zoals beschreven in stap 1.1.
- Leg de ventrale zijde van het oor plat. Pipetteer 5 x 106 plaque-vormende eenheden (PFU) van het "vacciniavirus" virus (VacV) verdund in 10 µL van PBS op de pinna oor. Met behulp van een 29-gauge-naald, steken de pinna 25 keer40.
- 24 uur na infectie, anesthetize VacV-geïnfecteerde muizen met isofluorane zoals beschreven in stap 1.1 en Pipetteer 20 µL 5% FITC in aceton op de ventrale zijde van de pinna oor opgelost. Het toestaan van het oor te drogen voor een paar seconden.
- 24 h na FITC toepassing, euthanaseren van de muizen en de oor veervormige, cervicale LNs en inguïnale LNs verzamelen zoals beschreven in stap 1.3.
Opmerking: FITC kan worden toegepast op eventuele infecties tijd punt bericht om te bepalen van DC mensenhandel op verschillende tijdstippen van de 24 h. Eerder meldden wij dat DC migratie naar dLNs op een vergelijkbaar niveau van dag 1 tot en met 3 post infectie41wordt gehandhaafd.
4. "vacciniavirus" infectie van muis Pinna en Photoconversion.
- Anesthetize een Kaede-Tg muis met gevaporiseerde isofluorane zoals beschreven in stap 1.1.
- Infecteren de pinna oor met VacV zoals beschreven in stap 3.2.
- 24u na infectie, anesthetize VacV-geïnfecteerde Kaede muizen zoals beschreven in stap 2.1 en photoconversion uit te voeren zoals beschreven in stap 2.3-2.4.
- 24 h na photoconversion, euthanaseren van de muizen en de oogst van het oor veervormige, cervicale LNs en inguïnale LNs zoals beschreven in stap 1.3.
Opmerking: Zoals hierboven vermeld in stap 3.4, photoconversion kan worden beheerd op een tijd-punt post-infectie.
5. oor en lymfeklier verwerking voor stroom Cytometry
- Maken van eencellige schorsingen van oor veervormige: schil uit elkaar de ventrale en dorsale zijkanten van het oor pinna twee paar pincet en plaats met de binnenkant van het oor naar beneden in de putjes van de plaat van een 24-well met 1 mg/mL collagenase D en 80 U/mL DNase verdund Henks gebufferde zout oplossing (HBSS) (met Ca2 + en Mg2 +). Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten druk op het weefsel verteerd door een 70 µm nylon cel zeef.
- Maken van eencellige schorsingen van LNs: LNs in putjes van de plaat van een 24-well met 1 mg/mL collagenase D en 80 U/mL DNase verdund in HBSS plaatsen. Open de lymfeklier capsule met behulp van twee 29-gauge naalden, en vervolgens uit te broeden de lymfeknopen bij 37 ° C gedurende 30 minuten druk op het weefsel verteerd door een 70 µm nylon cel zeef plagen.
6. intradermale Melanoma Tumor implantatie en Photoconversion.
- Scheren van de vacht van het midden van de achterkant van een Kaede-Tg-muis met behulp van een elektrisch scheerapparaat.
- Plaats een 29-gauge naald in het midden van de rug tussen de linker- en rechter boven scapulae, en 5 x 105 tumorcellen (verdund in 50 µL zoutoplossing) intradermaal injecteren in de huid van Kaede-Tg muizen. Tumoren moeten zorgvuldig worden geplaatst zodat de lymfedrainage naar opgegeven lymfeklieren (d.w.z., links en rechts brachialis LNs voor tumoren in het midden van de bovenrug geplaatst). Vermijd het plaatsen van de tumor boven dLN als dit leiden directe photoconversion van de LNs via de huid/tumor tot kan.
- Toestaan dat de tumoren groeien tot de gewenste grootte (100-650 mm3).
- Een dag voorafgaand aan weefsel collectie, een muis Kaede-Tg anesthetize zoals beschreven in punt 2.1 en scheren van elk nieuw regrown vacht rond de tumor.
- Een circulaire gat in aluminiumfolie en haal de tumor door de tumor aan de lichtbron bloot te stellen. Het gat iets kleiner dan de tumor om te voorkomen dat de tumor terug te vallen door het gat en de conversie van aangrenzende, niet-tumor huid te minimaliseren.
- Plaats van de tumor direct onder de lichtbron en photoconvert voor 5 min met behulp van een lichtbron voor 405 nm bij 200 mW vermogen.
- 24 h na photoconversion, euthanaseren de muizen zoals beschreven in stap 1.3. De tumoren, brachialis dLNs en inguïnale niet-drainage LNs in PBS verzamelen. Snij van de tumoren uit de buurt van de omliggende huid met behulp van schaar en verwijder LNs zoals beschreven in stap 1.3.
7. de tumor en lymfeklieren verwerking voor stroom Cytometry
- Maken van eencellige schorsingen van de tumoren: gehakt van de tumoren met een schaar in putjes van de plaat van een 24-well met 1 mg/mL collagenase D en 80 U/mL DNase verdund in HBSS. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 h. pers het verteerd weefsel door een 70 µm nylon zeef.
- Maak één celsuspensie van lymfklieren zoals beschreven in stap 5.2.
8. antilichaam kleuring voor stroom Cytometry
- Voer na het verteren van de weefsels in eencellige schorsingen, standaard stroom cytometry kleuring technieken om de cellen van een label met markeringen van belang. Kort, Pipetteer 2 x 106 cellen in een 96-wells-plaat. Incubeer de monsters met Fc blok (1 µg/mL) voor 20 min op het ijs; wassen tweemaal met FACs buffer (1% bovien serumalbumine in PBS). Live/dode vlek (verdund in PBS) toevoegen aan de monsters en incubeer gedurende 15 minuten op het ijs; wassen tweemaal met FACs buffer. Incubeer met primaire antilichamen (Tabel of Materials) verdund in FACs buffer gedurende 30 minuten op het ijs; wassen tweemaal met FACs buffer.
Opmerking: Kaede groen en Kaede rode fluorescentie met FITC en PE fluorophores overlapt; Dus, FITC en PE-geconjugeerde antilichamen kunnen niet worden gebruikt in combinatie met Kaede eiwitten. - Na kleuring, de monsters worden uitgevoerd op een cytometer van de stroom. Als alternatief, het herstellen van de cellen met de 2% PFA.
9. Stroom Cytometry analyse
- Stel de FITC (Kaede groen) en PE (Kaede rood) kanaal bet spanningen tot 70-80% van het totale bereik (centreren bevolking op ongeveer 104) met ex vivo Kaede groene of rode Kaede eenkleurige splenocytes of bloed.
Opmerking: Niet compenseren de Kaede groen (FITC) en Kaede rood (PE) kanalen zoals dit in meer signaal verspreid resulteren zal.- Eenkleurige Kaede als besturingselementen wilt maken, een milt of bloed van een Kaede-Tg muis te verzamelen. Lyse van de rode bloedcellen met ACK buffer, dan de cellen in twee groepen verdelen: onbekeerde Kaede groen en geconverteerde Kaede rood.
- Voor één kleur Kaede rode besturingselementen, schorten de cellen in 1 mL PBS en photoconvert in een 24-well plaat voor 5 min met behulp van een 405 nm lichtbronnen op een vermogen van 100 mW. Gebruik van deze cellen om te stellen de Kaede groen (FITC) en Kaede rode bet spanningen op het stroom cytometer (stap 9.1).
- Zodra de spanning voor de Kaede eiwitten is vastgesteld, compenseren voor alle andere primair antilichaam vlekken met behulp van de één-fluorophore label compensatie kralen per de instructies van de fabrikant.
- De monsters worden uitgevoerd op een stroom cytometer om gegevens te verzamelen.
Opmerking: Het eiwit Kaede voortdurend wordt geproduceerd door de cellen. Dit betekent dat 24 h na photoconversion, zullen de geconverteerde cellen dubbele positief voor Kaede groen en Kaede rood als nieuw samengestelde Kaede (groen) eiwit heeft opgelopen in de cel. - Het analyseren van de gegevens met behulp van FlowJo of een soortgelijke software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wij willen eerst repliceren photoconversion resultaten gepubliceerd in de literatuur tot evaluatie van de doeltreffendheid en de bijbehorende ontsteking in de huid van de muis te bepalen. De pinna oor was blootgesteld aan 100 mW violet licht (405 nm) voor 3 min33zoals hiervoor is beschreven. Eén cel schorsingen gegenereerd op basis van het oor huid of cervicale dLNs onmiddellijk na de blootstelling bleek een omzettingsefficiëntie van 78% van alle CD45+ leukocyten in de huid met geen geconverteerde cellen waargenomen in dLNs (figuur 1A). Om te beoordelen van de inflammatoire respons die is gekoppeld aan photoconversion, gekwantificeerd we het aantal infiltreren CD45+ leukocyten in geconverteerde oren 0 en 24 h plaatsen conversie (figuur 1B) en acute wijzigingen in vasculaire permeabiliteit als gemeten door mijl van Assay42 (Figuur 1 c). Kort, geïnjecteerd 200 µL van 0,5% blauw Evans was intravascularly 2 h na photoconversion. De oren werden verzameld 30 min na de injectie en blauwe Evans werd geëxtraheerd met formamide gedurende 24 uur bij 55° C (extinctie lezen bij 610 nm42). Beide CD45+ (24 h) infiltreert en vasculaire lek (2 h) werden aanzienlijk verhoogd na de photoconversion, die aangeeft dat zelfs op dit korte blootstelling, photoconversion zelf mogelijk van invloed op de ontstekingsreactie weefsel-specifieke. Vergelijking met CD45+ infiltreert (figuur 1B) en vasculaire lek (1,4 µg/oor-±0.75) in VacV besmet oren 24u post infectie41 biedt context voor de omvang van de ontsteking veroorzaakt door ultraviolette straling (0,08 µg/oor ± 0,01).
Terwijl verschillende modellen in verschillende studies zijn gebruikt voor het bijhouden van de leukocyten egress uit niet-lymfoïde, perifere weefsels, is het onduidelijk hoe deze methoden vergelijken in hun vermogen om bij te houden van specifieke populaties als ze de huid verlaat. Daarom hebben we besloten om het uitvoeren van een directe head-to-head vergelijking van twee veelgebruikte methoden voor het bijhouden van DC uitgang naar LNs, FITC verf en in vivo photoconversion, teneinde de efficiëntie en de specificiteit van elke methode voor kwantitatieve analyse van DC uitgang om steady state, tijdens cutane ontsteking en van geïnfecteerde huid. Voor elke analyse de huid was onderworpen aan transdermaal FITC toepassing of blootgesteld aan 100 mW 405 nm licht voor 3 min. LN DC populaties werden omschreven als CD3ε-CD19-MHCII+CD11c+ en verdere gelaagde in 1) MHCIIHallo CD11cint DCs, dat voor trekkende DCs (mDCs) beide CD103 verrijkt+ BATF3-afhankelijke Kruis-presenteren DCs en CD11b+ dermale DCs; en 2) MHCIIintCD11cHallo DCs, dat voor ingezeten DCs (rDCs verrijkt) met inbegrip van CD8α+ BATF3-afhankelijke Kruis-presentatie van DCs (figuur 2A). 24u na FITC toepassing of photoconversion, de gelabelde cellen waren in het aftappen gemakkelijk aantoonbaar maar niet niet-drainage LNs (figuur 2B). Te kwantificeren van de omvang van DC migratie naar LNs en tegelijkertijd bepalen de specificiteit van de methode voor het labelen van migreren bevolking en niet resident LN populaties, gekwantificeerd we gelabelde mDCs en rDCs om steady state, 24 h na de toepassing van de DBP, en 48 uur na VacV insnijding (figuur 2C). Terwijl photoconversion (Kaede) zowel FITC aangeduid als mDCs in alle omstandigheden, zien we meer FITC-geëtiketteerden dan Kaede-label mDCs in dLNs, met uitzondering van VacV infectie waar het gemakkelijkst een soortgelijk niveau van egress gekwantificeerd. Bovendien, in het kader van DBP, FITC bovendien label rDC populaties waar photoconversion bleef specifiek voor mDCs (figuur 2C). Beide methoden gebruikt, waargenomen we de egress van ongeveer 200 DCs van VacV besmette huid en vooral opgemerkt dat dit niveau van egress recapituleert eerder gepubliceerde bevindingen transdermaal FITC toepassing via Loo et al. 41. dus, afhankelijk van de context van het inflammatoire, transdermaal FITC toepassing kan verhogen het aantal gelabelde DCs ontdekt in dLNs en resulteren in het niet-specifieke etikettering van niet-migrerende LN-ingezeten DC populaties, terwijl photoconversion specifiek identificeert DCs vallen in een populatie van de mDC.
Kaede-Tg muizen zijn gebruikt om de handhaving van de leukocyten in5,33,43 - en egress van5,6,35,,38 cutaan, mucosa, kwantificeren en lymfoïde weefsels onder stabiel staat en ontstoken voorwaarden en toegepast op tumoren alleen in waar de tumoren in de muis oren en photoconverted op kleine aantallen39intradermale ingeplant waren één publicatie. Dus, wij willen het nut van in vivo photoconversion voor de kwantificering van leukocyten egress van gevestigde, grote primaire tumoren om verdere immunologische hypothesen evalueren. Ten eerste, we ingeplant MC38 tumorcellen intradermaal Kaede-Tg muizen tussen de linker en rechter scapulae. Implanteerbare tumor modellen in staat stellen nauwkeurige positionering van de tumoren om lymfedrainage aan bekende LNs; tumoren in de huid van de bovenste geplaatst terug voornamelijk afvoer naar links en rechts brachialis LNs. Na het bereiken van 100-150 mm3, de tumoren waren photoconverted (10 min, 200 mW) en de tumoren en dLNs onmiddellijk na photoconversion geoogst. Analyse door stroom cytometry gebleken belangrijke omzetting van intratumoral CD45+ cellen van Kaede groen+ Kaede rood+ (69%; Figuur 3A), terwijl bovenal dLNs bleef negatief voor Kaede rode+ cellen. Immunofluorescentie microscopie van photoconverted YUMM 1.7 tumoren bleek dat photoconversion dringt diep in het weefsel van de tumor (> 1 mm; Figuur 3B). Interessant is dat express de huid en vasculaire cellen hoge niveaus van de proteïne van de Kaede leidt tot hoge photoconversion efficiëntie van deze celtypes zoals te zien in figuur 3B. Deze hoge Kaede rode expressie maakt het moeilijk om de immuuncellen (zowel onbekeerde geconverteerd) identificeren met behulp van immunofluorescentie microscopie.
Gezien onze bijzondere belangstelling voor melanoom immunologie, we vervolgens het effect van zowel de grootte van de tumor en de melanine op photoconversion-efficiëntie met behulp van verschillende implanteerbare lymfkliertest tumor cellijnen geëvalueerd: MC38 (unpigmented colorectal kanker lijn), B16. F10 (melanine-producerende melanoom lijn), YUMM 1.1 (unpigmented melanoom lijn) en YUMM 1.7 (unpigmented melanoom lijn)44. Elk van deze lijnen werden geïmplanteerd intradermale in Kaede-Tg muizen en photoconverted, zoals hierboven beschreven bij verschillende volumes van de tumor (50-650 mm3). De tumoren waren geoogst onmiddellijk na de photoconversion en geëvalueerd voor de aanwezigheid van Kaede rode CD45+ leukocyten door stroom cytometry. Interessant is dat de efficiëntie van de photoconversion van CD45+ leukocyten varieert aanzienlijk over de tumor soorten en maten (Figuur 3 c). CD45+ leukocyten binnen kleine (50-150 mm3) YUMM 1.7 en YUMM 1.1 tumoren blijkt het meest efficiënte photoconversion bij 80% en 60%, respectievelijk. Toen de steeds verder toenam voor deze tumoren, de conversie-efficiëntie daalde tot ongeveer 50% voor grote tumoren (> 600 mm3). Melanine had een opvallende invloed op de efficiëntie van de photoconversion: maximale photoconversion voor CD45+ cellen binnen het melanine-productie van B16. F10 tumoren was slechts ongeveer 30% en daalde tot 10% als de tumoren bereikt volumes van 400 mm3. Interessant, analyse van intratumoral CD8+ T cellen geopenbaarde photoconversion efficiëntie voor deze cellen op bijna 80-90% in kleine tumoren ongeacht de melanine productie (figuur 3D). Voor unpigmented tumoren, CD8+ T cel conversie bleef hoog terwijl de tumoren bereikt grote volumes, maar verminderde aanzienlijk met de grootte als de melanine aanwezig was. Als zodanig, het nut van B16. F10 lymfkliertest melanomen en andere melanine-producerende melanoom lijnen, kunnen worden beperkt tot kleine tumoren (50 mm3), die in overeenstemming is met de biologische functie van melanine in het opvangen van licht. Om te beoordelen van de inflammatoire respons die is gekoppeld aan de photoconversion van tumoren, gekwantificeerd we het aantal CD45+ cellen in onbekeerde tumoren en geconverteerde tumoren 24u post photoconversion (figuur 3E). We zagen geen significant verschil in het totale aantal CD45+ cellen in de tumoren 24u na de photoconversion in vergelijking met niet-geconverteerde tumoren ontdekt.
Wij vervolgens de leukocyten egress van tumor microenvironments met behulp van Kaede-Tg muizen, die het mogelijk voor de ondervraging van mensenhandel gedrag van beide myeloïde en lymfoïde celtypes maakt gekwantificeerd. MC38 of YUMM 1.7 tumorcellen waren intradermaal ingeplant Kaede-Tg muizen. De tumoren waren photoconverted zodra de volumes tussen 100-150 mm3 bereikt (5 min, 200 mW); brachialis dLNs en inguïnale niet-drainage LNs werden verzameld 24u na de photoconversion. Intratumoral leukocyten populaties werden gekwantificeerd van MC38 en YUMM 1.7 tumoren ingeplant control C57Bl/6 muizen en zodra de tumoren 100-150 mm3 bereiktverzameld. We de complexiteit van de leukocyten binnen de tumoren en egressed bevolking geëvalueerd door stroom cytometry: T-cellen (CD3ε+CD4+/-CD8+/-), B-cellen (CD3ε-CD19+), DCs (CD11c+MHCII+CD11b+/- ), neutrofiele granulocyten (CD11b+MHCII-Ly6G+), macrofagen (CD11b+MHCII+F4/80+), en inflammatoire monocyten (CD11b+Ly6G-Ly6C+; Figuur 4A). Met behulp van deze dezelfde gating regeling, we het percentage van elke leukocyte bevolking in dLNs die uitgedrukt Kaede rood met vermelding van de vorige verblijfplaats in tumor microenvironments (figuur 4B) geëvalueerd. Interessant, terwijl beide MC38 (figuur 4C) en YUMM 1.7 (Figuur 4 d) tumoren waren voornamelijk geïnfiltreerde met de myeloïde cellen (monocyten, DCs en macrofagen), ongeveer 50% van de cellen die uit beide typen tumor had egressed waren T lymfocyten (beide CD4+ en CD8+). Naast T-cellen, wij ook waargenomen DCs, B-cellen, en monocyten binnen egressed populaties van de tumoren maar macrofagen en neutrofielen zijn niet waargenomen vanaf beide typen van de tumor. Over het geheel genomen is deze gegevens toont het nut van Kaede-Tg photoconvertible muizen voor het bijhouden van meerdere leukocyte lineages in een endogene setting. Onze analyse geeft bovendien aan dat egress een selectieve en actieve proces dat aanzienlijke gevolgen is voor het bepalen van intratumoral leukocyten complexiteit kan hebben.
Figuur 1: Photoconversion-efficiëntie en bijbehorende ontsteking in lymfkliertest huid. Lymfkliertest dermis was photoconverted gedurende 3 minuten op 100 mW (licht van 405 nm). (A) representatieve stroom percelen met photoconverted (Kaede rood+) CD45+ cellen van een niet-geconverteerde en geconverteerde oor en cervicale dLN onmiddellijk daaropvolgende photoconversion. Populaties werden vooraf gated op leven, CD45+ enkele cellen. (B) opsomming van totale CD45+ cellen in onbekeerde oren (-), oren verzameld onmiddellijk na photoconversion, oren verzameld 24u na photoconversion en oren verzameld 24u na VacV infectie (n = 3). (C) A Mile de test werd uitgevoerd om te kwantificeren vasculaire leakiness onmiddellijk na de blootstelling aan licht van 405 nm (3 min, 100 mW). Representatief beeld van lekkage in oor huid (links) en kwantificering van uitgepakte kleurstof (rechts) (n = 3). Foutbalken vertegenwoordigen SEM. *p< 0,05 en **p< 0,01. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: DC uitgang van naïef, ontstoken, en geïnfecteerde huid. (A) Gating regeling te identificeren trekkende DCs (mDCs; MHCIIhiCD11cint) en resident DCs (rDCs; MHCIIhiCD11chi). (B) vertegenwoordiger stroom percelen met vermelding FITC+ of Kaede rode+ DCs, vooraf gated op mDCs, van de muizen geïnfecteerd met VacV (dLN) of contralaterale niet-drainage LN besturingselementen. (C) kwantificering van de aantallen Kaede rode+ en FITC+ mDCs en rDCs in dLNs van de steady-state, DBP-ontstoken (24u post application) en VacV besmette huid (de besmetting van de post van de 48 h). Foutbalken vertegenwoordigen SEM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Photoconversion-efficiëntie in de tumor microenvironments. Tumoren waren photoconverted gedurende 10 minuten bij 200 mW (licht van 405 nm). (A) representatieve stroom percelen van Kaede groen en Kaede rood in onbekeerde en geconverteerde MC38 tumoren en brachialis dLN onmiddellijk na photoconversion. Populaties werden vooraf gated op leven, CD45+ single-cellen. (B) immunofluorescentie microcopy van bevroren, OCT-embedded YUMM 1.7 tumoren beide onbekeerde en photoconverted. Schaal bar = 200 µm. (C) omzettingsefficiëntie van CD45+ leukocyten en (D) CD8+ lymfocyten in het melanine-productie (B16. F10) en unpigmented (MC38, 1.1 YUMM YUMM 1.7). Elk punt vertegenwoordigt één muisklik. (E) opsomming van totale CD45+ cellen in onbekeerde tumoren en photoconverted tumoren verzameld 24u na photoconversion (n = 3). Foutbalken vertegenwoordigen SEM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: leukocyten egress van tumor microenvironments is selectieve. (A) Gating schema voor het identificeren van myeloïde en lymfoïde populaties in MC38 dLNs. (B) vertegenwoordiger stroom percelen identificerende Kaede rode+ cellen onder myeloïde en lymfoïde cellen in MC38 dLNs 24 h na photoconversion. Percentages op de stroom percelen geven de frequentie van Kaede rode+ cellen binnen de aangegeven bovenliggende leukocyte bevolking in LNs. (C, D) relatieve aandeel van intratumoral (% van CD45+ cellen) en egressed (% Kaede rode+ cellen; leukocyten van de brachialis dLNs) van MC38 (C, n = 3) en YUMM 1.7 (D, n = 4) tumoren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel de leukocyten egress uit perifere, niet-lymfoïde weefsels essentieel voor de inleiding en de resolutie van de immuunrespons is, worden de moleculaire mechanismen die egress regeren slecht begrepen. Deze lacunes in de kennis is grotendeels te wijten aan de beschikbaarheid van instrumenten voor de kwantificering in vivo. Hier beschrijven we het gebruik van photoconvertible muizen (Kaede-Tg) te kwantificeren van endogene leukocyte uitgang van de huid en de tumoren en bieden een directe vergelijking van de head-to-head met FITC verf in inflammatoire en infectie modellen. We laten zien dat, terwijl beide modellen endogene DC populaties volgen, gratis afvoer van FITC en slechte opname door niet-fagocytische cellen het nut van FITC verf voor brede analyse van myeloïde en lymfoïde egress perifere, niet-lymfoïde weefsel beperkt, met inbegrip van tumoren. Bovendien presenteren we de informatie die aangeeft dat de uitgang van de tumoren is selectief in plaats van stochastische bevindingen door Torcellan et al. dus te bevestigen 39. verdere onderzoek naar de mechanismen inzake leukocyte egress van tumoren kan onthullen nieuwe inzicht in tumor-geassocieerde ontsteking en immuniteit.
We geëvalueerd eerst de efficiëntie van photoconversion in lymfkliertest huid en het effect ervan op plaatselijke ontsteking als met behulp van instellingen in de literatuur gemeld. De blootstelling van de oren aan violet licht voor 3 min op 100 mW kracht resulteerde in efficiënte photoconversion van CD45+ cellen in de huid (78%) van de oor met geen omzetting in stroomafwaarts dLNs. Verslagen in de literatuur laten zien dat de 3-5 min blootstelling is optimaal voor cutane weefsels5,33,38. Echter deze blootstelling geleid tot verhoogde aantallen CD45+ cellen in het oor pinna 24u na de conversie en vasculaire lekkage die aangeeft dat photoconversion bij deze instellingen in oor huid induceert lokale ontsteking, die moet worden beschouwd wanneer interpretatie van gegevens. Wij willen volgende rechtstreeks vergelijken DC mensenhandel aan LNs met behulp van zowel Kaede photoconversion en de meer in het algemeen gebruikt FITC verf assay23,24 op steady-state, tijdens de DBP-geïnduceerde ontsteking, en uit VacV besmet oren. We waargenomen verhoogde labeling in FITC behandeld als in vergelijking met photoconverted huid op steady-state en volgende DBP behandeling. Toepassing van gratis FITC aan de huid kan leiden tot directe afvoer via de lymfevaten zuig LNs waar resident DC populaties, die niet migreren (bv., CD8α+ DCs), proeven van FITC. In overeenstemming met dit, wij grote aantallen rDCs met FITC label wanneer behandeld met de irriterende DBP waargenomen. Daarentegen Kaede rood-geëtiketteerden DCs werden alleen waargenomen in de mDC bevolking volgende de photoconversion die aangeeft dat photoconversion biedt een meer specifieke manier om label mDCs. Zelfs binnen de bevolking van de mDC, echter waargenomen wij kwantitatief meer gelabelde mDCs bij het gebruik van FITC over photoconversion. Hoewel dit kan ook worden verklaard door gratis FITC drainage, is het mogelijk dat de verschillen in de periode van labeling, waar de photoconversion kan alleen label DCs momenteel woonachtig in huid terwijl FITC in de huid voor de duur van de periode van 24 uur blijft , verantwoordelijk voor de verschillen in waargenomen mDC egress. Interessant, in het kader van virale infectie, zowel de photoconversion als de FITC toepassing gemeten relatief gelijke niveaus van mDC egress en paar FITC+ rDCs in de LNs aftappen van oren VacV-besmet. Onlangs meldden we dat lymfedrainage aanzienlijk verminderd volgende VacV infectie is, en aldus de virale-geïnduceerde vermindering van lymfatische vervoer kan verbeteren de specificiteit van FITC verf en verminderd labeling van LN resident DC populaties31 . Nog belangrijker is, dit werk ook wijst op het feit dat binnen de bevolking van de mDC (CD3ε-CD19-MHCIIHalloCD11cint), het aantal DCs die actief binnen de 24u hebt gemigreerd is een kleine bevolking en dus de totale mDC nummers zijn niet een goed surrogaat voor actieve migratie41. Tot slot, is het interessant op te merken dat we consequent mDC egress op ongeveer 200 cellen voor elk gegeven 24u periode volgende VacV infectie41, terwijl 1500-2000 DCs egress van tumor microenvironments kwantificeren. Gezien de enorme werkzaamheid van VacV als een vaccin-platform, met name wanneer toegepast door insnijding45,46,47, is het interessant om te speculeren dat het is de kwaliteit van de DC en misschien het soort DC presentatie van antigeen, in plaats van de hoeveelheid, bepaalt dat robuuste protectieve immuniteit.
Leukocyten egress van tumor microenvironments, buiten DCs25,48, blijft een slecht onderzocht. Hoewel de tumoren worden beschouwd als chronisch ontstoken microenvironments, blijft of soortgelijke mechanismen reguleren cellulaire egress uit niet-kwaadaardige en kwaadaardige weefsels onbekend. Bovendien, of leukocyten egress van tumoren stochastische is of liever selectief zal aanzienlijke gevolgen hebben voor de interpretatie van de accumulatie van leukocyten en retentie in tumor microenvironments. Als zodanig, kan leukocyten egress van tumoren doorslaggevend zijn voor het inzicht in hoe tumoren immuun toezicht ontduiken en leiden tot nieuwe strategieën voor de immunotherapie. Hier passen we het model van de photoconvertible Kaede-Tg leukocyte egress van implanteerbare cutane tumoren, waar FITC verf onvoldoende om te zijn zou bestuderen in het algemeen label myeloïde zowel lymfoïde populaties. Aanvankelijke studies bleek dat photoconversion-efficiëntie in de geïmplanteerde tumoren afhankelijk zowel op de grootte van de tumor en melanine was. Terwijl photoconversion efficiëntie snel daalt uit, zoals tumoren groeien wanneer melanine aanwezig is (B16. F10), niet-gepigmenteerde tumor lijnen zoals de YUMM en MC38 tumoren vertonen stabieler omzettingsefficiëntie over tumor maten getest. Interessant is dat wij betere conversie-efficiëntie in de CD8 waargenomen+ compartiment van de T cel ten opzichte van CD45+ cellen, die als tumoren groter geworden daalde. Er zijn waarschijnlijk meerdere factoren die bijdragen aan deze opmerking. Ten eerste zal de locatie binnen een tumor impact de blootstelling, en dus het omzettingsrendement van bepaalde celtypen. T-cellen vaak beperkt tot de huid-tumor interface in implanteerbare tumor modellen gevonden en dus wellicht gemakkelijker photoconverted ten opzichte van myeloïde cellen de tumor parenchym infiltreren. Ten tweede, niet alle leukocyten express dezelfde niveaus van de Kaede eiwit49 en dus niet alle worden ook gedetecteerd door stroom cytometry; Dit kan leiden tot lagere waargenomen percentages van photoconversion bij het analyseren van een meer heterogene celpopulatie zoals alle CD45+ cellen. Tenslotte is het belangrijk op te merken dat de gegevens in Figuur 3 gegenereerde volgende 10 min van blootstelling aan violet licht was. Deze eerste blootstellingstijd werd gekozen op basis van rapporten in de literatuur onder vermelding van photoconversion tijden voor verschillende organen, met inbegrip van de huid, LNs, mucosal weefsels en tumoren5,6,33,35 ,39,43. De alleen andere studie gebruik van het systeem van de photoconvertible in tumoren, werd photoconversion uitgevoerd voor 20 min39. Verdere optimalisatie in onze handen geopenbaard verbeterde efficiëntie met een verkorte belichtingstijd van 5 min voor zowel kleine als grote volumes. Het is waarschijnlijk dat langdurige blootstelling tot photobleaching van Kaede fluorescentie leidt, en als zodanig onze gerapporteerde conversie-efficiëntie onderschat worden kunnen. Langdurige blootstelling kan ook leiden tot verhoogde photoconversion-geassocieerde ontsteking en studieresultaten beschamen. Tumoren photoconverted voor 5 min blijkt dat geen significant verschil in het aantal intratumoral CD45+ cellen 24u na photoconversion in vergelijking met niet-geconverteerde tumoren. Bovendien blijkt de tumoren photoconverted voor 5 min meetbare en reproduceerbare egress voor zowel myeloïde en lymfoïde populaties. Individuele optimalisatie binnen specifieke weefsels of tumoren van belang is dus noodzakelijk om optimale resultaten te bereiken.
Tot slot, we gewend in situ photoconversion kwantificeren van endogene leukocyte egress van tumoren Kaede-Tg muizen ingeplant. Met behulp van twee verschillende implanteerbare, niet-gepigmenteerde tumor modellen we aanzienlijke egress van DCs, waargenomen T-cellen en monocyten. Overeenstemming met de onlangs gepubliceerde werk39, beide CD4+ en CD8+ T cellen egressed van tumor microenvironments samen met een groot aantal dubbel negatief CD3ε+ T cellen. In ieder geval een onderdeel van deze bevolking mogelijk gamma delta T cellen als eerder beschreven39, hoewel de functionele betekenis van deze constatering moet nog worden bepaald. Nog belangrijker is, wij in vergelijking met de verhoudingen van leukocyten egressing van tumoren aan de relatieve verhoudingen van leukocyten aanwezig binnen de microenvironments van de tumor, waargenomen we leukocyte verrijking in egressed populaties ten opzichte van intratumoral zwembaden in beide modellen die selectieve leukocyte egress aangeeft. Met name de macrofagen en neutrofielen afwezig waren in egressed populaties, hoewel beide celtypen zijn geweest beschreven om egress onder ontstoken en geïnfecteerde voorwaarden2,50,51,52 , 53 , 54 en zijn belangrijke bijdragen aan intratumoral leukocyten repertoires39,55,56. Dus, de uitgang van de leukocyten van de tumoren kan worden gekwantificeerd aan de hand van photoconvertible modellen, niet stochastische maar eerder een gereglementeerde proces, en blijft een belangrijk en understudied biologie met aanzienlijke gevolgen voor begrip inflammatoire en immuun dynamiek in tumor microenvironments bij steady-state en in reactie op de therapie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs er geen conflicten optreden bekend te maken.
Acknowledgments
De auteurs bedank Dr. Marcus Bosenberg voor het verstrekken van YUMM 1.1 en YUMM 1.7 lymfkliertest melanoom lijnen en Dr. Deborah J. Fowell voor het verstrekken van B6. CG-Tg(CAG-tdKaede) 15Utr muizen in overleg met RIKEN BRC via de nationale Bio-bron van de MEXT, Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DNase | Roche | 4536282001 | |
| Silver-LED-405B light source with optical fiber and collimtor | Prizmatix Ltd | V8144 | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I | Sigma-Aldrich | F4274 | |
| dibutyl phthalate | Sigma-Aldrich | 524980 | |
| acetone | Macron Fine Chemicals | 2440-02 | |
| 29-guage syringes | Exel International | 26029 | |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | |
| 70 um cell strainers | VWR | 732-2758 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| HBSS | Caisson | HBL06 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L34966 | |
| Purified Anti-mouse CD16/CD32 | Tonbo Biosciences | 70-0161-M001 | |
| BV605 CD11c (clone N418) | Biolegend | 117334 | |
| PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2) | BD Pharmingen | 562363 | |
| BV421 CD3e (clone 145-2C11) | Biolegend | 100341 | |
| APC CD8a (clone 53-6.7) | TonBo Biosciences | 20-0081-u100 | |
| APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
| BV650 CD19 (clone 6D5) | Biolegend | 115541 | |
| PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4) | Biolegend | 128011 | |
| Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8) | Biolegend | 123121 | |
| APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8) | Biolegend | 127623 | |
| BV711 CD11b (clone M1/70) | Biolegend | 101241 | |
| BV605 CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103155 | |
| BV711 CD4 (clone RM4-5) | BD Biosciences | 563726 | |
| Bovine serum albumin (Fraction V) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Anit-Rat and Anti-Hamster Igk / Negative Control Compensation Particle Set | BD Biosciences | 552845 | |
| Fortessa Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10 Software | FlowJo |
References
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Hampton, H. R., Bailey, J., Tomura, M., Brink, R., Chtanova, T. Microbe-dependent lymphatic migration of neutrophils modulates lymphocyte proliferation in lymph nodes. Nature Communications. 6, 7139 (2015).
- D'Alessio, S., et al. VEGF-C-dependent stimulation of lymphatic function ameliorates experimental inflammatory bowel disease. Journal of Clinical Investigation. 124 (9), 3863-3878 (2014).
- Debes, G. F., et al. Chemokine receptor CCR7 required for T lymphocyte exit from peripheral tissues. Nature Immunology. 6 (9), 889-894 (2005).
- Bromley, S. K., Yan, S., Tomura, M., Kanagawa, O., Luster, A. D. Recirculating memory T cells are a unique subset of CD4+ T cells with a distinct phenotype and migratory pattern. Journal of Immunology. 190 (3), 970-976 (2013).
- Tomura, M., et al. Activated regulatory T cells are the major T cell type emigrating from the skin during a cutaneous immune response in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (3), 883-893 (2010).
- Tomura, M., Itoh, K., Kanagawa, O. Naive CD4+ T lymphocytes circulate through lymphoid organs to interact with endogenous antigens and upregulate their function. Journal of Immunology. 184 (9), 4646-4653 (2010).
- Jennrich, S., Lee, M. H., Lynn, R. C., Dewberry, K., Debes, G. F. Tissue exit: a novel control point in the accumulation of antigen-specific CD8 T cells in the influenza a virus-infected lung. Journal of Virology. 86 (7), 3436-3445 (2012).
- Geherin, S. A., Wilson, R. P., Jennrich, S., Debes, G. F. CXCR4 is dispensable for T cell egress from chronically inflamed skin via the afferent lymph. PLoS One. 9 (4), e95626 (2014).
- Brown, M. N., et al. Chemoattractant receptors and lymphocyte egress from extralymphoid tissue: changing requirements during the course of inflammation. Journal of Immunology. 185 (8), 4873-4882 (2010).
- Bromley, S. K., Thomas, S. Y., Luster, A. D. Chemokine receptor CCR7 guides T cell exit from peripheral tissues and entry into afferent lymphatics. Nature Immunology. 6 (9), 895-901 (2005).
- Gomez, D., Diehl, M. C., Crosby, E. J., Weinkopff, T., Debes, G. F. Effector T Cell Egress via Afferent Lymph Modulates Local Tissue Inflammation. Journal of Immunology. 195 (8), 3531-3536 (2015).
- Ohl, L., et al. CCR7 governs skin dendritic cell migration under inflammatory and steady-state conditions. Immunity. 21 (2), 279-288 (2004).
- Kabashima, K., et al. CXCL12-CXCR4 engagement is required for migration of cutaneous dendritic cells. American Journal of Pathology. 171 (4), 1249-1257 (2007).
- Cyster, J. G., Schwab, S. R. Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs. Annual Review of Immunology. 30, 69-94 (2012).
- Matloubian, M., et al. Lymphocyte egress from thymus and peripheral lymphoid organs is dependent on S1P receptor 1. Nature. 427 (6972), 355-360 (2004).
- Teijeira, A., Rouzaut, A., Melero, I. Initial afferent lymphatic vessels controlling outbound leukocyte traffic from skin to lymph nodes. Frontiers in Immunology. 4, 433 (2013).
- Hunter, M. C., Teijeira, A., Halin, C. T Cell Trafficking through Lymphatic Vessels. Frontiers in Immunology. 7, 613 (2016).
- Bujdoso, R., Hopkins, J., Dutia, B. M., Young, P., McConnell, I. Characterization of sheep afferent lymph dendritic cells and their role in antigen carriage. Journal of Experimental Medicine. 170 (4), 1285-1301 (1989).
- Young, A. J. The physiology of lymphocyte migration through the single lymph node in vivo. Seminars in Immunology. 11 (2), 73-83 (1999).
- Seabrook, T., et al. The traffic of resting lymphocytes through delayed hypersensitivity and chronic inflammatory lesions: a dynamic equilibrium. Seminars in Immunology. 11 (2), 115-123 (1999).
- Swartz, M. A., et al. Mechanics of interstitial-lymphatic fluid transport: theoretical foundation and experimental validation. Journal of Biomechanics. 32 (12), 1297-1307 (1999).
- Macatonia, S. E., Knight, S. C., Edwards, A. J., Griffiths, S., Fryer, P. Localization of antigen on lymph node dendritic cells after exposure to the contact sensitizer fluorescein isothiocyanate. Functional and morphological studies. Journal of Experimental Medicine. 166 (6), 1654-1667 (1987).
- Robbiani, D. F., et al. The leukotriene C(4) transporter MRP1 regulates CCL19 (MIP-3beta, ELC)-dependent mobilization of dendritic cells to lymph nodes. Cell. 103 (4), 757-768 (2000).
- Roberts, E. W., et al. Critical Role for CD103(+)/CD141(+) Dendritic Cells Bearing CCR7 for Tumor Antigen Trafficking and Priming of T Cell Immunity in Melanoma. Cancer Cell. 30 (2), 324-336 (2016).
- Forster, R., et al. CCR7 coordinates the primary immune response by establishing functional microenvironments in secondary lymphoid organs. Cell. 99 (1), 23-33 (1999).
- Johnson, L. A., Jackson, D. G. The chemokine CX3CL1 promotes trafficking of dendritic cells through inflamed lymphatics. Journal of Cell Science. 126, 5259-5270 (2013).
- Teijeira, A., et al. T Cell Migration from Inflamed Skin to Draining Lymph Nodes Requires Intralymphatic Crawling Supported by ICAM-1/LFA-1 Interactions. Cell Reports. 18 (4), 857-865 (2017).
- Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PLoS One. 8 (2), e57135 (2013).
- Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin alphaV. Nature Immunology. 14 (9), 949-958 (2013).
- Russo, E., et al. Intralymphatic CCL21 Promotes Tissue Egress of Dendritic Cells through Afferent Lymphatic Vessels. Cell Reports. 14 (7), 1723-1734 (2016).
- Steven, P., Bock, F., Huttmann, G., Cursiefen, C. Intravital two-photon microscopy of immune cell dynamics in corneal lymphatic vessels. PLoS One. 6 (10), e26253 (2011).
- Tomura, M., et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 105 (31), 10871-10876 (2008).
- Shand, F. H., et al. Tracking of intertissue migration reveals the origins of tumor-infiltrating monocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (21), 7771-7776 (2014).
- Tomura, M., et al. Tracking and quantification of dendritic cell migration and antigen trafficking between the skin and lymph nodes. Scientific Reports. 4, 6030 (2014).
- Moran, A. E., et al. T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse. Journal of Experimental Medicine. 208 (6), 1279-1289 (2011).
- Schmidt, T. H., Bannard, O., Gray, E. E., Cyster, J. G. CXCR4 promotes B cell egress from Peyer's patches. Journal of Experimental Medicine. 210 (6), 1099-1107 (2013).
- Beura, L. K., et al. T Cells in Nonlymphoid Tissues Give Rise to Lymph-Node-Resident Memory T Cells. Immunity. 48 (2), 327-338 (2018).
- Torcellan, T., et al. In vivo photolabeling of tumor-infiltrating cells reveals highly regulated egress of T-cell subsets from tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114 (22), 5677-5682 (2017).
- Khan, T. N., Mooster, J. L., Kilgore, A. M., Osborn, J. F., Nolz, J. C. Local antigen in nonlymphoid tissue promotes resident memory CD8+ T cell formation during viral infection. Journal of Experimental Medicine. 213 (6), 951-966 (2016).
- Loo, C. P., et al. Lymphatic Vessels Balance Viral Dissemination and Immune Activation following Cutaneous Viral Infection. Cell Reports. 20 (13), 3176-3187 (2017).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. (73), e50062 (2013).
- Morton, A. M., et al. Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (18), 6696-6701 (2014).
- Meeth, K., Wang, J. X., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations. Pigment Cell Melanoma Research. 29 (5), 590-597 (2016).
- Demkowicz, W. E., Littaua, R. A., Wang, J., Ennis, F. A. Human cytotoxic T-cell memory: long-lived responses to vaccinia virus. Journal of Virology. 70 (4), 2627-2631 (1996).
- Stewart, A. J., Devlin, P. M. The history of the smallpox vaccine. Journal of Infection. 52 (5), 329-334 (2006).
- Hammarlund, E., et al. Duration of antiviral immunity after smallpox vaccination. Nature Medicine. 9 (9), 1131-1137 (2003).
- Lund, A. W., et al. Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).
- Tomura, M., Kabashima, K. Analysis of cell movement between skin and other anatomical sites in vivo using photoconvertible fluorescent protein "Kaede"-transgenic mice. Methods in Molecular Biology. , 279-286 (2013).
- Bellingan, G. J., Caldwell, H., Howie, S. E., Dransfield, I., Haslett, C. In vivo fate of the inflammatory macrophage during the resolution of inflammation: inflammatory macrophages do not die locally, but emigrate to the draining lymph nodes. Journal of Immunology. 157 (6), 2577-2585 (1996).
- Gautier, E. L., Ivanov, S., Lesnik, P., Randolph, G. J. Local apoptosis mediates clearance of macrophages from resolving inflammation in mice. Blood. 122 (15), 2714-2722 (2013).
- Abadie, V., et al. Neutrophils rapidly migrate via lymphatics after Mycobacterium bovis BCG intradermal vaccination and shuttle live bacilli to the draining lymph nodes. Blood. 106 (5), 1843-1850 (2005).
- Beauvillain, C., et al. CCR7 is involved in the migration of neutrophils to lymph nodes. Blood. 117 (4), 1196-1204 (2011).
- Rigby, D. A., Ferguson, D. J., Johnson, L. A., Jackson, D. G. Neutrophils rapidly transit inflamed lymphatic vessel endothelium via integrin-dependent proteolysis and lipoxin-induced junctional retraction. Journal of Leukocyte Biology. 98 (6), 897-912 (2015).
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Binnewies, M., et al. Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy. Nature Medicine. 24 (5), 541-550 (2018).
