Summary
Aqui, demonstramos os métodos para a quantificação na vivo de saída de leucócitos de ingênuo, inflamado e pele murino maligna. Realizamos uma Head-to-comparação de dois modelos: transdermal FITC photoconversion de aplicativo e in situ . Além disso, vamos demonstrar a utilidade da photoconversion para controlar a saída de leucócitos de tumores cutâneos.
Abstract
Saída de leucócitos de tecidos periféricos para drenagem de linfonodos não é somente crítica para vigilância imune e iniciação mas também contribui para a resolução das respostas do tecido periférico. Embora uma variedade de métodos são usados para quantificar a saída de leucócitos de tecidos não-linfoides, periféricos, os mecanismos celulares e moleculares que governam o egresso de contexto-dependente permanecem mal compreendidos. Aqui, descrevemos o uso de photoconversion em situ para análise quantitativa de saída de leucócitos da pele murino e tumores. Photoconversion permite a rotulagem direta de leucócitos residente no tecido cutâneo. Embora a exposição da pele à luz ultravioleta induz local respostas inflamatórias caracterizam por infiltração de leucócitos e leakiness vascular, em uma comparação frente a frente com aplicação transdérmica dos marcadores fluorescentes, photoconversion especificamente rotulado de populações de células dendríticas migratórias e simultaneamente habilitado a quantificação de mieloide e linfoide egresso do microambiente cutâneo e tumores. Os mecanismos de saída de leucócitos mantêm um componente em falta em nossa compreensão da complexidade de leucócitos intratumoral, e, portanto, a aplicação das ferramentas descritas neste documento fornecerá uma visão única da dinâmica do tumor imune microambiente que ambos Só firme estadual e em resposta à terapia.
Introduction
Respostas imunes de tecido periférico são moldadas não apenas por recrutamento de leucócitos para os locais de inflamação, mas também por mecanismos que regulam sua retenção subsequente. Assim, a imunidade protetora é ditada pela cumulativos mecanismos celulares e moleculares que determinam se um leucócito entra, fica dentro, ou melhor migra do tecido periférico, através de vasos linfáticos. Importante, a propensão para leucócitos sair do tecido através de vasos linfáticos (denominado Egresso) está ligada às suas funções especializadas. Células dendríticas (DC) adquirem comportamento migratório, em resposta a sinais de maturação, levando a transporte do antígeno e apresentação na drenagem dos gânglios linfáticos (dLN), um processo que é necessário para a imunidade adaptativa1. Eliminação de células mieloides, tais como os macrófagos e os neutrófilos, servem para limpar escombros apoptotic através da fagocitose. Durante a infecção bacteriana, os neutrófilos saída de tecido e, finalmente, sofrem apoptose em dLNs2 e em um modelo da colite induzida por DSS, dados suporta a hipótese de que o egresso macrófago é necessário para resolver a inflamação local3. No entanto, se o egresso de neutrófilos e macrófagos ocorre em todos os contextos inflamatórios, é desconhecido. Provas para saída de linfócitos T de estado estacionário4,5,6,7, infectados8e inflamada4,9,10, 11,12 periféricos, não-linfoides tecidos indica que células T recircular ativamente, embora os sinais baseados em tecido que impulsionam esta saída permanecem mal compreendidos. Vários estudos têm identificado os sinais necessários para a migração direcional para drenagem linfáticos capilares e subsequentes saída incluindo chemokine (C-C motif) ligand 21 (CCL21) e seu receptor CCR74,11, 13, chemokine (C-X-C motif) ligand 12 (CXCL12) e seu receptor CXCR42,14e esfingosina-1-fosfato (S1P)10,15,16. Estes mecanismos não são ativos em todos os contextos, no entanto, e se eles determinam a saída de todos os tipos de célula permanece uma questão em aberto. Importante, ainda mais insight sobre os mecanismos que regem o egresso e sua relevância funcional na doença requer métodos quantitativos na vivo de análise.
Vários métodos têm sido utilizados para quantificar o egresso em vários modelos animais na vivo incluindo canulação direta dos vasos linfáticos, transferência adotiva de ex vivo rotulado leucócitos, aplicação de transdermal dos marcadores fluorescentes, injeção de partículas rotuladas e na vivo photoconversion17,18. Canulação direta dos vasos linfáticos aferentes do rato é difícil e limitado em pequenos animais pelos volumes de líquido que pode ser recolhido. Assim, canulação em grande parte foi realizada em animais de grandes porte (ex., ovelha) onde tais manipulações cirúrgicas são práticas. Estes estudos fornecem a evidência direta da presença de células linfoides e mieloides em linfa10,19,20. Além disso, modelos de ovinos revelam que inflamação aguda e crônica aumentou a presença de linfócitos na linfa por quase 100 vezes10,21.
Transferência adotiva de linfócitos etiquetados e manipulados geneticamente importante revelou que CCR7 é necessária para a saída dos CD4+ T células de5,da pele inflamada aguda11, enquanto o pré-tratamento dos linfócitos com a pequena molécula agonista do receptor de S1P, FTY720, apenas parcialmente inibe sua saída10. Curiosamente, a saída de linfócitos transferidos de pele cronicamente inflamada é independente CCR710, mas parcialmente pode exigir CXCR49. Experimentos de transferência adotiva, no entanto, entregam números não-fisiológicos da ex vivo ativados e rotulados de linfócitos no tecido através de injeção, que altera o ambiente biomecânico dos tecidos e pressões elevadas de fluido intersticiais que abrir os capilares linfáticos iniciais e alterar suas propriedades de transporte22. Como uma alternativa, aplicação de transdermal de isotiocianato de fluoresceína (FITC) na presença ou ausência de irritantes dérmicas (EG., Dibutilftalato, DBP) ou infecção23,24 permite o acompanhamento das células fagocíticas que acumulam tracer e migram para o dLNs. Da mesma forma, tumores fluorescente etiquetadas fornecem um meio para controlar as células fagocíticas que tem engolido o tumor material25. Esses métodos têm fornecido importantes insights sobre os mecanismos que regem a DC saída13,14,17,26,27 , mas são incapazes de controlar não-fagocíticas linfócitos e, a interpretação podem ser complicadas por drenagem linfática grátis de solúvel FITC rotulando assim não migratória, LN residentes DCs.
Alternativamente, a microscopia intravital é uma ferramenta poderosa que permite o rastreamento no vivo das populações de leucócitos fisiologicamente relevantes em tempo real28,29. Usado em combinação com o repórter ratos e anticorpo-baseado na vivo imunofluorescência etiquetando, intravital microscopia revelou o complexo espacial e temporal dinâmica de imune celular de tráfico, incluindo a migração intersticial30 , transmigração através do endotélio linfático, passagem dentro do lúmen linfática e migração em cima LN entrada28,31. Ampla adoção de técnicas de imagem intravital é limitada pela despesa, conhecimentos necessários para configurar e limitado throughput para quantificação dos vários tipos de células. Ainda, métodos quantitativos que analisam a dinâmica populacional de acoplamento tecidos com intravital imagem irão fornecer uma visão mecanicista adicional e importante no que diz respeito as mecanismos de mobilidade e migração em direção e dentro de capilares linfáticos 18 , 31 , 32.
Por conseguinte, na vivo photoconversion emergiu como um método que permite em situ etiquetando, independente da atividade fagocítica e para a quantificação de saída de leucócitos fisiológica (quando acoplado com citometria de fluxo) na ausência ou presença de desafio. Ratos de Kaede-Tg constitutivamente expressam uma proteína isolada de corais stony que apresenta fluorescência verde (Kaede verde) até expostos à luz violeta, após o qual ele converte irreversivelmente a fluorescência vermelha (Kaede vermelho)33. Photoconverted células podem ser rastreadas como eles saída de sítios de tecidos periféricos e acumular-se no dLNs. Esta e outras semelhantes photoconvertible rato modelos34,35 revelaram importante biologia incluindo egresso constitutivo de pilhas de T reguladoras de pele36, egresso de células B CXCR4-dependente de Peyer37 , mobilização de células de memória residente T após peptídeo re-desafio38e saída de leucócitos amplo de tumor microambiente39. Neste documento, podemos realizar uma comparação frente a frente de photoconversion com aplicação de transdermal FITC no contexto da inflamação cutânea e infecção para permitir a comparação direta dos dados existentes com o método de photoconvertible. Além disso, demonstramos photoconversion em tumores implantados e descrever a eficiência de conversão e saída seletiva do microambiente do tumor. Como tal, podemos argumentar que é necessária mais aplicação destes métodos para elucidar a biologia crítica do egresso de leucócitos de tumores, que terá implicações significativas para interpretar a complexidade de leucócitos intratumoral, imunidade anti-tumoral, e resposta à terapia.
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Protocol
Todos os protocolos de animais foram aprovados pelo Comitê de uso no Oregon Health & Science University e institucional Cuidado Animal.
1. indução da inflamação e FITC pintura de Mouse Pinna
- Em uma capa de fluxo laminar, anestesiar um rato C57Bl/6 utilizando isofluorano vaporizado (induzir no 3-5% isofluorano e manter-se em 1-3% isofluorano; taxa de fluxo de oxigênio em 0,5-1,0 L/min). Assegurar a adequada anesthetization monitorando a perda do reflexo de pedal, movimentos involuntários e taxa respiratória reduzida.
- Lançar uma orelha plana com o lado ventral do ouvido fique virado para cima. Pipetar 20 µ l de solução FITC 5% dissolvido em 1:1 acetona: Dibutilftalato (DBP) para o lado ventral do pavilhão da orelha. Permita a orelha secar por alguns segundos.
- 24 h após a aplicação de FITC, eutanásia os ratos através de exposição de dióxido de carbono, seguido por deslocamento cervical. Colete o transformam de orelha em PBS separando as orelhas na cabeça com uma tesoura. Colete o dLNs cervical e inguinais não-drenando LNs em PBS, usando uma pinça para separar os serviços de imigração dos tecidos circundantes. Inguinais não-drenando LNs irão servir como controles negativos para a presença de leucócitos FITC+/Kaede vermelho+ . Descarte de carcaças de acordo com o protocolo institucional.
Nota: O tempo ideal post photoconversion para análise dependerá do tipo de célula e comportamentos migratórios conhecidos. Células dendríticas, por exemplo, podem ser detectadas em dLNs tão cedo como aplicativo de DBP post 6 h.
2. indução de inflamação e Photoconversion de rato Pinna
- Em uma capa de fluxo laminar, anestesia um rato de Kaede-Tg (fundo C57Bl/6) pela injeção intraperitoneal de 80 mg/kg de ketamina e xilazina 10 mg/kg, dissolvido em solução salina. Assegure a adequada anesthetization conforme descrito no passo 1.1.
- Lançar uma orelha plana com o lado ventral do ouvido fique virado para cima. Pipetar 20 µ l de um 1:1 acetona: DBP ao lado ventral do pavilhão da orelha. Permita a orelha secar por alguns segundos.
- Após a aplicação de DBP, cortar uma fenda em um pedaço de papel alumínio e puxar a orelha através da fenda para expor a orelha para a fonte de luz violeta. Deite a orelha com a dorsal virada para cima, usando fita adesiva para proteger a orelha para a folha.
- Posição da orelha diretamente sob a fonte de luz e photoconvert por 3 min usando uma fonte de luz de 405 nm em 100 mW de potência.
- 24 h após photoconversion, eutanásia em ratos a Kaede-Tg e colher o transformam de orelha, LNs cervicais e inguinais LNs, conforme descrito na etapa 1.3.
Nota: Além de considerações citadas na etapa 1.3, as taxas de proliferação irão determinar o tempo de análise como a perda de Kaede vermelho ocorrerá em rapidamente dividir células.
3. vaccinia infecção do Mouse Pinna e aplicação FITC
- Anestesia um rato C57Bl/6 com isofluorano vaporizado, conforme descrito no passo 1.1.
- Coloque o lado ventral da orelha plana. Pipetar 5 x 106 deformação unidades (PFU) de vírus vaccinia (VacV) diluído em 10 µ l de PBS para o pavilhão da orelha. Usando uma agulha de calibre 29, cutucar o pavilhão auricular 25 vezes40.
- pós-infecção 24 h, anestesiamos ratos infectados VacV com isofluorano, conforme descrito no passo 1.1 e pipetar 20 µ l 5% FITC dissolvido em acetona na face ventral do pavilhão da orelha. Permita a orelha secar por alguns segundos.
- 24 h após a aplicação de FITC, eutanásia de ratos e recolher transformam a orelha, LNs cervicais e inguinais LNs conforme descrito na etapa 1.3.
Nota: FITC pode ser aplicado em qualquer infecção de post do ponto de tempo para determinar DC tráfico em vários intervalos de 24h. Anteriormente, informou que a migração de DC para o dLNs é mantida a níveis semelhantes de dia 1 a 3 post infecção41.
4. vaccinia infecção do Mouse Pinna e Photoconversion.
- Anestesia um rato de Kaede-Tg com isofluorano vaporizado, conforme descrito no passo 1.1.
- Infectar o pavilhão auricular orelha com VacV conforme descrito no passo 3.2.
- pós-infecção 24 h, anestesiamos a ratos infectados VacV Kaede conforme descrito no passo 2.1 e executar photoconversion, conforme descrito nas etapas 2.3-2.4.
- 24 h após photoconversion, eutanásia de ratos e colher o transformam de orelha, LNs cervicais e inguinais LNs, conforme descrito na etapa 1.3.
Nota: Como mencionado acima, no passo 3.4, photoconversion pode ser administrado em qualquer infecção de post do ponto de tempo.
5. ouvido e linfonodo processamento por citometria de fluxo
- Criar suspensões única célula de transformam ouvido: Descasque separados os lados ventrais e dorsais do pavilhão auricular orelha usando dois pares de pinças e lugar com o interior da orelha voltada para baixo, para os poços de uma placa de 24 contendo 1 mg/mL colagenase D e 80 DNase U/mL, diluído em Hank é Buffered Saline solução (HBSS) (que contém Ca2 + e Mg2 +). Incube a 37 ° C por 30 min. Pressione o tecido digerido através de um filtro de célula de nylon 70 µm.
- Criar suspensões celulares único de LNs: Coloque LNs em poços de uma placa de 24 contendo 1 mg/mL colagenase D e 80 U/mL DNase diluído em HBSS. Provocadora Abra o nó de linfa cápsula usando duas agulhas de calibre 29 e então incubar os linfonodos a 37 ° C por 30 min. Pressione o tecido digerido através de um filtro de célula de nylon 70 µm.
6. intradérmica Melanoma Tumor implantação e Photoconversion.
- Raspe o pelo do centro das costas de um rato de Kaede-Tg usando um barbeador elétrico.
- Posicione uma agulha de calibre 29 no centro das costas entre as escápulas esquerdas e superiores direito e por via intradérmica, injetar 5 x 105 pilhas do tumor (diluídas em 50 µ l de soro fisiológico) na pele de ratos Kaede-Tg. Tumores devem ser cuidadosamente posicionados para assegurar a drenagem linfática, para linfonodos especificados (ou seja, esquerda e direita braquial LNs para tumores colocados no meio da parte superior das costas). Evite colocar o tumor acima dLN, pois isso pode resultar em photoconversion direto dos LNs através do pele/tumor.
- Permitir que os tumores crescem para o tamanho desejado (100-650 mm3).
- Um dia antes da coleta do tecido, anestesiar um rato Kaede-Tg conforme descrito no ponto 2.1 e raspar qualquer recém regrown peles ao redor do tumor.
- Corte um buraco circular em papel de alumínio e puxe o tumor através de expor o tumor para a fonte de luz. Cortar o furo ligeiramente menor do que o tumor para impedir que o tumor volta a cair no buraco e minimizar a conversão da pele adjacente, não-tumoral.
- Posicione o tumor diretamente abaixo da fonte de luz e photoconvert por 5 min usando uma fonte de luz de 405 nm em 200 mW de potência.
- 24 h após photoconversion, eutanásia os ratos, conforme descrito na etapa 1.3. Colete os tumores, dLNs braquial e inguinais não-drenando LNs em PBS. Corte os tumores longe da pele circundante com uma tesoura e retire o LNs, conforme descrito na etapa 1.3.
7. o tumor e linfonodo processamento por citometria de fluxo
- Criar suspensões celulares único de tumores: picar os tumores com tesoura em poços de uma placa de 24 contendo 1 mg/mL colagenase D e 80 U/mL DNase diluído em HBSS. Incube a 37 ° C, durante 1 h. Pressione o tecido digerido através de um filtro de nylon 70 µm.
- Crie suspensão única célula dos gânglios linfáticos, conforme descrito no passo 5.2.
8. anticorpo que mancha para citometria de fluxo
- Após a digestão dos tecidos em suspensões celulares simples, execute técnicas de coloração padrão fluxo cytometry para rotular as células com marcadores de interesse. Brevemente, Pipetar 2 x 106 células em uma placa de 96 poços. Incubar as amostras com bloco de Fc (1 µ g/mL) por 20 min no gelo; Lave duas vezes com tampão de FACs (1% albumina de soro bovino em PBS). Adicionar ao vivo/morto mancha (diluída em PBS) para as amostras e incube por 15 min no gelo; Lave duas vezes com tampão de FACs. Incube com anticorpos primários (Tabela de materiais), diluídos em tampão de FACs por 30 min no gelo; Lave duas vezes com tampão de FACs.
Nota: Kaede verde e Kaede se sobrepõe a fluorescência vermelha com fluorophores FITC e PE; assim, FITC e anticorpos conjugados a PE não podem ser usados em combinação com proteínas de Kaede. - Depois da coloração, execute as amostras em um citômetro de fluxo. Alternativamente, consertar as células com 2% PFA.
9. fluxo Cytometry Analysis
- Definir o FITC (Kaede verde) e PE (Kaede vermelho) canal tensões de PGTO para 70-80% da amplitude total (centro de população em aproximadamente 104) usando ex vivo Kaede verde ou vermelho Kaede splenocytes de cor única ou sangue.
Nota: Não compensa a Kaede verde (FITC) e canais de Kaede vermelho (PE) pois isso resultará em maior sinal espalhado.- Para criar controles de Kaede da único-cor, colete um baço ou o sangue de um rato de Kaede-Tg. Lisar os glóbulos vermelhos com buffer ACK e, em seguida, dividir as células em dois grupos: unconverted Kaede verde e convertido Kaede vermelho.
- Para única cor Kaede controles vermelhos, suspender as células em 1 mL de PBS e photoconvert em uma placa de 24 por 5 min usando uma fontes de luz de 405 nm, com uma potência de 100 mW. Usar essas células para definir a Kaede verde (FITC) e Kaede tensões de PGTO vermelhas sobre o citômetro de fluxo (passo 9.1).
- Uma vez que as tensões para as proteínas de Kaede tiver sido definida, compensa todas as outras manchas de anticorpo primário usando single-fluoróforo rotulado contas de compensação, as instruções do fabricante.
- Execute as amostras em um citômetro de fluxo para coletar dados.
Nota: A proteína de Kaede está continuamente sendo produzida pelas células. Isto significa que 24 h após photoconversion, células convertidas será positivo duplo para Kaede verde e proteína Kaede vermelho como Kaede recém sintetizado (verde) tem acumulado na célula. - Analise os dados usando o software de FlowJo ou um software similar.
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Representative Results
Primeiro procuramos replicar photoconversion resultados publicados na literatura para avaliar a eficiência e determinar a inflamação associada na pele do rato. O pavilhão auricular orelha foi exposto a 100 mW violeta luz (405 nm) para 3 min como anteriormente descrito33. Único suspensões celulares geradas a partir de pele de orelha ou cervical dLNs imediatamente após a exposição revelaram uma eficiência de conversão de 78% de todos os CD45+ leucócitos na pele com nenhum convertidas células observaram em dLNs (figura 1A). Para avaliar a resposta inflamatória associada com photoconversion, nós quantificados os números de infiltração CD45+ leucócitos nos ouvidos convertidos 0 e 24 h pós conversão (figura 1B) e agudas alterações na permeabilidade vascular, medido por ensaio42 (Figura 1). a milha Brevemente, 200 µ l de 0,5% de azul de Evans foi por via intravascular injetado 2 h após a photoconversion. As orelhas foram coletadas 30 min após a injeção e azul de Evans foi extraído com formamida por 24 h a 55° C (absorvância ler em 610 nm42). Ambos CD45+ se infiltra (24h) e vazamento vascular (2H) foram aumentados significativamente após a photoconversion, indicando que mesmo com esta exposição curta, photoconversion em si pode impactar a resposta inflamatória do tecido-específica. Comparação para CD45+ se infiltra (figura 1B) e vazamento vascular (1,4 µ g/orelha ±0.75) em VacV infectado orelhas 24h pós infecção41 fornece o contexto para a extensão da inflamação causada pela luz ultravioleta (0,08 µ g/orelha ± 0,01).
Enquanto vários modelos têm sido utilizados em diversos estudos para controlar a saída de leucócitos de tecidos não-linfoides, periféricos, não está claro como estes métodos comparam na sua capacidade de controlar as populações específicas como eles saem da pele. Por conseguinte, decidimos realizar uma comparação direta frente a frente dois métodos comumente usados para rastrear saída DC para LNs, FITC photoconversion pintura e na vivo , a fim de avaliar a eficiência e a especificidade de cada método para quantitativa análise de saída DC em estado estacionário, durante a inflamação cutânea e da pele infectada. Para cada análise, a pele foi submetida a aplicação de transdermal FITC ou exposta a luz de nm 100 mW 405 para populações de 3 min. LN DC foram definidas como CD3ε–CD19–MHCII+CD11c+ e ainda mais estratificada em 1) MHCIIOi CD11cint DCs, que enriquece para DCs migratórias (mDCs) ambos CD103+ BATF3-dependente Cruz-apresentando DCs e CD11b+ DCs dérmicas; e 2) MHCIIintCD11cOi DCs, que enriquece para residentes DCs (ERD), incluindo CD8α+ BATF3-dependente Cruz-apresentando DCs (Figura 2A). 24 h após aplicação FITC ou photoconversion, as pilhas etiquetadas foram prontamente detectável na drenagem mas não não-drenando LNs (Figura 2B). Para quantificar a extensão da migração de DC para LNs e simultaneamente determinar a especificidade do método para rotular populações migratórias e populações de LN não residentes, nós quantificada mDCs etiquetados e ERD no estado estacionário, 24h após a aplicação de DBP, e 48 h após a escarificação VacV (Figura 2). Enquanto ambos photoconversion (Kaede) e FITC rotulado mDCs em todas as condições, observamos mais FITC-rotulado de mDCs Kaede-etiquetadas em dLNs, com excepção da infecção VacV onde os dois métodos quantificados um nível semelhante de egresso. Além disso, no contexto da DBP, FITC adicionalmente rotulado rDC populações onde photoconversion permaneceu específicas para mDCs (Figura 2). Usando esses dois métodos, observamos a saída de aproximadamente 200 DCs de VacV infectado a pele e importante notar que este nível de saída recapitula resultados anteriormente publicados usando o aplicativo de FITC transdérmica por Loo et al 41. assim, dependendo do contexto inflamatório, aplicação de transdermal FITC pode aumentar o número de DCs rotulados detectados em dLNs e resultado em específico de rotulagem das populações de LN-residente DC não migratória, enquanto photoconversion Identifica especificamente DCs cair em uma população de mDC.
Ratos de Kaede-Tg têm sido utilizados para quantificar a retenção de leucócitos em5,33,43 e saída de5,6,35,38 cutâneo, mucoso, e tecidos linfoides sob constante estado e inflamado condições e aplicado aos tumores apenas em uma única publicação onde os tumores foram implantados intradérmica na orelha de rato e photoconverted em pequenos volumes de39. Assim, procuramos avaliar a utilidade do photoconversion na vivo para a quantificação de saída de leucócitos da estabelecida, grandes tumores primários para permitir testes de novas hipóteses imunológicos. Primeiro, colocamos o implante MC38 células de tumor por via intradérmica em camundongos Kaede-Tg entre a escápula esquerda e direita. Modelos de tumor implantável permitem um posicionamento preciso dos tumores para garantir a drenagem linfática para LNs conhecidos; tumores colocados na pele da parte superior de volta principalmente dreno para esquerda e direita braquiais LNs. Depois de atingir 100-150 mm3, os tumores foram photoconverted (10 min, 200 mW) e os tumores e dLNs colhidas imediatamente após photoconversion. Análise por citometria de fluxo revelou significativa conversão de intratumoral CD45+ células de Kaede verde+ a Kaede vermelha+ (69%; Figura 3A), enquanto importante, dLNs manteve-se negativa para células de Kaede vermelho+ . Microscopia de imunofluorescência de tumores photoconverted 1.7 YUMM revelou que photoconversion penetra profundamente no tecido do tumor (> 1 mm; Figura 3B). Curiosamente, a pele e as células vasculares expressam altos níveis da proteína Kaede levando a photoconversion alta eficiência estes tipos de células, como visto na Figura 3B. Esta alta expressão de Kaede vermelho torna difícil identificar as células imunes (ambos unconverted e convertido) usando microscopia de imunofluorescência.
Em seguida dado o nosso interesse particular em Imunologia do melanoma, avaliamos o efeito do tamanho do tumor e melanina na eficiência photoconversion usando várias linhas de células de tumor murino implantáveis: MC38 (unpigmented linha de câncer colorretal), B16. F10 (produtores de melanina linha de melanoma), YUMM 1.1 (linha unpigmented melanoma) e 1.7 YUMM (linha unpigmented melanoma)44. Cada uma dessas linhas foram implantados intradérmica em ratos Kaede-Tg e photoconverted, como descrito acima em vários volumes de tumor (50-650 mm3). Os tumores foram colhidos imediatamente após o photoconversion e avaliados para a presença de Kaede vermelho CD45+ leucócitos por citometria de fluxo. Curiosamente, a photoconversion a eficiência do CD45+ leucócitos variaram significativamente entre os tipos de tumor e tamanhos (Figura 3). CD45+ leucócitos dentro de pequenas (50-150 mm3) tumores YUMM 1.7 e 1.1 YUMM demonstraram o photoconversion mais eficiente em 80% e 60%, respectivamente. Como o volume aumentou para estes tumores, as eficiências de conversão diminuíram para cerca de 50% para tumores grandes (> 600 mm3). Melanina teve um impacto marcante sobre a eficiência de photoconversion: photoconversion máximo para CD45+ células dentro B16 produtoras de melanina. F10 tumores foi apenas cerca de 30% e caiu para 10%, como os tumores atingido volumes de 400 mm3. Curiosamente, a análise de intratumoral CD8+ T células eficiência photoconversion revelada por estas células de cerca de 80-90% em tumores pequenos, independentemente da produção de melanina (Figura 3D). Para tumores unpigmented, CD8+ conversão de célula T manteve-se elevado, enquanto os tumores alcançado grandes volumes, mas diminuiu significativamente com o tamanho quando a melanina estava presente. Como tal, o utilitário de B16. O melanoma murino F10 e outras linhas de melanoma produtoras de melanina, podem ser limitadas a pequenos tumores (50 mm3), que é consistente com a função biológica de melanina na absorção de luz. Para avaliar a resposta inflamatória associada com o photoconversion de tumores, podemos quantificar o número de CD45+ células em tumores não convertidos e tumores convertido 24h post photoconversion (Figura 3E). Nós não vimos nenhuma diferença significativa entre o número total de CD45+ células detectadas nos tumores 24 h após a photoconversion em comparação com tumores não convertidos.
Podemos em seguida quantificado a saída de leucócitos do microambiente do tumor usando ratos Kaede-Tg, que permite o interrogatório de comportamento tráfico de ambos os tipos de células mieloides e linfoides. MC38 ou 1.7 YUMM células tumorais por via intradérmica foram implantadas em ratos Kaede-Tg. Os tumores foram photoconverted, uma vez que os volumes alcançado entre 100-150 mm3 (5 min, 200 mW); dLNs braquial e inguinais não-drenando LNs foram coletados 24 h após o photoconversion. Populações de leucócitos Intratumoral foram quantificadas de MC38 e tumores YUMM 1.7 implantaram no controle de camundongos C57Bl/6 e recolhidos uma vez que os tumores chegaram a 100-150 mm3. Nós avaliamos a complexidade de leucócitos dentro dos tumores e capturar as populações por citometria de fluxo: células T (CD3ε+CD4+CD8+ /-), células B (CD3ε–CD19+), DCs (CD11c++CD11b MHCII+ /- ), neutrófilos (CD11b+MHCII–Ly6G+), macrófagos (CD11b+MHCII++de F4/80) e inflamatórios monócitos (CD11b+Ly6G–Ly6C+; Figura 4A). Usando este mesmo esquema associada, avaliamos a porcentagem de cada população de leucócitos em dLNs que expressa Kaede vermelho indicando a residência anterior no microambiente do tumor (Figura 4B). Curiosamente, enquanto ambos MC38 (Figura 4) e 1.7 YUMM (Figura 4) tumores foram principalmente infiltradas com células mieloides (monócitos, DCs e macrófagos), aproximadamente 50% das células que tinham compartilhar de ambos os tipos de tumor foram T linfócitos (ambos CD4+ e CD8+). Além de células T, observou-se também DCs, células B, e monócitos dentro das populações capturar dos tumores mas macrófagos e neutrófilos não foram detectados de qualquer tipo de tumor. No total, estes dados demonstram a utilidade dos ratos de photoconvertible Kaede-Tg para acompanhamento de várias linhagens de leucócitos em um ambiente endógeno. Além disso, nossa análise indica que a saída é um processo seletivo, ativo que pode ter implicações significativas para determinar a complexidade de leucócitos intratumoral.
Figura 1: eficiência de Photoconversion e associado a inflamação na pele murino. Murino derme foi photoconverted por 3 min em 100 mW (luz de 405 nm). (A) representativo fluxo parcelas retratando photoconverted (Kaede vermelha+) CD45+ células de uma orelha não convertida e convertida e imediatamente seguir photoconversion dLN cervical. Populações foram previamente fechadas ao vivo, CD45+ single células. (B) enumeração de CD45 total+ células nos ouvidos não convertidos (-), orelhas recolhidas imediatamente após photoconversion, orelhas colhidas 24 h após photoconversion e orelhas coletados 24 h após a infecção VacV (n = 3). (C) ensaio A milha foi realizado para quantificar vascular leakiness imediatamente após a exposição a 405 nm luz (3 min, 100 mW). Imagem representativa do vazamento na pele da orelha (à esquerda) e quantificação de corante extraído (à direita) (n = 3). Barras de erro representam SEM. *p< 0,05 e * *p< 0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: saída DC de ingênuo, inflamado e infectado a pele. (A) regime de Gating para identificar migratórias DCs (mDCs; MHCIIOiCD11cint) e DCs residentes (ERD; MHCIIOiCD11cOi). (B) fluxo representativo parcelas indicando FITC+ ou Kaede vermelho+ DCs, pre-condomínio fechado na mDCs, de ratos infectados com VacV (dLN) ou contralateral não drenagem LN controles. (C) quantificação do número de Kaede vermelho+ e FITC+ mDCs e ERD em dLNs de estado estacionário, DBP-inflamado (24h pós aplicação) e VacV infectados da pele (infecção de post 48 h). Barras de erro representam SEM. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Photoconversion eficiência no microambiente do tumor. Tumores foram photoconverted por 10 min em 200 mW (luz de 405 nm). (A) representativo fluxo parcelas de Kaede verde e vermelho em tumores de MC38 não convertidos e convertidos e braquial dLN imediatamente após photoconversion de Kaede. Populações foram previamente fechadas ao vivo, CD45+ single-células. (B) microcopy de imunofluorescência de congelados, OCT-incorporado YUMM 1.7 tumores ambos unconverted e photoconverted. Barra de escala = 200 µm. (C) eficiência de conversão de CD45+ leucócitos e CD8 (D) + linfócitos na produção de melanina (B16. F10) e unpigmented (MC38, YUMM 1.1, YUMM 1.7). Cada ponto representa um único rato. (E) enumeração de CD45 total+ células nos tumores não convertidos e tumores photoconverted coletados 24 h após photoconversion (n = 3). Barras de erro representam SEM. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: saída dos leucócitos do microambiente do tumor é seletiva. (A) regime de Gating para identificar populações mieloides e linfoides em MC38 dLNs. (B) fluxo representativo parcelas identificação Kaede vermelho+ células entre células mieloides e linfoides em MC38 dLNs 24 h após photoconversion. Percentagens em parcelas de fluxo indicam a frequência das células vermelhas Kaede+ no seio da população de leucócitos pai indicado em proporções relativas LNs. (C, D) intratumoral (% de CD45+ células) e compartilhar (células de Kaede vermelho+ %; dLNs braquial) leucócitos de MC38 (C, n = 3) e 1.7 YUMM (D, n = 4) tumores. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Embora a saída de leucócitos de tecidos não-linfoides, periféricos é fundamental para a iniciação e a resolução de respostas imunes, os mecanismos moleculares que governam o egresso são mal compreendidos. Esta lacuna no conhecimento é em grande parte devido à pronta disponibilidade de ferramentas para a quantificação em vivo. Aqui, descrevemos o uso de ratos de photoconvertible (Kaede-Tg) para quantificar a saída de leucócitos endógeno da pele e tumores e fornecer uma comparação direta de frente a frente com tinta FITC em inflamatórias e modelos de infecção. Demonstramos que enquanto ambos os modelos controlar populações de DC endógenas, drenagem livre de FITC e pobre absorção pelas células não fagocíticas limita a utilidade da pintura FITC para análise ampla de mieloide e linfoide egresso de tecidos não-linfoides, periféricos, incluindo tumores. Além disso, apresentamos os dados que indica que a saída de tumores é seletiva invés estocástico confirmando resultados apresentados por Torcellan et al 39. investigações dos mecanismos que regulam a saída de leucócitos de tumores podem revelar novos insights inflamação associada a tumor e imunidade.
Primeiramente avaliamos a eficiência de photoconversion em pele murino e seu efeito na inflamação local quando usando configurações relatados na literatura. A exposição de orelhas ao violeta luz por 3 min em 100 mW de potência resultou em photoconversion eficiente de CD45+ células dentro da pele da orelha (78%) com nenhuma conversão em dLNs a jusante. Relatos na literatura demonstram que a exposição de 3-5 min é ideal para tecidos cutâneos5,33,38. No entanto, esta exposição levou ao aumento do número de CD45+ células em pinna o ouvido 24 h após a conversão e escapamento vascular, indicando que photoconversion com essas configurações na pele da orelha induz inflamação local, que deve ser considerada quando interpretação dos dados. Em seguida procuramos comparar diretamente DC tráfico para LNs usando Kaede photoconversion e a mais amplamente utilizada FITC pintura ensaio23,24 no estado estacionário, durante a inflamação induzida por DBP e de orelhas VacV infectado. Observamos que a rotulagem elevados em FITC tratados como em comparação com a pele photoconverted em estado estacionário e seguir tratamento de DBP. Aplicação de FITC gratuito à pele pode resultar em drenagem direta através de vasos linfáticos para drenando LNs onde residente populações de DC, que não migram (EG., CD8α+ DCs), FITC da amostra. Consistente com isso, observamos um número significativo de ERD com rótulo FITC quando tratados com o DBP irritante. Em contraste, Kaede vermelho-rotulado DCs foram observados apenas no seguinte população mDC indicando que photoconversion o photoconversion fornece uma maneira mais específica de rótulo mDCs. Mesmo dentro da população de mDC, no entanto, observamos mDCs quantitativamente mais rotulada quando usando FITC sobre photoconversion. Enquanto isso também pode ser explicado pela livre drenagem FITC, é possível que as diferenças no período de rotulagem, onde o photoconversion só pode rotular DCs atualmente residente na pele enquanto FITC permanece na pele para a duração do período de 24 h , esclarece as diferenças no egresso mDC observados. Curiosamente, no contexto da infecção viral, ambos photoconversion e aplicação de FITC mediram níveis relativamente iguais de saída de mDC e alguns ERD FITC+ nos LNs drenagem ouvidos VacV-infectados. Nós recentemente relatou que a drenagem linfática é significativamente reduzida seguir VacV infecção, e assim a redução viral induzida em transporte linfático pode melhorar a especificidade da pintura FITC e reduziu a rotulagem das populações de DC residentes LN31 . Importante, este trabalho também destaca o fato de que no seio da população de mDC (CD3ε–CD19–MHCIIOiCD11cint), o número de DCs que migraram ativamente dentro de 24 h é uma população menor e, portanto, o mDC total os números não são um bom substituto para migração ativa41. Finalmente, é interessante notar que podemos quantificar consistentemente mDC egresso em cerca de 200 células por qualquer dado 24 h período seguinte VacV infecção41, enquanto 1500-2000 DCs egresso do microambiente do tumor. Dada a eficácia tremenda de VacV como uma plataforma de vacina, especialmente quando aplicado por escarificação45,46,47, é interessante especular que é a qualidade do DC e talvez o tipo de DC apresentação de antígeno, ao invés da quantidade, que determina a imunidade protetora robusta.
Saída dos leucócitos do microambiente do tumor, além de25,DCs48, continua a ser uma área mal investigada. Embora os tumores são considerados microambiente cronicamente inflamada, se mecanismos similares regulam egresso celular dos tecidos não-malignas e malignos permanece desconhecida. Além disso, se a saída de leucócitos de tumores é estocástica ou melhor seletiva terá implicações significativas para a interpretação de acúmulo de leucócitos e retenção no microambiente do tumor. Como tal, egresso de leucócitos de tumores pode ser crucial para a compreensão de como tumores iludir a vigilância imunológica e levar a novas estratégias para a imunoterapia. Aqui podemos aplicar o modelo de photoconvertible Kaede-Tg para estudar a saída de leucócitos de tumores cutâneos implantáveis, onde a pintura FITC seria insuficiente para rotular amplamente as populações mieloides e linfoides. Os estudos iniciais revelaram que photoconversion eficiência em tumores implantados foi dependente tanto sobre a melanina e tamanho do tumor. Enquanto photoconversion eficiência rapidamente cai como tumores crescem quando a melanina está presente (B16. F10), linhas de tumor não pigmentada, tais como os tumores YUMM e MC38 apresentam eficiência de conversão mais estável através de tamanhos de tumor testados. Curiosamente, observamos a eficiência de conversão melhorada no CD8+ compartimento de célula T comparado para CD45+ células, que declinou como tumores aumentados em tamanho. Há provavelmente diversos fatores contribuindo para esta observação. Primeiro, a localização dentro de um tumor terá impacto sobre a exposição e, portanto, a eficiência de conversão de tipos de célula específica. As células T são frequentemente encontradas restrito à interface de tumor de pele em modelos de tumor implantáveis e assim podem ser mais facilmente photoconverted em relação à infiltração do parênquima do tumor de células mieloides. Em segundo lugar, nem todos os leucócitos expressam os mesmos níveis de proteína Kaede49 e, portanto, podem não ser igualmente detectado por citometria de fluxo; Isso pode levar à baixa observadas percentagens de photoconversion ao analisar uma população de células mais heterogênea como todos CD45+ células. Finalmente, é importante notar que os dados apresentados na Figura 3 foram gerado seguinte 10 min de exposição à luz violeta. Este tempo de exposição inicial foi escolhido com base em relatos na literatura, citando photoconversion vezes para vários órgãos, incluindo tumores5,6,33,35, LNs, tecidos da mucosa e da pele ,39,43. Apenas outro empregando o sistema de photoconvertible em tumores, photoconversion foi realizado o estudo para 20 min39. Otimização mais nas nossas mãos revelou maior eficiência com um tempo de exposição reduzido de 5 min para pequenos e grandes volumes. É provável que a exposição prolongada leva à fotobranqueamento da fluorescência de Kaede, e como tal, a nossa eficiência de conversão relatado pode ser subestima. Exposição prolongada pode também levar à inflamação associada a photoconversion aumentada e confundir os resultados do estudo. Photoconverted de tumores por 5 min demonstrou que nenhuma diferença significativa no número de intratumoral CD45+ células 24h após photoconversion em comparação com tumores não convertidos. Além disso, o tumores photoconverted por 5 min demonstrado egresso mensurável e reprodutível para populações mieloides e linfoides. Consequentemente, a otimização individual dentro de tecidos específicos ou tumores de interesse é necessária para atingir resultados óptimos.
Por último, nós costumávamos em situ photoconversion quantificar a saída de leucócitos endógena de tumores implantados em camundongos Kaede-Tg. Usando dois modelos diferentes de tumor implantável, não pigmentada observamos significativo egresso de DCs, células T e monócitos. Consistente com o trabalho recentemente publicado39, ambos CD4+ e CD8+ T células compartilhar do microambiente do tumor junto com um número significativo de dupla negativa CD3ε+ T células. Pelo menos, um componente desta população pode ser gama delta T células como descrito anteriormente,39, embora o significado funcional desta observação permanece para ser determinado. Importante, quando comparamos as proporções de leucócitos egressing de tumores para as proporções relativas dos leucócitos presentes no microambiente que tumor, observamos enriquecimento de leucócitos em capturar as populações em relação intratumoral piscinas em ambos os modelos, indicando a saída de leucócitos seletiva. Notavelmente, os macrófagos e os neutrófilos estavam ausentes em populações capturar, embora ambos os tipos de células têm sido descritos para egresso sob condições inflamado e infectado2,50,,51,52 , 53 , 54 e são importantes contribuintes para intratumoral leucócitos repertórios39,55,56. Assim, a saída de leucócitos de tumores pode ser quantificada usando modelos de photoconvertible, não é estocástica, mas sim um processo regulado e continua a ser uma importante e pouco estudada biologia com implicações significativas para compreensão inflamatória e dinâmica imune no microambiente do tumor em estado estacionário e em resposta à terapia.
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Disclosures
Os autores não têm nenhum conflito para divulgar.
Acknowledgments
Os autores gostaria de agradecer o Dr. Marcus Bosenberg para fornecer YUMM 1.1 e 1.7 YUMM linhas de melanoma murino e Dr. Deborah J. Fowell para fornecer B6. CG-Tg(CAG-tdKaede) 15Utr ratos de acordo com a RIKEN BRC através do Bio-recurso nacional do MEXT, Japão.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DNase | Roche | 4536282001 | |
| Silver-LED-405B light source with optical fiber and collimtor | Prizmatix Ltd | V8144 | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I | Sigma-Aldrich | F4274 | |
| dibutyl phthalate | Sigma-Aldrich | 524980 | |
| acetone | Macron Fine Chemicals | 2440-02 | |
| 29-guage syringes | Exel International | 26029 | |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | |
| 70 um cell strainers | VWR | 732-2758 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| HBSS | Caisson | HBL06 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L34966 | |
| Purified Anti-mouse CD16/CD32 | Tonbo Biosciences | 70-0161-M001 | |
| BV605 CD11c (clone N418) | Biolegend | 117334 | |
| PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2) | BD Pharmingen | 562363 | |
| BV421 CD3e (clone 145-2C11) | Biolegend | 100341 | |
| APC CD8a (clone 53-6.7) | TonBo Biosciences | 20-0081-u100 | |
| APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
| BV650 CD19 (clone 6D5) | Biolegend | 115541 | |
| PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4) | Biolegend | 128011 | |
| Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8) | Biolegend | 123121 | |
| APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8) | Biolegend | 127623 | |
| BV711 CD11b (clone M1/70) | Biolegend | 101241 | |
| BV605 CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103155 | |
| BV711 CD4 (clone RM4-5) | BD Biosciences | 563726 | |
| Bovine serum albumin (Fraction V) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Anit-Rat and Anti-Hamster Igk / Negative Control Compensation Particle Set | BD Biosciences | 552845 | |
| Fortessa Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10 Software | FlowJo |
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