Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kvantificere leukocyt udgang via lymfekar fra Murine hud og tumorer

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58704
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 1,2,3,4
1Department of Cell, Developmental, & Cancer Biology, Oregon Health and Science University, 2Department of Molecular Microbiology & Immunology, Oregon Health and Science University, 3Department of Dermatology, Oregon Health and Science University, 4Knight Cancer Institute, Oregon Health and Science University

Summary

Her, viser vi metoder for i vivo kvantificering af leukocyt afstigning fra naiv, betændt, og ondartet murine hud. Vi udføre en head-to-head sammenligning af to modeller: transdermal FITC ansøgning og i situ photoconversion. Derudover viser vi nytte af photoconversion for sporing leukocyt afstigning fra kutane tumorer.

Abstract

Leukocyt afstigning fra perifere væv til afdrypning lymfeknuder er ikke kun afgørende for immun overvågning og indledning, men også bidrager til løsningen af perifere væv svar. Mens en række metoder bruges til at kvantificere leukocyt afstigning fra ikke-lymfoide, perifere væv, forbliver de cellulære og molekylære mekanismer, der styrer kontekst-afhængige egress dårligt forstået. Her, beskriver vi brugen af i situ photoconversion til kvantitativ analyse af leukocyt afstigning fra murine hud og tumorer. Photoconversion giver mulighed for direkte mærkning af leukocytter bopæl inden for kutant væv. Selvom huden udsættes for ultraviolet lys inducerer lokale karakteriseret inflammatoriske respons ved leukocyt infiltrater og kar leakiness, i et head-to-head sammenligning med transdermal anvendelse af fluorescerende sporstoffer, photoconversion specifikt mærket vandrende dendritiske cellepopulationer og samtidig aktiveret kvantificering af myeloid og lymfoide afstigning fra kutan microenvironments og tumorer. Mekanismer af leukocyt egress forblive en manglende komponent i vores forståelse af intratumoral leukocyt kompleksitet, og dermed anvendelse af de værktøjer, der beskrives heri vil give unikke indsigt i dynamikken i tumor immun microenvironments begge på stabil stat og som svar på terapi.

Introduction

Perifere væv immunrespons er formet af leukocyt rekruttering til lokaliteterne af betændelse, men også af mekanismer, der regulerer deres efterfølgende ejendomsforbehold. Således er beskyttende immunitet dikteret af kumulative cellulære og molekylære mekanismer, der bestemmer, om en leukocyt træder, forbliver inden for, eller rettere vandrer ud af perifere væv via lymfekar. Vigtigere, er tilbøjelighed for leukocytter at afslutte væv gennem lymfekar (betegnes afstigning) knyttet til deres specialiserede funktioner. Dendritiske celler (DC) erhverve vandrende adfærd som reaktion på modning signaler fører til antigen transport og præsentation i dræning lymfeknuder (dLN), en proces, der er nødvendige for adaptive immunitet1. Scavenging myeloide celler, makrofager og neutrofiler, tjene til klart apoptotiske vragrester gennem fagocytose. Under bakteriel infektion, neutrofiler egress væv og i sidste ende gennemgå apoptose i dLNs2 og i en model af DSS-induceret colitis, data støtter den hypotese, at makrofag egress er nødvendigt at løse lokale betændelse3. Om neutrofile og makrofag udgang sker i alle inflammatoriske sammenhænge, dog er ukendt. Beviser for T-lymfocytter afstigning fra steady state4,5,6,7, inficerede8og betændte4,9,10, 11,12 perifer, ikke-lymfoide væv angiver at recirkulere T celler aktivt, selvom de væv-baserede signaler, der driver denne exit forbliver dårligt forstået. Flere undersøgelser har identificeret signaler nødvendige for retningsbestemt overgangen til afdrypning lymfatisk kapillærer og efterfølgende egress herunder chemokine (C-C motiv) ligand 21 (CCL21) og dens receptor CCR74,11, 13, chemokine (C-X-C motiv) ligand 12 (CXCL12) og dens receptor CXCR42,14, og sphingosine-1-fosfat (S1P)10,15,16. Disse mekanismer er ikke aktiv i alle sammenhænge, dog, og hvorvidt de bestemmer afstigning af alle celletyper forbliver et åbent spørgsmål. Vigtigere, yderligere kræver indsigt i de mekanismer, der styrer egress og funktionelle relevans i sygdom kvantitative i vivo metoder til analyse.

Flere metoder er blevet brugt til at kvantificere egress i flere dyremodeller i vivo herunder direkte cannulation af lymfekar, adoptiv overførsel af ex vivo mærket leukocytter, transdermal anvendelse af fluorescerende sporstoffer, injektion af mærket partikler, og i vivo photoconversion17,18. Direkte cannulation af afferente mus lymfekar er vanskeligt og begrænset i små dyr af mængden af væske, der kan indsamles. Cannulation er således i vid udstrækning udført i store dyr (fx., får) hvor sådanne kirurgiske manipulationer er praktisk. Disse undersøgelser giver direkte beviser for forekomsten af lymfoide og myeloide celler i lymfeknuder10,19,20. Derudover afslører får modeller, at akut og kronisk inflammation steget næsten 100-fold10,21lymfocyt tilstedeværelse i lymfeknuder.

Adoptiv overførsel af mærket og genetisk manipulerede lymfocytter har vigtigere afslørede, at CCR7 er nødvendig for afstigning af CD4+ T celler fra akut betændt hud5,11, mens forbehandling af lymfocytter med den lille molekyle S1P receptor agonist hæmmer FTY720, kun delvist deres udgang10. Interessant, afstigning af overførte lymfocytter fra kronisk betændte hud er CCR7-uafhængig10, men kan delvist kræve CXCR49. Adoptiv overførsel eksperimenter, dog levere ikke-fysiologisk numre af ex vivo aktiveret og mærket lymfocytter i væv gennem indsprøjtning, som ændrer den biomekaniske miljø af væv og forhøjede interstitiel væske pres det åbne oprindelige lymfatisk kapillærer og ændre deres transport egenskaber22. Som et alternativ, transdermal anvendelse af fluorescein isothiocyanat (FITC) i tilstedeværelse eller fravær af dermal irritanter (fx., dibutylphthalat, DBP) eller infektion23,24 giver mulighed for sporing af fagocyterende celler, der ophobes tracer og overføre til dLNs. Ligeledes er fluorescently mærket tumorer et middel til at spore fagocyterende celler, som har opslugt tumor materielle25. Disse metoder har givet vigtige indsigt i de mekanismer, der regulerer DC udgang13,14,17,26,27 , men ikke er i stand til at spore ikke-fagocyterende lymfocytter og fortolkning kan blive kompliceret af gratis lymfedrænage af opløselige FITC således mærkning ikke-trækfugl, LN bosiddende DCs.

Alternativt, intravital mikroskopi er et kraftfuldt værktøj, der giver mulighed for i vivo sporing af fysiologisk relevante leukocyt populationer i realtid28,29. Anvendes i kombination med reporter mus og antistof-baseret i vivo immunfluorescent mærkning, intravital mikroskopi har afsløret den komplekse rumlige og tidsmæssige dynamikken i immun celle menneskehandel, herunder intramuskulært migration30 , transmigration på tværs af lymfatisk endothelium, passage i lymfe lumen, og migration på LN posten28,31. Bred vedtagelsen af intravital billeddiagnostiske teknikker er begrænset af bekostning, nødvendige ekspertise til nedsat, og begrænset overførselshastighed for kvantificering af flere celletyper. Stadig, kobling kvantitative metoder, der analyserer populationsdynamik væv med intravital imaging vil give yderligere og vigtig mekanistiske indblik med hensyn til mekanismerne i motilitet og migration mod og inden for lymfatisk kapillærer 18 , 31 , 32.

Derfor, i vivo photoconversion er opstået som en metode, der giver mulighed for i situ mærkning, uafhængig af Fagocytisk aktivitet og til kvantificering af fysiologiske leukocyt udgang (når kombineret med flowcytometri) i den fravær eller tilstedeværelse af udfordring. Kaede-Tg mus udtrykke constitutively et protein, der er isoleret fra stony koral, der udstiller grønne fluorescens (Kaede grøn) indtil udsat for ultraviolet lys, hvorefter det uigenkaldeligt konverterer til røde fluorescens (Kaede rød)33. Photoconverted celler kan spores som de udgangsdøre fra perifere væv websteder og ophobes i dLNs. Dette og andre lignende photoconvertible mus modeller34,35 har afsløret vigtigt biologi herunder konstitutiv afstigning af regulerende T-celler fra huden36, CXCR4 afhænger af B-celle afstigning fra Peyerske37 , mobilisering af bopæl hukommelse T celler ved peptid re-udfordring38og bred leukocyt afstigning fra tumor microenvironments39. Heri, udfører vi en head-to-head sammenligning af photoconversion med transdermal FITC ansøgning inden for rammerne af kutane betændelse og infektion at muliggøre direkte sammenligning af eksisterende data med metoden photoconvertible. Desuden, vi viser photoconversion i implanterede tumorer og beskrive konverteringseffektivitet og selektiv afstigning fra tumor microenvironments. Som sådan, vi argumentere for, at der er behov for yderligere anvendelse af disse metoder til at belyse den kritiske biologi af leukocyt afstigning fra tumorer, som vil få betydelige følger for at fortolke intratumoral leukocyt kompleksitet, anti-tumor immunitet, og svar til terapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr protokoller er blevet godkendt af det institutionelle Animal Care og brug udvalg på Oregon Health & Science University.

1. induktion af betændelse og FITC maleri af musen Pinna

  1. I en laminar flow hætte, bedøver en C57Bl/6 mus ved hjælp af forstøvet isofluorane (fremkalde på 3-5% isofluorane og fastholde på 1-3% isofluorane; ilt flow-hastighed på 0,5-1,0 L/min.). Sikre ordentlig anesthetization ved overvågning af tab af pedal refleks, ufrivillige bevægelser og nedsat respirationsfrekvens.
  2. Lå en øre lejlighed med den ventrale side af øret opad. Med pipette overfoeres 20 µL af 5% FITC løsning opløst i 1:1 acetone: dibutylphthalat (DBP) til den ventrale side af øre toppunkt. Tillad øre til tørre i et par sekunder.
  3. 24 h efter FITC ansøgning, aflive mus via CO2-eksponering efterfulgt af cervikal dislokation. Indsamle øre ørerne i PBS ved at adskille ørerne fra hovedet ved hjælp af saks. Indsamle cervikal dLNs og lyskebrok ikke-afløb LNs i PBS ved hjælp af pincet til at adskille LNs fra omkringliggende væv. Lyskebrok ikke-afløb LNs vil tjene som negative kontroller for tilstedeværelsen af FITC+/Kaede red+ leukocytter. Bortskaffe kadavere pr. institutionelle protokol.
    Bemærk: Optimale tidspunkt post photoconversion for analyse vil afhænge celletype og kendte vandrende adfærd. Dendritiske celler, for eksempel, kan blive opdaget i dLNs så tidligt som 6 h Efterudlign DBP.

2. induktion af betændelse og Photoconversion af mus Pinna

  1. I en laminar flow hætte, bedøver en Kaede-Tg mus (baggrund C57Bl/6) ved intraperitoneal injektion af 80 mg/kg ketamin og 10 mg/kg xylazin opløst i saltvand. Sikre ordentlig anesthetization, som beskrevet i trin 1.1.
  2. Lå en øre lejlighed med den ventrale side af øret opad. Med pipette overfoeres 20 µL af en 1:1 acetone: DBP til den ventrale side af den øre toppunkt. Tillad øre til tørre i et par sekunder.
  3. Efter DBP ansøgning, skåret en slids i et stykke alufolie og trække øret gennem spalten at udsætte øret til violet lyskilden. Lægge øret fladt med den dorsale side vender opad ved hjælp af dobbeltsidet tape til at sikre øre at folien.
  4. Placer øret direkte under lyskilden og photoconvert i 3 min. ved hjælp af en 405 nm lyskilde på 100 mW strøm.
  5. 24 timer efter photoconversion, aflive Kaede-Tg mus og høste øre ørerne, cervikal LNs og lyskebrok LNs som beskrevet i trin 1.3.
    Bemærk: Ud over overvejelser nævnt i trin 1.3, satser for spredning vil bestemme timingen af analyse som tabet af Kaede røde vil opstå i hurtigt dividere celler.

3. vaccinia infektion af musen Pinna og FITC ansøgning

  1. Bedøver en C57Bl/6 mus med forstøvet isofluorane som beskrevet i trin 1.1.
  2. Lægge den ventrale side af øret flade. Med pipette overfoeres 5 x 106 plaquedannelse enheder (PFU) vaccinia virus (VacV) fortyndet i 10 µL af PBS på den øre toppunkt. Ved hjælp af en 29-gauge kanyle, stikke toppunkt 25 gange40.
  3. 24 timer efter infektionen, bedøver VacV-inficerede mus med isofluorane som beskrevet i trin 1.1 og med pipette overfoeres 20 µL 5% FITC opløst i acetone på den ventrale side af den øre toppunkt. Tillad øre til tørre i et par sekunder.
  4. 24 timer efter FITC ansøgning, aflive mus og indsamle øre ørerne, cervikal LNs og lyskebrok LNs som beskrevet i trin 1.3.
    Bemærk: FITC kan anvendes på enhver tidspunkt efter infektion at bestemme DC handel med forskellige 24 h intervaller. Vi har tidligere rapporteret, at DC migration til dLNs holdes på nogenlunde samme niveau fra dag 1 til 3 indlæg infektion41.

4. vaccinia infektion af musen Pinna og Photoconversion.

  1. Bedøver en Kaede-Tg mus med forstøvet isofluorane som beskrevet i trin 1.1.
  2. Inficere den øre toppunkt med VacV, som beskrevet i trin 3.2.
  3. 24 timer efter infektionen, bedøver VacV-inficerede Kaede mus som beskrevet i trin 2.1 og udføre photoconversion, som beskrevet i trin 2.3-2.4.
  4. 24 timer efter photoconversion, aflive mus og høste øre ørerne, cervikal LNs og lyskebrok LNs som beskrevet i trin 1.3.
    Bemærk: Som nævnt ovenfor i trin 3.4, photoconversion kan gives på enhver tidspunkt efter infektion.

5. øre og lymfeknude forarbejdning til flowcytometri

  1. Oprette enkelt celle suspensioner af øre ørerne: skræl fra hinanden de ventrale og dorsale sider i den øre toppunkt ved hjælp af to par pincet og sted med indersiden af øret vender nedad i wells af en 24-godt plade indeholdende 1 mg/mL collagenase D og 80 U/mL DNase fortyndes i Hanks bufferet saltvand løsning (HBSS) (som indeholder Ca2 + og Mg2 +). Der inkuberes ved 37 ° C i 30 min. pressen de fordøjede væv gennem en 70 µm nylon celle si.
  2. Oprette enkelt celle suspensioner fra LNs: placere LNs i wells af en 24-godt plade indeholdende 1 mg/mL collagenase D og 80 U/mL DNase fortyndet i HBSS. Drille open lymfeknude kapsel ved hjælp af to 29-gauge nåle, og derefter inkuberes lymfeknuder ved 37 ° C i 30 min. pressen de fordøjede væv gennem en 70 µm nylon celle si.

6. intradermal melanom Tumor Implantation og Photoconversion.

  1. Barbere pels fra midten af bagsiden af en Kaede-Tg mus ved hjælp af en elektrisk barbermaskine.
  2. Placer en 29-gauge kanyle i midten af ryggen mellem scapulae venstre og øverste højre, og indsprøjtes intradermalt 5 x 105 tumorceller (fortyndet i 50 µL af saltvand) ind i huden af Kaede-Tg mus. Tumorer skal placeres omhyggeligt for at sikre lymfedrænage til angivne lymfeknuder (dvs., venstre og højre brachialis LNs for tumorer placeret i midten af den øverste del af ryggen). Undgå at placere tumor ovenfor dLN, da dette kan resultere i direkte photoconversion af LNs gennem huden/tumor.
  3. Tillade svulster til at vokse til ønsket størrelse (100-650 mm3).
  4. En dag før væv samling, bedøver en Kaede-Tg mus som beskrevet i punkt 2.1 og barbere eventuelle nyligt regrown pels omkring tumor.
  5. Skære et cirkelformet hul i aluminiumsfolie og trække tumor for at eksponere tumor til lyskilden. Skære hul lidt mindre end tumor til at forhindre, at svulsten falder tilbage gennem hullet og minimere konvertering af tilstødende, ikke-tumor hud.
  6. Placer tumor direkte under lyskilde og photoconvert i 5 min. ved hjælp af en 405 nm lyskilde på 200 mW strøm.
  7. 24 timer efter photoconversion, aflive mus som beskrevet i trin 1.3. Indsamle tumorer, brachialis dLNs og lyskebrok ikke-afløb LNs i PBS. Skær tumorer fra den omkringliggende hud ved hjælp af saks og fjern LNs som beskrevet i trin 1.3.

7. svulsten og lymfeknude forarbejdning til flowcytometri

  1. Oprette enkelt celle suspensioner fra tumorer: hakkekød tumorer med en saks i wells af en 24-godt plade indeholdende 1 mg/mL collagenase D og 80 U/mL DNase fortyndet i HBSS. Der inkuberes ved 37 ° C i 1 h. pressen de fordøjede væv gennem en 70 µm nylon si.
  2. Oprette enkelt cellesuspension af lymfeknuder, som beskrevet i trin 5.2.

8. antistof farvning for flowcytometri

  1. Efter fordøje væv i enkelt celle suspensioner, udføre standard flow flowcytometri farvning teknikker for at mærke cellerne med markører af interesse. Kort, afpipetteres 2 x 106 celler ind i en 96-brønd plade. Inkuber prøver med Fc blok (1 µg/mL) i 20 min. på isen; vaskes to gange med FACs buffer (1% bovint serumalbumin i PBS). Tilføje live/døde pletter (fortyndet i PBS) til prøverne og Inkuber i 15 min på isen; vaskes to gange med FACs buffer. Der inkuberes med primære antistoffer (Table of Materials) fortyndet i FACs buffer i 30 min på isen; vaskes to gange med FACs buffer.
    Bemærk: Kaede grønne og Kaede røde fluorescens overlapper med FITC og PE fluorophores; således kan ikke FITC og PE-konjugerede antistoffer bruges i kombination med Kaede proteiner.
  2. Efter farvning, køre prøverne på en flow Flowcytometret. Alternativt kan du lave cellerne med 2% PFA.

9. flow flowcytometri analyse

  1. Indstil FITC (Kaede grønne) og PE (Kaede rød) kanal ydelse spændinger til 70-80% af den samlede vifte (center befolkning på ca. 104) ved hjælp af ex vivo Kaede grøn eller Kaede røde ensfarvet splenocytes eller blod.
    Bemærk: Kompensere ikke for den Kaede grøn (FITC) og Kaede rød (PE) kanaler, da dette vil resultere i større signal spredes.
    1. Hvis du vil oprette en ensfarvet Kaede kontrolelementer, indsamle en milt eller blod fra en Kaede-Tg mus. Lyse røde blodlegemer med ACK buffer, så opdele celler i to grupper: uomvendte Kaede grønne og konverterede Kaede rød.
    2. For enkelt farve Kaede rød kontrol, suspendere celler i 1 mL PBS og photoconvert i en 24-godt plade i 5 min ved hjælp af en 405 nm lys kilder ved en effekt på 100 mW. Brug disse celler til at indstille Kaede grøn (FITC) og Kaede røde ydelse spændinger på flow forskellige (trin 9.1).
  2. Når spændinger for Kaede proteiner har været indstillet, kompensere for alle andre primære antistof pletter ved hjælp af single-fluorophore mærket kompensation perler pr fabrikantens anvisninger.
  3. Køre prøverne på en flow forskellige til at indsamle data.
    Bemærk: Kaede protein er hele tiden at være produceret af celler. Det betyder, at 24 timer efter photoconversion, konverterede celler vil være dobbelt positive for Kaede grønne og Kaede rød som nyligt syntetiserede Kaede (grøn) protein har akkumuleret i cellen.
  4. Analysere data ved hjælp af FlowJo eller en lignende software.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Først søgte vi at replikere photoconversion resultaterne offentliggjort i litteraturen til at vurdere effektiviteten og bestemme den tilknyttede betændelse i huden, mus. Øre pinna blev udsat for 100 mW violet lys (405 nm) for 3 min som tidligere beskrevet33. Enkelt celle suspensioner genereret fra øre hud eller livmoderhalskræft dLNs umiddelbart efter eksponeringen afslørede en 78% konverteringseffektivitet på alle CD45+ leukocytter i huden med ingen konverterede celler observeret i dLNs (figur 1A). For at evaluere det inflammatoriske respons forbundet med photoconversion, vi kvantificeret numre af infiltrerer CD45+ leukocytter i konverterede ører 0 og 24 timer efter konvertering (figur 1B) og akutte ændringer i vaskulær permeabilitet målt af Mile's Assay42 (figur 1 c). Kort, injiceres 200 µL af 0,5% Evans blå blev intravascularly 2 h efter photoconversion. Ørerne blev indsamlet 30 min efter injektion og Evans blå blev ekstraheret med formamid i 24 timer ved 55° C (absorbans læse på 610 nm42). Begge CD45+ infiltrater (24 h) og vaskulær lækage (2 h) var steget betydeligt, efter photoconversion, der angiver, at photoconversion sig selv på denne korte eksponering, kan påvirke det væv-specifikke inflammatoriske respons. Sammenligning til CD45+ infiltrater (figur 1B) og vaskulær lækage (1,4 µg/øre ±0.75) i VacV inficeret ører 24 h post infektion41 giver forbindelse til omfanget af betændelse forårsaget af UV-lys (0,08 µg/øre ± 0,01).

Mens flere modeller har været brugt i forskellige undersøgelser til at spore leukocyt afstigning fra ikke-lymfoide, perifere væv, er det uklart, hvordan disse metoder sammenligne deres evne til at spore bestemte befolkninger, som de forlader huden. Vi besluttede derfor, at udføre en direkte head-to-head sammenligning af to almindeligt anvendte metoder til at spore DC udgang til LNs, FITC maling og i vivo photoconversion, for at vurdere effektiviteten og specificiteten af hver metode for kvantitative analyse af DC udgang i steady state, under kutane betændelse, og fra inficeret hud. For hver analyse huden var udsat for transdermal FITC ansøgning eller udsættes for 100 mW 405 nm lys i 3 min. LN DC populationer var defineret som CD3ε-CD19-MHCII+CD11c+ og yderligere stratificeret ind 1) MHCIIHej CD11cint DCs, som beriger for migrerende DCs (mDCs) begge CD103+ BATF3-afhængige cross-præsenterer DCs og CD11b+ dermal DCs; og 2) MHCIIintCD11cHej DCs, som beriger for hjemmehørende DCs (regionale distributionsselskaber) herunder CD8α+ BATF3-afhængige cross-præsenterer DCs (figur 2A). 24 timer efter enten FITC ansøgning eller photoconversion, mærket cellerne var let påviselige i afløb, men ikke ikke-afløb LNs (figur 2B). For at opgøre omfanget af DC migration til LNs og samtidig bestemme specificiteten af metode for mærkning overflytter befolkninger og ikke bopæl LN befolkninger, kvantificeret vi mærket mDCs og regionale distributionsselskaber i steady state, 24 h, efter anvendelse af DBP, og 48 timer efter VacV scarification (figur 2 c). Mens både photoconversion (Kaede) og FITC mærket mDCs i alle forhold, observerede vi mere FITC-mærket end Kaede-mærket mDCs i dLNs, med undtagelse af VacV infektion hvor de to metoder kvantificeret et tilsvarende niveau for udgang. Desuden inden for rammerne af DBP mærket FITC desuden rDC populationer, hvor photoconversion blev bestemt til mDCs (figur 2 c). Ved hjælp af begge disse metoder, observeret vi afstigning af ca. 200 DCs fra VacV inficeret hud og vigtigere bemærkes, at dette niveau af egress sammenfatter tidligere offentliggjorte resultater ved hjælp af transdermalt FITC anvendelse af Loo et al. 41. således afhængigt af inflammatoriske forbindelse, transdermal FITC ansøgning kan øge antallet af mærket DCs opdaget i dLNs og resultere i ikke-specifik mærkning af ikke-vandrende LN-resident DC populationer, mens photoconversion specifikt identificerer DCs falder i en mDC befolkning.

Kaede-Tg mus har været brugt til at kvantificere leukocyt opbevaring i5,33,43 og afstigning fra5,6,35,38 kutane, slimhinder, og lymfoide væv under steady state og betændt forhold og anvendes til tumorer kun i en enkelt publikation, hvor tumorer blev implanteret intradermal ind i musen ører og photoconverted på små mængder39. Dermed, vi forsøgt at vurdere nytten af i vivo photoconversion til kvantificering af leukocyt afstigning fra etablerede, store primære tumorer at aktivere yderligere immunologiske hypotese testning. Først, vi implanteret MC38 tumorceller intradermalt i Kaede-Tg mus mellem venstre og højre scapulae. Implantable tumor modeller aktiverer præcis positionering af tumorer at sikre lymfedrænage til kendte LNs; tumorer i huden på øverst tilbage primært afløb til venstre og højre brachialis LNs. Efter at nå 100-150 mm3, tumorer var photoconverted (10 min, 200 mW) og tumorer og dLNs høstet umiddelbart efter photoconversion. Analyse ved flowcytometri afsløret betydelige konvertering af intratumoral CD45+ celler fra Kaede green+ til Kaede rød+ (69%; Figur 3A), mens især dLNs forblev negativ for Kaede røde+ celler. Immunfluorescens mikroskopi af photoconverted LÆK 1.7 tumorer viste, at photoconversion trænger dybt ind i tumor væv (> 1 mm; Figur 3B). Interessant, udtrykker hud og vaskulære celler høje niveauer af Kaede protein fører til høj photoconversion effektiviteten af disse celletyper, som det ses i figur 3B. Denne høje Kaede røde udtryk gør det vanskeligt at identificere de immunceller, (både uomvendte og konverteret) ved hjælp af immunofluorescens mikroskopi.

I betragtning af vores særlige interesse i melanom immunologi, vi næste vurderet effekten af både tumorstørrelse og melanin på photoconversion effektivitet ved hjælp af forskellige implantable murine tumor cellelinjer: MC38 (unpigmented kolorektal cancer linje), B16. F10 (melanin-producerende melanom linje), LÆK 1.1 (unpigmented melanom linje) og LÆK 1.7 (unpigmented melanom linje)44. Hver af disse linjer blev implanteret intradermal Kaede-Tg mus og photoconverted, som beskrevet ovenfor ved forskellige tumor mængder (50-650 mm3). Tumorer blev høstet umiddelbart efter photoconversion og evalueret for tilstedeværelsen af Kaede røde CD45+ leukocytter ved flowcytometri. Det er interessant, photoconversion effektiviteten af CD45+ leukocytter varierede betydeligt på tværs af tumortyper og størrelser (figur 3 c). CD45+ leukocytter inden for små (50-150 mm3) LÆK 1.7 og LÆK 1.1 tumorer viste den mest effektive photoconversion på 80% og 60%, henholdsvis. Mængderne, der øges for disse tumorer, konvertering effektivitet faldt til omkring 50% for store tumorer (> 600 mm3). Melanin havde en markant effekt på photoconversion effektivitet: maksimal photoconversion for CD45+ celler inden for melanin-producerende B16. F10 tumorer var kun ca. 30% og er faldet til 10% da tumorer nåede mængder af 400 mm3. Interessant, analyse af intratumoral CD8+ T celler afsløret photoconversion effektivitet for disse celler på næsten 80-90% i små tumorer uanset melanin produktion (figur 3D). For unpigmented tumorer, CD8+ T-celle konvertering forblev høj, selv som tumorer nået store mængder, men faldt betydeligt med størrelsen når melanin var til stede. Som sådan, nytten af B16. F10 murine melanomer og andre melanin-producerende melanom linjer, kan være begrænset til små tumorer (50 mm3), som er konsistent med den biologiske funktion af melanin til at absorbere lys. For at evaluere det inflammatoriske respons forbundet med photoconversion af tumorer, kvantificeres vi antallet af CD45+ celler i uomvendte tumorer og konverterede tumorer 24 h post photoconversion (figur 3). Vi så ingen signifikant forskel i det samlede antal CD45+ celler opdaget i tumorer 24 h efter photoconversion i forhold til uomvendte tumorer.

Vi næste kvantificeret leukocyt udgang fra tumor microenvironments ved hjælp af Kaede-Tg mus, som giver mulighed for afhøring af menneskehandel opførsel af begge myeloid og lymfoide celletyper. MC38 eller LÆK 1.7 tumorceller blev intradermalt implanteret i Kaede-Tg mus. Tumorer var photoconverted når mængderne, der blev indgået mellem 100-150 mm3 (5 min, 200 mW); brachialis dLNs og lyskebrok ikke-afløb LNs blev indsamlet 24 h efter photoconversion. Intratumoral leukocyt populationer var kvantificeres fra MC38 og LÆK 1.7 tumorer implanteret i kontrol C57Bl/6 mus og indsamlet når tumorer nået 100-150 mm3. Vi evalueret leukocyt kompleksitet inden for tumorer og egressed befolkninger ved flowcytometri: T-celler (CD3ε+CD4+ /CD8+ /-), B-celler (CD3ε-CD19+), DCs (CD11c+MHCII+CD11b+ /- ), neutrofiler (CD11b+MHCII-Ly6G+), makrofager (CD11b+MHCII+F4/80+), og inflammatorisk monocytter (CD11b+Ly6G-Ly6C+; Figur 4A). Ved hjælp af denne samme gating ordning, evalueret vi procent af hver leukocyt befolkning i dLNs, som udtrykte Kaede rødt tidligere bopæl i tumor microenvironments (figur 4B). Interessant, mens begge MC38 (fig. 4 c) og LÆK 1.7 (figur 4D) tumorer var hovedsagelig infiltreret med de myeloide celler (monocytter, DCs og makrofager), ca. 50% af de celler, der havde egressed fra begge tumortyper T lymfocytter (begge CD4+ og CD8+). Ud over T-celler, vi også observeret DCs, B-celler, og monocytter i egressed befolkninger fra tumorer, men makrofager og neutrofiler ikke var blevet opdaget fra enten tumor type. Helt, disse data viser nytten af Kaede-Tg photoconvertible mus til sporing af flere leukocyt lineages i endogene omgivelser. Vores analyse viser desuden at egress er en selektiv, aktiv proces, der kan have betydelige konsekvenser for bestemmelse af intratumoral leukocyt kompleksitet.

Figure 1
Figur 1: Photoconversion effektivitet og tilhørende betændelse i murine hud. Murine dermis var photoconverted for 3 min på 100 mW (405 nm lys). (A) repræsentative flow observationsområder skildrer photoconverted (Kaede red+) CD45+ celler fra en uomvendte og konverterede øre og cervikal dLN umiddelbart følgende photoconversion. Populationer var præ indhegnede på live CD45+ enkelt celler. (B) optælling af samlede CD45-+ celler uomvendte ørerne (-), ører indsamlet straks følge photoconversion, ører indsamlet 24 timer efter photoconversion, og ører indsamlet 24 h efter VacV infektion (n = 3). (C) en Mile analyse blev udført for at kvantificere vaskulær leakiness umiddelbart efter udsættelse for 405 nm lys (3 min, 100 mW). Repræsentativt billede af lækage i øre hud (venstre) og kvantificering af uddraget farvestof (højre) (n = 3). Fejllinjer udgør SEM. *p< 0,05 og **p< 0,01. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: DC udgang fra naiv, betændte og inficerede hud. (A) Gating ordning at identificere vandrende DCs (mDCs; MHCIIHejCD11cint) og bosiddende DCs (regionale distributionsselskaber; MHCIIHejCD11cHej). (B) repræsentative flow parceller der angiver FITC+ eller Kaede røde+ DCs, pre låge på mDCs, fra mus inficeret med VacV (dLN) eller kontralaterale ikke-afløb LN kontrol. (C) kvantificering af numrene på Kaede røde+ og FITC+ mDCs og regionale distributionsselskaber i dLNs af steady state, DBP-betændt (24 indlæg ansøgning), og VacV inficeret hud (48 timer efter infektion). Fejllinjer udgør SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Photoconversion effektivitet i tumor microenvironments. Tumorer var photoconverted i 10 min ved 200 mW (405 nm lys). (A) repræsentative flow parceller af Kaede grønne og Kaede rød i uomvendte og konverterede MC38 tumorer og brachialis dLN umiddelbart efter photoconversion. Populationer var præ indhegnede på live CD45+ single-celler. (B) immunofluorescens microcopy frosne, OCT-embedded LÆK 1.7 tumorer både uomvendte og photoconverted. Skalalinjen = 200 µm. (C) -virkningsgraden af CD45+ leukocytter og (D) CD8+ lymfocytter i melanin-producerende (B16. F10) og unpigmented (MC38, LÆK 1.1, LÆK 1.7). Hvert punkt repræsenterer et enkelt museklik. (E) optælling af samlede CD45-+ celler i uomvendte tumorer og photoconverted tumorer indsamlet 24 h efter photoconversion (n = 3). Fejllinjer udgør SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: leukocyt afstigning fra tumor microenvironments er selektiv. (A) Gating ordningen til at identificere myeloid og lymfoide populationer i MC38 dLNs. (B) repræsentative flow observationsområder identificerende Kaede røde+ celler blandt myeloid og lymfoide celler i MC38 dLNs 24 timer efter photoconversion. Procenterne i flow parceller angiver hyppigheden af Kaede røde+ celler inden for den angivne overordnede leukocyt befolkning i LNs. (C, D) Relative proportioner af intratumoral (% af CD45+ celler) og egressed (% Kaede røde+ celler; brachialis dLNs) leukocytter fra MC38 (C, n = 3) og LÆK 1.7 (D, n = 4) tumorer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Selvom leukocyt afstigning fra perifer, ikke-lymfoide væv er kritisk for indledningen og opløsning af immunrespons, er de molekylære mekanismer, der styrer egress dårligt forstået. Denne forskel i viden er i vid udstrækning klar tilgængelighed af værktøjer til kvantificering in vivo. Her, beskriver vi brugen af photoconvertible mus (Kaede-Tg) at kvantificere endogene leukocyt afstigning fra huden og tumorer og give en direkte head-to-head sammenligning med FITC maling i inflammatoriske og infektion modeller. Vi viser, at mens begge modeller spore endogene DC populationer, fri dræning af FITC og dårlig optagelse af ikke-fagocyterende celler begrænser nytte af FITC maling til bred analyse af myeloid og lymfoide afstigning fra perifer, ikke-lymfoide væv, herunder tumorer. Desuden præsenterer vi de data, der angiver afstigning fra tumorer er selektiv i stedet for stokastiske, hvilket bekræfter resultaterne præsenteret af Torcellan et al. 39. yderligere undersøgelse af de mekanismer, der regulerer leukocyt afstigning fra tumorer kan afsløre roman indsigt i tumor-associerede betændelse og immunitet.

Vi først evalueres effektiviteten af photoconversion i murine huden og dens indvirkning på lokale betændelse, når ved hjælp af indstillingerne rapporteret i litteraturen. Eksponering af ører til violet lys i 3 min. på 100 mW strøm resulterede i effektive photoconversion af CD45+ celler inden for øre hud (78%) uden konvertering i downstream dLNs. Rapporter i litteraturen viser 3-5 min eksponering er optimal for kutant væv5,33,38. Men denne eksponering førte til øgede antallet af CD45-+ celler i øret pinna 24 h efter konverteringen og vaskulær lækage, der angiver, at photoconversion på disse indstillinger i øre hud inducerer lokale betændelse, som bør tages i betragtning når fortolke data. Vi søgte næste direkte sammenligne DC handel til LNs ved hjælp af både Kaede photoconversion og den mere bredt udnyttede FITC maling assay23,24 ved steady-state, under DBP-induceret inflammation, og fra VacV inficeret ører. Vi observerede forhøjede mærkning i FITC behandlet i forhold til photoconverted hud ved steady state og følgende DBP behandling. Anvendelsen af gratis FITC at huden kan resultere i direkte afløb via lymfekar til afdrypning LNs hvor bopæl DC populationer, der ikke overflyttes (fx., CD8α+ DCs), prøve FITC. Overensstemmelse med det, vi observeret betydelige antal regionale distributionsselskaber med FITC etiket når behandlet med den irriterende DBP. Derimod Kaede rød-mærket DCs var kun observeret i mDC befolkning følgende den photoconversion, der angiver, at photoconversion giver en mere specifik måde at mærke mDCs. Selv inden for befolkningens mDC observerede vi dog kvantitativt mere mærket mDCs ved brug af FITC over photoconversion. Mens dette kan også forklares ved gratis FITC dræning, er det muligt, at forskelle i perioden af mærkning, hvor photoconversion kan kun mærke DCs i øjeblikket bosat i huden, mens FITC forbliver i huden i varigheden af perioden 24 h , tegner sig for forskelle i observerede mDC udgang. Interessant, i forbindelse med viral infektion målt både photoconversion og FITC ansøgning forholdsvis lige niveauer af mDC udgang og få FITC+ regionale distributionsselskaber i LNs afløb VacV-inficerede ører. Vi for nylig rapporteret, at lymfedrænage er betydeligt nedsat følgende VacV infektion, og dermed en viral-induceret reduktion i lymfe transport kan forbedre specificiteten af FITC maling og reduceret mærkning af LN bosiddende DC populationer31 . Vigtigere, dette arbejde også understreger, at inden for mDC befolkning (CD3ε-CD19-MHCIIHejCD11cint), antallet af DCs, der aktivt overført inden for 24 timer er en mindre befolkning og dermed samlede mDC numre er ikke en god surrogat for aktive migration41. Endelig er det interessant at bemærke, at vi konsekvent kvantificere mDC udgang på omkring 200 celler for en given 24 h periode følgende VacV infektion41, mens 1500-2000 DCs afstigning fra tumor microenvironments. Givet enorme effekten af VacV som en vaccine platform, især når den anvendes af scarification45,46,47, er det interessant at spekulere, at det er kvaliteten af DC og måske slags DC præsentation af antigen, snarere end mængden, bestemmer der robust beskyttende immunitet.

Leukocyt afstigning fra tumor microenvironments, ud over DCs25,48, forbliver et dårligt undersøgte område. Selvom tumorer betragtes som kronisk betændte microenvironments, forbliver hvorvidt lignende mekanismer regulere cellulære afstigning fra ikke-maligne, og ondartet væv ukendt. Derudover om leukocyt afstigning fra tumorer er stokastiske vil eller rettere selektiv få betydelige følger for tolkning leukocyt ophobning og opbevaring i tumor microenvironments. Som sådan, kan leukocyt afstigning fra tumorer være afgørende for at forstå hvordan tumorer unddrage immun overvågning og fører til nye strategier for immunterapi. Her anvender vi photoconvertible Kaede-GS model for at studere leukocyt afstigning fra implantable kutane tumorer, hvor FITC maling ville være utilstrækkelige til at stort set label myeloid og lymfoide populationer. Indledende undersøgelser afslørede, at photoconversion effektivitet i implanterede tumorer var afhængige af både ved tumorstørrelse og melanin. Mens photoconversion effektivitet hurtigt falder ud som tumorer vokser når melanin er til stede (B16. F10), ikke-pigmenterede tumor linjer såsom LÆK og MC38 tumorer udviser mere stabil konverteringseffektivitet på tværs af tumor størrelser testet. Interessant, vi observeret forbedret konverteringseffektivitet i CD8+ T-celle rum i forhold til CD45+ celler, som faldt som tumorer steg i størrelse. Der er sandsynligvis flere faktorer bidrager til denne observation. Først, placeringen i en tumor vil påvirke eksponering og dermed konverteringseffektivitet på bestemte celletyper. T-celler findes ofte begrænset til hud-tumor grænseflade i implantable tumor modeller og kan således være mere let photoconverted i forhold til myeloide celler infiltrerer tumoren parenkym. For det andet, ikke alle leukocytter udtrykke de samme niveauer af Kaede protein49 og dermed muligvis ikke alle lige fundet ved flowcytometri; Dette kan føre til lavere observerede procenter af photoconversion, når du analyserer en mere heterogene celle population som alle CD45+ celler. Endelig er det vigtigt at bemærke, at data præsenteret i figur 3 var genererede følgende 10 min af violet lys eksponering. Denne indledende eksponeringstiden blev valgt, baseret på rapporter i litteraturen citerer photoconversion gange til forskellige organer, herunder hud, LNs, slimhinden væv og tumorer5,6,33,35 ,39,43. Kun andre undersøgelsen beskæftiger photoconvertible system i tumorer, blev photoconversion udført for 20 min39. Yderligere optimering i vores hænder afslørede forbedret effektivitet med en forkortet eksponeringstid på 5 min. for både små og store mængder. Det er sandsynligt, at langvarig eksponering fører til photobleaching af Kaede fluorescens, og som sådan vores rapporterede konvertering effektivitetsgevinster kan være undervurdering. Langvarig eksponering kan også føre til øget photoconversion-associerede betændelse og forvirre undersøgelsens resultater. Tumorer photoconverted for 5 min viste ingen signifikant forskel i antallet af intratumoral CD45+ celler 24 h efter photoconversion i forhold til uomvendte tumorer. Derudover demonstreret tumorer photoconverted for 5 min målbare og reproducerbare udgang til både myeloide og lymfoide populationer. Enkelte optimering inden for specifikke væv eller tumorer af interesse er derfor nødvendig for at opnå optimale resultater.

Endelig, vi brugte i situ photoconversion at kvantificere endogene leukocyt afstigning fra tumorer implanteret i Kaede-Tg mus. Ved hjælp af to forskellige implantable, ikke-pigmenterede tumor modeller vi observeret betydelige afstigning af DCs, T-celler og monocytter. Overensstemmelse med nyligt offentliggjorte arbejde39, begge CD4+ og CD8+ T celler egressed fra tumor microenvironments sammen med et betydeligt antal dobbelt negativ CD3ε+ T celler. Mindst kan én komponent af denne befolkning være gamma delta T celler som tidligere beskrevet39, selvom den funktionelle betydning af denne observation stadig skal fastlægges. Vigtigere, når vi sammenligner proportioner af leukocytter egressing fra tumorer til de relative proportioner af leukocytter stede i tumor microenvironments, observeret vi leukocyt berigelse i egressed populationer i forhold til intratumoral pools i begge modeller, der angiver selektiv leukocyt udgang. Navnlig, makrofager og neutrofiler var fraværende i egressed populationer, selvom begge celletyper har været beskrevet at egress under betændte og inficerede betingelser2,50,51,52 , 53 , 54 og er væsentlige bidragsydere til intratumoral leukocyt repertoirer39,55,56. Således leukocyt afstigning fra tumorer kan kvantificeres ved hjælp af photoconvertible modeller, er ikke stokastiske men snarere en lovreguleret proces, og er stadig en vigtig og forsømt biologi med betydelige konsekvenser for forståelse inflammatoriske og immun dynamics i tumor microenvironments på steady state og som svar til terapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke nogen konflikter til at videregive.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Dr. Marcus Bosenberg for at give LÆK 1.1 og LÆK 1.7 murine melanom linjer og Dr. Deborah J. Fowell for at give B6. CG-Tg(CAG-tdKaede) 15Utr mus efter aftale med RIKEN BRC gennem den nationale Bio-ressource af MEXT, Japan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase D Roche 11088866001
DNase Roche 4536282001
Silver-LED-405B light source with optical fiber and collimtor Prizmatix Ltd V8144
Fluorescein isothiocyanate isomer I Sigma-Aldrich F4274
dibutyl phthalate Sigma-Aldrich 524980
acetone Macron Fine Chemicals 2440-02
29-guage syringes Exel International 26029
Evans Blue Sigma-Aldrich E2129
70 um cell strainers VWR 732-2758
paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
HBSS Caisson HBL06
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit Invitrogen L34966
Purified Anti-mouse CD16/CD32 Tonbo Biosciences 70-0161-M001
BV605 CD11c (clone N418) Biolegend 117334
PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2) BD Pharmingen 562363
BV421 CD3e (clone 145-2C11) Biolegend 100341
APC CD8a (clone 53-6.7) TonBo Biosciences 20-0081-u100
APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11) Biolegend 103116
BV650 CD19 (clone 6D5) Biolegend 115541
PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4) Biolegend 128011
Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8) Biolegend 123121
APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8) Biolegend 127623
BV711 CD11b (clone M1/70) Biolegend 101241
BV605 CD45 (clone 30-F11) Biolegend 103155
BV711 CD4 (clone RM4-5) BD Biosciences 563726
Bovine serum albumin (Fraction V) Fisher Scientific BP1600-100
Anit-Rat and Anti-Hamster Igk / Negative Control Compensation Particle Set BD Biosciences 552845
Fortessa Flow Cytometer BD Biosciences
FlowJo v10 Software FlowJo

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
  2. Hampton, H. R., Bailey, J., Tomura, M., Brink, R., Chtanova, T. Microbe-dependent lymphatic migration of neutrophils modulates lymphocyte proliferation in lymph nodes. Nature Communications. 6, 7139 (2015).
  3. D'Alessio, S., et al. VEGF-C-dependent stimulation of lymphatic function ameliorates experimental inflammatory bowel disease. Journal of Clinical Investigation. 124 (9), 3863-3878 (2014).
  4. Debes, G. F., et al. Chemokine receptor CCR7 required for T lymphocyte exit from peripheral tissues. Nature Immunology. 6 (9), 889-894 (2005).
  5. Bromley, S. K., Yan, S., Tomura, M., Kanagawa, O., Luster, A. D. Recirculating memory T cells are a unique subset of CD4+ T cells with a distinct phenotype and migratory pattern. Journal of Immunology. 190 (3), 970-976 (2013).
  6. Tomura, M., et al. Activated regulatory T cells are the major T cell type emigrating from the skin during a cutaneous immune response in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (3), 883-893 (2010).
  7. Tomura, M., Itoh, K., Kanagawa, O. Naive CD4+ T lymphocytes circulate through lymphoid organs to interact with endogenous antigens and upregulate their function. Journal of Immunology. 184 (9), 4646-4653 (2010).
  8. Jennrich, S., Lee, M. H., Lynn, R. C., Dewberry, K., Debes, G. F. Tissue exit: a novel control point in the accumulation of antigen-specific CD8 T cells in the influenza a virus-infected lung. Journal of Virology. 86 (7), 3436-3445 (2012).
  9. Geherin, S. A., Wilson, R. P., Jennrich, S., Debes, G. F. CXCR4 is dispensable for T cell egress from chronically inflamed skin via the afferent lymph. PLoS One. 9 (4), e95626 (2014).
  10. Brown, M. N., et al. Chemoattractant receptors and lymphocyte egress from extralymphoid tissue: changing requirements during the course of inflammation. Journal of Immunology. 185 (8), 4873-4882 (2010).
  11. Bromley, S. K., Thomas, S. Y., Luster, A. D. Chemokine receptor CCR7 guides T cell exit from peripheral tissues and entry into afferent lymphatics. Nature Immunology. 6 (9), 895-901 (2005).
  12. Gomez, D., Diehl, M. C., Crosby, E. J., Weinkopff, T., Debes, G. F. Effector T Cell Egress via Afferent Lymph Modulates Local Tissue Inflammation. Journal of Immunology. 195 (8), 3531-3536 (2015).
  13. Ohl, L., et al. CCR7 governs skin dendritic cell migration under inflammatory and steady-state conditions. Immunity. 21 (2), 279-288 (2004).
  14. Kabashima, K., et al. CXCL12-CXCR4 engagement is required for migration of cutaneous dendritic cells. American Journal of Pathology. 171 (4), 1249-1257 (2007).
  15. Cyster, J. G., Schwab, S. R. Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs. Annual Review of Immunology. 30, 69-94 (2012).
  16. Matloubian, M., et al. Lymphocyte egress from thymus and peripheral lymphoid organs is dependent on S1P receptor 1. Nature. 427 (6972), 355-360 (2004).
  17. Teijeira, A., Rouzaut, A., Melero, I. Initial afferent lymphatic vessels controlling outbound leukocyte traffic from skin to lymph nodes. Frontiers in Immunology. 4, 433 (2013).
  18. Hunter, M. C., Teijeira, A., Halin, C. T Cell Trafficking through Lymphatic Vessels. Frontiers in Immunology. 7, 613 (2016).
  19. Bujdoso, R., Hopkins, J., Dutia, B. M., Young, P., McConnell, I. Characterization of sheep afferent lymph dendritic cells and their role in antigen carriage. Journal of Experimental Medicine. 170 (4), 1285-1301 (1989).
  20. Young, A. J. The physiology of lymphocyte migration through the single lymph node in vivo. Seminars in Immunology. 11 (2), 73-83 (1999).
  21. Seabrook, T., et al. The traffic of resting lymphocytes through delayed hypersensitivity and chronic inflammatory lesions: a dynamic equilibrium. Seminars in Immunology. 11 (2), 115-123 (1999).
  22. Swartz, M. A., et al. Mechanics of interstitial-lymphatic fluid transport: theoretical foundation and experimental validation. Journal of Biomechanics. 32 (12), 1297-1307 (1999).
  23. Macatonia, S. E., Knight, S. C., Edwards, A. J., Griffiths, S., Fryer, P. Localization of antigen on lymph node dendritic cells after exposure to the contact sensitizer fluorescein isothiocyanate. Functional and morphological studies. Journal of Experimental Medicine. 166 (6), 1654-1667 (1987).
  24. Robbiani, D. F., et al. The leukotriene C(4) transporter MRP1 regulates CCL19 (MIP-3beta, ELC)-dependent mobilization of dendritic cells to lymph nodes. Cell. 103 (4), 757-768 (2000).
  25. Roberts, E. W., et al. Critical Role for CD103(+)/CD141(+) Dendritic Cells Bearing CCR7 for Tumor Antigen Trafficking and Priming of T Cell Immunity in Melanoma. Cancer Cell. 30 (2), 324-336 (2016).
  26. Forster, R., et al. CCR7 coordinates the primary immune response by establishing functional microenvironments in secondary lymphoid organs. Cell. 99 (1), 23-33 (1999).
  27. Johnson, L. A., Jackson, D. G. The chemokine CX3CL1 promotes trafficking of dendritic cells through inflamed lymphatics. Journal of Cell Science. 126, 5259-5270 (2013).
  28. Teijeira, A., et al. T Cell Migration from Inflamed Skin to Draining Lymph Nodes Requires Intralymphatic Crawling Supported by ICAM-1/LFA-1 Interactions. Cell Reports. 18 (4), 857-865 (2017).
  29. Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PLoS One. 8 (2), e57135 (2013).
  30. Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin alphaV. Nature Immunology. 14 (9), 949-958 (2013).
  31. Russo, E., et al. Intralymphatic CCL21 Promotes Tissue Egress of Dendritic Cells through Afferent Lymphatic Vessels. Cell Reports. 14 (7), 1723-1734 (2016).
  32. Steven, P., Bock, F., Huttmann, G., Cursiefen, C. Intravital two-photon microscopy of immune cell dynamics in corneal lymphatic vessels. PLoS One. 6 (10), e26253 (2011).
  33. Tomura, M., et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 105 (31), 10871-10876 (2008).
  34. Shand, F. H., et al. Tracking of intertissue migration reveals the origins of tumor-infiltrating monocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (21), 7771-7776 (2014).
  35. Tomura, M., et al. Tracking and quantification of dendritic cell migration and antigen trafficking between the skin and lymph nodes. Scientific Reports. 4, 6030 (2014).
  36. Moran, A. E., et al. T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse. Journal of Experimental Medicine. 208 (6), 1279-1289 (2011).
  37. Schmidt, T. H., Bannard, O., Gray, E. E., Cyster, J. G. CXCR4 promotes B cell egress from Peyer's patches. Journal of Experimental Medicine. 210 (6), 1099-1107 (2013).
  38. Beura, L. K., et al. T Cells in Nonlymphoid Tissues Give Rise to Lymph-Node-Resident Memory T Cells. Immunity. 48 (2), 327-338 (2018).
  39. Torcellan, T., et al. In vivo photolabeling of tumor-infiltrating cells reveals highly regulated egress of T-cell subsets from tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114 (22), 5677-5682 (2017).
  40. Khan, T. N., Mooster, J. L., Kilgore, A. M., Osborn, J. F., Nolz, J. C. Local antigen in nonlymphoid tissue promotes resident memory CD8+ T cell formation during viral infection. Journal of Experimental Medicine. 213 (6), 951-966 (2016).
  41. Loo, C. P., et al. Lymphatic Vessels Balance Viral Dissemination and Immune Activation following Cutaneous Viral Infection. Cell Reports. 20 (13), 3176-3187 (2017).
  42. Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. (73), e50062 (2013).
  43. Morton, A. M., et al. Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (18), 6696-6701 (2014).
  44. Meeth, K., Wang, J. X., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations. Pigment Cell Melanoma Research. 29 (5), 590-597 (2016).
  45. Demkowicz, W. E., Littaua, R. A., Wang, J., Ennis, F. A. Human cytotoxic T-cell memory: long-lived responses to vaccinia virus. Journal of Virology. 70 (4), 2627-2631 (1996).
  46. Stewart, A. J., Devlin, P. M. The history of the smallpox vaccine. Journal of Infection. 52 (5), 329-334 (2006).
  47. Hammarlund, E., et al. Duration of antiviral immunity after smallpox vaccination. Nature Medicine. 9 (9), 1131-1137 (2003).
  48. Lund, A. W., et al. Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).
  49. Tomura, M., Kabashima, K. Analysis of cell movement between skin and other anatomical sites in vivo using photoconvertible fluorescent protein "Kaede"-transgenic mice. Methods in Molecular Biology. , 279-286 (2013).
  50. Bellingan, G. J., Caldwell, H., Howie, S. E., Dransfield, I., Haslett, C. In vivo fate of the inflammatory macrophage during the resolution of inflammation: inflammatory macrophages do not die locally, but emigrate to the draining lymph nodes. Journal of Immunology. 157 (6), 2577-2585 (1996).
  51. Gautier, E. L., Ivanov, S., Lesnik, P., Randolph, G. J. Local apoptosis mediates clearance of macrophages from resolving inflammation in mice. Blood. 122 (15), 2714-2722 (2013).
  52. Abadie, V., et al. Neutrophils rapidly migrate via lymphatics after Mycobacterium bovis BCG intradermal vaccination and shuttle live bacilli to the draining lymph nodes. Blood. 106 (5), 1843-1850 (2005).
  53. Beauvillain, C., et al. CCR7 is involved in the migration of neutrophils to lymph nodes. Blood. 117 (4), 1196-1204 (2011).
  54. Rigby, D. A., Ferguson, D. J., Johnson, L. A., Jackson, D. G. Neutrophils rapidly transit inflamed lymphatic vessel endothelium via integrin-dependent proteolysis and lipoxin-induced junctional retraction. Journal of Leukocyte Biology. 98 (6), 897-912 (2015).
  55. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
  56. Binnewies, M., et al. Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy. Nature Medicine. 24 (5), 541-550 (2018).

Tags

Biologi spørgsmålet 143 lymfekar egress menneskehandel Kaede FITC maling leukocytter melanom
Kvantificere leukocyt udgang via lymfekar fra Murine hud og tumorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Steele, M. M., Churchill, M. J.,… More

Steele, M. M., Churchill, M. J., Breazeale, A. P., Lane, R. S., Nelson, N. A., Lund, A. W. Quantifying Leukocyte Egress via Lymphatic Vessels from Murine Skin and Tumors. J. Vis. Exp. (143), e58704, doi:10.3791/58704 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter