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Biology

Murine त्वचा और ट्यूमर से लसीका वाहिकाओं के माध्यम से ल्युकोसैट निकास बढ़ाता

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58704
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 1,2,3,4
1Department of Cell, Developmental, & Cancer Biology, Oregon Health and Science University, 2Department of Molecular Microbiology & Immunology, Oregon Health and Science University, 3Department of Dermatology, Oregon Health and Science University, 4Knight Cancer Institute, Oregon Health and Science University

Summary

यहां, हम ल्युकोसैट निकास के vivo ठहराव में भोले, सूजन, और घातक murine त्वचा के लिए तरीके प्रदर्शित करते हैं । हम दो मॉडलों की एक सिर से सिर की तुलना प्रदर्शन: ट्रांसडर्मल FITC आवेदन और सीटू photoconversion में । इसके अलावा, हम त्वचा के ट्यूमर से ल्युकोसैट निकास पर नज़र रखने के लिए photoconversion की उपयोगिता का प्रदर्शन ।

Abstract

परिधीय ऊतकों से ल्युकोसैट निकास लिम्फ नोड्स draining के लिए न केवल प्रतिरक्षा निगरानी और दीक्षा के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन यह भी परिधीय ऊतक प्रतिक्रियाओं के समाधान के लिए योगदान देता है । जबकि तरीकों की एक किस्म के लिए गैर लसीकावत्, परिधीय ऊतकों, सेलुलर और आणविक तंत्र है कि संदर्भ पर शासन-निर्भर निकास खराब समझ में रहने से ल्युकोसैट निकास यों तो इस्तेमाल किया जाता है । यहां, हम murine त्वचा और ट्यूमर से ल्युकोसैट निकास के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए सीटू photoconversion में उपयोग का वर्णन । Photoconversion चमड़े के नीचे ऊतक के भीतर ल्यूकोसाइट्स निवासी के प्रत्यक्ष लेबलिंग के लिए अनुमति देता है । हालांकि बैंगनी प्रकाश के लिए त्वचा जोखिम स्थानीय भड़काऊ ल्युकोसैट घुसपैठ और संवहनी leakiness द्वारा विशेषता प्रतिक्रियाओं लाती है, एक सिर में फ्लोरोसेंट अनुरेखकों के ट्रांसडर्मल आवेदन के साथ तुलना सिर, photoconversion विशेष रूप से लेबल प्रवासी वृक्ष कोशिका आबादी और इसके साथ ही त्वचा के microenvironments और ट्यूमर से माइलॉयड और लसीकावत् निकास के ठहराव सक्षम होना चाहिए । ल्युकोसैट निकास के तंत्र intratumoral ल्युकोसैट जटिलता के बारे में हमारी समझ में एक लापता घटक रहते हैं, और इस प्रकार के उपकरण के आवेदन के साथ साथ यहां वर्णित ट्यूमर प्रतिरक्षा की गतिशीलता में अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा microenvironments दोनों स्थिर राज्य में और चिकित्सा के जवाब में ।

Introduction

परिधीय ऊतक प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं न केवल सूजन की साइटों के लिए ल्युकोसैट भर्ती द्वारा आकार के हैं, लेकिन यह भी तंत्र है कि उनके बाद प्रतिधारण को विनियमित द्वारा । इस प्रकार, सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा संचई सेलुलर और आणविक तंत्र है कि निर्धारित करता है कि एक ल्युकोसैट में प्रवेश करती है, भीतर रहता है, या नहीं बल्कि लसीका वाहिकाओं के माध्यम से परिधीय ऊतक के बाहर प्रवास द्वारा तय है । महत्वपूर्ण बात, ल्यूकोसाइट्स के लिए प्रवृत्ति लसीका वाहिकाओं के माध्यम से ऊतक बाहर निकलने के लिए (निकास) उनके विशेष कार्यों से जुड़ा हुआ है । वृक्ष कक्ष (DC) में परिपक्वता संकेत antigen परिवहन और प्रस्तुति में लिम्फ नोड्स (dLN), एक प्रक्रिया है कि अनुकूली उन्मुक्ति प्रतिरक्षा के लिए आवश्यक है के लिए अग्रणी की प्रतिक्रिया में प्रवासी व्यवहार प्राप्त1। ऐसी मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल के रूप में माइलॉयड कोशिकाओं सफाई, phagocytosis के माध्यम से अपोप्तोटिक मलबे स्पष्ट करने के लिए सेवा करते हैं । बैक्टीरियल संक्रमण के दौरान, न्यूट्रोफिल निकास ऊतक और अंत में dLNs2 में apoptosis से गुजरना और DSS-प्रेरित कोलाइटिस के एक मॉडल में, डेटा परिकल्पना है कि मैक्रोफेज निकास स्थानीय सूजन3को हल करने के लिए आवश्यक है का समर्थन करता है । चाहे न्युट्रोफिल और मैक्रोफेज निकास सभी भड़काऊ संदर्भों में होता है, तथापि, अज्ञात है । टीलिम्फोसाइट निकास स्थिर राज्य से4,5,6,7, संक्रमित8, और सूजन4,9,10, के लिए सबूत 11,12 परिधीय, गैर लसीकावत् ऊतकों को इंगित करता है कि टी कोशिकाओं को सक्रिय रूप से पुनर्संचारित, हालांकि ऊतक आधारित संकेतों है कि इस बाहर निकलें ड्राइव खराब समझ में रहते हैं । कई अध्ययनों से पहचाना लसीका केशिकाओं और बाद में निकास सहित chemokine (सी सी आकृति) ligand 21 (CCL21) और इसकी रिसेप्टर CCR74,11draining की ओर दिशात्मक प्रवास के लिए आवश्यक संकेतों की पहचान की है 13, chemokine (सी-एक्स-सी आकृति) ligand 12 (CXCL12) और इसकी रिसेप्टर CXCR42,14, और sphingosine-1-फॉस्फेट (S1P)10,15,16. इन तंत्रों सभी संदर्भों में सक्रिय नहीं हैं, तथापि, और क्या वे सभी प्रकार के सेल के निकास निर्धारित एक खुला सवाल रहता है । महत्वपूर्ण बात, तंत्र में और अधिक जानकारी है कि निकास और उसकी बीमारी में कार्यात्मक प्रासंगिकता नियंत्रण के विश्लेषण के vivo तरीकों में मात्रात्मक की आवश्यकता है ।

कई तरीकों को लसीका वाहिकाओं के प्रत्यक्ष cannulation सहित vivo में कई पशु मॉडलों में निकास यों तो इस्तेमाल किया गया है, पूर्व वीवो लेबल ल्यूकोसाइट्स, फ्लोरोसेंट अनुरेखक के ट्रांसडर्मल आवेदन के दत्तक हस्तांतरण, लेबल कणों के इंजेक्शन, और vivo photoconversion में17,18. प्रत्यक्ष cannulation के afferent माउस लसीका वाहिकाओं मुश्किल है और तरल पदार्थ है कि एकत्र किया जा सकता है की मात्रा से छोटे जानवरों में सीमित है । इस प्रकार, cannulation मोटे तौर पर बड़े जानवरों में प्रदर्शन किया गया है (जैसे, भेड़) जहां इस तरह के सर्जिकल जोड़तोड़ व्यावहारिक हैं । ये अध्ययन दोनों लसीकावत् और माइलॉयड कोशिकाओं की उपस्थिति के लिए प्रत्यक्ष सबूत10,19,20में प्रदान करते हैं । इसके अलावा, ovine मॉडल पता चलता है कि तीव्र और जीर्ण सूजन लिम्फ में लिम्फोसाइट उपस्थिति में वृद्धि हुई लगभग १००-गुना10,21.

लेबल और आनुवंशिक रूप से हेरफेर लिम्फोसाइटों के दत्तक स्थानांतरण महत्वपूर्ण रूप से पता चला है कि CCR7 तीव्र सूजन त्वचा से CD4+ टी कोशिकाओं के निकास के लिए आवश्यक है5,11, जबकि लिम्फोसाइटों के उपचार छोटे अणु S1P रिसेप्टर एगोनिस्ट, FTY720 के साथ, केवल आंशिक रूप से उनके10निकास को रोकता है । दिलचस्प है, लंबे समय से सूजन त्वचा से तबादला लिम्फोसाइटों के निकास CCR7-स्वतंत्र10है, लेकिन आंशिक रूप से9CXCR4 की आवश्यकता हो सकती है । adoption स्थानांतरण प्रयोगों, तथापि, गैर शारीरिक संख्या में सक्रिय पूर्व vivo और इंजेक्शन के माध्यम से ऊतक में लिम्फोसाइटों लेबल, जो ऊतकों और ऊंचा मध्यवर्ती द्रव दबाव के यांत्रिक वातावरण बदल वितरित कि प्रारंभिक लसीका केशिकाओं खुला और उनके परिवहन गुण22बदल जाते हैं । एक विकल्प के रूप में, fluorescein isothiocyanate (FITC) की उपस्थिति या चमड़े की अड़चन के अभाव में ट्रांसडर्मल आवेदन (जैसे, dibutyl phthalate, DBP) या23संक्रमण,24 की ट्रैकिंग के लिए अनुमति देता है phagocytic कोशिकाओं है कि अनुरेखक जमा और dLNs के लिए माइग्रेट. इसी तरह, फ्लोरोसेंट लेबल ट्यूमर phagocytic कोशिकाओं है कि ट्यूमर सामग्री25घिरा हुआ है ट्रैक करने के लिए एक साधन प्रदान करते हैं । इन पद्धतियों तंत्र है किडीसी निकास13,14,17,26,27 पर शासन में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की है, लेकिन गैर phagocytic ट्रैक करने में असमर्थ है लिम्फोसाइटों और, व्याख्या मुक्त घुलनशील FITC के लसीका जल निकासी इस प्रकार गैर प्रवासी, LN निवासी dc लेबल द्वारा जटिल हो सकता है ।

वैकल्पिक रूप से, intravital माइक्रोस्कोपी एक शक्तिशाली उपकरण है कि vivo वास्तविक समय28,29में शारीरिक रूप से प्रासंगिक ल्युकोसैट आबादी के ट्रैकिंग में के लिए अनुमति देता है । रिपोर्टर चूहों और एंटीबॉडी-vivo immunofluorescent लेबलिंग में आधारित के साथ संयोजन में प्रयुक्त, intravital माइक्रोस्कोपी मध्य प्रवास 30 सहित प्रतिरक्षा कोशिका तस्करी के जटिल स्थानिक और लौकिक गतिशीलता से पता चला है , लसीका endothelium भर में स्थानांतरगमन, लसीका लुमेन के भीतर पारित होने और, LN प्रविष्टि28,31पर प्रवासन । intravital इमेजिंग तकनीक के व्यापक अपनाने व्यय द्वारा सीमित है, सेट अप के लिए आवश्यक विशेषज्ञता, और एकाधिक कोशिका प्रकार को बढ़ाता है के लिए सीमित प्रवाह । फिर भी, युग्मन मात्रात्मक विधियों कि intravital इमेजिंग के साथ जनसंख्या गतिशीलता ऊतकों का विश्लेषण गतिशीलता और प्रवास की ओर और लसीका केशिकाओं के भीतर के तंत्र के संबंध में अतिरिक्त और महत्वपूर्ण यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा 18 , 31 , ३२.

नतीजतन, vivo photoconversion में एक तरीका है कि सीटू लेबलिंग में , phagocytic गतिविधि से स्वतंत्र के लिए अनुमति देता है के रूप में उभरा है, और शारीरिक ल्युकोसैट निकास के ठहराव के लिए (जब प्रवाह cytometry के साथ युग्मित) में अनुपस्थिति या चुनौती की उपस्थिति । Kaede-टीजी चूहों constitutively पथरीले कोरल है कि हरी प्रतिदीप्ति (Kaede हरा) से अलग बैंगनी प्रकाश को उजागर जब तक प्रदर्शित एक प्रोटीन व्यक्त, जिसके बाद यह अचल लाल प्रतिदीप्ति (Kaede लाल)३३में धर्मांतरित । Photoconverted कोशिकाओं के रूप में वे परिधीय ऊतक साइटों से निकास और dLNs में जमा ट्रैक किया जा सकता है । यह और इसी तरह के अंय photoconvertible माउस मॉडल३४,३५ से पता चला है महत्वपूर्ण जीव विज्ञान के गठन निकास सहित त्वचा से विनियामक टी कोशिकाओं३६, CXCR4-निर्भर बी सेल निकास से Peyer पैच३७ , पर निवासी स्मृति टी कोशिकाओं के जुड़ाव पेप्टाइड पुनः चुनौती३८, और व्यापक ल्युकोसैट निकास ट्यूमर microenvironments३९से । इस के साथ साथ, हम त्वचा की सूजन और संक्रमण के संदर्भ में ट्रांसडर्मल FITC आवेदन के साथ photoconversion की एक सिर से सिर की तुलना करने के लिए photoconvertible विधि के साथ मौजूदा डेटा की प्रत्यक्ष तुलना के लिए अनुमति देते हैं । इसके अलावा, हम प्रत्यारोपित ट्यूमर में photoconversion प्रदर्शन और ट्यूमर microenvironments से रूपांतरण दक्षता और चयनात्मक निकास का वर्णन । जैसे, हम तर्क है कि इन तरीकों के आगे आवेदन के लिए ट्यूमर से ल्युकोसैट निकास के महत्वपूर्ण जीव विज्ञान स्पष्ट की जरूरत है, जो intratumoral ल्युकोसैट जटिलता की व्याख्या के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ होगा, विरोधी ट्यूमर उन्मुक्ति, और चिकित्सा के लिए प्रतिक्रिया ।

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Protocol

सभी पशु प्रोटोकॉल ओरेगन स्वास्थ्य & विज्ञान विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. सूजन और माउस Pinna के FITC पेंटिंग की प्रेरण

  1. एक लामिना प्रवाह हूड में, anesthetize एक C57Bl/6 का उपयोग कर भाँप isofluorane (3-5% isofluorane पर प्रेरित और बनाए रखने में 1-3% isofluorane पर ऑक्सीजन प्रवाह दर 0.5-1.0 L/ पैडल पलटा, अनैच्छिक आंदोलनों और कम श्वसन दर के नुकसान की निगरानी द्वारा उचित anesthetization सुनिश्चित करें ।
  2. ऊपर की ओर का सामना करना पड़ कान के ventral पक्ष के साथ एक कान फ्लैट करना । प्लास्टिक 20 µ l के 5% FITC हल में भंग 1:1 एसीटोन: dibutyl phthalate (DBP) के ventral ओर कान pinna । कान कुछ सेकंड के लिए शुष्क करने की अनुमति दें ।
  3. 24 एच FITC आवेदन के बाद, गर्भाशय ग्रीवा के विस्थापन के बाद कार्बन डाइऑक्साइड जोखिम के माध्यम से चूहों euthanize । कैंची का इस्तेमाल कर सिर से कानों को अलग करके पंजाब में कान pinnae लीजिए. आसपास के ऊतकों से LNs अलग करने के लिए चिमटी का उपयोग कर पंजाब में ग्रीवा dLNs और वंक्षण गैर draining LNs लीजिए । वंक्षण गैर draining LNs FITC+/Kaede लाल+ ल्यूकोसाइट्स की उपस्थिति के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम करेगा । संस्थागत प्रोटोकॉल प्रति लावे का निपटारा ।
    नोट: विश्लेषण के लिए इष्टतम समय पोस्ट photoconversion सेल प्रकार और ज्ञात प्रवासी व्यवहार पर निर्भर करेगा । वृक्ष कोशिकाओं, उदाहरण के लिए, dLNs में 6 एच पोस्ट DBP आवेदन के रूप में जल्दी पता लगाया जा सकता है ।

2. सूजन और माउस Pinna के Photoconversion की प्रेरण

  1. एक लामिना फ्लो हुड में, anesthetize एक Kaede-टीजी माउस (पृष्ठभूमि C57Bl/intraperitoneal इंजेक्शन के द्वारा ८० मिलीग्राम/किलो ketamine और 10 मिलीग्राम/खारा में भंग xylazine । चरण १.१ में बताए अनुसार उचित anesthetization सुनिश्चित करें ।
  2. ऊपर की ओर का सामना करना पड़ कान के ventral पक्ष के साथ एक कान फ्लैट करना । प्लास्टिक 20 µ l की एक 1:1 एसीटोन: DBP के ventral ओर कान pinna । कान कुछ सेकंड के लिए शुष्क करने की अनुमति दें ।
  3. DBP आवेदन के बाद, एल्यूमीनियम पंनी का एक टुकड़ा में एक भट्ठा काट और भट्ठा के माध्यम से कान खींचने के लिए वायलेट प्रकाश स्रोत को कान बेनकाब । पन्नी के लिए कान सुरक्षित करने के लिए डबल पक्षीय टेप का उपयोग कर ऊपर की ओर पृष्ठीय पक्ष के साथ फ्लैट कान करना ।
  4. प्रकाश स्रोत के तहत सीधे कान की स्थिति, और 3 मिनट के लिए photoconvert १०० मेगावाट बिजली पर एक ४०५ एनएम प्रकाश स्रोत का उपयोग कर ।
  5. 24 ज photoconversion के बाद, Kaede-टीजी चूहों euthanize और चरण १.३ में वर्णित के रूप में कान pinnae, ग्रीवा LNs, और वंक्षण LNs फसल ।
    नोट: १.३ कदम में उद्धृत विचार के अलावा, प्रसार की दरों Kaede लाल का नुकसान तेजी से कोशिकाओं विभाजन में हो जाएगा के रूप में विश्लेषण के समय का निर्धारण करेगा.

3. माउस Pinna और FITC आवेदन के Vaccinia संक्रमण

  1. Anesthetize एक C57Bl/6 माउस के साथ १.१ चरण में वर्णित के रूप में भाँप isofluorane ।
  2. कान के समतल की ओर ventral करना. प्लास्टिक 5 एक्स 106 पट्टिका बनाने इकाइयों (PFU) के vaccinia वायरस (VacV) के कान µ पर पंजाब के 10 pinna एल में पतला । एक 29 गेज सुई का उपयोग कर, pinna प्रहार 25 बार४०।
  3. 24 एच के बाद संक्रमण, anesthetize VacV-संक्रमित चूहों के साथ isofluorane चरण १.१ में वर्णित के रूप में और प्लास्टिक 20 µ l 5% FITC में एसीटोन साइड पर ventral में भंग कान pinna. कान कुछ सेकंड के लिए शुष्क करने की अनुमति दें ।
  4. 24 ज FITC आवेदन करने के बाद, चूहों euthanize और चरण १.३ में वर्णित के रूप में कान pinnae, ग्रीवा LNs और वंक्षण LNs इकट्ठा ।
    नोट: FITC विभिंन 24 एच अंतराल पर डीसी तस्करी निर्धारित करने के लिए किसी भी समय बिंदु पद संक्रमण पर लागू किया जा सकता है । हमने पहले बताया था कि dLNs करने के लिए डीसी माइग्रेशन 1 दिन से 3 पोस्ट संक्रमण४१समान स्तर पर बनाए रखा है ।

4. माउस Pinna और Photoconversion का Vaccinia इंफेक्शन ।

  1. १.१ चरण में वर्णित के रूप में भाँप isofluorane के साथ एक Kaede-टीजी माउस Anesthetize.
  2. चरण ३.२ में वर्णित के रूप में VacV के साथ कान pinna संक्रमित ।
  3. 24 एच के बाद संक्रमण, anesthetize VacV-संक्रमित Kaede चूहों के रूप में २.१ कदम में वर्णित है और चरण 2.3-2.4 में वर्णित के रूप में photoconversion प्रदर्शन ।
  4. 24 ज photoconversion के बाद, चूहों euthanize और चरण १.३ में वर्णित के रूप में कान pinnae, ग्रीवा LNs, और वंक्षण LNs फसल ।
    नोट: चरण ३.४ में ऊपर वर्णित के रूप में, photoconversion किसी भी समय बिंदु पद संक्रमण पर प्रशासित किया जा सकता है ।

5. कान और लिम्फ नोड प्रवाह Cytometry के लिए प्रसंस्करण

  1. कान pinnae के सिंगल सेल सस्पेंशन बनाएं: कान के ventral और पृष्ठीय किनारों के अलावा pinna चिमटी के दो जोड़े का उपयोग कर और एक 24 अच्छी तरह से प्लेट युक्त के कुओं में नीचे का सामना करना पड़ कान के अंदर के साथ जगह 1 मिलीग्राम/एमएल collagenase डी और ८० यू/एमएल DNase में पतला है हांक बफर खारा समाधान (HBSS) (2 Ca + और2 मिलीग्राम +युक्त) । 30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन एक ७० µm नायलॉन सेल छलनी के माध्यम से पचा ऊतक दबाएँ ।
  2. LNs से सिंगल सेल सस्पेंशन बनाएं: एक 24 वेल प्लेट वाले LNs के कुंए में जगह 1 मिलीग्राम/एमएल collagenase डी और ८० यू/एमएल DNase HBSS में पतला । चिढ़ाना २ २९-गेज सुई का उपयोग कर लिम्फ नोड कैप्सूल खोलें, और फिर 30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर लिम्फ नोड्स मशीन एक ७० µm नायलॉन सेल छलनी के माध्यम से पचा ऊतक दबाएँ ।

6. Intradermal मेलेनोमा ट्यूमर आरोपण और Photoconversion ।

  1. एक Kaede-टीजी माउस के पीछे के केंद्र से फर दाढ़ी एक बिजली के रेजर का उपयोग कर ।
  2. स्थिति एक 29-बाएं और दाएं ऊपरी scapulae के बीच पीठ के केंद्र में गेज सुई, और intradermally सुई 5 एक्स 105 ट्यूमर कोशिकाओं (खारा के ५० µ एल में पतला) Kaede-टीजी चूहों की त्वचा में । ट्यूमर ध्यान से निर्दिष्ट लिम्फ नोड्स के लिए लसीका जल निकासी सुनिश्चित करने के लिए तैनात किया जाना चाहिए (यानी, बाएं और दाएं बाहु LNs ट्यूमर के लिए ऊपरी पीठ के बीच में रखा) । dLN के ऊपर ट्यूमर रखने से बचने के रूप में यह त्वचा के माध्यम से LNs के प्रत्यक्ष photoconversion में परिणाम कर सकते है/
  3. ट्यूमर वांछित आकार (100-650 mm3) को विकसित करने की अनुमति दें ।
  4. एक दिन ऊतक संग्रह करने से पहले, anesthetize एक Kaede-टीजी माउस के रूप में २.१ में वर्णित है और किसी भी नव हो ट्यूमर के आसपास फर दाढ़ी ।
  5. एल्यूमीनियम पंनी में एक परिपत्र छेद में कटौती और ट्यूमर खींच के माध्यम से प्रकाश स्रोत के लिए ट्यूमर बेनकाब । छेद थोड़ा ट्यूमर से छोटे छेद के माध्यम से वापस गिरने से रोकने के लिए और आसंन, गैर ट्यूमर त्वचा के रूपांतरण को कम करने से छोटा काट ।
  6. 5 मिनट के लिए प्रकाश स्रोत और photoconvert नीचे सीधे ट्यूमर स्थिति २०० मेगावाट बिजली पर एक ४०५ एनएम प्रकाश स्रोत का उपयोग कर ।
  7. 24 ज photoconversion के बाद, euthanize चरण १.३ में वर्णित के रूप में चूहों । पंजाबियों में ट्यूमर, बाहु dLNs, और वंक्षण गैर draining LNs ले लीजिए । ट्यूमर का उपयोग कर आसपास की त्वचा से दूर काटें और LNs चरण १.३ में वर्णित के रूप में निकालें ।

7. ट्यूमर और लिम्फ नोड प्रवाह Cytometry के लिए प्रसंस्करण

  1. ट्यूमर से एकल सेल सस्पेंशन बनाएँ: एक 24 अच्छी तरह से युक्त प्लेट के कुओं में कैंची के साथ ट्यूमर कीमा 1 मिलीग्राम/एमएल collagenase डी और ८० यू/एमएल DNase HBSS में पतला । 1 घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन एक ७० µm नायलॉन छलनी के माध्यम से पचा ऊतक दबाएं ।
  2. चरण ५.२ में वर्णित के रूप में लिम्फ नोड्स के एकल सेल निलंबन बनाएँ ।

8. प्रवाह Cytometry के लिए एंटीबॉडी धुंधला

  1. एक कोशिका निलंबन में ऊतकों को पचाने के बाद, मानक प्रवाह cytometry धुंधला तकनीक ब्याज की मार्कर के साथ कोशिकाओं लेबल करने के लिए प्रदर्शन । संक्षेप में, एक ९६-अच्छी तरह से थाली में प्लास्टिक 2 x 106 कोशिकाओं । बर्फ पर 20 मिनट के लिए एफसी ब्लॉक (1 µ g/एमएल) के साथ नमूनों की मशीन; FACs बफर (पंजाब में 1% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन) के साथ दो बार धो लें । जीवित/मृत दाग (पंजाब में पतला) के नमूनों को जोड़ें और बर्फ पर 15 मिनट के लिए मशीन; FACs बफर के साथ दो बार धो लें । प्राथमिक एंटीबॉडी (सामग्री की मेज) बर्फ पर 30 मिनट के लिए FACs बफर में पतला के साथ मशीन; FACs बफर के साथ दो बार धो लें ।
    नोट: Kaede हरे और Kaede लाल प्रतिदीप्ति FITC और पीई fluorophores के साथ ओवरलैप; इस प्रकार, FITC और पीई-संयुग्मित एंटीबॉडी Kaede प्रोटीन के साथ संयोजन में इस्तेमाल नहीं किया जा सकता ।
  2. दाग के बाद, एक प्रवाह cytometer पर नमूने चलाते हैं । वैकल्पिक रूप से, 2% पीएफए के साथ कोशिकाओं को ठीक करें ।

9. फ्लो Cytometry एनालिसिस

  1. सेट FITC (Kaede ग्रीन) और पीई (Kaede लाल) चैनल PMT वोल्टेज की कुल रेंज का 70-80% (केंद्र जनसंख्या पर लगभग 104) का उपयोग कर पूर्व विवो Kaede ग्रीन या Kaede लाल एकल रंग splenocytes या रक्त.
    नोट: Kaede ग्रीन (FITC) और Kaede लाल (पीई) चैनलों के लिए क्षतिपूर्ति नहीं के रूप में इस अधिक से अधिक संकेत प्रसार में परिणाम होगा ।
    1. एकल रंग Kaede नियंत्रण बनाने के लिए, एक तिल्ली या एक Kaede-टीजी माउस से रक्त इकट्ठा । लाइसे लाल रक्त कोशिकाओं को ले बफर के साथ, फिर कोशिकाओं को दो समूहों में विभाजित: Kaede हरे और परिवर्तित Kaede लाल परिवर्तित ।
    2. एक रंग Kaede लाल नियंत्रण के लिए, पंजाबियों और photoconvert के 1 मिलीलीटर में एक 24 अच्छी तरह से प्लेट के लिए 5 मिनट के लिए १०० मेगावाट की बिजली पर एक ४०५ एनएम प्रकाश स्रोतों का उपयोग कर में कोशिकाओं को निलंबित । Kaede ग्रीन (FITC) और Kaede लाल PMT वोल्टेज प्रवाह cytometer (चरण ९.१) पर सेट करने के लिए इन कक्षों का उपयोग करें ।
  2. एक बार Kaede प्रोटीन के लिए वोल्टेज सेट किया गया है, अंय सभी प्राथमिक एंटीबॉडी एक निर्माता के निर्देशों के अनुसार मुआवजा मोती लेबल fluorophore का उपयोग दाग के लिए क्षतिपूर्ति ।
  3. डेटा एकत्रित करने के लिए एक प्रवाह cytometer पर नमूने चलाएं ।
    नोट: Kaede प्रोटीन लगातार कोशिकाओं द्वारा उत्पादित किया जा रहा है । इसका मतलब यह है कि photoconversion के बाद 24 ज, परिवर्तित कोशिकाओं Kaede हरी और Kaede लाल के लिए डबल हो जाएगा के रूप में नए संश्लेषित Kaede (हरा) प्रोटीन सेल में जमा है ।
  4. FlowJo सॉफ्टवेयर या एक समान सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण ।

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Representative Results

हम पहले photoconversion साहित्य में प्रकाशित करने के लिए दक्षता का मूल्यांकन परिणाम दोहराने की मांग की और माउस त्वचा में जुड़े सूजन निर्धारित करते हैं । कान pinna पहले३३वर्णित के रूप में 3 मिनट के लिए १०० मेगावाट वायलेट प्रकाश (४०५ एनएम) के संपर्क में था । एक कोशिका कान त्वचा या ग्रीवा dLNs से उत्पंन निलंबन तुरंत प्रदर्शन के बाद dLNs (चित्र 1a) में मनाया कोई परिवर्तित कोशिकाओं के साथ त्वचा में सभी CD45+ ल्यूकोसाइट्स की एक ७८% रूपांतरण क्षमता का पता चला । photoconversion के साथ जुड़े भड़काऊ प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए, हम घुसपैठ की संख्या quantified CD45+ परिवर्तित कान में ल्यूकोसाइट्स 0 और 24 एच पद रूपांतरण (आंकड़ा 1b) और मापा के रूप में संवहनी पारगम्यता में तीव्र परिवर्तन मील की परख४२ (चित्रा 1C) द्वारा । संक्षेप में, २०० µ एल के ०.५% इवांस नीले photoconversion के बाद intravascularly इंजेक्शन 2 ज था । कान इंजेक्शन और इवांस ब्लू formamide के साथ 55 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए निकाला गया था के बाद 30 मिनट एकत्र किए गए थे (अवशोषक ६१० एनएम४२पर पढ़ें) । दोनों CD45+ घुसपैठ (24 एच) और संवहनी रिसाव (2 ज) काफी photoconversion के बाद बढ़ रहे थे, यह दर्शाता है कि इस छोटे से जोखिम पर भी, photoconversion ही ऊतक विशेष भड़काऊ प्रतिक्रिया प्रभाव हो सकता है । CD45 से तुलना+ घुसपैठ (चित्रा 1b) और संवहनी रिसाव (१.४ µ g/कान ± ०.७५) VacV संक्रमित कान में 24 एच पद संक्रमण४१ वायलेट प्रकाश (०.०८ µ जी/कान ± ०.०१) की वजह से सूजन की हद तक के लिए संदर्भ प्रदान करता है ।

जबकि कई मॉडलों को गैर लसीकावत्, परिधीय ऊतकों से ल्युकोसैट निकास ट्रैक करने के लिए विभिंन अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है, यह स्पष्ट नहीं है कि इन तरीकों को अपनी विशिष्ट आबादी को ट्रैक करने की क्षमता में तुलना के रूप में वे त्वचा से बाहर निकलें । नतीजतन, हम एक प्रत्यक्ष सिर करने के लिए दो सामांयतः इस्तेमाल किया तरीकों के सिर की तुलना करने के लिए LNs, FITC रंग और vivo photoconversion में डीसी निकास ट्रैक, क्रम में दक्षता और मात्रा के लिए प्रत्येक विधि की विशिष्टता का मूल्यांकन करने का फैसला किया स्थिर राज्य में डीसी निकास के विश्लेषण, त्वचा की सूजन के दौरान, और संक्रमित चमड़ी से । प्रत्येक विश्लेषण के लिए, त्वचा ट्रांसडर्मल FITC आवेदन के अधीन या 3 मिनट के लिए १०० मेगावाट ४०५ एनएम प्रकाश को उजागर किया गया था । LN डीसी आबादी के रूप में परिभाषित किया गया CD3ε-CD19-MHCII+CD11c+ और आगे स्तरीकृत में 1) MHCIIहाय CD11cint dc, जो प्रवासी dc (mDCs) के लिए समृद्ध करता है दोनों CD103+ BATF3-निर्भर पार-पेश dc, और CD11b+ अधययन dc; और 2) MHCIIintCD11chi dc है, जो CD8α+ BATF3-निर्भर क्रॉस-पेश करने वाले dc (चित्रा 2a) सहित निवासी dc (rDCs) के लिए समृद्ध करता है । 24 ज या तो FITC आवेदन या photoconversion के बाद, लेबल कोशिकाओं को नालियों में आसानी से पता लगाने में थे, लेकिन गैर draining LNs (चित्रा बी) । डीसी प्रवासन की हद तक LNs और साथ ही लेबलिंग आबादियों और नहीं निवासी LN आबादी के लिए विधि की विशिष्टता का निर्धारण करने के लिए, हम स्थिर राज्य में mDCs और rDCs लेबल quantified, 24 ज DBP के आवेदन के बाद, व ४८ ज म् VacV scarification (चित्रा 2c). जबकि दोनों photoconversion (Kaede) और FITC लेबल mDCs सभी स्थितियों में, हम FITC में Kaede लेबल mDCs की तुलना में अधिक dLNs-लेबल देखा, VacV संक्रमण के अपवाद के साथ जहां दो तरीकों quantified के एक समान स्तर के साथ एक प्रकार का... इसके अलावा, DBP के संदर्भ में, FITC अतिरिक्त rDC आबादी लेबल जहां photoconversion mDCs (चित्रा 2c) के लिए विशिष्ट रहे । इन तरीकों में से दोनों का उपयोग करना, हम VacV संक्रमित त्वचा से लगभग २०० dc के निकास मनाया और महत्वपूर्ण बात यह है कि निकास recapitulates के इस स्तर पहले प्रकाशित ट्रांसडर्मल एट अल द्वारा FITC लू आवेदन का उपयोग कर निष्कर्षों का उल्लेख किया । ४१. इस प्रकार, भड़काऊ संदर्भ के आधार पर, ट्रांसडर्मल FITC आवेदन dLNs में पाया लेबल dc की संख्या में वृद्धि हो सकती है और गैर-प्रवासी LN-निवासी डीसी आबादी के गैर-विशिष्ट लेबलिंग में परिणाम है, जबकि photoconversion विशेष रूप से एक एमडीसी जनसंख्या में गिरने dc की पहचान करता है ।

Kaede-टीजी चूहों 5,6,३५,३८ चर्म, श्लैष्मिक, से5,३३,४३ और निकास में ल्युकोसैट प्रतिधारण मात्रा के लिए इस्तेमाल किया गया है स्थिर राज्य और सूजन की स्थिति के तहत ऊतकों लसीकावत् और ट्यूमर के लिए लागू केवल एक ही प्रकाशन में जहां ट्यूमर intradermal प्रत्यारोपित किया गया माउस कान में और photoconverted छोटी मात्रा पर३९. इस प्रकार, हम और प्रतिरक्षा परिकल्पना परीक्षण सक्षम करने के लिए स्थापित, बड़े प्राथमिक ट्यूमर से ल्युकोसैट निकास के ठहराव के लिए vivo photoconversion में की उपयोगिता का मूल्यांकन करने की मांग की । सबसे पहले, हम Kaede-टीजी चूहों में छोड़ दिया और सही scapulae के बीच MC38 ट्यूमर कोशिकाओं intradermally प्रत्यारोपित । प्रत्यारोपित ट्यूमर मॉडल ट्यूमर की सटीक स्थिति को सक्षम करने के लिए लसीका जल निकासी सुनिश्चित करने के लिए जाना जाता LNs; ऊपरी पीठ की त्वचा में रखा ट्यूमर मुख्य रूप से छोड़ दिया और सही बाहु LNs के लिए नाली । १००-१५० मिमी3तक पहुंचने के बाद, ट्यूमर photoconverted थे (10 मिनट, २०० मेगावाट) और ट्यूमर और dLNs तुरंत photoconversion के बाद काटा । प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण Kaede ग्रीन से intratumoral CD45+ कोशिकाओं के महत्वपूर्ण रूपांतरण से पता चला + Kaede लाल+ (६९%; 3 ए चित्रा), जबकि महत्वपूर्ण बात, dLNs Kaede लाल+ कोशिकाओं के लिए नकारात्मक बने रहे । photoconverted YUMM १.७ ट्यूमर के इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी से पता चला कि photoconversion ट्यूमर ऊतक में गहरी प्रवेश (> 1 मिमी; चित्र बी) । दिलचस्प है, त्वचा और संवहनी कोशिकाओं Kaede प्रोटीन के उच्च स्तर को व्यक्त इन सेल प्रकार के उच्च photoconversion दक्षता के लिए अग्रणी के रूप में चित्र बीमें देखा । इस उच्च Kaede लाल अभिव्यक्ति यह मुश्किल प्रतिरक्षा कोशिकाओं की पहचान करने के लिए बनाता है (दोनों unconvert और परिवर्तित) इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग.

मेलेनोमा इम्यूनोलॉजी में हमारे विशेष रुचि को देखते हुए, हम अगले दोनों ट्यूमर आकार और photoconversion दक्षता पर मेलेनिन विभिंन आरोपण murine ट्यूमर सेल लाइनों का उपयोग कर के प्रभाव का मूल्यांकन: MC38 (pigmented कोलोरेक्टल कैंसर लाइन), B16 । F10 (मेलेनिन-मेलेनोमा लाइन का निर्माण), YUMM १.१ (unpigmented मेलेनोमा लाइन), और YUMM १.७ (pigmented मेलेनोमा लाइन)४४। इन पंक्तियों में से प्रत्येक Kaede-टीजी चूहों और photoconverted में intradermal प्रत्यारोपित किया गया, के रूप में विभिंन ट्यूमर खंड में ऊपर वर्णित है (५०-६५० mm3) । ट्यूमर तुरंत photoconversion के बाद काटा गया था और Kaede लाल CD45 की उपस्थिति के लिए मूल्यांकन+ प्रवाह cytometry द्वारा ल्यूकोसाइट्स । दिलचस्प है, CD45 के photoconversion क्षमता+ ल्यूकोसाइट्स ट्यूमर प्रकार और आकार (आंकड़ा 3सी) भर में काफी विविध । CD45+ ल्यूकोसाइट्स के भीतर छोटे (५०-१५० मिमी3) YUMM १.७ और YUMM १.१ ट्यूमर क्रमशः ८०% और ६०% पर सबसे कुशल photoconversion का प्रदर्शन किया । इन ट्यूमर के लिए मात्रा में वृद्धि के रूप में, रूपांतरण क्षमता के आसपास के लिए ५०% की कमी हुई बड़े ट्यूमर (> ६०० mm3) । मेलेनिन photoconversion क्षमता पर एक हड़ताली प्रभाव था: CD45 के लिए अधिकतम photoconversion+ कोशिकाओं मेलेनिन के भीतर उत्पादन B16 । F10 ट्यूमर के बारे में केवल 30% था और 10% तक गिरा ट्यूमर ४०० mm3के संस्करणों तक पहुंच गया । दिलचस्प है, intratumoral सीडी 8 के विश्लेषण+ टी कोशिकाओं को छोटे ट्यूमर में लगभग ८०-९०% पर इन कोशिकाओं के लिए photoconversion क्षमता मेलेनिन उत्पादन (चित्रा 3 डी) की परवाह प्रगट की । pigmented ट्यूमर के लिए, सीडी 8+ टी सेल रूपांतरण उच्च भी बने के रूप में ट्यूमर बड़ी मात्रा तक पहुंच गया है, लेकिन आकार के साथ काफी कमी आई जब मेलेनिन मौजूद था । जैसे, B16 की उपयोगिता । F10 murine melanomas, और अंय मेलेनिन-मेलेनोमा लाइनों के उत्पादन, छोटे ट्यूमर (५० mm3), जो अवशोषित प्रकाश में मेलेनिन के जैविक समारोह के अनुरूप है तक ही सीमित हो सकता है । ट्यूमर के photoconversion से जुड़े भड़काऊ प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए, हम CD45+ कोशिकाओं में परिवर्तित ट्यूमर और परिवर्तित ट्यूमर 24 एच पोस्ट photoconversion (चित्रा 3E) की संख्या quantified । हम CD45 की कुल संख्या में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा+ कोशिकाओं के ट्यूमर में पता चला 24 एच photoconversion के बाद unconvert ट्यूमर की तुलना में.

हम अगले quantified ट्यूमर microenvironments से ल्युकोसैट निकास Kaede-टीजी चूहों, जो दोनों माइलॉयड और लसीकावत् सेल प्रकार के तस्करी व्यवहार के पूछताछ के लिए अनुमति देता है का उपयोग कर । MC38 या YUMM १.७ ट्यूमर कोशिकाओं intradermally Kaede-टीजी चूहों में प्रत्यारोपित किया गया । ट्यूमर १००-१५० मिमी3 (5 मिनट, २०० मेगावाट) के बीच पहुंच गया एक बार photoconverted थे; बाहु dLNs और वंक्षण गैर-draining LNs के photoconversion के बाद २४ ज एकत्र हो गए थे. Intratumoral ल्युकोसैट आबादी MC38 से quantified थे और YUMM १.७ ट्यूमर नियंत्रण में प्रत्यारोपित C57Bl/6 चूहों और एक बार एकत्र ट्यूमर १००-१५० mm3तक पहुंच गया । हम प्रवाह cytometry द्वारा ट्यूमर और egressed आबादी के भीतर ल्युकोसैट जटिलता का मूल्यांकन: टी कोशिकाओं (CD3ε+CD4 +/-सीडी 8+/-), बी कोशिकाओं (CD3ε-CD19+), dc (CD11c+MHCII + CD11b+/ ), न्यूट्रोफिल (CD11b+MHCII-Ly6G+), मैक्रोफेज (CD11b+MHCII+ F4/80+), व भड़काऊ monocytes (CD11b+Ly6G-Ly6C+; चित्र 4a) । इसी गेटिंग योजना का प्रयोग करते हुए, हम dLNs में प्रत्येक ल्युकोसैट जनसंख्या के प्रतिशत का मूल्यांकन किया है कि Kaede लाल व्यक्त ट्यूमर microenvironments में पिछले निवास का संकेत (चित्रा 4B) । दिलचस्प है, जबकि दोनों MC38 (आंकड़ा 4c) और YUMM १.७ (चित्रा 4d) ट्यूमर मुख्य रूप से माइलॉयड कोशिकाओं के साथ घुसपैठ की थी (monocytes, dc, और मैक्रोफेज), कोशिकाओं है कि दोनों ट्यूमर प्रकार से egressed था की लगभग ५०% टी थे लिम्फोसाइटों (दोनों CD4+ और सीडी 8+) । टी कोशिकाओं के अलावा, हम भी देखा dc, बी कोशिकाओं, और ट्यूमर से egressed आबादी के भीतर monocytes लेकिन मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल या तो ट्यूमर प्रकार से नहीं पाया गया । कुल मिलाकर, यह डेटा एक अंतर्जात सेटिंग में एकाधिक ल्युकोसैट वंश पर नज़र रखने के लिए Kaede-टीजी photoconvertible चूहों की उपयोगिता को दर्शाता है । इसके अलावा, हमारे विश्लेषण इंगित करता है कि निकास एक चयनात्मक, सक्रिय प्रक्रिया है कि intratumoral ल्युकोसैट जटिलता निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ हो सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1: Photoconversion दक्षता और murine त्वचा में जुड़े सूजन । Murine dermis १०० मेगावाट (४०५ एनएम लाइट) पर 3 मिनट के लिए photoconverted था । (क) प्रतिनिधि प्रवाह भूखंडों का चित्रण photoconverted (Kaede red+) CD45+ कोशिकाओं से एक अनकन्वर्ट और परिवर्तित कान तथा सर्वाइकल dLN के तुरंत बाद photoconversion. आबादी रहने पर पूर्व gated थे, CD45+ एकल कोशिकाओं. (ख) अनकनवर्टेड कानों में कुल CD45+ कोशिकाओं के गणन (-), कान तुरंत निंनलिखित photoconversion एकत्र, कान photoconversion के बाद 24 ज एकत्र, और कान VacV संक्रमण के बाद 24 ज एकत्र (n = 3) । (ग) एक मील की परख को संवहनी leakiness तुरंत ४०५ एनएम प्रकाश (3 मिनट, १०० मेगावाट) के लिए जोखिम के बाद किया गया था । कान त्वचा में रिसाव की प्रतिनिधि छवि (बाएं) और निकाले डाई के ठहराव (दाएं) (n = 3) । त्रुटि पट्टियां SEM. *p< 0.05 और * *p< 0.01 का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: डीसी भोली, सूजन, और संक्रमित त्वचा से निकास । (क) गेटिंग योजना प्रवासी dc (mDCs की पहचान करने के लिए; MHCIIhiCD11cint) और निवासी dc (rDCs; MHCIIhiCD11chi). (ख) FITC+ या Kaede लाल+ dc, mDCs पर प्री-gated, VacV (dLN) या contralateral गैर-draining LN नियंत्रणों से संक्रमित चूहों से इंगित करते हुए प्रतिनिधि प्रवाह भूखंड । (ग) स्थिर अवस्था के rDCs में Kaede लाल+ और FITC+ mDCs और dLNs की संख्या का ठहराव, DBP-सूजन (२४ एच पद आवेदन), और VacV संक्रमित त्वचा (४८ एच पद संक्रमण). त्रुटि पट्टियों का प्रतिनिधित्व SEM. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: ट्यूमर microenvironments में Photoconversion दक्षता । ट्यूमर २०० मेगावाट (४०५ एनएम प्रकाश) में 10 मिनट के लिए photoconverted थे । (क) Kaede के प्रतिनिधि प्रवाह भूखंड हरे और Kaede लाल रंग में परिवर्तित और परिवर्तित MC38 ट्यूमर और बाहु dLN तुरंत निम्नलिखित photoconversion. आबादी जी, CD45+ एकल कोशिकाओं पर पूर्व gated थे. (ख) जम के इम्यूनोफ्लोरेसेंस microcopy, झालेले-एम्बेडेड YUMM १.७ ट्यूमर दोनों को अनकन्वर्ट और photoconverted. स्केल बार = २०० µm. (ग) CD45+ ल्यूकोसाइट्स की रूपांतरण क्षमता और (घ) सीडी 8+ लिम्फोसाइटों में मेलेनिन-उत्पादन (B16. F10) और pigmented (MC38, YUMM १.१, YUMM १.७) । प्रत्येक बिंदु एक ही माउस का प्रतिनिधित्व करता है । (ङ) अनकनवर्टेड ट्यूमरों और photoconverted ट्यूमरों में कुल CD45+ कोशिकाओं का गणन photoconversion (n = 3) के बाद 24 एच एकत्र किया । त्रुटि पट्टियों का प्रतिनिधित्व SEM. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: ट्यूमर microenvironments से ल्युकोसैट निकास आॅफिस है । (क) MC38 dLNs में माइलॉयड और लसीकावत् आबादी की पहचान के लिए गेटिंग स्कीम. (B) photoconversion के बाद MC38 dLNs 24 ज में माइलॉयड और लसीकावत् कोशिकाओं के बीच Kaede लाल+ कोशिकाओं की पहचान करने वाले प्रतिनिधि प्रवाह भूखंड । प्रवाह भूखंडों में प्रतिशत LNs में संकेत जनक ल्युकोसैट जनसंख्या के भीतर Kaede लाल+ कोशिकाओं की आवृत्ति से संकेत मिलता है. (सी, डी) intratumoral के सापेक्ष अनुपात (CD45+ कोशिकाओं का%) और egressed (% Kaede लाल+ कोशिकाओं; बाहु dLNs) ल्यूकोसाइट्स से MC38 (C, n = 3) और YUMM १.७ (D, n = 4) ट्यूमर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

हालांकि परिधीय से ल्युकोसैट निकास, गैर लसीकावत् ऊतकों दीक्षा और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के समाधान के लिए महत्वपूर्ण है, आणविक तंत्र है कि सरकार निकास खराब समझ रहे हैं । ज्ञान में यह अंतर काफी हद तक vivo मेंठहराव के लिए उपकरणों की तैयार उपलब्धता की वजह से है । यहां, हम त्वचा और ट्यूमर से अंतर्जात ल्युकोसैट निकास यों तो photoconvertible चूहों (Kaede-टीजी) के उपयोग का वर्णन और भड़काऊ और संक्रमण मॉडल में FITC रंग के साथ एक प्रत्यक्ष सिर से सिर तुलना प्रदान करते हैं । हम यह प्रदर्शित करते है कि दोनों मॉडलों ट्रैक अंतर्जात डीसी आबादी, FITC और गरीब गैर-phagocytic कोशिकाओं द्वारा अधिक से मुक्त जल निकासी के FITC पेंट की उपयोगिता माइलॉयड और लसीकावत् निकास परिधीय, गैर सहित लसीकावत् ऊतकों से व्यापक विश्लेषण के लिए सीमा ट्यूमर. इसके अलावा, हम डेटा है कि ट्यूमर से निकास इंगित करता है के बजाय stochastic इस प्रकार Torcellan एट अल द्वारा प्रस्तुत निष्कर्षों की पुष्टि चयनात्मक है उपस्थित । ३९. ट्यूमर से ल्युकोसैट निकास शासी तंत्र के आगे जांच ट्यूमर से जुड़े सूजन और प्रतिरक्षा में उपंयास अंतर्दृष्टि प्रकट हो सकता है ।

हम पहले murine त्वचा में photoconversion की दक्षता और स्थानीय सूजन पर इसके प्रभाव का मूल्यांकन जब साहित्य में रिपोर्ट सेटिंग्स का उपयोग कर । १०० मेगावाट बिजली पर 3 मिनट के लिए वायलेट प्रकाश के लिए कान का एक्सपोजर CD45 के कुशल photoconversion में हुई+ कोशिकाओं कान त्वचा के भीतर (७८%) बहाव dLNs में कोई रूपांतरण के साथ । साहित्य में रिपोर्ट प्रदर्शित 3-5 ंयूनतम जोखिम चमड़े का ऊतकों5,३३,३८के लिए इष्टतम है । हालांकि, इस जोखिम CD45+ कोशिकाओं के कान pinna 24 एच में वृद्धि की संख्या के लिए नेतृत्व में रूपांतरण और संवहनी रिसाव का संकेत है कि कान त्वचा में इन सेटिंग्स पर photoconversion स्थानीय सूजन लाती है, जो विचार किया जाना चाहिए जब डेटा की व्याख्या । हम अगले सीधे LNs के लिए डीसी तस्करी दोनों Kaede photoconversion और अधिक मोटे तौर पर उपयोग FITC रंग परख23,स्थिर पर24 , DBP-प्रेरित सूजन के दौरान, और VacV संक्रमित कानों से उपयोग की मांग की । हम स्थिर राज्य में photoconverted त्वचा की तुलना में और DBP उपचार के बाद के रूप में इलाज FITC में लेबल ऊंचा मनाया । त्वचा के लिए नि: शुल्क FITC के आवेदन के लिए लसीका वाहिकाओं के माध्यम से सीधे जल निकासी में परिणाम कर सकते है LNs जहां निवासी डीसी आबादी, कि (जैसे, CD8α+ dc), नमूना FITC माइग्रेट नहीं है । इस के साथ संगत, हम FITC लेबल के साथ rDCs की महत्वपूर्ण संख्या में मनाया जब अड़चन DBP के साथ इलाज किया । इसके विपरीत, Kaede लाल लेबल वाले dc केवल एमडीसी जनसंख्या में photoconversion का संकेत है कि photoconversion mDCs लेबल करने के लिए एक अधिक विशिष्ट तरीका प्रदान करता है निंनलिखित में मनाया गया । यहां तक कि एमडीसी जनसंख्या के भीतर, तथापि, हम मात्रात्मक अधिक photoconversion पर FITC का उपयोग करते समय mDCs लेबल मनाया । हालांकि यह भी मुक्त FITC जल निकासी के द्वारा समझाया जा सकता है, यह संभव है कि लेबल की अवधि में अंतर है, जहां photoconversion केवल वर्तमान में निवासी की त्वचा में निवास लेबल जबकि FITC 24 एच अवधि की अवधि के लिए त्वचा में रहता है सकते है , मनाया एमडीसी निकास में मतभेद के लिए खातों । दिलचस्प है, वायरल संक्रमण के संदर्भ में, दोनों photoconversion और FITC आवेदन एमडीसी निकास के अपेक्षाकृत बराबर स्तर मापा और FITC rDCs-संक्रमित कान में कुछ LNs+ VacV । हमने हाल ही में बताया कि लसीका जल निकासी काफी कम है VacV संक्रमण के बाद, और इस तरह के वायरल प्रेरित कमी लसीका परिवहन में FITC रंग की विशिष्टता में सुधार हो सकता है और कम लेबल LN निवासी डीसी की आबादी31 . महत्वपूर्ण बात यह है कि यह काम भी इस तथ्य पर प्रकाश डाला गया है कि एमडीसी जनसंख्या के भीतर (CD3ε-CD19-MHCIIhiCD11cint), dc की संख्या जो 24 ज के भीतर सक्रिय रूप से माइग्रेट किया है एक छोटी जनसंख्या है और इस प्रकार कुल एमडीसी नंबर सक्रिय प्रवास४१के लिए एक अच्छा किराए नहीं हैं । अंत में, यह ध्यान दें कि हम लगातार VacV संक्रमण४१के बाद किसी भी 24 एच अवधि के लिए लगभग २०० कोशिकाओं पर एमडीसी निकास यों तो दिलचस्प है, जबकि 1500-2000 dc निकास ट्यूमर microenvironments से । एक टीका मंच के रूप में VacV की जबरदस्त प्रभावकारिता को देखते हुए, विशेष रूप से जब scarification४५,४६,४७द्वारा आवेदन किया, यह अटकलें है कि यह डीसी की गुणवत्ता और शायद डीसी के प्रकार है दिलचस्प है प्रतिजन पेश, बजाय मात्रा, कि मजबूत सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा निर्धारित करता है ।

ल्युकोसैट निकास से परे ट्यूमर microenvironments, से अधिक dc25,४८, एक खराब खोजी क्षेत्र रहता है । हालांकि ट्यूमर लंबे समय से सूजन microenvironments माना जाता है, कि क्या समान तंत्र गैर घातक और घातक ऊतकों से सेलुलर निकास को विनियमित अज्ञात है । इसके अलावा, चाहे ल्युकोसैट ट्यूमर से निकास stochastic या बल्कि चयनात्मक ल्युकोसैट संचय और ट्यूमर microenvironments में प्रतिधारण की व्याख्या के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ होगा । जैसे, ट्यूमर से ल्युकोसैट निकास समझ कैसे ट्यूमर प्रतिरक्षा निगरानी से बचने और immunotherapy के लिए उपंयास रणनीतियों के लिए नेतृत्व करने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है । यहां हम photoconvertible Kaede-टीजी मॉडल लागू करने के लिए प्रत्यारोपित चमड़े का ट्यूमर, जहां FITC रंग के लिए मोटे तौर पर दोनों माइलॉयड और लसीकावत् आबादी लेबल अपर्याप्त होगा से ल्युकोसैट निकास का अध्ययन । प्रारंभिक अध्ययन से पता चला कि प्रत्यारोपित ट्यूमर में photoconversion दक्षता ट्यूमर के आकार और मेलेनिन दोनों पर निर्भर था । जबकि photoconversion दक्षता तेजी से चला जाता है के रूप में ट्यूमर बढ़ने जब मेलेनिन मौजूद है (B16. F10), गैर-pigmented ट्यूमर लाइनों जैसे YUMM और MC38 ट्यूमर का प्रदर्शन ट्यूमर के आकार में अधिक स्थिर रूपांतरण दक्षता का परीक्षण किया । दिलचस्प है, हम CD45+ कोशिकाओं है, जो आकार में वृद्धि ट्यूमर के रूप में गिरावट की तुलना में सीडी 8+ टी सेल डिब्बे में सुधार रूपांतरण दक्षता मनाया । इस अवलोकन में योगदान देने वाले कई कारकों की संभावना है । सबसे पहले, एक ट्यूमर के भीतर स्थान जोखिम और इस प्रकार विशेष कोशिका प्रकार के रूपांतरण दक्षता प्रभाव होगा । टी कोशिकाओं को अक्सर त्वचा के लिए प्रतिबंधित पाया जाता है-प्रत्यारोपित ट्यूमर मॉडल में ट्यूमर इंटरफेस और इस तरह अधिक आसानी से हो सकता है photoconverted माइलॉयड ट्यूमर पैरेन्काइमा घुसपैठ कोशिकाओं के सापेक्ष । दूसरे, नहीं सभी ल्यूकोसाइट्स Kaede प्रोटीन४९ के एक ही स्तर व्यक्त और इस तरह सभी समान रूप से प्रवाह cytometry द्वारा नहीं पाया जा सकता है; इस तरह के सभी CD45+ कोशिकाओं के रूप में एक अधिक विषम कोशिका जनसंख्या का विश्लेषण करते समय photoconversion के प्रतिशत मनाया कम करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. अंत में, यह ध्यान दें कि आंकड़ा 3 में प्रस्तुत डेटा वायलेट प्रकाश जोखिम के 10 मिनट के बाद उत्पंन किया गया महत्वपूर्ण है । यह प्रारंभिक जोखिम समय त्वचा, LNs, श्लैष्मिक ऊतकों सहित विभिंन अंगों के लिए photoconversion बार का हवाला देते हुए साहित्य में रिपोर्टों के आधार पर चुना गया था, और5,6,३३,३५ ट्यूमर ,३९,४३. केवल अंय ट्यूमर में photoconvertible प्रणाली को रोजगार के अध्ययन, photoconversion 20 मिनट३९के लिए प्रदर्शन किया गया । हमारे हाथ में इसके अलावा अनुकूलन दोनों छोटे और बड़े संस्करणों के लिए 5 मिनट का एक छोटा जोखिम समय के साथ बेहतर क्षमता का पता चला । यह संभावना है कि लंबे समय तक निवेश Kaede प्रतिदीप्ति के photobleaching की ओर जाता है, और जैसे, हमारी रिपोर्ट रूपांतरण क्षमता कम आंक सकते हैं । लंबे समय तक निवेश भी वृद्धि हुई photoconversion-जुड़े सूजन और पाया अध्ययन के परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । 5 मिनट के लिए photoconverted ट्यूमर intratumoral CD45+ कोशिकाओं की संख्या में कोई महत्वपूर्ण अंतर का प्रदर्शन किया photoconversion ट्यूमर की तुलना में 24 के बाद एच । इसके अतिरिक्त, 5 मिनट के लिए ट्यूमर photoconverted दोनों माइलॉयड और लसीकावत् आबादी के लिए मध्यम श्रेणी का और reproducible निकास का प्रदर्शन किया । नतीजतन, विशिष्ट ऊतकों या ब्याज के ट्यूमर के भीतर व्यक्तिगत अनुकूलन इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक है ।

अंत में, हम सीटू photoconversion में इस्तेमाल Kaede-टीजी चूहों में प्रत्यारोपित ट्यूमर से अंतर्जात ल्युकोसैट निकास यों तो । दो अलग प्रत्यारोपित, गैर pigmented ट्यूमर मॉडल का उपयोग हम dc, टी कोशिकाओं की महत्वपूर्ण निकास मनाया, और monocytes । हाल ही में प्रकाशित काम३९के साथ सुसंगत, दोनों CD4+ और सीडी 8+ टी कोशिकाओं ट्यूमर microenvironments से egressed डबल नकारात्मक CD3ε की एक महत्वपूर्ण संख्या के साथ+ टी कोशिकाओं । इस निरीक्षण के कार्यात्मक महत्व को निर्धारित किया जा करने के लिए रहता है, हालांकि, इस जनसंख्या का एक घटक गामा डेल्टा टी कोशिकाओं के रूप में पहले३९वर्णित हो सकता है । महत्वपूर्ण बात, हम ट्यूमर से ल्यूकोसाइट्स egressing के अनुपात की तुलना में ट्यूमर microenvironments के भीतर मौजूद ल्यूकोसाइट्स के सापेक्ष अनुपात के लिए, हम ल्युकोसैट में egressed पूल के सापेक्ष आबादी में intratumoral संवर्धन मनाया दोनों मॉडल का संकेत चयनात्मक ल्युकोसैट निकास । विशेष रूप से, मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल egressed आबादी में अनुपस्थित थे, हालांकि दोनों कोशिका प्रकार सूजन और संक्रमित शर्तों के तहत निकास करने के लिए वर्णित किया गया है2,५०,५१,५२ , ५३ , ५४ और intratumoral ल्युकोसैट प्रदर्शनों३९,५५,५६के लिए महत्वपूर्ण योगदान कर रहे हैं । इस प्रकार, ट्यूमर से ल्युकोसैट निकास photoconvertible मॉडल का उपयोग कर quantified किया जा सकता है, बल्कि एक विनियमित प्रक्रिया stochastic नहीं है, और सूजन को समझने के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ के साथ एक महत्वपूर्ण और अध्ययन जीव विज्ञान रहता है और स्थिर राज्य में और चिकित्सा के जवाब में ट्यूमर microenvironments में प्रतिरक्षा गतिशीलता ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने का कोई विरोध नहीं है.

Acknowledgments

लेखक YUMM १.१ और YUMM १.७ murine मेलेनोमा लाइनों और डॉ दबोरा जे Fowell प्रदान करने के लिए बी-6 प्रदान करने के लिए डॉ मार्कस Bosenberg शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । तटरक्षक-टीजी (सीएजी-tdKaede) MEXT, जापान के राष्ट्रीय जैव संसाधन के माध्यम से आरआईकेईएन BRC के साथ समझौते में चूहों 15Utr ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase D Roche 11088866001
DNase Roche 4536282001
Silver-LED-405B light source with optical fiber and collimtor Prizmatix Ltd V8144
Fluorescein isothiocyanate isomer I Sigma-Aldrich F4274
dibutyl phthalate Sigma-Aldrich 524980
acetone Macron Fine Chemicals 2440-02
29-guage syringes Exel International 26029
Evans Blue Sigma-Aldrich E2129
70 um cell strainers VWR 732-2758
paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
HBSS Caisson HBL06
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit Invitrogen L34966
Purified Anti-mouse CD16/CD32 Tonbo Biosciences 70-0161-M001
BV605 CD11c (clone N418) Biolegend 117334
PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2) BD Pharmingen 562363
BV421 CD3e (clone 145-2C11) Biolegend 100341
APC CD8a (clone 53-6.7) TonBo Biosciences 20-0081-u100
APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11) Biolegend 103116
BV650 CD19 (clone 6D5) Biolegend 115541
PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4) Biolegend 128011
Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8) Biolegend 123121
APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8) Biolegend 127623
BV711 CD11b (clone M1/70) Biolegend 101241
BV605 CD45 (clone 30-F11) Biolegend 103155
BV711 CD4 (clone RM4-5) BD Biosciences 563726
Bovine serum albumin (Fraction V) Fisher Scientific BP1600-100
Anit-Rat and Anti-Hamster Igk / Negative Control Compensation Particle Set BD Biosciences 552845
Fortessa Flow Cytometer BD Biosciences
FlowJo v10 Software FlowJo

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जीव विज्ञान अंक १४३ लसीका वाहिकाओं निकास ्े Kaede FITC पेंट ल्यूकोसाइट्स मेलेनोमा
Murine त्वचा और ट्यूमर से लसीका वाहिकाओं के माध्यम से ल्युकोसैट निकास बढ़ाता
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Steele, M. M., Churchill, M. J.,… More

Steele, M. M., Churchill, M. J., Breazeale, A. P., Lane, R. S., Nelson, N. A., Lund, A. W. Quantifying Leukocyte Egress via Lymphatic Vessels from Murine Skin and Tumors. J. Vis. Exp. (143), e58704, doi:10.3791/58704 (2019).

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