Summary
Здесь мы продемонстрировать методы в vivo подсчета лейкоцитов выхода из наивно, воспаление, и злокачественные мышиных кожи. Мы выполняем голова к голове сравнения двух моделей: Трансдермальные FITC приложения и на месте photoconversion. Кроме того мы демонстрируем утилита photoconversion для отслеживания лейкоцита выход из кожные опухоли.
Abstract
Лейкоцита выхода из периферических тканей для слива лимфатические узлы не только крайне важное значение для иммунной наблюдения и посвящения, но и способствует резолюции реакции периферических тканей. Хотя различные методы используются для количественного определения лейкоцита выхода из не лимфоидной, периферических тканях, клеточном и молекулярном механизмы, которые управляют контекстно зависимые выход по-прежнему осознаются. Здесь мы описывают использование в местах photoconversion для количественного анализа лейкоцита выхода из мышиных кожи и опухоли. Photoconversion позволяет прямой маркировки лейкоциты-резидентов в кожные ткани. Хотя воздействие фиолетового света на кожу стимулирует местных воспалительных реакций характерны лейкоцита инфильтраты и сосудистые утечки, в прямом сравнении с трансдермального применения люминесцентных индикаторов, photoconversion специально помечены мигрирующие дендритные клетки населения и одновременно позволило количественная оценка миелоидного и лимфоидных выхода из кожный микросреды и опухоли. Механизмы лейкоцита выход остаются отсутствующий компонент в нашем понимании сложности внутриопухолевых лейкоцитов, и таким образом применение инструментов, описанных в данном документе даст уникальную возможность заглянуть в динамике опухоли иммунной микросреды оба на ровное и в ответ на терапию.
Introduction
Периферических тканей иммунной реакции формируются не только набора лейкоцитов к местам воспаления, но и механизмов, которые регулируют их последующего хранения. Таким образом защитный иммунитет диктуется накопительное клеточной и молекулярной механизмов, которые определяют ли лейкоцита входит, остается внутри, или скорее мигрирует из периферических тканей через лимфатические сосуды. Важно отметить, что склонность к лейкоцитов для выхода из ткани через лимфатические сосуды (называется выход) связано с их специализированных функций. Дендритные клетки (DC) приобрести мигрирующих поведение в ответ на сигналы созревания, ведущих к антигену транспорта и презентации в дренаж лимфатических узлов (dLN), процесс, который необходим для адаптивного иммунитета1. Очистки миелоидных клеток, такие как макрофаги и нейтрофилы, служат для очистки мусора apoptotic через фагоцитоза. При бактериальной инфекции нейтрофилы выход ткани и в конечном счете проходят apoptosis в dLNs2 и модели DSS-индуцированной колита, данных поддерживает гипотеза, что макрофагов выхода необходимо решить местные воспаления3. Происходит ли выход нейтрофилов и макрофагов во всех контекстах воспалительных, однако, неизвестно. Доказательства для Т-лимфоцитов выхода из устойчивого состояния4,5,6,7, зараженных8и воспаленные4,9,10, 11,12 периферийных, не лимфоидных тканей указывает, что Т-клетки активно рециркуляции, хотя сигналы на основе ткани, которые диск этот выход по-прежнему не ясны. Некоторые исследования выявили сигналов, необходимых для направления миграции в дренаж лимфатических капилляров и последующий выход включая хемокиновых (C-C мотив) лигандом 21 (CCL21) и его рецептор CCR74,11, 13, хемокиновых (C-X-C мотив) лигандом 12 (CXCL12) и его рецептор CXCR42,14и сфингозин-1-фосфата (S1P)10,,1516. Однако эти механизмы не являются активными во всех контекстах, и ли они определяют эвакуация всех типов клеток остается открытым вопрос. Важно понимание механизмов, которые регулируют исходящего трафика и его функциональной значимости в болезни требует количественных в vivo методы анализа.
Некоторые методы были использованы для количественного определения выхода в нескольких животных моделей в естественных условиях , включая прямые катетеризации лимфатических сосудов, приемные передачи ex vivo помечены лейкоцитов, трансдермального применения люминесцентных индикаторов, инъекции помечены частиц, и в естественных условиях photoconversion17,18. Прямые катетеризации мыши афферентные лимфатические сосуды является сложным и ограниченным в мелких животных по объему жидкости, которые могут быть собраны. Таким образом, катетеризации проводилось главным образом в крупных животных (например., овец) где такие хирургические манипуляции практичны. Эти исследования дают прямые доказательства наличия лимфоидных и миелоидных клеток в лимфатических10,19,20. Кроме того овечья модели показывают, острого и хронического воспаления увеличился почти 100-кратного10,21присутствие лимфоцитов лимфатических.
Приемных передачи маркировку и генномодифицированные лимфоцитов главное показали, что CCR7 является обязательным для выхода CD4 клеток+ T от остро воспаленной кожи5,11, во время предварительной обработки лимфоцитов с малые молекулы S1P рецептора агонистом FTY720, лишь частично ингибирует их эвакуация в10. Интересно, что выход передаваемых лимфоцитов из хронически воспаленной кожи CCR7-независимые10, но частично может потребовать CXCR49. Приемных передачи эксперименты, однако, доставить-физиологические количество ex vivo помечены и активированных лимфоцитов в ткани через инъекции, которая изменяет биомеханических окружающей среды тканей и повышенные давление интерстициальной жидкости это открыть первоначальный лимфатических капилляров и изменять их свойства транспорта22. Как альтернатива, применение трансдермальных флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC) в присутствии или отсутствии кожных раздражителей (например., дибутилфталат, DBP) или инфекции23,24 позволяет для отслеживания Фагоцитирующих клеток, которые аккумулируют трассирующими и мигрируют на dLNs. Аналогичным образом дневно обозначенные опухоли предоставляют средства для отслеживания фагоцитирующих клеток, которые охватили опухоли материала25. Эти методы предоставляют важные понимание механизмов, которые регулируют DC выход13,14,17,26,27 , но не могут отслеживать не фагоцитарной лимфоциты и интерпретация может быть осложнено бесплатно лимфодренаж растворимых FITC таким образом маркировки не миграционных, LN-резидентов DCs.
В качестве альтернативы прижизненной микроскопии является мощным инструментом, который позволяет для отслеживания в естественных условиях населения физиологически соответствующих лейкоцитов в реальном времени28,29. Используется в сочетании с репортером мышей и на основе антител в vivo immunofluorescent маркировки, прижизненной микроскопии выявило комплекс пространственной и временной динамики иммунных клеток торговли людьми, в том числе интерстициальных миграции30 , переселение через лимфатические эндотелия, проход в лимфатический люмен и миграции при LN запись28,31. Широкое принятие методы прижизненной визуализации ограничивается расходы, необходимые знания для набора и ограниченной пропускной способности для количественной оценки нескольких типов клеток. Тем не менее муфты количественные методы, предназначенные для анализа динамики народонаселения тканей с прижизненной визуализации обеспечит дополнительный и важный механистический понимание в отношении механизмов подвижности и миграции к и внутри лимфатических капилляров 18 , 31 , 32.
Следовательно, в естественных условиях photoconversion возникла как метод, который позволяет в situ обозначая, независимой фагоцитарной активности, а также для количественной оценки физиологической лейкоцита выход (при сочетании с проточной цитометрии) в отсутствие или наличие проблемы. Каэдэ-Tg мышей конститутивно Экспресс белка, изолированный от Стони кораллов, что экспонаты Зеленая флуоресценция (Каэдэ зеленый) до тех пор, пока фиолетовый свет, после чего он необратимо преобразует красной флуоресценцией (Каэдэ красный)33. Photoconverted клетки могут быть отслежены, как они исходящего от периферических тканей сайтов и накапливаются в dLNs. Это и другие34,мыши аналогичные photoconvertible версии модели35 выявили важные биологии включая учредительный ОВВИГ регуляторных клеток T от кожи36, CXCR4-зависимой ячейки B выхода из патчи Пейера в37 , мобилизация резидентная память T клеток пептид повторно вызов38, и широкие лейкоцита выхода из опухоли микросреды39. Здесь мы выполняем голова к голове сравнения photoconversion с FITC трансдермального применения в контексте кожные воспаления и инфекции позволяет для прямого сравнения существующих данных с помощью метода photoconvertible. Кроме того мы продемонстрировать photoconversion в имплантированными опухолями и описать эффективность преобразования и селективного выход от опухоли микросреды. Таким образом, мы утверждаем, что дальнейшее применение этих методов необходима для выяснения критических биологии лейкоцита выход от опухоли, которые будут иметь значительные последствия для интерпретации внутриопухолевых лейкоцита сложности, противоопухолевый иммунитет, и ответ на терапию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животные протоколы были одобрены институциональный уход животных и использования Комитетом в Oregon Health и науки университета.
1. индукция воспаления и FITC живописи из мыши Пинна
- В Ламинарный шкаф, анестезировать C57Bl/6 мыши, с помощью испаряется isofluorane (побудить в 3-5% isofluorane и поддерживать в isofluorane 1-3%; скорость потока кислорода на 0,5-1,0 Л/мин). Обеспечение надлежащего анестезии путем наблюдения за потери педали рефлекс, непроизвольные движения и снижение частоты дыхания.
- Положите ухо плоский с вентральной стороне уха вверх. Накапайте 20 мкл FITC 5% раствора растворяют в 1:1 ацетон: Дибутилфталат (БРФ) на вентральной стороне уха Пинна. Разрешить уха высохнуть в течение нескольких секунд.
- 24 ч после применения FITC, усыпить мышей через воздействия диоксида углерода, следуют шейки матки дислокации. Соберите уха перьев в PBS, разделив уши от головы с помощью ножниц. Соберите шейки матки dLNs и паховых-слив LNs в PBS с помощью пинцета, чтобы отделить LNs от окружающих тканей. Паховый-слив LNs будет служить негативный контроль на наличие FITC+/Kaede красный+ лейкоциты. Распоряжаться туши за институциональные протокол.
Примечание: Пост photoconversion оптимальное время для анализа будет зависеть от типа ячейки и известных миграционных поведения. Дендритные клетки, например, может быть обнаружен в dLNs уже как 6 h пост DBP приложение.
2. индукция воспаления и Photoconversion Пинна мыши
- В Ламинарный шкаф анестезировать Каэдэ-Tg мышь (фон C57Bl/6) внутрибрюшинной инъекции кетамин 80 мг/кг и 10 мг/кг Ксилазина растворяют в солевой раствор. Обеспечение надлежащего анестезии, как описано в шаге 1.1.
- Положите ухо плоский с вентральной стороне уха вверх. Накапайте 20 мкл ацетон: DBP 1:1 на брюшной стороне уха Пинна. Разрешить уха высохнуть в течение нескольких секунд.
- После применения DBP cut щели в кусок алюминиевой фольги и потяните ухо через щель подвергать уха до фиолетового источника света. Лежать уха с спинной стороне, обращенной вверх с помощью двухсторонней ленты для обеспечения ухо к пленке.
- Положение уха непосредственно под источником света и photoconvert на 3 мин, с использованием источника света 405 нм на 100 МВт мощности.
- 24 ч после photoconversion, усыпить Каэдэ-Tg мышей и урожай уха перьев, шейки матки LNs и паховых LNs, как описано в шаге 1.3.
Примечание: Помимо соображений, указанных в шаге 1.3, темпы распространения будет определить сроки проведения анализа как потеря Каэдэ Красного будет происходить в быстро делящихся клетках.
3. vaccinia заражения мыши Пинна и FITC приложения
- Анестезировать C57Bl/6 мышь с isofluorane испаряется, как описано в шаге 1.1.
- Заложить вентральной стороне уха плоский. Накапайте 5 х 106 металлическ формируя единицы (ОРП) vaccinia вируса (VacV) разводят в 10 мкл PBS на ухо Пинна. С помощью 29-иглы, совать Пинна 25 раз40.
- 24 h послеоперационные инфекции, анестезировать VacV инфицированных мышей с isofluorane, как описано в шаге 1.1 и пипетки 20 мкл 5% FITC растворенных в ацетоне на вентральной стороне уха Пинна. Разрешить уха высохнуть в течение нескольких секунд.
- 24 ч после применения FITC, усыпить мышей и собирать уха перьев, шейки матки LNs и паховых LNs, как описано в шаге 1.3.
Примечание: FITC может применяться в любой время точки пост инфекции определить DC людьми в различных интервалах 24 h. Ранее мы сообщали, что DC миграции dLNs поддерживается на аналогичных уровнях от инфекции пост 1-3 день41.
4. vaccinia заражения мыши Пинна и Photoconversion.
- Анестезировать Каэдэ-Tg мышь с isofluorane испаряется, как описано в шаге 1.1.
- Заразить Пинна уха с VacV, как описано в шаге 3.2.
- 24 h послеоперационные инфекции, анестезировать Каэдэ VacV инфицированных мышей, как описано в шаге 2.1 и выполнять photoconversion, как описано в шагах 2.3-2.4.
- 24 ч после photoconversion, усыпить мышей и урожай уха перьев, шейки матки LNs и паховых LNs, как описано в шаге 1.3.
Примечание: Как уже упоминалось выше в шаге 3.4, photoconversion может проводиться в любое время точки пост инфекции.
5. уха и лимфатических узлов обработки для проточной цитометрии
- Создайте одну ячейку подвески ухо перьев: Помимо чистить брюшной и спинной стороны уха Пинна, используя две пары пинцета и место с внутренним ухом вниз в скважины 24-ну пластины, содержащие 1 мг/мл коллагеназы D и 80 ед/мл DNase, разбавленных в Хэнка буфер солевой раствор (HBSS) (содержащие Ca2 + и Mg2 +). Инкубируйте при 37 ° C на 30 мин пресс переваривается ткани через стрейнер клеток нейлон 70 мкм.
- Создание единого клеточных суспензий от LNs: место LNs в скважинах 24-ну пластины, содержащие 1 мг/мл коллагеназы D и 80 ед/мл DNase, разбавленных в HBSS. Дразнить open лимфатических узлов капсула с использованием двух игл 29-го калибра и затем инкубировать лимфатические узлы при 37 ° C на 30 мин пресс переваривается ткани через стрейнер клеток нейлон 70 мкм.
6. внутрикожные меланома опухоли имплантация и Photoconversion.
- Брить шерсть из центра задней части Каэдэ-Tg мыши, с помощью электрической бритвой.
- Позиции 29-иглы в центре задней между левой и правой верхней лопатку и intradermally кожу мышей Каэдэ-Tg вставляют 5 x 105 опухолевых клеток (разводят в 50 мкл физиологического раствора). Опухоли должны быть тщательно расположены для обеспечения лимфатический дренаж для указанного лимфатических узлов (то есть, левой и правой плечевой LNs для опухолей посередине верхней части спины). Избегайте размещения опухоль выше dLN, поскольку это может привести к прямым photoconversion LNs через опухоли кожи.
- Разрешить опухоли расти до нужного размера (3100-650 мм).
- Один день до коллекции тканей, анестезировать Каэдэ-Tg мышь, как описано в пункте 2.1 и бритье любой вновь отросшими меха вокруг опухоли.
- Вырезать круглое отверстие в алюминиевой фольги и потяните опухоли подвергать опухоли к источнику света. Вырезать отверстие немного меньше, чем опухоли для предотвращения падения обратно через отверстие опухоли и свести к минимуму преобразование рядом, не опухоли кожи.
- Расположите опухоль непосредственно под источником света и photoconvert 5 минут с помощью источника света 405 нм на 200 МВт мощности.
- 24 ч после photoconversion, усыпить мышей, как описано в шаге 1.3. Соберите опухоли, плечевая dLNs и паховых-слив LNs в PBS. Опухоли от окружающей кожи ножницами вырезать и удалить LNs, как описано в шаге 1.3.
7. опухоли и лимфатических узлов обработки для проточной цитометрии
- Создание единого клеточных суспензий из опухоли: фарш опухоли с ножницами в скважины 24-ну пластины, содержащие 1 мг/мл коллагеназы D и 80 ед/мл DNase, разбавленных в HBSS. Инкубируйте на 37 ° C в течение 1 ч. Пресс переваривается ткани через стрейнер нейлон 70 мкм.
- Создайте одну ячейку подвеска лимфатических узлов, как описано в шаге 5.2.
8. антитело пятная для проточной цитометрии
- После переваривания тканей в одной ячейке суспензий, выполняют методы окраски цитометрии стандартного потока для пометки ячеек с маркерами интерес. Вкратце пипетки 2 x 106 клеток в 96-луночных плиту. Проинкубируйте образцы с ФК блок (1 мкг/мл) за 20 минут на льду; мыть дважды с СУИМ буфера (1% бычьего сывороточного альбумина в PBS). Добавление образцов live/мертвые пятна (разводят в PBS) и Инкубируйте 15 мин на льду; мыть дважды с СУИМ буфера. Проинкубируйте с первичных антител (Таблица материалов) разводят в буфере СУИМ за 30 минут на льду; мыть дважды с СУИМ буфера.
Примечание: Каэдэ зеленый и Каэдэ красной флуоресценцией перекрывается с FITC и PE флуорофоров; Таким образом FITC и PE-конъюгированных антител не может использоваться в сочетании с Каэдэ белков. - После окрашивания, запустите образцы на проточный цитометр. Кроме того, исправить клетки с 2% PFA.
9. поток Cytometry анализ
- Установите FITC (Каэдэ зеленый) и PE (Каэдэ красный) канал ПЛТ напряжения до 70-80% от общего диапазона (центр населения приблизительно 104) с помощью ex vivo Каэдэ зеленый или Каэдэ красный одноцветном splenocytes или крови.
Примечание: Не компенсирует Каэдэ Грин (FITC) и каналы Каэдэ красный (PE), как это приведет к большей распространения сигнала.- Для создания элементов управления Каэдэ одноцветный, соберите селезенки или крови от мыши Каэдэ-Tg. Лизировать красные кровяные клетки с ACK буфера, а затем разделить ячейки на две группы: нереализованный Каэдэ зеленый и преобразованные Каэдэ красный.
- Для одного цвета Каэдэ красный контроля, приостановить клеток в 1 мл PBS и photoconvert в 24-ну пластине 5 мин с использованием 405 нм источники света на мощность 100 МВт. Используйте эти клетки для задания Каэдэ зеленый (FITC) и Каэдэ красный ПЛТ напряжений на проточный цитометр (шаг 9.1).
- После задания напряжения для белков Каэдэ компенсировать все другие основное антитело пятна с помощью одного Флюорофор помечены бусины компенсации за инструкциями изготовителя.
- Выполнение примеров на проточный цитометр для сбора данных.
Примечание: Каэдэ белок непрерывно вырабатывается на клетки. Это означает, что 24 ч после photoconversion, преобразованных ячеек будет двойной положительный для Каэдэ зеленый и Каэдэ красный, как недавно синтезированных Каэдэ (зеленый) белок накопила в ячейке. - Анализировать данные с помощью программного обеспечения FlowJo или аналогичного программного обеспечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы сначала пытались повторить photoconversion результаты, опубликованные в литературе для оценки эффективности и определения связанных воспаление в коже мыши. Пинна уха подвергается 100 МВт фиолетовый свет (405 нм) за 3 мин как описано33. Одноместный клеточных суспензий, созданного из кожи уха или шейки матки dLNs сразу после облучения показали эффективность преобразования 78% всех CD45+ лейкоциты в коже с никакие преобразованной клетки наблюдается в dLNs (рис. 1A). Чтобы оценить воспалительной реакции, связанные с photoconversion, мы количественно количество проникновения CD45+ лейкоциты в преобразованной уши 0 и 24 h после преобразования (рис. 1B) и острые изменения в сосудистой проницаемости измеренного Мили в Assay42 (рис. 1 c). Вкратце промаркированные 0,5% синий Эванс был intravascularly вводят 2 ч после photoconversion. Уши были собраны 30 мин после инъекции и синий Эванс был извлечен с формамид за 24 часа при температуре 55° C (поглощение читать 610 Нм42). Обе CD45+ инфильтраты (24 ч) и сосудистые утечки (2 h) были значительно возросло после photoconversion, указав, что даже в этой экспозиции, photoconversion, сам может повлиять ткани конкретных воспалительной реакции. Сравнение с CD45+ инфильтраты (рис. 1B) и сосудистые утечки (1.4 мкг/ухо ±0.75) в VacV инфицированных уши 24 h пост инфекции41 обеспечивает контекст для степени воспаления, вызванного фиолетовый светлый (0,08 мкг/ухо ± 0,01).
В то время как несколько моделей были использованы в различных исследованиях для отслеживания лейкоцита выход из не лимфоидной, периферических тканях, неясно, каким образом эти методы сравнения в их способности отслеживать конкретные группы населения, как они выходят из кожи. Следовательно, мы решили выполнять прямое сравнение соперничество двух широко используемых методов для отслеживания DC выход LNs, FITC краски и в естественных условиях photoconversion, с тем чтобы оценить эффективность и специфика каждого метода для количественного анализ DC выход в устойчивом состоянии, во время кожные воспаления и от инфицированных кожи. Для каждого анализа, кожа подвергается трансдермального применения FITC или подвергаются 100 МВт 405 нм света за 3 мин LN DC населения были определены как CD3ε–CD19–MHCII+CD11c+ и далее разбиты на 1) MHCIIПривет CD11cint DCs, который обогащает для мигрирующих DCs (офицеров) оба CD103+ BATF3-зависимых Кросс Представляя DCs и CD11b+ кожного DCs; и 2) MHCIIintCD11cПривет DCs, который обогащает для резидентов DCs (РРК), включая CD8α+ BATF3-зависимых Кросс Представляя DCs (рис. 2A). 24 ч после FITC приложения или photoconversion, обозначенные клетки были легко обнаруживаемая в слив, но не-слив LNs (рис. 2B). Для количественной оценки степени DC миграции LNs и одновременно определить специфичность метода для маркировки миграции населения и не жителей LN, мы количественно обозначенных офицеров и РРК в устойчивом состоянии, 24 ч после применения DBP, и 48 ч после VacV скарификация (рис. 2 c). Хотя photoconversion (Каэдэ) и FITC помечены офицеров во всех условиях, мы наблюдали более FITC-меченых чем Каэдэ обозначенных офицеров в dLNs, за исключением VacV инфекции, где два метода количественно аналогичного уровня выхода. Кроме того в контексте DBP, FITC дополнительно помечены rDC населения, где photoconversion оставался для офицеров (рис. 2 c). Использование обоих этих методов, мы наблюдали эвакуация примерно 200 DCs от VacV инфицированных кожи и важно отметить, что этот уровень выхода повторяет ранее опубликованных выводах трансдермальных FITC приложения с помощью Лоо et al. 41. Таким образом, в зависимости от контекста воспалительных, трансдермального применения FITC может увеличить число помеченных DCs, обнаруженной в dLNs и результат в неспецифической маркировки не мигрирующих LN-резидентов DC населения, во время photoconversion конкретно определяет DCs, впадая в МЦС населения.
Каэдэ-Tg мышей были использованы для количественной оценки лейкоцита удержания в5,,3343 и выхода из5,6,35,38 кожи, слизистых оболочек, и лимфоидной ткани под устойчивое состояние и воспаленные условий и применяется к опухоли только в одной публикации, где опухоли были имплантированы внутрикожные в мыши уши и photoconverted в небольших объемах39. Таким образом мы стремились оценить полезность в vivo photoconversion для количественной оценки лейкоцита выхода из установленных, большой первичной опухоли для включения проверки далее иммунологических гипотез. Во-первых мы intradermally имплантируется MC38 опухолевых клеток в Каэдэ-Tg мышей между левой и правой лопатки. Имплантируемые опухоли модели позволяют точное позиционирование опухоли для обеспечения лимфатический дренаж для известных LNs; опухоли, помещены в коже верхней обратно прежде всего стока в левой и правой плечевой LNs. После достижения 100-150 мм3, опухоли были photoconverted (10 мин., 200 МВт) и опухоли и dLNs собирают сразу после photoconversion. Анализ подачей cytometry выявил значительные преобразования внутриопухолевых CD45+ клетки от Каэдэ Грин+ Каэдэ красный+ (69%; Рисунок 3А), а главное, dLNs остается отрицательным для Каэдэ красный+ клеток. Иммунофлуоресценции photoconverted YUMM 1.7 опухоли показали, что photoconversion глубоко проникает в ткани опухоли (> 1 мм; Рисунок 3B). Интересно, что кожу и сосудистой клетки Экспресс высокий уровень белка Каэдэ, ведущих к высокой photoconversion эффективности этих типов ячеек, как показано на рисунке 3B. Это высокое выражение Каэдэ красный делает его трудным для идентификации иммунных клеток (как нереализованный и преобразован) с использованием иммунофлуоресценции.
Учитывая наш особый интерес меланомы иммунологии, мы далее оценивали влияние размера опухоли и меланина на photoconversion эффективности, с использованием различных клеточных линий имплантируемые мышиных опухоли: MC38 (непигментированных колоректального рака линия), B16. F10 (производство меланина меланомы линия), YUMM 1.1 (непигментированные меланомы линия) и ТОРТА 1.7 (линия непигментированные меланомы)44. Каждая из этих линий были имплантированы внутрикожные Каэдэ-Tg мышей и photoconverted, как описано выше в различных томах опухоли (350-650 мм). Опухоли были собраны сразу же после photoconversion и оценивается наличие Каэдэ красный CD45+ лейкоциты подачей cytometry. Интересно, что эффективность photoconversion CD45+ лейкоциты существенно различных типов опухолей и размеров (рис. 3 c). CD45+ лейкоциты в малых (50-150 мм3) опухоли YUMM 1.7 и YUMM 1.1 продемонстрировали наиболее эффективным photoconversion на 80% и 60%, соответственно. С увеличением объемов этих опухолей, эффективности преобразования энергии снизилась до примерно 50% для крупных опухолей (3> 600 мм). Меланин поразительное сказалось на эффективности photoconversion: максимальная photoconversion для CD45+ клеток в пределах меланина производство B16. F10 опухоли был только около 30% и упала на 10%, как опухоль достигла объемов 400 мм3. Интересно, что анализ внутриопухолевых CD8+ T клеток показали photoconversion эффективности для этих клеток в почти 80-90% в небольших опухолей независимо от меланина (рис. 3D). Для непигментированные опухоли, CD8+ Т-клеток преобразования оставался высоким, даже как опухоль достигла больших томов, но снизилась значительно с размером, когда меланин присутствовал. Как таковой, Утилита B16. F10 мышиных меланомы и других линий производства меланина меланомы может быть ограничена небольшой опухоли (350 мм), которая согласуется с биологической функцией меланина в поглощающие свет. Чтобы оценить воспалительной реакции, связанные с photoconversion опухолей, мы количественно количество CD45+ клеток в неконвертированных опухоли и преобразованные опухоли 24 h пост photoconversion (Рисунок 3E). Мы видели, никакого существенного различия в общее количество CD45+ клеток в опухоли 24 ч после photoconversion, по сравнению с необращенный опухоли обнаружены.
Мы далее количественно лейкоцита выхода из опухоли микросреды, используя Каэдэ-Tg мышей, который позволяет для допроса людьми поведения обоих типов миелоидного и лимфоидных клеток. MC38 или YUMM 1.7 опухолевые клетки были intradermally имплантируется в Каэдэ-Tg мышей. Опухоли были photoconverted, когда объемы достигли между 100-150 мм3 (5 мин, 200 МВт); Плечевая dLNs и паховых-слив LNs были собраны 24 ч после photoconversion. Внутриопухолевых лейкоцита населения были количественно от MC38 и YUMM 1.7 опухоли имплантируются в управления мышей C57Bl/6 и собранных по достижении 100-150 мм3опухоли. Мы оценивали лейкоцита сложности внутри опухоли и egressed населения подачей cytometry: Т-клетки (CD3ε+CD4+ /CD8+ /-), клетки B (CD3ε–CD19+), DCs (CD11c+MHCII+CD11b+ /- ), нейтрофилы (CD11b+MHCII–Ly6G+), макрофагов (CD11b+MHCII+F4/80+) и воспалительных моноцитов (CD11b+Ly6G–Ly6C+; На рисунке 4A). С помощью этой же стробирования схемы, мы оценивали % населения каждого лейкоцитов в dLNs, который выразил Каэдэ красный указывая прежнего проживания в опухоли микросреды (рис. 4B). Интересно, что хотя оба MC38 (рис. 4 c) и YUMM 1.7 (рис. 4 d) опухоли были главным образом проникли с миелоидных клеток (DCs, моноциты и макрофаги), примерно 50% из клеток, которые egressed от обоих типов опухолей были T лимфоцитов (CD4 как+ и CD8+). В дополнение к Т-клеток мы также наблюдали DCs, клетки B, и моноцитов в egressed населения от опухоли, но макрофаги и нейтрофилы не были обнаружены от любой тип опухоли. Вообще эти данные демонстрирует утилита Каэдэ-Tg photoconvertible мышей для отслеживания нескольких линий лейкоцитов в эндогенного обстановке. Кроме того наш анализ показывает, что выход является выборочный, активный процесс, который может иметь значительные последствия для определения сложности внутриопухолевых лейкоцитов.
Рисунок 1: Photoconversion эффективность и связанных воспаление в мышиных кожи. Мышиных дермы был photoconverted за 3 мин на 100 МВт (405 нм свет). (A) представитель потока участки с изображением photoconverted (красный+Каэдэ) CD45+ клеток из необращенный и преобразованные уха и шейки матки dLN сразу после photoconversion. Населения были предварительно воротами в эфире, CD45+ одной клетки. (B) перечисление всего CD45+ клеток в неконвертированных уши (-), собранные немедленно, следуя photoconversion, уши уши собрали 24 ч после photoconversion и уши собрали 24 ч после VacV инфекции (n = 3). (C) пробирного миля была выполнена для количественной оценки сосудистой негерметичности сразу после воздействия 405 нм света (3 мин, 100 МВт). Представитель изображение утечки в ухо кожи (слева) и количественной оценки извлеченных краситель (справа) (n = 3). Планки погрешностей представляют SEM. *p< 0,05 и **p< 0.01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: DC выход от наивного, воспаление и инфицированных кожи. (A) Gating схема для выявления миграционных DCs (офицеров; MHCIIПриветCD11cint) и резидентов DCs (РРК; MHCIIПриветCD11cПривет). (B) представитель потока участков указанием FITC+ или Каэдэ красный+ РСУ, перед воротами на офицеров, от мышей инфицированных VacV (dLN) или контралатеральной LN слив элементов управления. (C) количественная оценка числа Каэдэ красный+ и офицеров FITC+ и РРК в dLNs устойчивого состояния, DBP-воспаление (24 ч после применения) и VacV инфицированных кожи (48 h пост инфекции). Планки погрешностей представляют SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: эффективность Photoconversion в опухоли микросреды. Опухоли были photoconverted течение 10 минут при 200 МВт (405 нм свет). (A) представитель потока участков Каэдэ зеленый и красный в неконвертированных и преобразуется MC38 опухоли и плечевая dLN, сразу же после photoconversion Каэдэ. Населения были предварительно воротами в эфире, CD45+ сингл клетки. (B) микрофильм иммунофлуоресценции замороженные, Сен встроенный YUMM 1.7 опухолей как нереализованный и photoconverted. Шкалы бар = 200 µm. (C) эффективность преобразования CD45+ лейкоцитов и CD8 (D) + лимфоцитов в производстве меланина (B16. F10) и непигментированных (MC38, YUMM 1.1, YUMM 1.7). Каждая точка представляет одну мышь. (E) перечисление всего CD45+ клетки в неконвертированных опухоли и опухоли photoconverted собрали 24 ч после photoconversion (n = 3). Планки погрешностей представляют SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: лейкоцита выхода из опухоли микросреды является селективным. (A) Gating схема для выявления миелоидного и лимфоидных населения в MC38 dLNs. (B) представитель потока участков выявления Каэдэ красный+ клетки среди миелоидного и лимфоидных клеток в MC38 dLNs 24 часа после photoconversion. Проценты в участки потока установите частоту Каэдэ красный+ клеток в пределах указанного родительского лейкоцита населения LNs. (C, D) относительные пропорции внутриопухолевых (% CD45+ клеток) и egressed (клетки Каэдэ красный+ %; лейкоциты плечевая dLNs) из MC38 (C, n = 3) и YUMM 1.7 (D, n = 4) опухоли. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хотя лейкоцита выхода из периферийных устройств, не лимфоидной ткани имеет решающее значение для инициирования и резолюции иммунных реакций, молекулярные механизмы, которые управляют выход плохо понимают. Этот пробел в знаниях объясняется в основном доступность инструментов для количественной оценки в естественных условиях. Здесь мы описывают использование photoconvertible мышей (Каэдэ-Tg) количественно эндогенного лейкоцита выход из кожи и опухоли и обеспечить прямое сравнение соперничество с FITC краской в воспалительных и инфекции моделей. Мы демонстрируем, что, хотя обе модели отслеживания эндогенного населения DC, свободный дренаж FITC и плохое поглощение не фагоцитирующих клеток ограничивает полезность FITC краска для широкого анализа миелоидного и лимфоидных выхода из периферийных устройств, не являющихся лимфоидных тканей, в том числе опухоли. Кроме того мы представляем данные, указывает, что выход из опухоли является избирательным, а не стохастические, таким образом подтверждая выводы, представленные Torcellan et al. 39. дальнейшие исследования механизмов, регулирующих лейкоцита выход из опухоли может выявить Роман понимание опухольассоциированных воспаления и иммунитет.
Сначала мы оценивали эффективность photoconversion в мышиных кожи и его влияние на местные воспаления при использовании параметров в литературе. Воздействия на уши фиолетовый свет 3 мин на 100 МВт мощности привело к эффективным photoconversion CD45+ клеток в пределах кожи уха (78%), без преобразования в нижнем dLNs. В литературе продемонстрировать является оптимальным для кожных тканей5,,3338экспозиции 3-5 мин. Однако, это воздействие привело к росту числа CD45+ клетки в ухо Пинна 24 ч после преобразования и сосудистые утечки, указывающее, что photoconversion на эти параметры в ухо кожи побуждает местные воспаления, которые должны быть рассмотрены при интерпретация данных. Далее мы стремились непосредственно сравнить DC людьми LNs, используя photoconversion Каэдэ и более широко использовать FITC краска пробирного23,24 в устойчивом состоянии, в DBP-индуцированной воспаление, а из ушей инфицированных VacV. Мы наблюдали, что повышенные маркировки в FITC считаются по сравнению с photoconverted кожи на установившемся и последующее лечение DBP. Приложение бесплатно FITC кожи может привести к прямой дренаж через лимфатические сосуды крылом LNs где резидентов DC населения, которые не мигрируют (например., CD8α+ DCs), образец FITC. В соответствии с этим, мы наблюдали значительное количество РРК с лейблом FITC когда обращаются с раздражающим DBP. В отличие от Каэдэ красно меченых DCs только наблюдались в МЦС населения ниже photoconversion, указывающее, что photoconversion обеспечивает более конкретный способ этикетке офицеров. Однако, даже в пределах mDC населения, мы наблюдали количественно более Приклеенные этикетку офицеров при использовании FITC над photoconversion. Хотя это может быть объяснено бесплатно FITC дренажа, вполне возможно, что различия в период маркировки, где photoconversion можно только ярлык DCs в настоящее время проживающий в коже при FITC остается на коже в течение периода 24 h , учитывает различия в наблюдаемых mDC выход. Интересно, что в контексте вирусной инфекции, photoconversion и FITC приложения измеряется относительно равных уровней выхода mDC и несколько FITC+ РРК в LNs крылом VacV инфицированных уши. Мы недавно сообщили, что лимфатический дренаж значительно сокращена следующим VacV инфекции, и таким образом вирусный индуцированной снижение лимфатический транспорта может улучшить специфика FITC краски и снижение маркировки LN DC жителей31 . Важно отметить, что эта работа также подчеркивается тот факт, что в рамках населения mDC (CD3ε–CD19–MHCIIПриветCD11cint), количество контроллеров домена, которые активно мигрируют в течение 24 ч — незначительные населения и таким образом общая mDC числа являются не хороший суррогат для активной миграции41. Наконец интересно отметить, что мы последовательно количественно mDC выход на около 200 клеток для любого заданного 24 h периода следующие VacV инфекции41, при 1500-2000 DCs выхода из опухоли микросреды. Учитывая огромную эффективность VacV как вакцина платформы, особенно при применении скарификация45,,4647, это интересно спекулировать что это качество DC и возможно, что тип DC Представляя антиген, а не количество, что определяет надежного защитного иммунитета.
Лейкоцитарные выхода из опухоли микросреды, помимо DCs25,48, остается слабо исследованной площади. Хотя опухоли считаются хронически воспаленной микросреды, ли аналогичные механизмы регулирования сотовой выход из доброкачественных и злокачественных тканей остается неизвестным. Кроме того ли лейкоцита выход из опухоли стохастических или скорее выборочный будет иметь значительные последствия для интерпретации лейкоцита накопления и хранения в опухоли микросреды. Таким образом лейкоцитарные выход из опухоли могут иметь решающее значение для понимания, как опухоли уклониться от иммунного надзора и привести к Роман стратегий для иммунотерапии. Здесь мы применяем photoconvertible Каэдэ-Tg модель для изучения лейкоцита выход из имплантируемые кожные опухоли, где FITC краска будет недостаточно для широко ярлык миелоидного и лимфоидных населения. Первоначальные исследования показало, что эффективность photoconversion в имплантированных опухоли зависит как от размера опухоли и меланина. В то время как эффективность photoconversion быстро падает, как опухоли расти, когда меланин присутствует (B16. F10), опухоли-пигментированные линии такие опухоли ТОРТА и MC38 демонстрируют более стабильная эффективность преобразования различных размеров опухоли испытания. Интересно, что мы наблюдали повышение КПД в CD8+ Т-клеток отсека по сравнению с CD45+ клетки, которые снизились как опухоли, увеличилась в размерах. Есть скорее всего несколько факторов, способствующих это наблюдение. Во-первых расположение в опухоль повлияет экспозиции и, таким образом, эффективность преобразования типов конкретных клеток. Т-клетки часто встречаются ограничено к интерфейсу опухоли кожи в моделях имплантируемые опухоли и таким образом может быть более легко photoconverted по отношению к миелоидных клеток, проникновения опухоли паренхимы. Во-вторых не все лейкоциты выразить те же уровни белка Каэдэ49 и таким образом могут не все одинаково детектируется проточной цитометрии; Это может привести к снижению наблюдаемых процентных долей photoconversion при анализе более гетерогенной популяции клеток как все CD45+ клеток. Наконец важно отметить, что данные, представленные на рисунке 3 сгенерированный следующие 10 мин фиолетовый освещенности. Это время первоначального воздействия был выбран, основываясь на докладах в литературе, сославшись на photoconversion раз для различных органов, включая кожу, LNs, слизистых тканей и опухоли5,6,33,35 ,,3943. Только другие используя photoconvertible системы в опухоли, photoconversion было проведено исследование для 20 мин39. Дальнейшая оптимизация в наших руках показали повышение эффективности с укороченной Выдержка 5 мин для малых и больших объемов. Вполне вероятно, что длительное воздействие приводит к Фотообесцвечивание Каэдэ флуоресценции, и таким образом, наша эффективность сообщил преобразования могут быть заниженными. Длительное воздействие также может привести к увеличилась воспаление, связанные с photoconversion и смешаем результаты исследования. Опухоли photoconverted 5 минут продемонстрировал, что никакого существенного различия в количестве внутриопухолевых CD45+ клетки 24 ч после photoconversion, по сравнению с необращенный опухоли. Кроме того опухоли photoconverted 5 минут продемонстрировал измеримые и воспроизводимые выход для миелоидных и лимфоидных населения. Следовательно индивидуальной оптимизации в рамках конкретных тканей или опухоли интерес является необходимым для достижения оптимальных результатов.
Наконец мы использовали photoconversion в месте для количественного определения эндогенного лейкоцита выход из опухоли, имплантируется в Каэдэ-Tg мышей. С помощью двух различных имплантируемые, пигментные опухоли модели мы наблюдали значительное ОВВИГ DCs, Т-клетки и моноцитов. В соответствии с недавно опубликованной работе39, оба CD4+ и CD8+ T клетки egressed от опухоли микросреды, а также значительное количество двойное отрицание CD3ε+ T клетки. По крайней мере один компонент этого населения может быть Гамма Дельта T клетки как описано выше39, хотя предстоит определить функциональную значимость этих наблюдений. Важно отметить, что когда мы сравнили пропорции лейкоциты, egressing от опухоли в относительном соотношении числа лейкоцитов в рамках микросреды опухоли, мы наблюдали лейкоцита обогащения в egressed населения относительно внутриопухолевых бассейны в Обе модели, указывающее селективного лейкоцита выход. В частности, макрофаги и нейтрофилы отсутствовали в egressed населения, хотя обоих типов клеток были описаны для выхода под воспаленные и инфицированные условия2,50,51,52 , 53 , 54 и являются значительный вклад внутриопухолевых лейкоцита репертуаров39,55,56. Таким образом, лейкоцитарные выход из опухоли могут быть количественно с помощью photoconvertible модели, не стохастические но скорее регулируемый процесс и остается важным и изученными биологии со значительными последствиями для понимания воспалительных и иммунные динамика в опухоли микросреды в стационарном состоянии и в ответ на терапию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы имеют конфликты не разглашать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Маркуса Bosenberg за предоставление YUMM 1.1 и YUMM 1.7 мышиных меланомы линии и д-р Дебора J. Fowell для предоставления B6. CG-Tg(CAG-tdKaede) 15Utr мышей с согласия RIKEN BRC через национальные био-ресурс МПКСНТ, Япония.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DNase | Roche | 4536282001 | |
| Silver-LED-405B light source with optical fiber and collimtor | Prizmatix Ltd | V8144 | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I | Sigma-Aldrich | F4274 | |
| dibutyl phthalate | Sigma-Aldrich | 524980 | |
| acetone | Macron Fine Chemicals | 2440-02 | |
| 29-guage syringes | Exel International | 26029 | |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | |
| 70 um cell strainers | VWR | 732-2758 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| HBSS | Caisson | HBL06 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L34966 | |
| Purified Anti-mouse CD16/CD32 | Tonbo Biosciences | 70-0161-M001 | |
| BV605 CD11c (clone N418) | Biolegend | 117334 | |
| PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2) | BD Pharmingen | 562363 | |
| BV421 CD3e (clone 145-2C11) | Biolegend | 100341 | |
| APC CD8a (clone 53-6.7) | TonBo Biosciences | 20-0081-u100 | |
| APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
| BV650 CD19 (clone 6D5) | Biolegend | 115541 | |
| PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4) | Biolegend | 128011 | |
| Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8) | Biolegend | 123121 | |
| APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8) | Biolegend | 127623 | |
| BV711 CD11b (clone M1/70) | Biolegend | 101241 | |
| BV605 CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103155 | |
| BV711 CD4 (clone RM4-5) | BD Biosciences | 563726 | |
| Bovine serum albumin (Fraction V) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Anit-Rat and Anti-Hamster Igk / Negative Control Compensation Particle Set | BD Biosciences | 552845 | |
| Fortessa Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10 Software | FlowJo |
References
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Hampton, H. R., Bailey, J., Tomura, M., Brink, R., Chtanova, T. Microbe-dependent lymphatic migration of neutrophils modulates lymphocyte proliferation in lymph nodes. Nature Communications. 6, 7139 (2015).
- D'Alessio, S., et al. VEGF-C-dependent stimulation of lymphatic function ameliorates experimental inflammatory bowel disease. Journal of Clinical Investigation. 124 (9), 3863-3878 (2014).
- Debes, G. F., et al. Chemokine receptor CCR7 required for T lymphocyte exit from peripheral tissues. Nature Immunology. 6 (9), 889-894 (2005).
- Bromley, S. K., Yan, S., Tomura, M., Kanagawa, O., Luster, A. D. Recirculating memory T cells are a unique subset of CD4+ T cells with a distinct phenotype and migratory pattern. Journal of Immunology. 190 (3), 970-976 (2013).
- Tomura, M., et al. Activated regulatory T cells are the major T cell type emigrating from the skin during a cutaneous immune response in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (3), 883-893 (2010).
- Tomura, M., Itoh, K., Kanagawa, O. Naive CD4+ T lymphocytes circulate through lymphoid organs to interact with endogenous antigens and upregulate their function. Journal of Immunology. 184 (9), 4646-4653 (2010).
- Jennrich, S., Lee, M. H., Lynn, R. C., Dewberry, K., Debes, G. F. Tissue exit: a novel control point in the accumulation of antigen-specific CD8 T cells in the influenza a virus-infected lung. Journal of Virology. 86 (7), 3436-3445 (2012).
- Geherin, S. A., Wilson, R. P., Jennrich, S., Debes, G. F. CXCR4 is dispensable for T cell egress from chronically inflamed skin via the afferent lymph. PLoS One. 9 (4), e95626 (2014).
- Brown, M. N., et al. Chemoattractant receptors and lymphocyte egress from extralymphoid tissue: changing requirements during the course of inflammation. Journal of Immunology. 185 (8), 4873-4882 (2010).
- Bromley, S. K., Thomas, S. Y., Luster, A. D. Chemokine receptor CCR7 guides T cell exit from peripheral tissues and entry into afferent lymphatics. Nature Immunology. 6 (9), 895-901 (2005).
- Gomez, D., Diehl, M. C., Crosby, E. J., Weinkopff, T., Debes, G. F. Effector T Cell Egress via Afferent Lymph Modulates Local Tissue Inflammation. Journal of Immunology. 195 (8), 3531-3536 (2015).
- Ohl, L., et al. CCR7 governs skin dendritic cell migration under inflammatory and steady-state conditions. Immunity. 21 (2), 279-288 (2004).
- Kabashima, K., et al. CXCL12-CXCR4 engagement is required for migration of cutaneous dendritic cells. American Journal of Pathology. 171 (4), 1249-1257 (2007).
- Cyster, J. G., Schwab, S. R. Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs. Annual Review of Immunology. 30, 69-94 (2012).
- Matloubian, M., et al. Lymphocyte egress from thymus and peripheral lymphoid organs is dependent on S1P receptor 1. Nature. 427 (6972), 355-360 (2004).
- Teijeira, A., Rouzaut, A., Melero, I. Initial afferent lymphatic vessels controlling outbound leukocyte traffic from skin to lymph nodes. Frontiers in Immunology. 4, 433 (2013).
- Hunter, M. C., Teijeira, A., Halin, C. T Cell Trafficking through Lymphatic Vessels. Frontiers in Immunology. 7, 613 (2016).
- Bujdoso, R., Hopkins, J., Dutia, B. M., Young, P., McConnell, I. Characterization of sheep afferent lymph dendritic cells and their role in antigen carriage. Journal of Experimental Medicine. 170 (4), 1285-1301 (1989).
- Young, A. J. The physiology of lymphocyte migration through the single lymph node in vivo. Seminars in Immunology. 11 (2), 73-83 (1999).
- Seabrook, T., et al. The traffic of resting lymphocytes through delayed hypersensitivity and chronic inflammatory lesions: a dynamic equilibrium. Seminars in Immunology. 11 (2), 115-123 (1999).
- Swartz, M. A., et al. Mechanics of interstitial-lymphatic fluid transport: theoretical foundation and experimental validation. Journal of Biomechanics. 32 (12), 1297-1307 (1999).
- Macatonia, S. E., Knight, S. C., Edwards, A. J., Griffiths, S., Fryer, P. Localization of antigen on lymph node dendritic cells after exposure to the contact sensitizer fluorescein isothiocyanate. Functional and morphological studies. Journal of Experimental Medicine. 166 (6), 1654-1667 (1987).
- Robbiani, D. F., et al. The leukotriene C(4) transporter MRP1 regulates CCL19 (MIP-3beta, ELC)-dependent mobilization of dendritic cells to lymph nodes. Cell. 103 (4), 757-768 (2000).
- Roberts, E. W., et al. Critical Role for CD103(+)/CD141(+) Dendritic Cells Bearing CCR7 for Tumor Antigen Trafficking and Priming of T Cell Immunity in Melanoma. Cancer Cell. 30 (2), 324-336 (2016).
- Forster, R., et al. CCR7 coordinates the primary immune response by establishing functional microenvironments in secondary lymphoid organs. Cell. 99 (1), 23-33 (1999).
- Johnson, L. A., Jackson, D. G. The chemokine CX3CL1 promotes trafficking of dendritic cells through inflamed lymphatics. Journal of Cell Science. 126, 5259-5270 (2013).
- Teijeira, A., et al. T Cell Migration from Inflamed Skin to Draining Lymph Nodes Requires Intralymphatic Crawling Supported by ICAM-1/LFA-1 Interactions. Cell Reports. 18 (4), 857-865 (2017).
- Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PLoS One. 8 (2), e57135 (2013).
- Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin alphaV. Nature Immunology. 14 (9), 949-958 (2013).
- Russo, E., et al. Intralymphatic CCL21 Promotes Tissue Egress of Dendritic Cells through Afferent Lymphatic Vessels. Cell Reports. 14 (7), 1723-1734 (2016).
- Steven, P., Bock, F., Huttmann, G., Cursiefen, C. Intravital two-photon microscopy of immune cell dynamics in corneal lymphatic vessels. PLoS One. 6 (10), e26253 (2011).
- Tomura, M., et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 105 (31), 10871-10876 (2008).
- Shand, F. H., et al. Tracking of intertissue migration reveals the origins of tumor-infiltrating monocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (21), 7771-7776 (2014).
- Tomura, M., et al. Tracking and quantification of dendritic cell migration and antigen trafficking between the skin and lymph nodes. Scientific Reports. 4, 6030 (2014).
- Moran, A. E., et al. T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse. Journal of Experimental Medicine. 208 (6), 1279-1289 (2011).
- Schmidt, T. H., Bannard, O., Gray, E. E., Cyster, J. G. CXCR4 promotes B cell egress from Peyer's patches. Journal of Experimental Medicine. 210 (6), 1099-1107 (2013).
- Beura, L. K., et al. T Cells in Nonlymphoid Tissues Give Rise to Lymph-Node-Resident Memory T Cells. Immunity. 48 (2), 327-338 (2018).
- Torcellan, T., et al. In vivo photolabeling of tumor-infiltrating cells reveals highly regulated egress of T-cell subsets from tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114 (22), 5677-5682 (2017).
- Khan, T. N., Mooster, J. L., Kilgore, A. M., Osborn, J. F., Nolz, J. C. Local antigen in nonlymphoid tissue promotes resident memory CD8+ T cell formation during viral infection. Journal of Experimental Medicine. 213 (6), 951-966 (2016).
- Loo, C. P., et al. Lymphatic Vessels Balance Viral Dissemination and Immune Activation following Cutaneous Viral Infection. Cell Reports. 20 (13), 3176-3187 (2017).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. (73), e50062 (2013).
- Morton, A. M., et al. Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (18), 6696-6701 (2014).
- Meeth, K., Wang, J. X., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations. Pigment Cell Melanoma Research. 29 (5), 590-597 (2016).
- Demkowicz, W. E., Littaua, R. A., Wang, J., Ennis, F. A. Human cytotoxic T-cell memory: long-lived responses to vaccinia virus. Journal of Virology. 70 (4), 2627-2631 (1996).
- Stewart, A. J., Devlin, P. M. The history of the smallpox vaccine. Journal of Infection. 52 (5), 329-334 (2006).
- Hammarlund, E., et al. Duration of antiviral immunity after smallpox vaccination. Nature Medicine. 9 (9), 1131-1137 (2003).
- Lund, A. W., et al. Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).
- Tomura, M., Kabashima, K. Analysis of cell movement between skin and other anatomical sites in vivo using photoconvertible fluorescent protein "Kaede"-transgenic mice. Methods in Molecular Biology. , 279-286 (2013).
- Bellingan, G. J., Caldwell, H., Howie, S. E., Dransfield, I., Haslett, C. In vivo fate of the inflammatory macrophage during the resolution of inflammation: inflammatory macrophages do not die locally, but emigrate to the draining lymph nodes. Journal of Immunology. 157 (6), 2577-2585 (1996).
- Gautier, E. L., Ivanov, S., Lesnik, P., Randolph, G. J. Local apoptosis mediates clearance of macrophages from resolving inflammation in mice. Blood. 122 (15), 2714-2722 (2013).
- Abadie, V., et al. Neutrophils rapidly migrate via lymphatics after Mycobacterium bovis BCG intradermal vaccination and shuttle live bacilli to the draining lymph nodes. Blood. 106 (5), 1843-1850 (2005).
- Beauvillain, C., et al. CCR7 is involved in the migration of neutrophils to lymph nodes. Blood. 117 (4), 1196-1204 (2011).
- Rigby, D. A., Ferguson, D. J., Johnson, L. A., Jackson, D. G. Neutrophils rapidly transit inflamed lymphatic vessel endothelium via integrin-dependent proteolysis and lipoxin-induced junctional retraction. Journal of Leukocyte Biology. 98 (6), 897-912 (2015).
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Binnewies, M., et al. Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy. Nature Medicine. 24 (5), 541-550 (2018).
