Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kvantifiera leukocyt avstigning via lymfkärl från murina hud och tumörer

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58704
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 1,2,3,4
1Department of Cell, Developmental, & Cancer Biology, Oregon Health and Science University, 2Department of Molecular Microbiology & Immunology, Oregon Health and Science University, 3Department of Dermatology, Oregon Health and Science University, 4Knight Cancer Institute, Oregon Health and Science University

Summary

Här visar vi metoderna för in-vivo kvantifiering av leukocyt avstigning från naiva, inflammerad, och maligna murina hud. Vi utför en head-to-head jämförelse av två modeller: transdermal FITC ansökan och i situ photoconversion. Vi visar dessutom nyttan av photoconversion för att spåra leukocyt avstigning från kutana tumörer.

Abstract

Leukocyt avstigning från perifera vävnader till dränerande lymfkörtlar är inte bara avgörande för immun övervakning och initiering utan bidrar även till resolution av perifer vävnad svaren. Medan en mängd metoder används för att kvantifiera leukocyt avstigning från icke-lymfoida, perifera vävnader, förblir de cellulära och molekylära mekanismer som reglerar innehållsberoende avstigning dåligt förstådd. Här, beskriver vi användningen av i situ photoconversion för kvantitativ analys av leukocyt avstigning från murina hud och tumörer. Photoconversion möjliggör direkt märkning av leukocyter bosatta inom kutan tissue. Om huden utsätts för ultraviolett ljus inducerar lokala kännetecknas inflammatoriska svar av leukocyt infiltrat och vaskulära leakiness, i en head-to-head jämförelse med transdermal applikation av fluorescerande spårämnen, photoconversion specifikt märkt flyttande dendritiska cellpopulationer och samtidigt aktiverade kvantifiering av myeloiska och lymfoida avstigning från kutana mikromiljö och tumörer. Mekanismer för egress leukocyt förbli en komponent som saknas i vår förståelse av intratumoral leukocyt komplexitet och således tillämpningen av verktygen som beskrivs häri ger unik insikt i dynamiken i tumör immun mikromiljö båda vid steady state och som svar på behandling.

Introduction

Perifer vävnad immunsvar formas inte bara av leukocyt rekrytering till platser av inflammation, men också av mekanismer som reglerar deras efterföljande kvarhållandet. Skyddande immunitet styrs således av kumulativa cellulära och molekylära mekanismer som avgör huruvida en leukocyt träder, vistelser inom, eller snarare migrerar ut ur perifer vävnad via lymfkärl. Ännu viktigare, är benägenheten för leukocyter att avsluta vävnad genom lymfkärl (kallas avstigning) kopplad till sina specialiserade funktioner. Dendritiska celler (DC) förvärva flyttande beteende som svar till mognad signaler leder till antigen transport och presentation i dränerande lymfkörtlar (dLN), en process som är nödvändig för adaptiv immunitet1. Rensning myeloida celler, såsom makrofager och neutrofiler, tjäna till att rensa apoptotiska skräp genom fagocytos. Under bakterieinfektion, neutrofiler avstigning vävnad och slutligen genomgå apoptos i dLNs2 och en modell av DSS-inducerad kolit, data stödjer hypotesen att makrofag avstigning är nödvändigt att lösa lokal inflammation3. Om antal neutrofiler och makrofager avstigning uppstår i alla inflammatoriska sammanhang är dock okänd. Bevis för T-lymfocyter avstigning från steady state4,5,6,7, infekterade8och inflammerade4,9,10, 11,12 perifer, icke-lymfoida vävnader indikerar att återcirkulera aktivt T-celler, men de tissue-baserade signaler som kör denna avfart förblir dåligt förstådd. Flera studier har identifierat signaler behövs för riktad övergång till dränering lymfatiska kapillärer och efterföljande avstigning inklusive chemokine (C-C motiv) ligand 21 (CCL21) och dess receptor CCR74,11, 13, chemokine (C-X-C motiv) ligand 12 (CXCL12) och dess receptor CXCR42,14, och sfingosin-1-fosfat-(S1P)10,15,16. Dessa mekanismer är inte aktiva i alla sammanhang dock och huruvida de fastställa avstigning av alla celltyper förblir en öppen fråga. Ännu viktigare, ytterligare kräver insikt om de mekanismer som reglerar avstigning och dess funktionella relevans i sjukdom kvantitativa i vivo analysmetoder.

Flera metoder har använts för att kvantifiera avstigning i flera djurmodeller i vivo inklusive direkta kanylering av lymfkärl, överföring av ex vivo märkta leukocyter, transdermal applikation av fluorescerande spårämnen, injektion av märkta partiklar och i vivo photoconversion17,18. Direkta kanylering av afferenta mus lymfkärl är svårt och begränsad i små djur av volymerna av vätska som kan samlas in. Kanylering har således till stor del utförts i stora djur (t.ex., får) där sådana kirurgiska manipulationer är praktiska. Dessa studier ger direkta bevis för förekomsten av både lymfoida och myeloida celler i lymfan10,19,20. Dessutom avslöjar får modeller att akut och kronisk inflammation ökade nästan 100 gånger10,21lymfocyter närvaro i lymfan.

Överföring av märkta och genetiskt manipulerade lymfocyter har allt avslöjat att CCR7 krävs för avstigning av CD4+ T celler från akut inflammerad hud5,11, medan förbehandling av lymfocyter med små molekylen S1P-receptoragonist hämmar FTY720, endast delvis sina avstigning10. Intressant, avstigning av överförda lymfocyter från kroniskt inflammerad hud är CCR7-oberoende10, men kräva delvis CXCR49. Överföring experiment, dock leverera icke-fysiologiskt antal ex vivo aktiveras och märkta lymfocyter in vävnaden genom injektion, vilket förändrar den biomekaniska miljön av vävnader och förhöjda interstitiell vätska tryck som öppna inledande lymfatiska kapillärer och förändra deras transport boenden22. Som ett alternativ, transdermal applicering av fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC) i närvaro eller frånvaro av dermal irriterande (t.ex., dibutylftalat, DBP) eller infektion23,24 möjliggör spårning av Fagocytos celler som ackumuleras tracer och migrera till dLNs. Likaså ger fluorescently märkt tumörer ett sätt att spåra Fagocytos celler som har uppslukat tumör material25. Dessa metoder har gett viktig insikt om de mekanismer som styr DC utgång13,14,17,26,27 men inte kan spåra icke-fagocytos lymfocyter och tolkning kan kompliceras av gratis lymfdränage av lösliga FITC således märkning stannfågel, LN bosatt DCs.

Alternativt, intravital mikroskopi är ett kraftfullt verktyg som möjliggör in-vivo spårning av fysiologiskt relevanta leukocyt populationer i realtid28,29. Används i kombination med reporter möss och antikroppsbaserade i vivo märkning Immunofluorescerande, intravital mikroskopi har avslöjat komplexet rumsliga och tidsmässiga dynamiken i immun cell människohandel, inklusive interstitiell migration30 , själavandring över de lymfatiska endotelet, passage inom lymfatiska lumen och migration på LN post28,31. Brett antagandet av intravital avbildningstekniker begränsas av bekostnad, nödvändig expertis för uppsättning upp, och begränsade genomströmning för att kvantifiera flera celltyper. Fortfarande, koppling kvantitativa metoder att analyserar populationsdynamik vävnader med intravital imaging kommer att ge ytterligare och viktiga mekanistisk insikt beträffande mekanismer motilitet och migration mot och inom lymfatiska kapillärer 18 , 31 , 32.

Följaktligen i vivo photoconversion har vuxit fram som en metod som möjliggör i situ märkning, oberoende av fagocytiska aktiviteten, och för kvantifiering av fysiologiska leukocyt avstigning (när den kombineras med flödescytometri) i den avsaknaden eller förekomsten av utmaning. Kaede-Tg möss express konstitutivt ett protein som isolerats från stenig korallrev som uppvisar grön fluorescens (Kaede grön) tills utsätts för ultraviolett ljus, varefter det irreversibelt konverterar till röd fluorescens (Kaede röd)33. Photoconverted celler kan spåras som de avstigning från perifer vävnad webbplatser och ackumuleras i dLNs. Detta och andra liknande photoconvertible mus modeller34,35 har avslöjat viktig biologi inklusive konstituerande avstigning av regulatoriska T-celler från huden36, CXCR4-beroende B cell avstigning från Peyers37 , mobilisering av resident T minnesceller vid peptid rechallenge38och bred leukocyt avstigning från tumör mikromiljö39. Häri, utför vi en head-to-head jämförelse av photoconversion med transdermal FITC ansökan i samband med kutan inflammation och infektion som möjliggör direkt jämförelse av befintliga data med metoden photoconvertible. Dessutom vi demonstrera photoconversion i implanterade tumörer och beskriva verkningsgraden och selektiv avstigning från tumör mikromiljö. Som sådan, hävdar vi att ytterligare tillämpning av dessa metoder krävs att belysa leukocyt avstigning från tumörer, som kommer att ha betydande konsekvenser för att tolka intratumoral leukocyt komplexitet, anti-tumor immunitet, kritiska biologi och behandlingssvaret.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djur protokoll har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén på Oregon Health & Science University.

1. induktion av Inflammation och FITC målning av mus Pinna

  1. I en LAF, söva en C57Bl/6 mus med förångade isofluorane (framkalla på 3-5% isofluorane och underhålla på 1-3% isofluorane; syre flöde på 0,5-1,0 L/min). Säkerställa korrekt anesthetization genom att övervaka förlusten av pedal reflexen, ofrivilliga rörelser och nedsatt andningsfrekvens.
  2. Låg ett öra platta med den ventrala sidan av örat uppåt. Pipettera 20 µL 5% FITC lösning upplöst i 1:1 aceton: dibutylftalat (DBP) öra pinna ventrala sida. Tillåta örat torka i några sekunder.
  3. 24 h efter FITC ansökan, eutanasi möss via koldioxid exponering följt av cervikal dislokation. Samla in de öra extremiteterna i PBS genom att separera öronen från huvudet med sax. Samla in de cervikal dLNs och inguinal icke-dränering LNs i PBS med pincett för att avgränsa LNs från omgivande vävnader. Inguinal icke-dränering LNs kommer fungera som negativa kontroller för förekomst av FITC+/Kaede röda+ leukocyter. Avyttra slaktkroppar per institutionella protokollet.
    Obs: Den optimala tiden inlägget photoconversion för analys kommer att bero på celltyp och kända flyttande beteenden. Dendritiska celler, till exempel kan upptäckas i dLNs så tidigt som 6 h post DBP ansökan.

2. induktion av Inflammation och Photoconversion av mus Pinna

  1. I en LAF, söva en Kaede-Tg mus (bakgrund C57Bl/6) av intraperitoneal injektion av 80 mg/kg ketamin och 10 mg/kg xylazin upplöst i saltlösning. Säkerställa korrekt anesthetization som beskrivs i steg 1,1.
  2. Låg ett öra platta med den ventrala sidan av örat uppåt. Pipettera 20 µL av en 1:1 aceton: DBP den öra pinna ventrala sida. Tillåta örat torka i några sekunder.
  3. Efter DBP ansökan, skär en skåra i en bit aluminiumfolie och dra i örat genom skåran att utsätta örat till violett ljuskällan. Lägga örat platt med dorsal vänd uppåt använder dubbelhäftande tejp för att säkra örat och folien.
  4. Placera i örat direkt under ljuskälla och photoconvert för 3 min med en 405 nm ljuskälla vid 100 mW effekt.
  5. 24 h efter photoconversion, eutanasi Kaede-Tg möss och skörda den öra extremiteterna, cervikal LNs och inguinal LNs som beskrivs i steg 1.3.
    Obs: Utöver överväganden ovan i steg 1.3, andelen spridning kommer att bestämma tidpunkten för analys som förlusten av Kaede röda kommer att ske i snabbt delande celler.

3. vaccinia infektion mus Pinna och FITC tillämpning

  1. Söva en C57Bl/6 mus med förångade isofluorane som beskrivs i steg 1,1.
  2. Låg den ventrala sidan av örat platta. Pipettera 5 x 106 plaque-forming enheter (PFU) av vacciniavirus (VacV) utspätt i 10 µL av PBS på det örat pinna. Använder en 29-gauge nål, peta pinna 25 gånger40.
  3. 24 h efter infektion, söva VacV-infekterade möss med isofluorane som beskrivs i steg 1.1 och Pipettera 20 µL 5% FITC löst i aceton till den ventrala sidan på det örat pinna. Tillåta örat torka i några sekunder.
  4. 24 h efter FITC ansökan, eutanasi möss och samla de öra extremiteterna, cervikal LNs och inguinal LNs som beskrivs i steg 1.3.
    Obs: FITC kan tillämpas på någon tid punkt post infektion att bestämma DC människohandel på olika 24 h intervall. Vi har tidigare rapporterat att DC migrering till dLNs upprätthålls på liknande nivåer från dag 1 till 3 post infektion41.

4. vaccinia infektion av mus Pinna och Photoconversion.

  1. Söva en Kaede-Tg mus med förångade isofluorane som beskrivs i steg 1,1.
  2. Infektera den öra pinna med VacV som beskrivs i steg 3,2.
  3. 24 h efter infektion, söva VacV-infekterade Kaede möss som beskrivs i steg 2.1 och utför photoconversion som beskrivs i steg 2,3-2.4.
  4. 24 h efter photoconversion, eutanasi möss och skörda den öra extremiteterna, cervikal LNs och inguinal LNs som beskrivs i steg 1.3.
    Obs: Som nämnts ovan i steg 3,4, photoconversion kan administreras vid någon tid punkt post infektion.

5. öra och lymfkörtel bearbetning för flödescytometri

  1. Skapa enstaka cellsuspensioner av örat extremiteterna: dra isär den öra pinna med två par pincett och plats med insidan av örat nedåt i brunnar 24-well platta innehållande 1 mg/mL kollagenas D och 80 U/mL DNAS utspätt i ventrala och dorsala sidor Hanks buffrad koksaltlösning lösning (HBSS) (som innehåller Ca2 + och Mg2 +). Inkubera vid 37 ° C i 30 min. Tryck smält vävnaden genom en 70 µm nylon cell SIL.
  2. Skapa enda cellsuspensioner från LNs: placera LNs i brunnar 24-well platta innehållande 1 mg/mL kollagenas D och 80 U/mL DNAS utspätt i HBSS. Retas öppna lymfkörteln kapsel med två 29-gauge nålar och sedan Inkubera lymfkörtlar vid 37 ° C i 30 min. Tryck smält vävnaden genom en 70 µm nylon cell SIL.

6. intradermala melanom tumör Implantation och Photoconversion.

  1. Raka pälsen från mitten av baksidan av en Kaede-Tg mus med en rakapparat.
  2. Placera en 29-gauge nål i mitten av baksidan mellan de vänstra och högra övre scapulae och intradermalt injicera 5 x 105 tumörceller (utspädd i 50 µL saltlösning) i huden av Kaede-Tg möss. Tumörer måste placeras noggrant för att säkerställa lymfdränage till angivna lymfkörtlar (dvsvänster och höger brachialis LNs för tumörer placeras mitt i övre delen av ryggen). Undvik att placera tumören ovan dLN eftersom detta kan resultera i direkt photoconversion av LNs genom huden/tumören.
  3. Tillåta tumörer att växa till önskad storlek (100-650 mm3).
  4. En dag före vävnad samling, söva en Kaede-Tg mus som beskrivs i 2.1 och raka någon nyligen återväxta päls runt tumören.
  5. Klipp ett cirkulärt hål i aluminiumfolie och dra tumören för att utsätta tumören till ljuskällan. Klipp hålet något mindre än tumören att hindra tumören från att falla tillbaka genom hålet och minimera omvandlingen av intilliggande, icke-tumör hud.
  6. Placera tumören direkt nedanför ljuskälla och photoconvert för 5 min med en 405 nm ljuskälla på 200 mW effekt.
  7. 24 h efter photoconversion, eutanasi mössen som beskrivs i steg 1.3. Samla in de tumörer och brakial dLNs inguinal icke-dränering LNs i PBS. Skär tumörer från omgivande huden med sax och ta bort LNs enligt beskrivningen i steg 1.3.

7. tumör och lymfkörtel bearbetning för flödescytometri

  1. Skapa enda cellsuspensioner från tumörer: finhacka tumörer med sax i brunnar i en 24-well platta innehållande 1 mg/mL kollagenas D och 80 U/mL DNAS utspätt i HBSS. Inkubera vid 37 ° C under 1 h. Tryck smält vävnaden genom en sil med 70 µm i nylon.
  2. Skapa enda cellsuspension av lymfkörtlar som beskrivs i steg 5.2.

8. antikropp färgning för flödescytometri

  1. Efter smälta vävnader in enda cellsuspensioner, utföra standard flöde flödescytometri färgning tekniker för att märka cellerna med markörer av intresse. Kort, Pipettera 2 x 106 celler i en plattan med 96 brunnar. Inkubera proverna med Fc block (1 µg/mL) i 20 min på is; Tvätta två gånger med FACs buffert (1% bovint serumalbumin i PBS). Lägga till live/dead fläcken (utspädd i PBS) i proverna och inkubera i 15 min på is; Tvätta två gånger med FACs buffert. Inkubera med primära antikroppar (Tabell för material) utspätt i FACs buffert för 30 min på is; Tvätta två gånger med FACs buffert.
    Obs: Kaede grön och Kaede röd fluorescens överlappar med FITC och PE fluorophores; Således, FITC och PE-konjugerade antikroppar kan inte användas i kombination med Kaede proteiner.
  2. Efter färgning, kör exemplen på en flödescytometer. Alternativt, fixa cellerna med 2% PFA.

9. Flödesanalys flödescytometri

  1. Ställ in FITC (Kaede grön) och PE (Kaede röd) kanal PMT spänningar till 70-80% av den totala utbud (centrerar befolkningen på ungefärligt 104) med ex vivo Kaede green, Kaede röd enfärgad splenocytes eller blod.
    Obs: Kompensera inte för Kaede grönt (FITC) och Kaede röd (PE) kanaler eftersom detta kommer att resultera i större signal sprids.
    1. För att skapa en färg Kaede kontroller, samla en mjälte eller blod från en Kaede-Tg mus. Lysera röda blodkroppar med ACK buffert och sedan dela celler i två grupper: oomvänd Kaede gröna och konverterade Kaede röd.
    2. För enda färg Kaede röd kontroller, stänga av cellerna i 1 mL PBS och photoconvert i en 24-well platta för 5 min med en 405 nm ljuskällor vid en effekt av 100 mW. Använda dessa celler för att ställa in Kaede grön (FITC) och Kaede röd PMT spänningar på flödescytometer (steg 9,1).
  2. När spänningar för Kaede proteinerna har angetts, kompensera för alla andra primär antikropp fläckar använder single-fluorophore märkt ersättning pärlor per tillverkarens anvisningar.
  3. Kör exemplen på en flödescytometer att samla in data.
    Obs: Kaede proteinet produceras kontinuerligt av celler. Detta innebär att 24 h efter photoconversion, konverterade celler blir dubbel positiv för Kaede grön och Kaede röd som nyligen syntetiserade Kaede (grön) protein har ackumulerats i cellen.
  4. Analysera data med hjälp av FlowJo eller en liknande programvara.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi försökte först replikera photoconversion resultat publicerade i litteraturen att utvärdera effektiviteten och bestämma den associerade inflammationen i mus huden. Den öra pinna utsattes för 100 mW violett ljus (405 nm) för 3 min som tidigare beskrivs33. Enstaka cellsuspensioner genereras från örat hud eller cervikal dLNs omedelbart efter exponeringen visade en 78% verkningsgrad för alla CD45+ leukocyter i huden med inga konverterade celler observeras i dLNs (figur 1A). Utvärdera den inflammatoriska reaktionen som är associerad med photoconversion, kvantifierade vi numrerar av infiltrera CD45+ leukocyter i konverterade öron 0 och 24 h post konvertering (figur 1B) och akuta ändringar i vaskulär permeabilitet mätt genom mils Assay42 (figur 1 c). Kort, 200 µL 0,5% Evans Blue var intravaskulärt injiceras 2 h efter photoconversion. Öronen samlades 30 min efter en injektion och Evans Blue extraherades med formamid för 24 h vid 55° C (absorbans Läs på 610 nm42). Båda CD45+ infiltrerar (24 h) och vaskulär läckage (2 h) ökades betydligt efter den photoconversion, som anger att photoconversion sig även på detta kort exponering, kan påverka den vävnad-specifika inflammatoriska reaktionen. Jämförelse med CD45+ infiltrerar (figur 1B) och vaskulär läckage (1,4 µg/öra ±0.75) i VacV infekterade öron 24 h post infektion41 ger ramen för omfattningen av inflammation som orsakas av ultraviolett ljus (0,08 µg/öra ± 0,01).

Medan flera modeller har använts i olika studier för att spåra den leukocyt avstigning från icke-lymfoida, perifera vävnader, är det oklart hur dessa metoder jämföra deras förmåga att spåra specifika populationer kommer ut ur huden. Vi beslutade följaktligen att utföra en direkt head-to-head jämförelse av två vanliga metoder för att spåra DC avstigning till LNs, FITC färg och i vivo photoconversion, för att utvärdera effektiviteten och specificitet av varje metod för kvantitativ analys av DC avstigning vid steady-state vid kutan inflammation, och från infekterad hud. För varje analys, var huden utsätts för transdermal FITC ansökan eller utsätts för 100 mW 405 nm ljus för 3 min. LN DC populationer definieras som CD3ε–CD19–MHCII+CD11c+ och ytterligare stratifierat in 1) MHCIIHej CD11cint DCs, som berikar för flyttande DCs (mDCs) båda CD103+ BATF3-beroende cross-presenterande DCs och CD11b+ dermal DCs; och 2) MHCIIintCD11cHej DCs, som berikar för bosatta DCs (regionala distributionsföretag) inklusive CD8α+ BATF3-beroende cross-presenterande DCs (figur 2A). 24 h efter antingen FITC program eller photoconversion, märkt cellerna var lätt upptäckas i dränering men inte icke-dränering LNs (figur 2B). För att kvantifiera omfattningen av DC migrering till LNs och samtidigt bestämma specificiteten av metoden för märkning migrerande befolkningar och inte bofasta LN populationer, kvantifierade vi märkt mDCs och regionala distributionsföretag vid steady state, 24 h efter applicering av DBP, och 48 h efter VacV harvning (figur 2 c). Medan både photoconversion (Kaede) och FITC märkta mDCs i alla förhållanden, observerade vi mer FITC-märkt än Kaede-märkt mDCs i dLNs, med undantag för VacV infektion där de två metoderna kvantifieras en liknande nivå av avstigning. Dessutom i samband med DBP märkt FITC dessutom rDC populationer där photoconversion förblev specifika för mDCs (figur 2 c). Använda båda dessa metoder, observerade vi avstigning av ungefärligt 200 DCs från VacV infekterad hud och huvudsakligen noterade att denna nivå av avstigning recapitulates tidigare publicerade resultaten genom Loo et al. transdermal FITC ansökan 41. således beroende på inflammatoriska sammanhang, transdermal FITC ansökan kan öka antalet märkta DCs upptäcks i dLNs och resultera i icke-specifik märkning av stannfåglar LN-resident DC populationer, medan photoconversion specifikt identifierar DCs falla i en mDC befolkning.

Kaede-Tg möss har använts för att kvantifiera leukocyt lagring i5,33,43 och avstigning från5,6,35,38 kutan, slemhinnor, och lymfvävnad under steady-state och inflammerad villkor och tillämpas på tumörer endast i en publikation där tumörerna var implanteras intrakutant i mus öron och photoconverted vid små volymer39. Således, vi försökte utvärdera nyttan av i vivo photoconversion för kvantifiering av leukocyt avstigning från etablerade, stora primära tumörer att aktivera ytterligare immunologiska hypotesprövning. Det första implanteras vi MC38 tumörceller intradermalt i Kaede-Tg möss mellan de vänstra och högra scapulae. Implanterbara tumör modeller aktivera exakt positionering av tumörer att säkerställa lymfdränage till kända LNs; tumörer i huden på övre tillbaka främst avlopp till vänster och höger brachialis LNs. Efter att nå 100-150 mm3, tumörerna photoconverted (10 min, 200 mW) och tumörer och dLNs skördas omedelbart efter photoconversion. Analys av flödescytometri visade betydande omvandling av intratumoral CD45+ celler från Kaede green+ till Kaede röda+ (69%. Figur 3A), medan viktigt, dLNs förblev negativ för Kaede röda+ celler. Immunofluorescens mikroskopi av photoconverted YUMM 1,7 tumörer visade att photoconversion tränger djupt in i tumörvävnad (> 1 mm; Figur 3B). Intressant, uttrycker hud och vaskulära celler höga nivåer av proteinet Kaede leder till höga photoconversion effektiviteten hos dessa celltyper som kan ses i figur 3B. Detta höga Kaede röd uttryck gör det svårt att identifiera immuncellerna (både oomvänd och omvandlas) med hjälp av immunofluorescens mikroskopi.

Med tanke på vårt speciella intresse för melanom immunologi, vi nästa utvärderat effekten av både tumörens storlek och melanin på photoconversion effektivitet med hjälp av olika implanterbara murina tumör cellinjer: MC38 (unpigmented kolorektal cancer linje), B16. F10 (melanin-producerande melanom linje), YUMM 1.1 (unpigmented melanom linje) och YUMM 1,7 (unpigmented melanom linje)44. Var och en av dessa linjer var implanteras intrakutant i Kaede-Tg möss och photoconverted, som beskrivs ovan vid olika tumör volymer (50-650 mm3). Tumörerna var skördas omedelbart efter photoconversion och utvärderas för förekomst av Kaede röd CD45+ leukocyter av flödescytometri. Intressant, photoconversion effektivitet CD45+ leukocyter varierade avsevärt över tumörtyper och storlekar (figur 3 c). CD45+ leukocyter inom små (50-150 mm3) YUMM 1.7 och YUMM 1.1 tumörer visade den mest effektiva photoconversion på 80% och 60%, respektive. Volymerna ökade för dessa tumörer, de konvertering effektivitetsvinsterna minskade till omkring 50% för stora tumörer (> 600 mm3). Melanin hade en slående effekt på photoconversion effektivitet: maximal photoconversion för CD45+ celler inom melanin-producerande B16. F10 tumörer var endast cirka 30 procent och sjönk till 10% som tumörer nått volymer av 400 mm3. Intressant analys av intratumoral CD8+ T celler uppenbarade photoconversion effektivitet för dessa celler på nästan 80-90% i små tumörer oavsett melaninproduktionen (figur 3D). För unpigmented tumörer, CD8+ T cell konvertering förblev hög även när tumörer nått stora volymer, men minskade betydligt med storleken när melanin var närvarande. Som sådan, nyttan av B16. F10 murina melanom och andra melanin-producerande melanom linjer, kan begränsas till små tumörer (50 mm3), vilket är förenligt med den biologiska funktionen av melanin i absorberar ljus. Utvärdera den inflammatoriska reaktionen som är associerad med photoconversion av tumörer, kvantifierade vi antalet CD45+ celler i oomvända tumörer och konverterade tumörer 24 h post photoconversion (figur 3E). Vi såg ingen signifikant skillnad i det totala antalet CD45+ celler upptäckts i tumörer 24 h efter den photoconversion jämfört med oomvända tumörer.

Vi kvantifieras nästa den leukocyt avstigning från tumör mikromiljö använder Kaede-Tg möss, vilket möjliggör förhör av människohandel beteende av båda typer av myeloiska och lymfoida celler. MC38 eller YUMM 1,7 tumörceller var intradermalt implanteras i Kaede-Tg möss. Tumörerna photoconverted när volymerna nått mellan 100-150 mm3 (5 min, 200 mW); brakial dLNs och inguinal icke-dränering LNs samlades 24 h efter photoconversion. Intratumoral leukocyt populationer kvantifierades från MC38 och YUMM 1,7 tumörer implanteras i kontroll C57Bl/6 möss och samlade när tumörer nått 100-150 mm3. Vi utvärderade leukocyt komplexiteten inom tumörer och egressed populationer av flödescytometri: T-celler (CD3ε+CD4+ /CD8+ /-), B-celler (CD3ε–CD19+), DCs (CD11c+MHCII+CD11b+/- ), neutrofiler (CD11b+MHCII–Ly6G+), makrofager (CD11b+MHCII+F4/80+), och inflammatorisk monocyter (CD11b+Ly6G–Ly6C+; Figur 4A). Använder detta samma Usenets system, utvärderat vi procenten av varje leukocyt befolkningen i dLNs som uttryckt Kaede röd vilket tidigare bosättning i tumör mikromiljö (figur 4B). Intressant, medan båda MC38 (figur 4 c) och YUMM 1,7 (figur 4 d) tumörer var främst infiltrerade med myeloida celler (monocyter, DCs och makrofager) var cirka 50% av de celler som hade egressed från båda tumortyper T lymfocyter (både CD4+ och CD8+). Förutom T-celler, vi också observerats DCs, B-celler, och monocyter inom egressed populationer från tumörer men makrofager och neutrofiler upptäcktes inte från antingen tumör typ. Sammantaget visar dessa data nyttan av Kaede-Tg photoconvertible möss för att spåra flera leukocyt härstamningar i en endogen miljö. Dessutom visar vår analys att avstigning är en selektiv, aktiv process som kan ha betydande konsekvenser för att bestämma intratumoral leukocyt komplexitet.

Figure 1
Figur 1: Photoconversion effektivitet och tillhörande inflammation i murina hud. Murina dermis var photoconverted för 3 min vid 100 mW (405 nm ljus). (A) representativa flöde tomter skildrar photoconverted (Kaede röd+) CD45+ celler från en oomvända och konverterade öra och cervikal dLN omedelbart följande photoconversion. Populationer var pre gated på live, CD45+ enstaka celler. (B) uppräkning av totala CD45+ celler i oomvända öron (-), öron samlas in omedelbart efter photoconversion, öron samlat 24 h efter photoconversion och öron samlat 24 h efter VacV infektion (n = 3). (C) A Miles analys utfördes för att kvantifiera vaskulär leakiness omedelbart efter exponeringen för 405 nm ljus (3 min, 100 mW). Representativ bild av läckage i örat hud (vänster) och kvantifiering av extraherade färgämne (höger) (n = 3). Felstaplar representera SEM. *p< 0,05 och **p< 0,01. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: DC avstigning från naiva, inflammerad och infekterad hud. (A) Gating systemet att identifiera flyttande DCs (mDCs; MHCIIHejCD11cint) och bosatt DCs (regionala distributionsföretag; MHCIIHejCD11cHej). (B) representativa flöde tomter som anger FITC+ eller Kaede röda+ DCs, pre gated på mDCs, från möss infekterade med VacV (dLN) eller kontralaterala icke-dränering LN kontroller. (C) kvantifiering av numrerar av Kaede röda+ och FITC+ mDCs och regionala distributionsföretag i dLNs steady-state, DBP-inflammerad (24 h efter ansökan) och VacV infekterad hud (48 h post infektion). Felstaplar representera SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Photoconversion effektivitet i tumör mikromiljö. Tumörerna photoconverted i 10 min på 200 mW (405 nm ljus). (A) representativa flöde tomter Kaede grön och Kaede röd i oomvända och konverterade MC38 tumörer och brachialis dLN omedelbart efter photoconversion. Populationer var pre gated på live, CD45+ singel-celler. (B) immunofluorescens microcopy av frysta, OCT-embedded YUMM 1,7 tumörer både oomvänd och photoconverted. Skalstapeln = 200 µm. (C) verkningsgraden av CD45+ leukocyter och (D) CD8+ lymfocyter i melanin-producerande (B16. F10) och unpigmented (MC38, YUMM 1.1, YUMM 1,7). Varje punkt representerar ett enda musklick. (E) uppräkning av totala CD45+ celler i oomvända tumörer och photoconverted tumörer samlat 24 h efter photoconversion (n = 3). Felstaplar representera SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: leukocyt avstigning från tumör mikromiljö är selektiv. (A) Gating system för att identifiera myeloisk och lymfatisk populationer i MC38 dLNs. (B) tomter representativa flöde identifierande Kaede röda+ celler bland myeloiska och lymfoida celler i MC38 dLNs 24 h efter photoconversion. Procenttalen i flödet tomter ange frekvensen av Kaede röda+ celler inom den angivna överordnade leukocyt befolkningen i LNs. (C, D) relativa andelar av intratumoral (% av CD45+ celler) och egressed (% Kaede röda+ celler; brakial dLNs) leukocyter från MC38 (C, n = 3) och YUMM 1,7 (D, n = 4) tumörer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Även om den leukocyt avstigning från perifera, icke-lymfoida vävnader är kritiska för initiering och upplösning av immunreaktioner, är de molekylära mekanismer som reglerar avstigning dåligt känd. Denna lucka i kunskap beror till stor del på tillgången av verktyg för kvantifiering i vivo. Här, beskriver vi användningen av photoconvertible möss (Kaede-Tg) för att kvantifiera endogena leukocyt avstigning från huden och tumörer och ge en direkt head-to-head jämförelse med FITC färg i inflammatoriska och infektion modeller. Vi visar att medan båda modellerna spåra endogena DC populationer, gratis dränering av FITC och dåligt upptag av icke-Fagocytos celler begränsar nyttan av FITC färg för bred analys av myeloiska och lymfoida avstigning från perifera, icke-lymfoida vävnader, inklusive tumörer. Dessutom presenterar vi de data som indikerar avstigning från tumörer är selektiv i stället för stokastiska vilket bekräftar resultaten presenteras av Torcellan et al. 39. vidare utredning av de mekanismer som styr leukocyt avstigning från tumörer kan avslöja nya insikt tumör-associerad inflammation och immunitet.

Vi utvärderade först effektiviteten i photoconversion i murina hud och dess effekt på lokal inflammation när med inställningar som rapporterats i litteraturen. Exponering för öron violett ljus för 3 min vid 100 mW power resulterade i effektiv photoconversion av CD45+ celler i örat huden (78%) utan konvertering i nedströms dLNs. Rapporter i litteraturen visar 3-5 minuters exponering är optimal för kutana vävnader5,33,38. Men denna exponering lett till ökade antalet CD45+ celler i det örat pinna 24 h efter konverteringen och vaskulär läckage indikerar att photoconversion på dessa inställningar i örat hud inducerar lokal inflammation, vilket bör beaktas vid tolkning av data. Vi försökte nästa direkt jämföra DC människohandel till LNs använder både Kaede photoconversion och den bredare utnyttjad FITC paint assay23,24 vid steady-state under DBP-inducerad inflammation och från VacV infekterade öron. Vi observerade förhöjda märkning i FITC behandlade jämfört med photoconverted hud vid steady state och följande DBP behandling. Applicering av gratis FITC på huden kan resultera i direkt dränering via lymfkärl till dränerande LNs där bosatta DC populationer, som inte migrera (t.ex., CD8α+ DCs), prova FITC. Konsekvent med detta, vi observerat betydande antal regionala distributionsföretag med FITC etikett när de behandlas med den irriterande DBP. Däremot Kaede röd-märkt DCs endast observerades i mDC befolkningen efter de photoconversion som anger att photoconversion ger en mer specifika sätt att etiketten mDCs. Även inom mDC befolkningen konstaterade vi dock kvantitativt mer märkt mDCs när du använder FITC över photoconversion. Medan detta kan också förklaras av gratis FITC dränering, är det möjligt att skillnaderna i perioden av märkning, där photoconversion kan endast märka DCs för närvarande bosatt i huden medan FITC förblir i huden under perioden 24 h , står för skillnaderna i observerade mDC avstigning. Intressant, i samband med virusinfektion mäts både photoconversion och FITC ansökan relativt lika nivåer av mDC avstigning och några FITC+ regionala distributionsföretag i de LNs tömning VacV-infekterade öron. Vi rapporterade nyligen att lymfdränage är betydligt reducerad följande VacV infektion, och således viral-inducerad minskning i lymfatiska transport kan förbättra specificiteten av FITC paint och minskat märkning av LN bofasta DC populationer31 . Allt detta arbete belyser också faktumen att inom mDC befolkningen (CD3ε–CD19–MHCIIHejCD11cint), antalet DCs som aktivt migrerats inom 24 h är en mindre befolkning och därmed totalt mDC siffror är inte ett bra surrogat för aktiv migrering41. Slutligen är det intressant att notera att vi konsekvent kvantifiera mDC avstigning på runt 200 celler för någon viss 24 h period följande VacV infektion41, medan 1500-2000 DCs avstigning från tumör mikromiljö. Ges VacV enorm effekt som ett vaccin-plattformen, särskilt när den tillämpas av harvning45,46,47, är det intressant att spekulera i att det är kvaliteten på DC och kanske typ av DC presentera antigen, snarare än kvantiteten, avgör som robust skyddande immunitet.

Leukocyt avstigning från tumör mikromiljö, bortom DCs25,48, är fortfarande ett dåligt undersökta område. Även tumörer anses kroniskt inflammerade mikromiljö, förblir huruvida liknande mekanismer reglera cellulär avstigning från icke-malign och malign vävnad okänd. Dessutom om leukocyt avstigning från tumörer är stokastiska har eller snarare selektiv betydande konsekvenser för tolkningen leukocyt ackumulering och retention i tumör mikromiljö. Som sådan, kan leukocyt avstigning från tumörer vara avgörande för att förstå hur tumörer undgå immun övervakning och leda till nya strategier för immunterapi. Här tillämpar vi photoconvertible Kaede-Tg modell för att studera leukocyt avstigning från implanterbara kutana tumörer, där FITC färg skulle vara otillräckliga för att i stort sett etikett både myeloisk och lymfatisk populationer. Inledande studier visade att photoconversion effektivitet i implanterade tumörer beroende både på tumörens storlek och melanin. Medan photoconversion effektiviteten sjunker snabbt när tumörer växer när melanin är närvarande (B16. F10), icke-pigmenterade tumör linjer såsom YUMM och MC38 tumörer uppvisar mer stabil verkningsgrad över tumör storlekar testade. Intressant, vi observerade förbättrad verkningsgrad i CD8+ T cell fack jämfört med CD45+ celler, som minskade på grund av tumörer ökat i storlek. Det finns sannolikt flera faktorer som bidrar till denna observation. Första påverkar platsen i en tumör exponeringen och därmed verkningsgraden speciella celltyper. T-celler påträffas ofta begränsad till hudtumör gränssnitt i implanterbara tumör modeller och därför kan vara mer lätt photoconverted i förhållande till myeloida celler infiltrera tumör parenkymet. För det andra, inte alla leukocyter uttrycker samma nivåer av de Kaede protein49 och således kan identifieras inte alla lika med flödescytometri; Detta kan leda till lägre observerade andelen photoconversion när du analyserar en mer heterogen cell befolkningen såsom alla CD45+ celler. Slutligen är det viktigt att notera att uppgifterna i figur 3 var genererade följande 10 min av violett ljus exponering. Denna inledande exponeringstid valdes baserat på rapporter i litteraturen med hänvisning till photoconversion tider för olika organ inklusive hud, LNs, slemhinnor vävnader och tumörer5,6,33,35 ,39,43. Den enda andra anställa systemets photoconvertible i tumörer, photoconversion utfördes för 20 min39. Ytterligare optimering i våra händer visade förbättrad effektivitet med en kortare exponeringstid på 5 min för både små och stora volymer. Det är troligt att långvarig exponering leder till fotoblekning Kaede fluorescensintensitet, och som sådan, vår rapporterade konvertering effektivitetsvinster kan vara underskattningar. Långvarig exponering kan också leda till ökad photoconversion-associerad inflammation och blanda ihop studieresultat. Tumörer photoconverted för 5 min visade ingen signifikant skillnad i antalet intratumoral CD45+ celler 24 h efter photoconversion jämfört med oomvända tumörer. Dessutom visade den tumörer photoconverted för 5 min mätbara och reproducerbara avstigning för både myeloisk och lymfatisk populationer. Följaktligen, enskilda optimering inom specifika vävnader eller tumörer av intresse är nödvändigt för att uppnå optimalt resultat.

Slutligen, vi brukade i situ photoconversion kvantifiera endogena leukocyt avstigning från tumörer implanteras i Kaede-Tg möss. Med hjälp av två olika implanterbara, icke-pigmenterade tumör modeller vi observerat betydande avstigning av DCs, T-celler och monocyter. Överensstämmer med nyligen publicerade arbete39, både CD4+ och CD8+ T celler egressed från tumör mikromiljö tillsammans med ett betydande antal dubbel negativ CD3ε+ T celler. Åtminstone kan en del av denna befolkning vara gamma delta T celler som tidigare beskrivits39, men den funktionella betydelsen av denna observation återstår för att pröva. Ännu viktigare, när vi jämförde proportionerna av leukocyter egressing från tumörer till de relativa proportionerna av leukocyter inom de tumör mikromiljö, observerade vi leukocyt anrikning i egressed populationer i förhållande till intratumoral pooler i båda modellerna som anger selektiv leukocyt avstigning. Bland annat makrofager och neutrofiler var frånvarande i egressed populationer, men båda celltyper har beskrivits till avstigning under inflammerad och infekterade villkor2,50,51,52 , 53 , 54 och är betydande bidragsgivare till intratumoral leukocyt repertoarer39,55,56. Således den leukocyt avstigning från tumörer kan kvantifieras med hjälp av photoconvertible modeller, inte är stokastiska men snarare en reglerad process, och förblir en viktig och understudied biologi med betydande konsekvenser för förståelse inflammatoriska och immun dynamiken i tumör mikromiljö vid steady state och som svar på behandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga konflikter att avslöja.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Dr Marcus Bosenberg för att tillhandahålla YUMM 1.1 och YUMM 1,7 murina melanom linjer och Dr Deborah J. Fowell för att tillhandahålla B6. CG-Tg(CAG-tdKaede) 15Utr möss i samförstånd med RIKEN BRC genom nationella Bio-resursen i MEXT, Japan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase D Roche 11088866001
DNase Roche 4536282001
Silver-LED-405B light source with optical fiber and collimtor Prizmatix Ltd V8144
Fluorescein isothiocyanate isomer I Sigma-Aldrich F4274
dibutyl phthalate Sigma-Aldrich 524980
acetone Macron Fine Chemicals 2440-02
29-guage syringes Exel International 26029
Evans Blue Sigma-Aldrich E2129
70 um cell strainers VWR 732-2758
paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
HBSS Caisson HBL06
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit Invitrogen L34966
Purified Anti-mouse CD16/CD32 Tonbo Biosciences 70-0161-M001
BV605 CD11c (clone N418) Biolegend 117334
PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2) BD Pharmingen 562363
BV421 CD3e (clone 145-2C11) Biolegend 100341
APC CD8a (clone 53-6.7) TonBo Biosciences 20-0081-u100
APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11) Biolegend 103116
BV650 CD19 (clone 6D5) Biolegend 115541
PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4) Biolegend 128011
Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8) Biolegend 123121
APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8) Biolegend 127623
BV711 CD11b (clone M1/70) Biolegend 101241
BV605 CD45 (clone 30-F11) Biolegend 103155
BV711 CD4 (clone RM4-5) BD Biosciences 563726
Bovine serum albumin (Fraction V) Fisher Scientific BP1600-100
Anit-Rat and Anti-Hamster Igk / Negative Control Compensation Particle Set BD Biosciences 552845
Fortessa Flow Cytometer BD Biosciences
FlowJo v10 Software FlowJo

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
  2. Hampton, H. R., Bailey, J., Tomura, M., Brink, R., Chtanova, T. Microbe-dependent lymphatic migration of neutrophils modulates lymphocyte proliferation in lymph nodes. Nature Communications. 6, 7139 (2015).
  3. D'Alessio, S., et al. VEGF-C-dependent stimulation of lymphatic function ameliorates experimental inflammatory bowel disease. Journal of Clinical Investigation. 124 (9), 3863-3878 (2014).
  4. Debes, G. F., et al. Chemokine receptor CCR7 required for T lymphocyte exit from peripheral tissues. Nature Immunology. 6 (9), 889-894 (2005).
  5. Bromley, S. K., Yan, S., Tomura, M., Kanagawa, O., Luster, A. D. Recirculating memory T cells are a unique subset of CD4+ T cells with a distinct phenotype and migratory pattern. Journal of Immunology. 190 (3), 970-976 (2013).
  6. Tomura, M., et al. Activated regulatory T cells are the major T cell type emigrating from the skin during a cutaneous immune response in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (3), 883-893 (2010).
  7. Tomura, M., Itoh, K., Kanagawa, O. Naive CD4+ T lymphocytes circulate through lymphoid organs to interact with endogenous antigens and upregulate their function. Journal of Immunology. 184 (9), 4646-4653 (2010).
  8. Jennrich, S., Lee, M. H., Lynn, R. C., Dewberry, K., Debes, G. F. Tissue exit: a novel control point in the accumulation of antigen-specific CD8 T cells in the influenza a virus-infected lung. Journal of Virology. 86 (7), 3436-3445 (2012).
  9. Geherin, S. A., Wilson, R. P., Jennrich, S., Debes, G. F. CXCR4 is dispensable for T cell egress from chronically inflamed skin via the afferent lymph. PLoS One. 9 (4), e95626 (2014).
  10. Brown, M. N., et al. Chemoattractant receptors and lymphocyte egress from extralymphoid tissue: changing requirements during the course of inflammation. Journal of Immunology. 185 (8), 4873-4882 (2010).
  11. Bromley, S. K., Thomas, S. Y., Luster, A. D. Chemokine receptor CCR7 guides T cell exit from peripheral tissues and entry into afferent lymphatics. Nature Immunology. 6 (9), 895-901 (2005).
  12. Gomez, D., Diehl, M. C., Crosby, E. J., Weinkopff, T., Debes, G. F. Effector T Cell Egress via Afferent Lymph Modulates Local Tissue Inflammation. Journal of Immunology. 195 (8), 3531-3536 (2015).
  13. Ohl, L., et al. CCR7 governs skin dendritic cell migration under inflammatory and steady-state conditions. Immunity. 21 (2), 279-288 (2004).
  14. Kabashima, K., et al. CXCL12-CXCR4 engagement is required for migration of cutaneous dendritic cells. American Journal of Pathology. 171 (4), 1249-1257 (2007).
  15. Cyster, J. G., Schwab, S. R. Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs. Annual Review of Immunology. 30, 69-94 (2012).
  16. Matloubian, M., et al. Lymphocyte egress from thymus and peripheral lymphoid organs is dependent on S1P receptor 1. Nature. 427 (6972), 355-360 (2004).
  17. Teijeira, A., Rouzaut, A., Melero, I. Initial afferent lymphatic vessels controlling outbound leukocyte traffic from skin to lymph nodes. Frontiers in Immunology. 4, 433 (2013).
  18. Hunter, M. C., Teijeira, A., Halin, C. T Cell Trafficking through Lymphatic Vessels. Frontiers in Immunology. 7, 613 (2016).
  19. Bujdoso, R., Hopkins, J., Dutia, B. M., Young, P., McConnell, I. Characterization of sheep afferent lymph dendritic cells and their role in antigen carriage. Journal of Experimental Medicine. 170 (4), 1285-1301 (1989).
  20. Young, A. J. The physiology of lymphocyte migration through the single lymph node in vivo. Seminars in Immunology. 11 (2), 73-83 (1999).
  21. Seabrook, T., et al. The traffic of resting lymphocytes through delayed hypersensitivity and chronic inflammatory lesions: a dynamic equilibrium. Seminars in Immunology. 11 (2), 115-123 (1999).
  22. Swartz, M. A., et al. Mechanics of interstitial-lymphatic fluid transport: theoretical foundation and experimental validation. Journal of Biomechanics. 32 (12), 1297-1307 (1999).
  23. Macatonia, S. E., Knight, S. C., Edwards, A. J., Griffiths, S., Fryer, P. Localization of antigen on lymph node dendritic cells after exposure to the contact sensitizer fluorescein isothiocyanate. Functional and morphological studies. Journal of Experimental Medicine. 166 (6), 1654-1667 (1987).
  24. Robbiani, D. F., et al. The leukotriene C(4) transporter MRP1 regulates CCL19 (MIP-3beta, ELC)-dependent mobilization of dendritic cells to lymph nodes. Cell. 103 (4), 757-768 (2000).
  25. Roberts, E. W., et al. Critical Role for CD103(+)/CD141(+) Dendritic Cells Bearing CCR7 for Tumor Antigen Trafficking and Priming of T Cell Immunity in Melanoma. Cancer Cell. 30 (2), 324-336 (2016).
  26. Forster, R., et al. CCR7 coordinates the primary immune response by establishing functional microenvironments in secondary lymphoid organs. Cell. 99 (1), 23-33 (1999).
  27. Johnson, L. A., Jackson, D. G. The chemokine CX3CL1 promotes trafficking of dendritic cells through inflamed lymphatics. Journal of Cell Science. 126, 5259-5270 (2013).
  28. Teijeira, A., et al. T Cell Migration from Inflamed Skin to Draining Lymph Nodes Requires Intralymphatic Crawling Supported by ICAM-1/LFA-1 Interactions. Cell Reports. 18 (4), 857-865 (2017).
  29. Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PLoS One. 8 (2), e57135 (2013).
  30. Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin alphaV. Nature Immunology. 14 (9), 949-958 (2013).
  31. Russo, E., et al. Intralymphatic CCL21 Promotes Tissue Egress of Dendritic Cells through Afferent Lymphatic Vessels. Cell Reports. 14 (7), 1723-1734 (2016).
  32. Steven, P., Bock, F., Huttmann, G., Cursiefen, C. Intravital two-photon microscopy of immune cell dynamics in corneal lymphatic vessels. PLoS One. 6 (10), e26253 (2011).
  33. Tomura, M., et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 105 (31), 10871-10876 (2008).
  34. Shand, F. H., et al. Tracking of intertissue migration reveals the origins of tumor-infiltrating monocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (21), 7771-7776 (2014).
  35. Tomura, M., et al. Tracking and quantification of dendritic cell migration and antigen trafficking between the skin and lymph nodes. Scientific Reports. 4, 6030 (2014).
  36. Moran, A. E., et al. T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse. Journal of Experimental Medicine. 208 (6), 1279-1289 (2011).
  37. Schmidt, T. H., Bannard, O., Gray, E. E., Cyster, J. G. CXCR4 promotes B cell egress from Peyer's patches. Journal of Experimental Medicine. 210 (6), 1099-1107 (2013).
  38. Beura, L. K., et al. T Cells in Nonlymphoid Tissues Give Rise to Lymph-Node-Resident Memory T Cells. Immunity. 48 (2), 327-338 (2018).
  39. Torcellan, T., et al. In vivo photolabeling of tumor-infiltrating cells reveals highly regulated egress of T-cell subsets from tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114 (22), 5677-5682 (2017).
  40. Khan, T. N., Mooster, J. L., Kilgore, A. M., Osborn, J. F., Nolz, J. C. Local antigen in nonlymphoid tissue promotes resident memory CD8+ T cell formation during viral infection. Journal of Experimental Medicine. 213 (6), 951-966 (2016).
  41. Loo, C. P., et al. Lymphatic Vessels Balance Viral Dissemination and Immune Activation following Cutaneous Viral Infection. Cell Reports. 20 (13), 3176-3187 (2017).
  42. Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. (73), e50062 (2013).
  43. Morton, A. M., et al. Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (18), 6696-6701 (2014).
  44. Meeth, K., Wang, J. X., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations. Pigment Cell Melanoma Research. 29 (5), 590-597 (2016).
  45. Demkowicz, W. E., Littaua, R. A., Wang, J., Ennis, F. A. Human cytotoxic T-cell memory: long-lived responses to vaccinia virus. Journal of Virology. 70 (4), 2627-2631 (1996).
  46. Stewart, A. J., Devlin, P. M. The history of the smallpox vaccine. Journal of Infection. 52 (5), 329-334 (2006).
  47. Hammarlund, E., et al. Duration of antiviral immunity after smallpox vaccination. Nature Medicine. 9 (9), 1131-1137 (2003).
  48. Lund, A. W., et al. Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).
  49. Tomura, M., Kabashima, K. Analysis of cell movement between skin and other anatomical sites in vivo using photoconvertible fluorescent protein "Kaede"-transgenic mice. Methods in Molecular Biology. , 279-286 (2013).
  50. Bellingan, G. J., Caldwell, H., Howie, S. E., Dransfield, I., Haslett, C. In vivo fate of the inflammatory macrophage during the resolution of inflammation: inflammatory macrophages do not die locally, but emigrate to the draining lymph nodes. Journal of Immunology. 157 (6), 2577-2585 (1996).
  51. Gautier, E. L., Ivanov, S., Lesnik, P., Randolph, G. J. Local apoptosis mediates clearance of macrophages from resolving inflammation in mice. Blood. 122 (15), 2714-2722 (2013).
  52. Abadie, V., et al. Neutrophils rapidly migrate via lymphatics after Mycobacterium bovis BCG intradermal vaccination and shuttle live bacilli to the draining lymph nodes. Blood. 106 (5), 1843-1850 (2005).
  53. Beauvillain, C., et al. CCR7 is involved in the migration of neutrophils to lymph nodes. Blood. 117 (4), 1196-1204 (2011).
  54. Rigby, D. A., Ferguson, D. J., Johnson, L. A., Jackson, D. G. Neutrophils rapidly transit inflamed lymphatic vessel endothelium via integrin-dependent proteolysis and lipoxin-induced junctional retraction. Journal of Leukocyte Biology. 98 (6), 897-912 (2015).
  55. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
  56. Binnewies, M., et al. Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy. Nature Medicine. 24 (5), 541-550 (2018).

Tags

Biologi fråga 143 lymfkärl avstigning människohandel Kaede FITC färg leukocyter melanom
Kvantifiera leukocyt avstigning via lymfkärl från murina hud och tumörer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Steele, M. M., Churchill, M. J.,… More

Steele, M. M., Churchill, M. J., Breazeale, A. P., Lane, R. S., Nelson, N. A., Lund, A. W. Quantifying Leukocyte Egress via Lymphatic Vessels from Murine Skin and Tumors. J. Vis. Exp. (143), e58704, doi:10.3791/58704 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter