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Behavior

Supramaximal intensidad ejercicio hipóxico y evaluación de la función Vascular en ratones

Published: March 15, 2019 doi: 10.3791/58708
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1, 3, 1, 2
1Division of Angiology, Heart and Vessel Department, Lausanne University Hospital (CHUV), 2Institute of Sport Sciences, Faculty of Biology and Medicine, University of Lausanne, 3Neonatal Research Laboratory, Clinic of Neonatology, Department Woman-Mother-Child, Lausanne University Hospital

Summary

Entrenamiento de alta intensidad de la hipoxia es un protocolo que se ha demostrado para inducir adaptaciones vasculares potencialmente beneficiosas en algunos pacientes y mejorar a los atletas repiten capacidad de sprint. Aquí, nosotros probar la viabilidad de ratones de formación con que protocolo e identificar las adaptaciones vasculares con ex vivo evaluación de la función vascular.

Abstract

Entrenamiento es una estrategia importante para mantener la salud y la prevención de muchas enfermedades crónicas. Es la primera línea de tratamiento recomendado por las normas internacionales para pacientes que sufren de enfermedades cardiovasculares, más específicamente, disminuir enfermedades de las arterias de la extremidad, donde la capacidad de caminar del paciente se altera considerablemente, afectando a su calidad de vida.

Tradicionalmente, se han utilizado bajo continuo ejercicio y entrenamiento a intervalos. Recientemente, supramaximal formación también ha demostrado para mejorar los resultados de los atletas mediante adaptaciones vasculares, entre otros mecanismos. La combinación de este tipo de entrenamiento con hipoxia podría traer un efecto sinérgico o adicional, que puede ser de interés para determinadas patologías. Aquí, describimos cómo realizar las sesiones de entrenamiento de intensidad supramaximal en hipoxia en ratones sanos al 150% de su máxima velocidad, utilizando una caminadora motorizada y un cuadro de hipoxia. También mostramos cómo diseccionar el ratón con el fin de recuperar los órganos de interés, especialmente la arteria pulmonar, la aorta abdominal y la arteria ilíaca. Por último, os mostramos cómo realizar ex vivo evaluación de la función vascular en los vasos obtenidos, mediante estudios de tensión isométrica.

Introduction

En la hipoxia, la disminuida fracción inspirada de oxígeno (O2) conduce a hipoxemia (presión arterial baja en hipoxia) y una alteración O2 transporte capacidad1. Hipoxia aguda induce una actividad mayor vasoconstrictor simpático dirigida hacia el músculo esquelético2 y una vasodilatación 'compensatoria' opuesta.

A intensidad submáxima en hipoxia, esta vasodilatación 'compensatoria', en relación con el mismo nivel de ejercicio bajo condiciones normoxic, está bien establecido3. Esta vasodilatación es esencial para asegurar un flujo de sangre aumentada y mantenimiento (o limitar la alteración) de la entrega de oxígeno a los músculos activos. Adenosina fue demostrada para no tener un papel independiente en esta respuesta, mientras que el óxido nítrico (NO) parece la fuente endotelial primaria ya importante embotamiento de la vasodilatación aumentada fue reportado con inhibición de la óxido nítrico sintasa (NOS) durante la hipoxia ejercicio4. Varias otras sustancias vasoactivas son probablemente un papel en la vasodilatación compensatoria durante un ejercicio hipóxico.

Esta hiperemia mayor ejercicio hipóxico es proporcional a la caída inducida por la hipoxia arterial contenido de O2 y es más grande a medida que aumenta la intensidad de ejercicio, por ejemplo durante el ejercicio intenso incremental en hipoxia.

El componente NO-mediada de la vasodilatación compensatoria se regula a través de diferentes vías con mayor intensidad al ejercicio3: si β-adrenérgicos del receptor no estimularon ningún componente aparece primordial durante el ejercicio hipóxico de baja intensidad , la fuente de NO contribuir a la dilatación compensatoria parece menos dependiente de los mecanismos adrenérgicos como la intensidad del ejercicio aumenta. Hay otros candidatos para no estimular ningún lanzamiento durante el ejercicio hipóxico de mayor intensidad, como el ATP liberado de eritrocitos o endoteliales derivados de prostaglandinas.

Supramaximal ejercicio en hipoxia (llamada entrenamiento de sprint repetido en hipoxia [RSH] en la literatura de fisiología del ejercicio) es una reciente formación método5 proporcionando mejora de rendimiento en los jugadores del deporte de equipo o de raqueta. Este método diferencia de intervalo de entrenamiento en hipoxia en o cerca de velocidad máxima6 (Vmax) puesto que RSH realizadas en máxima intensidad conduce a una mayor perfusión muscular y oxigenación7 y muscular específica transcripcional respuestas8. Se han propuesto varios mecanismos para explicar la efectividad de los RSH: durante sprints en la hipoxia, la vasodilatación compensatoria y asociados mayor flujo de sangre se beneficiarían las fibras de contracción rápida, más que las fibras de contracción lenta. En consecuencia, eficacia RSH es probable que sea fibra de tipo selectivo y dependiente de la intensidad. Especulamos que la capacidad de respuesta mejorada del sistema vascular es primordial en RSH.

Entrenamiento ha sido extensamente estudiada en ratones, tanto en individuos sanos como en modelos de ratón patológica9,10. La forma más común de formar ratones es usar una caminadora roedor, y el régimen tradicionalmente usado es entrenamiento de baja intensidad, en el 40% – 60% de Vmáximo (determinado mediante una cinta incremental prueba11), de 30 – 60 min12,13 ,14,15. Entrenamiento de intervalo de intensidad máxima y su impacto en patologías han sido ampliamente estudiados en ratones16,17; así, se han desarrollado protocolos de funcionamiento para ratones de entrenamiento interválico. Los protocolos consisten en generalmente cerca de 10 peleas de correr en el 80% – 100% de Vmax en una cinta de correr motorizada roedor, por 1-4 min, entremezclado con descanso activo o pasivo16,18.

El interés en ratones ejercicio a intensidad supramaximal (es decir, por encima de la Vmax) en la hipoxia viene de los resultados anteriores que las compensaciones vasodilatadores microvasculares y la performance de ejercicio intermitente son más creciente en supramaximal de intensidades máxima o moderada. Sin embargo, a nuestro conocimiento, no hay ningún informe previo de un protocolo de entrenamiento supramaximal en ratones, ya sea en normoxia o hipoxia.

El primer objetivo del presente estudio fue probar la factibilidad de entrenamiento de intensidad supramaximal en ratones y la determinación de un protocolo adecuado y tolerable (intensidad, duración del sprint, recuperación, etcetera). El segundo objetivo fue evaluar los efectos del régimen de entrenamiento en normoxia e hipoxia en la función vascular. Por lo tanto, probamos las hipótesis que (1) ratones toleran bien supramaximal ejercicio en hipoxia, y (2) que este protocolo induce una mejoría más importante en la función vascular que ejercicio de normoxia, sino que el ejercicio en hipoxia a intensidades más bajas.

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Protocol

Comité de cuidado de los animales del estado local (servicio de la Consommation et des Affaires Vétérinaires [SCAV], Lausanne, Suiza) aprobó todos los experimentos (autorización VD3224; 01.06.2017) y todos los experimentos se llevaron a cabo con arreglo a la pertinente normas y directrices.

1. animal vivienda y preparación

  1. Casa de 6 a 8 ratones machos de C57BL/6J de semana en las instalaciones animales durante al menos 1 semana antes del comienzo de los experimentos en orden para los ratones para que se acostumbre a sus nuevas condiciones de la vivienda. Por razones prácticas, ratones del mismo grupo experimental se encuentran generalmente juntos.
  2. Mantener los ratones en una sala de temperatura controlada (22 ± 1 ° C) con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h con acceso ad libitum al alimento y al agua.

2. determinación de la velocidad máxima y la evaluación estándar de mejora del rendimiento por ergometría Incremental

Nota: Los siguientes pasos son fundamentales para completar los protocolos de entrenamiento.

  1. Utilice una cinta de correr motorizada para ratones donde los ratones pueden ser en múltiples carriles uno junto al otro, con una inclinación de 0° y montaron con una red eléctrica a 0.2 mA en la parte posterior del carril, con el fin de alentar a los ratones a correr.
  2. Antes de la primera prueba, presentar los ratones y 4 días de aclimatación a la cinta, según el siguiente protocolo.
    1. El día 1, tienen ratones corren 4,8 m/min durante 10 minutos.
    2. En el día 2, tienen los ratones corren 6 m/min durante 10 minutos.
    3. El día 3, tienen los ratones corren 7,2 m/min durante 10 minutos.
    4. El día 4, tienen los ratones corren 8,4 m/min durante 10 minutos.
  3. El día 5, presentar los ratones una prueba incremental hasta la extenuación, según el siguiente protocolo.
    1. Que los ratones calientes durante 5 min a 4,8 m/min (con una inclinación de 0 °).
    2. Aumentar la velocidad de 1.2 m/min cada 3 minutos (por ejemplo, 5 min a 4,8 m/min, luego de 3 min a 6 m/min, de 3 min a 7,2 m/min, de 3 min a 8,4 m/min, etc.) hasta el agotamiento, que se alcanza cuando el ratón o bien pasa 3 segundos consecutivos en la red eléctrica o recibe 100 descargas (aparece por el aparato).
    3. Escribir la velocidad alcanzada (considerada como elmáximoV), duración, distancia, número de choques, y el tiempo total de la red.
      Nota: Por lo general, Vmax fue 28,8 ± 3,7 m/min.
    4. Entrenamiento medio, vuelva a enviar los ratones a esta prueba con el fin de reajustar la velocidad de la formación para la actualización Vmax de los ratones (por ejemplo, si el protocolo de entrenamiento dura 8 semanas, y luego realizar una prueba incremental de formación media en 4 semanas. En este caso, sustituir a uno de los cursos de capacitación programados por la prueba) y hacer tan otra vez al final del estudio para evaluar mejoras en el rendimiento.
    5. Implementar un período de descanso de 48 h antes y después de esta prueba.
      Nota: Se realizaron todas las pruebas incrementales en la mañana.

3. hipoxia medio ambiente

  1. Para las sesiones de entrenamiento en hipoxia, coloque la cinta en el cuadro de hipoxia (figura 1) ligada a un mezclador de gas. Utilizar un oxímetro calibrado para controlar regularmente la fracción ambiental de oxígeno (FO2 [es decir, el nivel de hipoxia]) en el cuadro.
  2. Configurar el mezclador de gas en el 100% de nitrógeno (N2) y usar el oxímetro para verificar el nivel de hipoxia. Una vez FO2 = 0,13, cambiar el parámetro de la mezcla de gas de 100% N2 a 13% O2.
  3. Para evitar la exposición pasiva prolongada a la hipoxia, los ratones en una jaula más pequeña temporal con basura y enriquecimiento y rápidamente en el cuadro una vez FO2 = 0.13 ha sido alcanzado. Verificar que el ambiente es todavía en 13% O2 después de poner la jaula Si no es así, vuelva a ajustarlo.
  4. Verificar regularmente el nivel de O2 en el transcurso de una sesión de entrenamiento para asegurarse de que permanece en FiO2 = 0,13 ± 0.002.

4. Normoxic entorno

  1. Para las sesiones de entrenamiento en normoxia, mantener la cinta en el cuadro hipóxico, pero quitar los guantes para que haya aire ambiente (FO2 = 0.21). El objetivo es recrear el mismo ambiente de formación como los ratones en hipoxia.

5. entrenamiento de intensidad Supramaximal

  1. Coloque el ratón en carriles individuales en la caminadora (en una inclinación de 0°) y enviar al siguiente protocolo.
    1. Tienen los ratones calientes durante 5 min a 4,8 m/min, seguido de 5 min a 9 m/min.
    2. Ajustar la velocidad de los sprints al 150% de los previamente Vmax.
      Nota: Por lo general, la velocidad de sprint fue 42,1 ± 5,5 m/min.
    3. Tren los ratones para cuatro juegos de carreras de 5 x 10 s 20 s de descanso entre cada sprint. El resto interset está a 5 minutos (figura 2).
      Nota: Añadir un período de enfriamiento si la carga total de trabajo de la sesión de entrenamiento tiene que coincidir con la de otro grupo de entrenamiento.
  2. Realizar esto 3 veces por semana, preferentemente 48 h entre sesiones de entrenamiento de formación.
  3. Usar hisopos de algodón como un método complementario a descargas eléctricas a los ratones a correr. Colocar un hisopo de algodón en una hendidura en la parte superior del carril, entre el ratón y la red eléctrica y empujar suavemente el ratón cuando se alcanza la parte posterior de la caminadora. Esto evitar la prestación de los electroshocks y estimular los ratones a correr de una manera más suave.

6. entrenamiento de baja intensidad de

  1. Coloque el ratón en carriles individuales en la caminadora (en una inclinación de 0°) y enviar al siguiente protocolo.
    1. Tienen los ratones calientes durante 5 min a 4,8 m/min, seguido de 5 min a 7,2 m/min.
    2. Ajustar la velocidad de la sesión corriente continua hasta el 40% de los previamente Vmax.
      Nota: Por lo general, la velocidad de corriente continua fue 9,9 m/min.
    3. Tren de los ratones durante 40 minutos.
    4. Realizar esto 3 veces por semana preferentemente 48 h entre sesiones de entrenamiento de formación.
    5. Usar hisopos de algodón como un método complementario a descargas eléctricas a los ratones a correr.

7. ratones eutanasia y extracción de órganos

  1. Al final del Protocolo de entrenamiento y por lo menos 24 h después de la última prueba incremental, anestesiar el ratón en una cámara de inducción con isoflurano (4% – 5% de O2 para inducir la anestesia y 1% – 2% de 100% O2 para mantener la anestesia). Confirmar la correcta anestesia utilizando el reflejo de retracción de la pata (pellizcar firmemente la pata del animal; anestesia se considera adecuada cuando el animal no reacciona al estímulo).
  2. El uso de una aguja de 25 G, realizar una punción cardiaca percutánea, para recoger el volumen máximo de sangre como se describió anteriormente19.
  3. Realizar una dislocación cervical y retire la piel del ratón el corte a través de la primera capa de la piel en el abdomen con unas tijeras de punta redonda y tirando de los dos lados de la incisión (hacia la cabeza y la cola).
  4. Corte a través del peritoneo debajo de la caja torácica en el lado izquierdo del ratón con tijeras de punta de punto fino para alcanzar el bazo y extraer si es necesario.
    Nota: Diseccionar a los músculos si es necesario.
  5. Diseccionar a la arteria pulmonar.
    1. Utilizar pequeñas tijeras y pinzas, quite la caja torácica y despeje el área de corazón y pulmón.
    2. Con "cierre automático" pinzas, pellizcar el corazón lo más cerca posible de la apex y tire suavemente para estirar la base del arco aórtico y la arteria pulmonar.
    3. Con la mano derecha, insertar pinzas curvas debajo de la arteria pulmonar y la aorta y luego mover las pinzas hacia atrás un poco para sostener sólo la arteria pulmonar (figura 3).
    4. Utilizar la mano izquierda para insertar otro par de pinzas para reemplazar el lugar con la mano derecha.
    5. Con microscissors recta afilada en la mano derecha, disecar la arteria pulmonar como cerca del corazón posible, por un lado y lo más lejos posible en el otro lado.
      Nota: No importa que mano sostiene que instrumento, aunque hemos encontrado más fácil de cortar con la mano derecha que con la izquierda.
    6. Poner en un tubo de 2 mL con frío con tampón fosfato salino (PBS) almacenador intermediario y mantener en hielo.
  6. Realizar una perfusión de cuerpo entero.
    1. En la parte superior de la extremidad inferior derecha del ratón, utilice unas pinzas para limpiar la arteria ilíaca derecha externa interna hasta la arteria femoral derecha (bajo el ligamento inguinal). Con microscissors recto agudo, hacer un corte completo en la arteria femoral.
    2. Inserte una jeringa de 25 G de 5 mL con PBS frío en el ventrículo izquierdo del corazón e inyecte suavemente el PBS frío para quitar la sangre restante de los vasos.
      Nota: Debido a la extracción de la arteria pulmonar, es posible que el PBS no circula hasta la incisión.
  7. Con unas pinzas, quitar el tejido blando que rodea la aorta de los ligamentos inguinales derecha e izquierdas al corazón lo mejor posible.
    Nota: El corazón puede ser extraído para su posterior análisis, si es necesario.
  8. Utilizando pinzas y microscissors, diseccionar el corazón hasta el punto más bajo de la arteria ilíaca externa (en miembros izquierdos y derechos) y la sección completamente disecado-out en un plato de 10 cm de diámetro con PBS frío.
  9. Usar pinzas o microscissors, terminen la limpieza de la grasa restante alrededor de la aorta y las arterias suavemente tirando o corte de los vasos.
  10. Con microscissors, cortar la arteria ilíaca izquierda en la bifurcación de la arteria ilíaca izquierda y almacenarlo para su posterior análisis.
  11. Con microscissors, cortar la aorta abdominal debajo de la arteria renal izquierda y coloque el recipiente extraído en buffer de PBS frío en hielo (figura 4).
  12. Mantener el recipiente limpio restante, desde el arco aórtico a derecha por encima de la arteria renal izquierda, en el almacenamiento para su posterior análisis.

Figure 4
Figura 4 : Imagen de los vasos disecados. Recipiente extraído de la parte superior de la aorta abdominal (debajo de la arteria renal izquierda) hasta el final de la arteria ilíaca derecha, listo para ser colocados en buffer de PBS frío en hielo. (1) Abdominal aorta. (2) derecha arteria ilíaca común. (3) externa de la arteria ilíaca. (4) interna de la arteria ilíaca. (5) la arteria Femoral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

8. ex Vivo evaluación de la función Vascular

Nota: Un lavado corresponde el vaciado y llenado de las cámaras con Krebs.

  1. Según un protocolo previamente descritos20, cortar la aislada de la arteria pulmonar, aorta abdominal y segmentos de arteria ilíaca derecha en anillos vasculares de 1.0 – 2.0 mm de largo y montar cada anillo en estribos de dos 0.1 mm de diámetro pasados a través del lumen.
  2. Suspender los anillos de vaso en cámaras verticales órgano llenados con 10 mL de solución de bicarbonato de modificado Krebs-Ringer (118,3 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 2, 5 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH2PO4, 25,0 mM NaHCO3y 11,1 mM glucosa) mantenidos a 37 ° C y aireado con un 95% O2-5% CO2 (pH 7.4). Un estribo está anclada a la parte inferior de la cámara de órgano y el otro está conectado a un medidor de tensión para la medición de la fuerza isométrica en gramos.
  3. Traer los vasos a su tensión descanso óptimo: estirar los anillos y 0,5 g de la arteria pulmonar, 1,5 g de la arteria ilíaca, 2 g para la aorta abdominal y lavar después de un período de 20 minutos de conseguir el equilibrio. Repita el estiramiento-equilibrar-lavado los pasos 1 x.
  4. Para probar la viabilidad de los vasos, contrato los anillos con 235 μl de KCl (10-1 M) durante 10 minutos, lávelas durante otros 10 minutos y contrato otra vez con 235 μl de KCl (10-1 M) por unos 20 min hasta alcanzar una meseta.
  5. Lavar los vasos otra vez por 10 min y agregar 58,4 μL de indometacina (10-5 M) (un inhibidor de la ciclooxigenasa actividad) por al menos 20 min para evitar la posible interferencia de los prostanoides endógenos.
  6. Añadir dosis acumulativas de la fenilefrina (Phe) de 10-9 (10 μl) a 10-4 M (o 10-9 a 10-5 M para la arteria pulmonar; 9 μL para todas las concentraciones por encima de 10-9 M) a contraer los vasos.
  7. Después de la última dosis de Phe, espere alrededor de 1 h hasta que los recipientes alcancen un estado de contracción relativamente estable (meseta).
  8. Añadir dosis acumulativas de la acetilcolina (ACh), del vasodilatador dependiente del endotelio de 10-9 a 10-4 M (58,4 μL de 10-9 M y alternativamente 12,6 μl y 40 μL para todas las concentraciones por encima de 10-9 M), para inducir el nítrico óxido (NO)-mediada por relajación.
  9. Al final de la curva de relajación, lavar los vasos durante 10 min y añadir 58,4 μL de indometacina (10-5 M), así como 184 μl de NG-nitro-L-arginina (NLA, 10-4 M), que es un inhibidor de la CNC, para por lo menos 20 minutos.
  10. Se contraen los vasos otra vez con una dosis única de 10 μl de Phe (10-5 y 10-4 M para la arteria pulmonar y 10-4 M para la aorta abdominal y la arteria ilíaca) por 1 h, para inducir una contracción relativamente estable.
  11. Añadir una dosis única de 40 μl de ACh (10-4 M) hasta llegar a una meseta.
  12. Lavar los vasos nuevamente por 10 minutos, antes de añadir 58,4 μL de indometacina (10-5 M) y 184 μl de NLA (10-4 M) por 20 min.
  13. Contrato de los buques con 10 μl de Phe (10-5 y 10-4 M) para 1 h.
  14. Añadir dosis acumulativas (10-9 [58,4 μL] a 10-4 M [40 μL para todas las concentraciones por encima de 10-9 M]) de lo NO donantes Dietilamina (DEA) / NO, en orden a evaluar la relajación inducida por el NO independiente del endotelio.
  15. Al final del experimento, almacenar los recipientes en nitrógeno líquido para futuros análisis si es necesario.

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Representative Results

A nuestro conocimiento, el presente estudio es el primero en describir un programa de entrenamiento de intensidad supramaximal en normoxia y en hipoxia para los ratones. En este protocolo, ratones funcionaron cuatro series de sprints de 5 10 s con una recuperación de s 20 entre cada sprint. Los conjuntos se intercalaron con 5 min de períodos de recuperación. Es desconocido si los ratones serían capaces de sostener dicho protocolo y completar correctamente. Sin embargo, según la figura 5, la ganancia de peso corporal de los ratones sometidos a la formación de intensidad supramaximal fue similar a la de los ratones sometidos al entrenamiento de baja intensidad tanto en la hipoxia en normoxia.

El bienestar de los animales fue supervisado dos veces por semana, utilizando hojas de puntuación, basadas en los siguientes criterios: aspecto, comportamiento natural y peso corporal. Cada uno de esos criterios fue gradual hasta una puntuación de 3, y un ratón con una puntuación de 3 en cualquiera de estos criterios era considerado en dolor y angustia por el protocolo de sostenido y tuvieron que ser sacrificados. Ningún ratón nunca alcanzó una puntuación de 3 en el transcurso de cualquiera de los regímenes de entrenamiento (tabla 1).

Tal como se presenta en la introducción, se ha presumido que supramaximal de formación, en particular cuando se combina con hipoxia, induciría una vasodilatación compensatoria. Este fenómeno tiene como objetivo proporcionar suficiente O2 a los músculos contratantes, compensando así el desequilibrio entre O2 marketingConjunto que es realzada por la combinación de entrenamiento de intensidad supramaximal e hipoxia. Para investigar esta hipótesis, se utilizó la segunda técnica presentada aquí, el ex vivo la evaluación de la función vascular, en la arteria pulmonar, la aorta abdominal y la arteria ilíaca derecha. La figura 6 muestra las curvas dosis-respuesta obtenidas al final del Protocolo, en la aorta abdominal de un ratón de la formación del grupo en intensidad supramaximal en hipoxia. Este gráfico muestra todo el proceso de contracción-relajación observado después de la adición de los diferentes agentes farmacológicos (KCL, Phe, ACh, NLA y [DEA] smoking) en los baños de órgano.

La figura 7 muestra la curva dosis-respuesta relajación de la arteria ilíaca derecha al aumentar las concentraciones de ACh. Los dos colectivos representados son el grupo de intensidad supramaximal en normoxia (SupraN) y el grupo de intensidad supramaximal en hipoxia (SupraH). Los resultados preliminares muestran que SupraH tendían a mejorar la relajación inducida por ACh en comparación con SupraN, con diferencias significativas en el 10-5 M y 10-4 M.

Figure 1
Figura 1 : Configuración hipóxico. La cinta se coloca dentro de la guantera casera, que está vinculada a un mezclador de gas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Descripción de una sesión de entrenamiento de intensidad supramaximal. Los ratones realizaron cuatro series de sprints de cinco 10 s, entremezclados con 20 s de descanso. El resto interset fue 5 min. Esta figura se ha adaptado de Faiss et al21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Representación esquemática de la técnica para recuperar la aorta pulmonar. (1) colocar las pinzas en la arteria pulmonar y la aorta. (2) Tire hacia atrás la pinza en la dirección del número 2 con el fin de mantener la pinza en la aorta pulmonar solamente. (3) posición final de las pinzas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Evolución del peso del cuerpo en el transcurso del experimento. En verde, los grupos de entrenamiento de baja intensidad; en rojo, los grupos de entrenamiento de intensidad supramaximal. No hubo diferencias significativas entre ninguno de los grupos en ninguno de los puntos de tiempo (n = 4 ratones por grupo; los datos se presentan como media ± SD). Análisis estadístico se realizó utilizando una medida repetida dos vías ANOVA). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6 : Curvas de valoración de la función vascular. Sucesión de fases de contracción y relajación inducida en el conjunto del Protocolo, expresada en gramos. Registro representativo de las variaciones en la tensión de la nave en respuesta a las sustancias aplicadas, en un anillo de la aorta abdominal aislado de un ratón formado en intensidad supramaximal en hipoxia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7 : Las respuestas farmacológicas de una aislado de la arteria ilíaca preconstruidos con fenilefrina (Phe) a acetilcolina (ACh). Curva de relajación de respuesta a la dosis acumulativa de la arteria ilíaca derecha al aumentar las concentraciones de ACh (10-9 a 10-4 M). Los resultados se expresan como media ± SD del porcentaje de cambio en la tensión inducida por el vasodilatador, con n = 3 en SupraN y n = 4 en SupraH. Análisis estadístico se realizó mediante un ANOVA de dos vías para medidas repetidas pruebas. p < 0.05 vs SupraN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Table 1
Tabla 1: puntuación típica hoja de un entrenamiento de ratón en intensidad supramaximal en hipoxia. Utilizamos hojas de resultados para monitorear el bienestar de los ratones. Una puntuación de 3 en cualquiera de los criterios indicados (aspecto, comportamiento natural y peso corporal) o una puntuación total de 5 (por la adición de la puntuación de cada categoría) significada el animal estaba sufriendo y tuvieron que ser sacrificados.

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Discussion

El primer objetivo de este estudio fue evaluar la viabilidad del entrenamiento de alta intensidad hipóxico en ratones y determinar las características adecuadas del protocolo que sería bien tolerada por los ratones. Deliberadamente, ya que no hay datos usando supramaximal (es decir, más de Vmax) intensidad entrenamiento en ratones, tuvimos que realizar ensayos basados en protocolos anteriores desarrollados con los atletas, que consistió en cuatro o cinco series de cinco sprints total (aproximadamente 200% de Vmax), entremezclado con recuperaciones activo de 20 s, con una recuperación activa interset de 5 min21,22. Por lo tanto, el Protocolo inicial consistió en seis series de sprints de seis 10 s al 200% de Vmax, entremezclado con 20 s de recuperación pasiva y con una recuperación pasiva interset de 3 minutos, realizada cinco veces por semana. Después de unos try-out funciona al 200% de la Vmax, teniendo en cuenta los ratones tuvo problemas para mantener una alta intensidad, hemos decidido reducir la velocidad al 150% de la Vmax. Con ejercicio intensidad, trató de ejecutar a los ratones a lo largo de un protocolo completo y ajustar el número de sprints dentro de cada conjunto y el número de series por sesión. Finalmente, aumentamos el tiempo de recuperación entre series y disminuyó la frecuencia de las sesiones de entrenamiento. Siguiendo un método de ensayo y error, establecimos un protocolo óptimo final que es muy similar al utilizado en atletas y hecho posible para los ratones tolerar esta prueba de intensidad supramaximal.

Hay una posibilidad que puede subestimar seriamente el funcionamiento de los ratones, como observó grandes diferencias entre los estudios anteriores, utilizando protocolos de ejercicio animal23,24. Sin embargo, en el presente estudio, basado en valores de pre-experimento, habría sido imposible imponer una intensidad relativa mayor en los animales teniendo en cuenta la necesidad de completar la sesión de sprint repetido todo. Por otra parte, los valoresmáximos de V reportados en este estudio (28.8 ± 3,7 m/min) parece estar en el rango de valores previamente registrados en el mismo C57BL/6J cepa25,26,27,28. Por ejemplo, Lightfoot et al.25 reportaron valores de ~ 28 m/min y Muller et al.27 de 28,3 m/min. Por lo tanto, estamos seguros de que la intensidad supramaximal corresponde a la intensidad de entrenamiento de sprint en estos ratones.

Aunque velocidades críticas (CS) se ha demostrado (1) ser un medio valioso para prescribir la intensidad del ejercicio en los seres humanos y pacientes sanos29 y (2) estar perfectamente determinada en ratones23,24,30, el ejercicio receta de intensidad basado en la determinación de Vmax sigue siendo pertinente. Es sabido, en ratones, la decidida VO2peak y VO2max dependen el protocolo, y, como con los seres humanos, VO2max pueden determinarse con una rampa ejercicio protocolo11. Puesto que el objetivo del presente estudio fue determinar la factibilidad de supramaximal repitió sprint en ratones, y a pesar de la importancia de la CS, no creemos que utilizar Vmax sería un error con respecto a los objetivos de este estudio.

Mientras observa los ratones comportamiento, quedó claro que la red eléctrica en la parte posterior de la caminadora sin duda animó a ratones a correr; sin embargo, también parece contribuir a la fatiga. De hecho, la red siendo ligeramente desplazada de la banda de marcha, los ratones tenían que generar un esfuerzo adicional para conseguir detrás en el carril. Decidimos complementar esta estimulación con otra, más suave, uno, es decir, la estimulación de torunda algodón, que disminuyó el número de golpes recibidos por los animales y les impidió tener que volver al carril de la red. A pesar de la recomendación de Kregel et al31, no queda claro si el estrés se reduce mediante la estimulación de soplo de aire en comparación con el32de la red eléctrica.

Lo que sabemos, sólo un estudio ha utilizado "sprint training intervalo"33. Sin embargo, desde la intensidad más alta en ese estudio correspondió a un 75-80% de Vmax y la duración del sprint es de 1,5 min, dicho protocolo fue muy distinto al actual (es decir, 150% de la Vmax, 10 s). Se desconocía si supramaximal intensidad sería tolerada por los ratones. En el presente estudio, ofrecemos resultados que muestran que los animales se realizó muy bien en este entrenamiento de intensidad supramaximal, hipoxia y normoxia. Por ejemplo, la figura 5 muestra un aumento en el peso corporal durante el período de formación similar a la observada en los grupos de baja intensidad. Del mismo modo, la tabla 1 refleja el nivel de bienestar con una puntuación inferior a 3 en todos los grupos. En conjunto, los parámetros fisiológicos indican que hipoxia y entrenamiento de intensidad supramaximal eran muy bien toleradas por los ratones.

El segundo objetivo del presente estudio fue evaluar la función vascular de la arteria pulmonar, la aorta abdominal y la arteria ilíaca, utilizando recipiente isométrica tensión estudios20. Esta técnica permite determinar si la intervención de interés afectadas la capacidad de los vasos para contraerse y relajarse en respuesta a las drogas farmacológicas. Como se muestra en la figura 7, la arteria ilíaca fue relajada utilizando concentraciones crecientes de ACh. Lo observado curvas reflejan un aumento progresivo en la relajación de los vasos, más marcada para el grupo SupraH. Si cualquiera de las curvas observadas había sido completamente plana y alrededor del 0% de relajación, podría significar que la droga no fue entregada a la cámara de órgano, o que los buques habían sido dañados durante la disección o el montaje de los estribos, o fue que uno de los medicamentos no t había administrado en la dosis óptima o durante el tiempo suficiente.

El entrenamiento de intensidad supramaximal en hipoxia se transfiere ahora a los ratones y potencialmente podría ser utilizado en modelos patológicos para mejorar diversos parámetros, incluyendo la función vascular, que puede evaluarse mediante estudios de tensión isométrica del buque.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a Danilo Gubian y Stephane Altaus del taller mecánico del Hospital de la Universidad de Lausana (CHUV) para ayudar a crear la configuración hipóxica. Los autores también desean agradecer a Diane Macabrey y Melanie Sipion por su ayuda con el entrenamiento de los animales.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cotton swab Q-tip
Gas mixer Sonimix 7100 LSI Swissgas, Geneva, Switzerland Gas-flow: 10 L/min and 1 L/min for O2 and CO2, respectively
Hypoxic Box  Homemade Made in Plexiglas
Motorized rodents treadmill Panlab LE-8710 Bioseb, France
Oximeter Greisinger GOX 100 GREISINGER electronic Gmbh, Regenstauf, Germany
Sedacom software Bioseb, France
Strain gauge PowerLab/8SP; ADInstruments

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Comportamiento número 145 intensidad Supramaximal hipoxia función vascular ratones caminadora correr
Supramaximal intensidad ejercicio hipóxico y evaluación de la función Vascular en ratones
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Lavier, J., Beaumann, M., Ménetrey, S., Mazzolai, L., Peyter, A. C., Pellegrin, M., Millet, G. P. Supramaximal Intensity Hypoxic Exercise and Vascular Function Assessment in Mice. J. Vis. Exp. (145), e58708, doi:10.3791/58708 (2019).

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