Summary
Det här protokollet beskriver de allmänna processerna och kvalitetskontroll kontroller som krävs för att förbereda friska vuxna enda däggdjursceller droplet-baserade, hög genomströmning enda cell RNA-Seq preparat. Sekvensering parametrar, finns Läs justering och nedströms encelliga bioinformatiska analyser också.
Abstract
Analys av enstaka cell genuttryck över tusentals enskilda celler i en vävnad eller närmiljön är ett värdefullt verktyg för att identifiera cell sammansättning, diskriminering av funktionellt påstår och molekylära vägar bakomliggande observerade vävnad funktioner och djurs beteenden. Isolering av intakt, friska enstaka celler från vuxna däggdjur vävnader för efterföljande nedströms enda cell molekylär analys kan dock vara utmanande. Det här protokollet beskriver de allmänna processerna och kvalitetskontroll kontroller behövs för att få hög kvalitet vuxen enda cell preparat från nervsystemet eller hud som aktiverat efterföljande opartisk enda cell RNA-sekvensering och analys. Riktlinjer för nedströms bioinformatiska analyser finns också.
Introduction
Med utvecklingen av hög genomströmning enda cell teknik1,2 och framsteg inom användarvänliga bioinformatiska verktyg över de senaste decenniet3, har ett nytt fält av högupplösta gen uttryck analys uppstått – encelliga RNA-sekvensering (scRNA-Seq). Studien av enstaka cell genuttryck utvecklades först att identifiera heterogenitet inom definierade cellpopulationer, såsom i stamceller eller cancerceller, eller för att identifiera sällsynta populationer av celler4,5, som var ouppnåeliga använder traditionell bulk RNA-sekvensering tekniker. Bioinformatiska verktyg har aktiverat identifiering av romanen subpopulationer (Seurat)2, visualisering storleksordningen celler längs ett psuedotime utrymme (Monocle)6, definitionen av aktiva signalering nätverk inom eller mellan populationer ( NATURSKÖNA)7, prediktion av montering av singel-celler i en konstgjord 3D-rymden (Seurat, och mer)8. Med dessa nya och spännande analyser finns tillgängliga för det vetenskapliga samfundet, scRNA-Seq är snabbt på att bli den nya standarda metoden för gen uttryck analys.
Trots den stora potentialen hos scRNA-Seq, kan tekniska skillsets krävs för att producera en ren datamängd och korrekt tolka resultaten vara utmanande att nykomlingar. Här, ett grundläggande, men omfattande protokoll, start från isoleringen av enstaka celler från hela primära vävnader till visualisering och presentation av data för publikationen presenteras (figur 1). Först, isolering av friska enstaka celler kan anses vara utmanande, eftersom olika vävnader varierar i deras grad av känslighet för enzymatisk nedbrytning och efterföljande mekaniska dissociation. Detta protokoll ger vägledning i stegen isolering och identifierar viktiga kvalitetskontroll kontrollpunkter i hela processen. Andra, förstå kompatibilitet och krav mellan singelcellteknologi och nästa generations sekvensering kan vara förvirrande. Detta protokoll ger riktlinjer för att genomföra en användarvänlig, droplet-baserade encelliga streckkodning plattform och utföra sekvensering. Slutligen, datorprogrammering är en viktig förutsättning för att analysera encelliga transcriptomic datamängder. Detta protokoll innehåller resurser för att komma igång med programmeringsspråket R och ger vägledning om genomföra två populära scRNA-Seq-specifika R paket. Tillsammans, kan detta protokoll vägleda nykomlingar i utföra scRNA-Seq analys för att få tydliga och tolkningsbara resultat. Detta protokoll kan anpassas till de flesta vävnader i musen, och allt kan ändras för användning med andra organismer, inklusive mänsklig vävnad. Justeringar beroende på vävnad och användaren kommer att krävas.
Det finns flera faktorer att ha i åtanke när du följer detta protokoll; inklusive, 1) efter alla kvalitetskontroll riktlinjer i steg 1 och 2 i detta protokoll rekommenderas att garantera en livskraftig enda cellsuspension av alla celler i provet av intresse samtidigt som man säkerställer korrekta totala antalet blodkroppar (sammanfattas i figur 2 ). När detta uppnås, och om alla optimerade villkor följs, kvalitetskontroll stegen kan släppas (Spara tid - bevara RNA kvalitet och minska celler förlust). Bekräftar framgångsrika isolering av hög bärkraft enstaka celler från vävnaden av intresse är starkt rekommendera innan något nedströms bearbetning. (2) eftersom vissa celltyper är mer känsliga än andra för att betona, kan Överdriven dissociation tekniker oavsiktligt bias befolkningen, därför confounding nedströms analys. Mild dissociation utan onödiga cellulära klippning och matsmältningen är kritiska för att uppnå hög cellulära avkastning och en korrekt representation av vävnadssammansättning. Skeva styrkor inträffa under sönderdelning, FACS och resuspension stegen. (3) som med varje RNA-arbete, är det bäst att presentera som lite extra RNase i provet som möjligt under beredning. Detta kommer att bidra till att upprätthålla hög kvalitet RNA. Använda ribonunkleas hämmare lösningar med sköljning till rena verktyg och utrustning som inte RNase-fri men undvika DEPC-behandlad produkter. (4) utför förberedelserna så snabbt som möjligt. Detta hjälper upprätthålla hög kvalitet RNA och minska celldöd. Beroende på vilken vävnad dissektion längd och djurens antal, överväga att starta flera dissektioner/preparat samtidigt. (5) Förbered celler på is när möjligt att upprätthålla hög kvalitet RNA, minska celldöd och långsam cell signalering och transkriptionell aktivitet. Om än, iskall bearbetning är idealisk för de flesta celltyper, presterar vissa celltyper (t.ex., neutrofiler) bättre när bearbetas vid rumstemperatur. (6) undvika kalcium, magnesium, EDTA och DEPC-behandlad produkter under cell beredning.
Protocol
Alla protokoll som beskrivs här är i enlighet med och godkänts av University of Calgary's Animal eftervård kommittén.
1. separera vävnad (dag 1)
- Euthanize möss med en överdos av natrium pentobarbital (i.p., 50 mg/kg) eller i förekommande fall enligt djuretik protokoll. Sedan ta bort oönskat hår från rygg och ben av musen och etanol-sterilisera regionen av dissektion.
- Dissekera den vävnad eller närmiljön sevärdheter. För detta protokoll använder vi hud och vävnader nerv för att demonstrera generaliserbarhet av droplet streckkodning-baserade enda cell transkriptomik efter vuxen vävnad dissociation.
- För ischiasnerven, använda detaljerad protokollet finns på Stratton o.a. 9. kort, skära huden bort från regionen hind i rygg/ben mus. Gör ett snitt längs med låret med en steril skalpell blad. Använd fina pincett och sax att exponera och ta bort ischiasnerven.
- För tillbaka huden, använda detaljerad protokollet finns på Biernaskie et al. 10. kort, dissekera dorsala tillbaka huden genom att göra snitt från skuldra vid skuldra, över gumpen och ner på baksidan med fin pincett och sax. Skära huden i tunna skivor (0,5 cm tjocklek) med hjälp av en steril skalpell blad.
- Tvätta vävnad 2 gånger med iskall HBSS och ta bort oönskade bindväv, fettvävnad eller skräp i dissekera Mikroskop.
- För huden dermis endast, flyta skivor i dispase (5 mg/mL, 5 U/mL) i HBSS för 30-40 min vid 37 ° C. Kirurgiskt separera överhuden från läderhuden. Kassera epidermis eller ytterligare separera använder trypsin om av intresse.
- Finhacka prov i 1-2 mm bitar med en steril skalpell blad och sätta i nymalen tinade 2 mg/mL kall kollagenas-IV enzym (2 mg/mL, 125 CDU/mg, i F12 media).
- För nerven, använda ~ 500 µL per 2 x höftnerver. För huden, Använd ~ 8 mL per 1 x mus tillbaka huden.
Obs: Vävnader bör vara helt nedsänkt i kollagenas-IV lösning. Det är viktigt att alla matsmältning enzymer är hanteras, lagras och beredd på lämpligt sätt. Om enzymer finns kvar vid rumstemperatur för långa perioder, kommer enskild cell isolering kräver kraftig mekanisk sönderdelning och minska cellernas viabilitet. Kollagenas-IV kan också göras upp i cell kultur media där cellviabilitet är mest optimalt. Men detta kunde förändra enzymaktivitet eller transkriptionell signatur så bör optimeras av användaren.
- För nerven, använda ~ 500 µL per 2 x höftnerver. För huden, Använd ~ 8 mL per 1 x mus tillbaka huden.
- Inkubera provet i enzymet i badkar 37 ° C i 30 min under varsam skakning varje 10 min. En shaker placeras vid 37 ° C är också ett lämpligt alternativ.
- Pulverisera med P1000 vi rekommenderar att en 20 - 30 gånger på 30 min efter enzym tillskott.
- Upprepa trituration varje 30 min tills lösningen grumlig och bitar av vävnad dissocieras i hög grad.
Observera: Kontrollera fullständiga utgåvan av celler (figur 2b, 2 c). För att bekräfta hela release, platta celler med Nuc blå (2 droppar per 1 mL) och efter 20 min, kolla under mikroskopet se till alla kärnor är associerade med enstaka celler i stället för skräp. Det är viktigt att kontrollera graden av cell release inom en given experiment för varje vävnadstyp eller skick. I fibrotisk vävnad (dvs, kronisk skada) eller oskadd adult vävnad varierar frisläppandet av celler dramatiskt från akut skada eller embryonal vävnad. Detta är särskilt viktigt eftersom vissa celltyper är mindre benägna att släppa från vävnaden än andra, således företrädesvis exklusive dessa celler från efterföljande analys.- För nerven, dissociera vävnad för 0,5-1,5 timmar totalt. För huden, dissociera vävnad för 2 timmar totalt (under den sista timmen av inkubation, tillsätt DNAS (1 mg/mL) hud).
- Filter två gånger med ett 40 µm filter. Skölj filtret med iskall 1% BSA/HBSS.
- Centrifugera vid 260 x g i 8 min. Ta sedan bort supernatanten.
- Återsuspendera cellpelleten i HBSS som innehåller 1% BSA använder en wide-bore spets och placera på is. Resuspension volymen är baserad på vävnad volym (800 mg våt vikt för hud = 800 µL volym samt 10 mg våt vikt för nerver = 100 µL volym).
- Eventuellt börja med en låg resuspension volym och sedan justera vid behov baserat på flöde (händelser per sekund) på FACS sorterare. Det mest effektiva form densitet (maximera antalet celler samlas in samtidigt minimeras tiden) för samlingar är 3000-7000 händelser per sekund.
- Om använder livskraft färgämne, ta ut en subaliquot för en ofärgade kontroll. Lägg sedan till 1:15,000 livskraft färgämne (lager: 20.000 nM/µL) till prov (1.3 nM/µL slutlig koncentration) med ett wide-bore-tips för att minska klippning.
Obs: Det är viktigt att kontrollera graden av celldöd inom en given experiment för varje vävnadstyp eller skick. Vissa celltyper inom ett prov är mer benägna att dö än andra, därmed utesluts företrädesvis från efterföljande analys.- Inkubera provet med livskraft färgämne för 5-10 min på is i mörkret. Lägg sedan till 4 mL iskallt 1% BSA/HBSS med urvalet. Centrifugera vid 260 x g i 8 min att ta bort överflödig livskraft färgämne. Behandla subaliquot med ingen bärkraft färga ofärgade kontroll på samma sätt.
2. isolera livskraftiga och friska celler (dag 1)
- Se till att anläggningen FACS följer lämpliga fluorescens aktiverad cell sorteringsparametrar (FACS).
- Förbereda FACS maskinen i förväg för att säkerställa att den är redo när slutliga centrifugen i steg 1 är klar, och se till att samlingen kupén hålls kallt med isblock.
- Använd följande parametrar: flöde: 1,0 (motsvarar ungefär 10 µL/min); Filter: 1,5 ND; Munstycke storlek: 100 µm; Framåt scatter: 80-180 V (förändring som behövs för att särskilja storlek händelser); Side scatter: 150-220 V (förändring som behövs för att särskilja granularitet/forma händelser); Laser: 100-400 V (förändring som behövs för att skilja livskraft dye positiv vs negativa händelser & Kontrollera detta mot någon livskraft dye kontroll); Utfärda utegångsförbud för: Ändra som behövs för att säkerställa alla celler samlas. Se figur 2d-2 g.
Obs: FACS parametrar är starkt beroende av celltyper och Sorteraren sysselsatt och därför måste optimeras av användaren.
- Förbereda 15 mL smal-botten rör med 8 mL iskallt 1% BSA/HBSS för forskningsprovsamlingar. Statisk inuti röret och ytspänning kan påverka insamlingskapacitet. Vänd rören innan samlingar att säkerställa gränssnittet mellan ytan på vätskan och insidan av röret är fuktig.
Obs: Om arbetar med mycket låg cell nummer, justera till liten samling fartyg förekommande. - När alla celler är samlat, Centrifugera provet vid 260 x g i 8 min.
Obs: Före centrifugering, tillsätt 1% BSA/HBSS att tvätta/push celler ned från ytan och Invertera/mix röret omedelbart efter FACS. - Återsuspendera cellpelleten i 1% BSA/HBSS och hålla på is. Maximal volym per prov som är kompatibel med steg 3 bearbetning är 33,8 µL, så se till att slutliga cellvolym utspädning/resuspension är lämpligt att erhålla perfekt cell nummer i 33,8 µL. Andra alternativ för detta steg utspädning media (och alla tidigare utspädningar i 1% BSA/HBSS) inkluderar DMEM, och upp till 40% serum, men undvika kalcium, magnesium eller EDTA innehållande reagenser.
- Lämna celler på is för en minimal tid. Idealiskt bör medarbetare förbereda all utrustning och reagenser för följande steg (steg 3) under sista stegen i steg 2.
- Cell förberedelse kritiska kontroller
- Bekräfta uppskattningar av cell nummer erhålls från FACS. Beroende på vävnadstyp och dissociation kan längder, skräp och celler vara mycket lika i storlek och form. Således, om inte en fluorescerande reporter används, FACS inte utesluta allt skräp. Det rekommenderas att en slutlig celltal efter FACS samling utförs för att förstå vilken procentandel av händelser (enligt FACS) är faktiskt celler för en viss förberedelse (figur 2 g). Utföra celltal med hjälp av en hemocytometer eller automatiserade cell räknare (upprepa två gånger) och beräkna procentandelen av viabla celler som representeras av de totala händelser som samlas in enligt FACS maskin.
- Validera cell förberedelse. Kontrollera att inga stora partiklar (> 100 µm) är närvarande som de kan täppa till utrustning i efterföljande steg. Otillräcklig borttagning av skräp kan riskera igensättning encelliga mikroflödessystem chip. Tallrik resterande celler med Nuc blå (som ovan) för att säkerställa ingen stor skräp fragment finns. Detta kommer också att för att bekräfta att cellerna är singular (dvsinte klibbar ihop) ger förtroende att nedströms enda cell genetisk analys representerar enstaka celler i stället för flera celler.
- Besluta om cell nummer sekvens: det finns ett stort utbud av adult vävnad-derived cell nummer per prov som kan laddas in i systemet med upp till 8 prover som kan köras på en gång. Författarna har lästs in någonstans från 500 – 50 000 celler per prov och erhålls god kvalitet scRNA-Seq datamängder. Mer diskussion om den lämpligaste cell nummer att ladda kan hittas i diskussionsavsnittet. Slutresultatet av sekvenserade cell nummer är starkt beroende av kvaliteten på singel-celler isolerade. Laddar 10 000 vuxna vävnad-derived celler kan återvända någonstans från 1,000 till 4.000 sekvenserade celler (10-40% avkastning). Om intresserad av sekvensering hög cell nummer (~ 10 000 celler, maxantalet rekommenderas för detta system), kommer sedan laddar 25 000-100 000 celler att krävas.
3. GEM (Gel pärla i Emulsion) Generation och streckkodning (dag 1)
Obs: Steg 3-6 i detta protokoll är utformade för att användas tillsammans med de vanligaste microdroplet-baserade encelliga plattform, tillverkas av 10 X Genomics. Detaljerade riktlinjer för steg 3 och 4 beskrivs i tillverkarens protokoll (se protokollet krom enda Cell 3')11,12 och måste följas i samband med detta protokoll. För bästa resultat, måste steg 3 slutföras omedelbart efter dissociation (steg 1) och cell isolering (steg 2) steg på dag 1 i detta protokoll.
- Förbereda chip enligt tillverkarens protokollet 11,12. Denna microdroplet-baserade encelliga plattform använder teknik som prover ~ 750 000 streckkoder att separat indexera varje cellens transkriptom. Detta uppnås genom partitionering celler i Gel pärla i emulsioner (ädelstenar) där genererade cDNA delar en gemensam streckkod. Under pärla generation, cellerna levereras så att majoriteten (90-99%) av genererade GEMs innehåller inga celler, medan resten, för det mesta, innehåller en enda cell.
- Placera chipet i chip hållaren.
- Förbereda cell master mix på is.
- Tillsätt 50% glycerol till oanvända brunnar och 90 µL av cell huvudmixen väl 1, 90 µL av gel pärlor till väl 2 och 270 µL partitionering olja väl 3.
- Täcka chipet med packningen.
- Läsa in chipet och köra i en enskild cell controller.
- Mata ut facket, placera chipet i släde, dra in facket och tryck på spela. En enda cell 3: gel pärla i en pärla innehåller grundfärger som innehåller en delsekvens Illumina R1 (Läs 1 sekvensering primer), en 16 nukleotider (nt) 10 x Barcode, en 10 nt unika molekylära identifierare (UMI) och en poly-dT primer sekvens. Under körningen, gel pärlor i kontrollern släpps och blandas med cell lysate och master mix.
- Samla 100 µL prov och plats i en PCR-röret.
- Plats PCR-rören i förinställda PCR-maskin och köra PCR enligt satsen. Efter inkubering pärlor kommer att omfatta fullängds, barcoded cDNA från poly-adenylated mRNA.
- Efter körningen, placera vid-20 ° C över natten för upp till 1 vecka innan föregående till nästa steg.
4. städa upp, förstärkning, bibliotek konstruktion och bibliotek kvantifiering (dag 2 och framåt)
Obs: Detaljerade riktlinjer för steg 4 beskrivs i tillverkarens protokollet 11,12, och måste följas i samband med detta protokoll.
- Använda silan magnetiska pärlor att ta bort överblivna biokemiska reagenser/primers från GEM reaktionsblandningen.
- Förstärka fullängds, barcoded cDNA att generera tillräcklig massa för bibliotek konstruktion.
- Bedöma DNA avkastning. Innan biblioteket konstruktion, bedöma DNA avkastningen av provet. Detta kommer att avgöra hur många cykler använda i nedströms PCR steg (prov Index PCR under bibliotek konstruktion). Beroende på ett givet prov, som kan variera beroende på aktivering stater (t.ex., kontroll vs skadade, etc.), celltyp och cell avkastning RNA innehåll, kan rekommenderade cykel ändras.
- För sekvensering ~ 3000 vävnad-derived celler (irrelevant för aktivering stater), författarna har funnit att 14 cykler (prover: ~ 10 – 100 ng DNA) är standard.
- Använd en Bioanalyzer för DNA-analys. Hänvisa till användaren Guide13.
- Fragmentera prov och välja storlek på DNA. Innan biblioteket konstruktion, Använd enzymatisk fragmentering och storlek urval protokoll för att få lämpliga cDNA kopiestorlek.
- Förbereda prov för bibliotek konstruktion. Medan R1 (Läs 1 primer sekvens) läggs till molekylerna under pärla inkubation; P5, P7 (ett prov index), och R2 (Läs 2 primer sekvens) läggs under bibliotek konstruktion.
- Bedöma DNA avkastning. De flesta sekvensering anläggningar kräva inlämnande av slutliga bibliotek som innehåller DNA avkastning och kvalitet information. Sålunda, springa den bioanalyzer efter avslutningen av hela protokollet och innan transport till anläggningen sekvensering.
- Lagra prover vid-80 ° C i upp till 2 månader.
- Innan sekvensering, kvantifiera prover med ett DNA kvantifiering kit. Detta kan göras vid anläggningen i sekvensering.
5. bibliotek sekvensering (dag 3 och framåt)
Obs: De encelliga transkriptom streckkodning plattform som används i detta protokoll genererar Illumina-kompatibel Parade-end bibliotek börjar och slutar med P5 P7 sekvenser. Även om minsta djup behövs för att lösa celltyp identitet kan vara så få som 10 000 – 50 000 läsningar per cell15,16, rekommenderas ~ 100 000 läsningar per cell som en optimal kostnadstäckning avvägning för vuxna i vivo celler (Tänk på någon cell typer eller minimalt aktiverad cell stater kommer till mättnad på 30.000-50.000 läsningar/cell).
- Transportera cDNA bibliotek på torr-is till en sekvensering anläggning utrustad med en lämplig Illumina sequencer.
- Lämna följande information till sekvensering anläggningen:
- Ge prov Detaljer: prova index-ID som motsvarar varje bibliotek; arter. genomisk databas för primär sammansättning (dvs.GRCm38 för mus); elektroferogram visar fragment storlekar från bioanalyzer (mellan 200 och 9000 bp); cDNA koncentration (ng/µL) och totala bibliotek koncentration (totala avkastningen varierar från 200 – 1400 ng); volym (µL) av provet.
- Tillhandahålla sekvensering förfrågningar: kvantifiera prover med ett DNA kvantifiering kit; adapter/index typ (TruSeq DNA); plåt typ (Eppendorf twin.tec, Full kjol - rekommenderas för DNA); sekvensering teknik/bibliotek typ (10 x, sekvenseringen instruktioner och cykel rekommendationer)17.
- Kör grunt sekvensering (tillval): studier analysera flera biologiska prover kommer att gynnas av samla prover (sammanläggning) för att generera en enda gen-barcode matris som innehåller data från alla prover. För att minimera batch effekter mellan prover vid poolning, bör Läs djupet mellan olika bibliotek standardiseras. För att göra detta, krävs en noggrann uppskattning av enda cell nummer. MiSeq sequencer gör att grunda sekvensering och är ett kostnadseffektiv, praktiska sätt att erhålla korrekt cell anseende.
Obs: En kör med en MiSeq SR50 sequencer ger tillräcklig täckning för att korrekt uppskatta ungefär 20 000 celler. Detta kör kommer ungefärliga antalet UMI återvinns för varje unik streckkod. I figur 3a, huvudet av ett exempel (prov 1,6) utdata (.csv) visas, notering streckkoder och dess motsvarande UMI räknas som bestäms av tryggt mappade läsningar.- Rådgör med en bioinformatiker bli bekant med R programmeringsspråk. Se DataCamp tutorials för mer information18.
- Bedöma rå data som erhållits från sequencer med det medföljande R-skriptet som en mall19. RAW-data avser antal UMIs mappas till varje unik cell streckkod. Skriptet läser en .csv-fil där den första kolumnen är en lista med streckkoder och den andra kolumnen är dess motsvarande UMI räknas. Detta skript kommer att ge en tomt (figur 3b) samt det uppskattade antalet barcoded celler i varje prov. Justera script för att säkerställa att matas in antalet UMI räknas för ett givet prov på en tredjedel av den första branta nedgången. I figur 3bfaller detta armbåge omkring 225 UMIs motsvarar 3.480 barcoded celler.
- Jämförbar med full-djup sekvensering använder HiSeq (där 3.516 celler var framgångsrikt sekvenserade, figur 3 c), grunt sekvensering beräkningar förutspådde 3.480 celler.
- Antingen använda cell återhämtning approximationer (från steg 5.3) eller använda recovery diagrammet finns i tillverkarens protokoll20 att planera lane distribution för djupare sekvensering. Varje prov bör få jämförbara täckning, så om grunt sekvensering avslöjar att det finns olika antal celler i varje prov (vilket ofta är fallet) sedan lane distribution bör beräknas med detta. En HiSeq flöde cell (som består av 8 banor) kan sekvens upp till 2,4 miljarder anpassade Parade slutet läsningar. Exempel flöde cell set-up presenteras i figur 3d.
6. behandling läsa filer
Obs: Sekvensering en enda cell 3' bibliotek som använder detta protokoll genererar rådata i binärt bas samtal (BCL) format. Den Cell Ranger paketet används för att generera text-baserade FASTQ filer från BCL filer, utför genomiska och transcriptomic linjeföring, genen räknas, demultiplexning och aggregering av prover. I det här avsnittet presenteras de viktiga steg som användarna kan hämta BCL rådata från en sekvensering anläggning och generera filtrerade gen-barcode matriser redo för nedströms bioinformatik.
- Använda en central server för att köra programmet. BCL filer, FASTQ filer och de flesta av de nedströms bioinformatik bearbetning kräver betydande processorkraft.
- Ladda ner alla rå Läs filer till server (eller FASTQ filer om de är tillgängliga).
- Kontakta serveradministratören att skapa ett konto på en centraliserad server eller kluster och att bekanta sig med Unix21.
- Använd ett fetch kommando för serverns operativsystem att ladda ner alla filer från sekvensering anläggningens server.
- De flesta sekvensering lokaler ger ett kommando för att hämta filer från en säker väg som kan köras från kommandoraden (se exempel nedan).
- Ersätt ”< användarnamn >” och ”< lösenord >” platshållare i kommandoraden med autentiseringsuppgifter som anges.
wget - O - ”https://your_sequencing_facilitys_server.com/path_to_raw_read_files/--no-cookies--no-kontrollera-certifikat--efter data ' j_username = användarnamn & j_password = lösenord ' | wget--no-cookies--no-kontrollera-certifikat--efter data ' j_username = användarnamn & j_password = lösenord ' - ci -
- Om bara en absolut sökväg till filerna tillhandahålls (dvs. https://your_sequencing_facilitys_server.com/path_to_raw_read_files/), denna väg in ett fetch-kommando.
- Packa upp filer: om hämtade filer slutet med tillägget ”.gz”, den har komprimerats med kommandot ”gzip”. För att packa, packa Kör kommando på kommandoraden (se exempel nedan).
gunzip raw_read_files.gz - Ladda ner den senaste versionen av Cell Ranger på servern som en fristående .tar22.
-
Kritisk: Innan nedladdning, kontrollera Linux-system uppfyller minimikraven23. Garantera ett minimum av 8-core Intel-processor med 64 GB RAM och 1 TB ledigt diskutrymme.
Obs: Cell Ranger ger förbyggda människa och gnagare referens transcriptomes. Dessa kan ändras kommandot cellranger mkref för att identifiera gener som GFP24.
-
Kritisk: Innan nedladdning, kontrollera Linux-system uppfyller minimikraven23. Garantera ett minimum av 8-core Intel-processor med 64 GB RAM och 1 TB ledigt diskutrymme.
- Generera FASTQ filer från sequencer's bas samtal filer (BCLs) med kommandot cellranger mkfastq.
Obs: Programmet kommer att justera raw-läsningar (från FASTQ filer) till en referens genomet och generera gen-cell matriser för efterföljande analys. Den använder STAR aligner som utför skarvning-medveten anpassning av läser en referens genomet. Bara tryggt mappade läsningar (dvs.läser kompatibel med en enda gen annotation) används för UMI inventering.- Till exempel, Använd kommandot cellranger mkfastq:
cellranger mkfastq --id = sample_name \
--Kör = / sökväg/till/prov \
--csv=csv_file_containing_lane_sample_index.csv
- Till exempel, Använd kommandot cellranger mkfastq:
- Kör cellranger räkna på FASTQ filer som genereras med mkfastq att generera enskild cell genen räknas.
- Till exempel, Använd kommandot cellranger count:
cellranger count --id = sample_name \
--transkriptom = refdata-cellranger-mm10-1.2.0 \
--fastqs = / absoluta/sökväg/till/fastq/files \
--prov = same_sample_name_supplied_to_cellranger_mkfastq \
--localcores = 30
- Till exempel, Använd kommandot cellranger count:
- Flera bibliotek aggregation (tillval): att kombinera prover, pool cellranger Antal utgångar med cellranger aggr. Detta resulterar i en enda gen-barcode matris som innehåller data poolade från flera bibliotek. Cellranger aggr kommando:
cellranger aggr--id = sample_name \
--csv = csv_with_libraryID_ & _path_to_molecule_h5.csv \
--normalisera = mappas
Obs: Biblioteken kan aggregeras med hjälp av tre normalisering lägen (mappade, rå, ingen). Mappade rekommenderas eftersom det delproverna högre-djup bibliotek tills alla bibliotek har lika sekvensering djup25. - För omedelbara visualisering/analys av data, importera filen .cloupe utgång (genereras med hjälp av cellranger räkningen eller cellranger aggr) till 10 x lupp cellen webbläsare26.
7. avancerad analys av scRNA-Seq datamängder
Obs: En komplett scRNA-Seq verktyg databas kan hittas på scRNA-verktyg3,27. Nedan är en ram för oövervakade cell klustring med Seurat2 och pseudotemporal att beställa använder Monocle6. Även om mycket av detta arbete kan göras på en lokal dator, förutsätter stegen nedan att uträkningen kommer att fyllas i med en institutionell server.
- Hämta den senaste versionen av Miniconda på serverkonto som använder Linux plattform28.
- Installera den senaste versionen av R använder conda29.
- Plotta data med hjälp av det medföljande Seurat R-skriptet som en mall-30.
Obs: Seurat är en R-baserad verktygslåda som gör kvalitetskontroller, klustring, differentiell gen uttryck analys, markör gen identifiering, dimensionalitet minskning och visualisering av scRNA-Seq data. En omfattande beskrivning av Seurat kodning och handledning kan hittas på Satija Lab hemsida31. - Plotta data med hjälp av det medföljande Monocle R-skriptet som en mall-32.
Obs: Monokel är ett annat R-baserad verktygslåda som möjliggör visualisering av uttrycket förändringar över pseudotime och identifierar gener bakom cell öde beslut. En omfattande beskrivning av monokel kodning och tutorials kan hittas på monokel webbplats33. - R-paket såsom kBET kan användas för att testa och korrigera batch effekter till följd av sammanslagning datamängder34.
8. NCBI'S GEO och SRA inlagor
Obs: Eftersom enkel tillgång till raw sekvensering filer säkerställa reproducerbarhet och reanalysis, är accessioned inlagor till online offentligt tillgängliga databaser rekommenderas eller krävs före manuskript. National Center for Biotechnology Information (NCBI) gen uttryck Omnibus (GEO) och sekvens Läs arkiv (SRA) är allmänt tillgängliga databaser för hög genomströmning sekvensering data35,36.
- Registrera dig för NCBI'S GEO inlämnare konto37.
- Komplett GEO inlämning som innehåller tre komponenter kompileras till en katalog/mapp (med titeln som GEO avsändarens användarnamn): 1) metadataposten (ett kalkylblad per projekt inlämning); (2) raw-datafiler; (3) bearbetade datafiler.
- Ladda ner och fylla i Metadata kalkylblad38. Följande offentliga GEO inlämning kan användas som en guide (GSE100320)39. Placera kalkylbladet i katalogen.
- Plats Raw datafiler som genereras från cellranger antal skript för alla bibliotek i katalogen.
- Plats bearbetas Data (filer filtrerade barcodes.tsv, genes.tsv och matrix.mtx) genereras från cellranger antal skript för alla bibliotek i katalogen.
- Använd autentiseringsuppgifter för GEO avsändarens FTP-servern för att överföra katalogen som innehåller alla tre komponenter. För Linux/Unix användare: ncftp, lftp, ftp, sftp och ncftpput kan användas.
- Meddela GEO för alla överföringar38.
Representative Results
Repertoar av open source-paket utformade för att analysera scRNA-Seq datamängder har ökat dramatiskt40 med majoriteten av dessa paket använder R-baserade språk3. Här, representativa resultat med hjälp av två av dessa paket presenteras: bedömning av oövervakade gruppering av enstaka celler baserat på genuttryck, och beställa enstaka celler längs en bana för att lösa cell heterogenitet och dekonstruera biologiska processer.
Figur 4 illustrerar användningen av Seurat för förbearbetning kvalitetskontroller och nedströms bioinformatik analys. Först, filtrering och borttagning av avvikande celler från analys är viktigt för kvalitet kontroll. Detta gjordes med hjälp av fiol (figur 4a) och scatter tomter (figur 4b) att visualisera procentandelen av mitochondrial gener, antal gener (nGene) och antalet UMI (nUMI) att identifiera cell dubletter och extremvärden. En cell med ett tydligt avvikande antal gener, UMI eller andelen mitochondrial gener togs bort funktionen Seurat's FilterCells. Eftersom Seurat använder huvudkomponenten (PC) analys noter till kluster celler, att fastställa statistiskt signifikant datorer att inkludera är ett viktigt steg. Armbågen tomter (figur 4 c) användes för val av PC, i vilka datorer utöver platån av 'standardavvikelsen för PC' axel var uteslutna. Upplösningen av klustring var också manipulerade visar att antalet kluster kan ändras, alltifrån 0,4 (lågupplöst leder till färre cell kluster, figur 4 d) till 4 (högupplöst leder till högre cell kluster, figur 4e ). Med låg upplösning är det troligt att varje kluster utgör en definierad celltyp, med hög upplösning kan detta också utgör undertyper eller de övergångsbestämmelser cell invånare. I detta fall användes lågupplösta klusterinställningar för att ytterligare analysera uttryck heatmaps (funktionen Seurat's DoHeatmap) för att identifiera de mest högt uttryckt generna i ett visst kluster (figur 4f). I detta fall identifierades de mest högt uttryckt generna genom att bedöma differentiell uttryck i ett visst kluster jämfört med alla andra kluster som sammantaget visar att varje kluster unikt företräddes av definierade gener. Dessutom kan enskilda kandidatgener visualiseras på tSNE tomter Seurat's FeaturePlot funktionen (figur 4 g). Detta möjliggjorde för att dechiffrera om det fanns kluster som representerade makrofager. Med FeaturePlot upptäckte vi att både kluster 2 och 4 uttryckte Cd68 - pan-makrofag markör.
Monocle paketet användes för bekräftande cell kluster identifierades i Seurat och bygga cellen banor, eller beställning av pseudotemporal, för att sammanfatta biologiska processer (figur 5). Beställning av pseudotemporal kan användas för prover där encelliga uttrycket profiler förväntas följa en biologisk tidsförlopp. Celler kan beställas längs en pseudotemporal kontinuum att lösa mellanlägen, bifurkation pekar av två alternativa cell öden, och identifiera genen signaturer underliggande förvärv av varje öde. För det första, liknar Seurats filtrering, dåliga celler togs bort så att fördelningen av mRNA över alla celler var log normal och föll mellan övre och nedre gränser som anges i figur 5a. Sedan använda Monocle's newCellTypeHierarchy funktion, enstaka celler klassificerades och räknade med känd härstamning markörgener (Figur 5b, 5 c). Till exempel tilldelades celler som uttrycker PDGF receptor alfa eller Fibroblast specifika Protein 1 till Cell typ #1 att skapa ett villkor för att definiera fibroblaster. Därefter bedömdes denna population (Cell typ nr 1) dechiffrera fibroblast banor. Detta gör utnyttjades Monocles differentierad GeneTest funktion, som jämförde celler som representerar de extrema staterna inom befolkningen och fann differentiell gener för beställning resterande celler i befolkningen (figur 5 d). Genom att tillämpa grenrör inlärningsmetoder (en typ av icke-linjära dimensionalitet minskning) över alla celler, tilldelades en koordinat längs en pseudotemporal bana. Denna bana var sedan visualiseras av cellen (figur 5e) och pseudotime (figur 5f).
Figur 1: flödesschema. Steg från hela djur förberedelse till analysera enstaka cell RNA-Seq datamängder till att skicka slutliga datamängder till en offentligt tillgänglig databas. Gel pärlor i Emulsion (ädelstenar) avser pärlor med barcoded oligonukleotider som kapsla in tusentals enstaka celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: skapa livskraftiga enda cellsuspension från nervvävnad. (a) tecknad översikt av kvalitetskontroller. (b) celler och skräp med celler fortfarande införlivas i skräp (röda pilar). (c) celler frigörs från skräp (röda pilar). (d) cell isolering av FACS. P0: skräp bråkdel; P1: cell-liknande bråkdel; P3: uteslutning av duplets; P4: livskraft färgämne (Sytox Orange) negativa fraktion. (e) ingen bärkraft dye kontroll. (f) bilden av P0 bråkdel som representerar isolerade skräp. (g) bilden av P4 bråkdel som representerar isolerade viabla celler (röda pilar). (b) (c) (f) och (g) hade kärnvapen dye tillkommer 20 minuter innan imaging. Skala barer: 80 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: grunt sekvensering förutspår antalet återvunna celler i 10 X bearbetade prover. (a) ett exempel (prov 1,6) MiSeq-genererade CSV notering cell streckkoder och dess motsvarande UMI räknas som bestäms av tryggt mappade läsningar. (b) streckkod rang tomt för provet 1.6 visar en betydande nedgång i UMI räknas som en funktion av cell streckkoder. De streckad och fasta linjerna representerar cutoff mellan celler och bakgrund som bestäms av okulärbesiktning. (c) cell streckkoder observerats med hjälp av Cell Ranger pipeline inlägg-HiSeq avslöjar grunt sekvensering approximeras exakt antalet celler för provet 1.6. (d) ett exempel på en flöde cell set-up baserat på grunt sekvensering härrör cell uppskattningar. För prov 1.6, eftersom grunt sekvensering förutspådde 3480 celler, 1,17 körfält tilldelades till säkerställa > 100 000 läsningar per cell sekvensering täckning i HiSeq. Obs: Alla körfält måste lägga till 100%. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: kvalitetskontroll och bioinformatik av encelliga RNA-Seq datamängd använder Seurat R package. (a) tomter kvalitetskontroll mätvärden som inkluderar antal gener, antal unika molekylära identifierare (UMIs) och andelen avskrifter mappning till mitokondriella genomet. (b) prov gen tomter upptäcka celler med avvikande nivåer av mitokondriell avskrifter och UMIs. (c) prov armbåge tomt används för ad hoc-bestämning av statistiskt signifikant datorer. De streckad och dot-streckad linjerna representerar cutoff där en tydlig ”armbågar” blir uppenbart i grafen. PC dimensioner innan denna armbåge ingår i efterföljande analys. (d, e) Graf-baserade cell kluster visualiseras på två olika upplösningar i en låg-dimensionell rymd som använder en tSNE tomt. (f) övre markörgener (gul) för varje kluster visualiseras på ett uttryck heatmap Seurat's DoHeatmap funktionen. (g) visualisera markör uttryck för, till exempel Cd68 gen som representerar makrofager (lila) använder Seurat's FeaturePlot funktion. Detta tyder på att kluster 2 och 4 (i panelen d) i denna dataset representerar makrofager. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Cell kategorisering och beställa längs peudotemporal bana med monokel toolkit. (a) inspekterar fördelningen av mRNA (innebäras från UMI räkningar) över alla celler i ett prov. Endast celler med mRNA mellan 0 - ~ 20.000 användes för efterföljande analys. (b, c) Tilldela och räknar celltyper baserat på kända härstamning cell markörer. Till exempel celler som uttrycker PDGF receptor alfa eller Fibroblast specifika Protein 1 tilldelades till Cell typ nr 1 som representerar pan-fibroblaster Monocle's newCellTypeHierarchy funktionen. Antal olika celltyper kan visualiseras som ett cirkeldiagram (b) och som en tabell (c). (d) använda Cell typ nr 1 (fibroblaster) som ett exempel, de gener som används för beställning av celler kan visualiseras med hjälp av ett spridningsdiagram som visar gen dispersion vs. genomsnittliga uttryck. Den röda kurvan visar cutoff för gener används för beställning beräknas av mean – variance modellen använder Monocle's estimateDispersions funktion. Gener som uppfyller denna cutoff användes för nedströms pseudotime beställning. (e, f) Visualisering av cell banor i en reducerad två-dimensionell rymd färgade genom cellens ”staten” (e) och Monocle-tilldelad ”Pseudotime” (f). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Detta protokoll visar hur den lämplig preparering av enstaka celler kan avslöja tusentals enstaka celler transkriptionell heterogenitet och diskriminera funktionellt påstår eller unika cellulära identiteter i en vävnad. Protokollet kräver inte fluorescerande reporter proteiner eller transgena verktyg och kan användas till isolering av enstaka celler från olika vävnader av intresse även från människor; att hålla i åtanke varje vävnad är unik och detta protokoll kommer att kräva en viss justering/ändring.
De mångsidiga och högdynamiska transkriptionell program inom celler har betonat värdet av encelliga genomik. Bortsett från isolera högkvalitativa RNA, är ett avgörande prov förberedelse steg nödvändigt för hög kvalitet datamängder att säkerställa att celler frigörs helt från vävnad och att celler är frisk och intakt. Detta är relativt rakt fram för att samla celler som lätt släppt, såsom cirkulerande celler eller vävnader celler behålls där löst, såsom i lymfvävnad. Men detta kan vara utmanande för andra vuxna vävnader, på grund av det välutvecklade cellulära arkitektur som spänner över stort distanserar, omgivande extracellulära matrix och de ofta-styv cytoskeletal proteinerna som är inblandade i att upprätthålla cellstruktur. Även med lämpliga dissociation tekniker för den fullständiga versionen av celler finns det potential att den rigorösa och ofta långdragna bearbetning som krävs skulle ändra mRNA kvalitet och cell integritet. Dessutom, påverka de höga temperaturer som används för enzym-assisted dissociation också transkriptionell signaturer29,30. Syftet med protokollet är att presentera kvalitetskontroll kontroller, använda vävnader såsom myeliniserade vuxen nerven och extracellulära matrix-rika vuxen huden, för att visa hur optimering kan bidra till att övervinna dessa hinder.
En viktig fråga vid utformningen av alla scRNA-Seq experiment är valet av sekvensering djup. Sekvensering kan vara mycket multiplexerade och läsa djup kan variera från att vara mycket låg med Drop-Seq2 till upp till 5 miljoner läsningar per cell14 metoden en fullängds RNA-Seq såsom Smart-följande punkter De flesta scRNA-Seq experiment kan upptäcka måttlig till hög uttryck avskrifter med sekvensering så låg som 10 000 läsningar/cell, vilket är normalt tillräcklig för cell typ klassificering41,42. Grunt sekvensering djup är av värde att spara på sekvensering kostnader när du försöker upptäcka sällsynta cellpopulationer över komplexa vävnader där tusentals celler kan behövas att tryggt tillskriva sällsynta populationer. Men grunt djup sekvensering är inte lämplig när detaljerad information om genuttryck och processer associerade med subtila transkriptionell signaturer krävs. För närvarande, uppskattas det att en stor majoritet av gener i en cell upptäcks med 500.000 läsningar/cell, men detta kan variera beroende på protokollet och vävnad typ43,44. Fullängds avskrift sekvensering kringgår behovet av montering och kan därför upptäcka roman eller sällsynta skarv varianter, begränsa sekvensering kostnader ofta skalning sådana tillvägagångssätt för att undersöka tusentals celler bestående av ett komplex vävnad system. Däremot taggade 3' encelliga bibliotek såsom de som beskrivs i detta protokoll vanligtvis har lägre komplexitet och kräver grundare sekvensering. Det är viktigt att notera att bibliotek som genereras med hjälp av beskrivna protokollet kan sekvenseras på en av fem stöds sequencers: 1) NovaSeq, (2) HiSeq 3000/4000, 3) HiSeq 2500 snabb kör och hög effekt, 4) NextSeq 500/550 och 5) MiSeq.
En alternativ strategi för enstaka cell RNA-Seq, som minskar behovet av delikat vävnads- och hantering ännu bevarar några av fördelarna med enstaka cell RNA-Seq, är analysen av RNA från enda atomkärnor45. Detta tillvägagångssätt tillåter snabbare bearbetning minska RNA nedbrytning, och mer extrema åtgärder för att säkerställa adekvat frisättning av kärnor, och således sannolikt möjliggör en mer självsäker fånga av transkriptionell profiler som representerar alla celler i en viss vävnad. Detta skulle, naturligtvis, endast ge en del av aktiviteten transkriptionell inom en given cell, således beroende på vad experimentella mål är av intresse detta tillvägagångssätt kan eller inte kan vara lämpliga.
Förutom fullständig karakterisering av cellulära identiteter inom en viss vävnad är en av de mest värdefulla analyserna för scRNA-Seq datamängder bedömningen av transkriptionell mellanlägen över 'definierade' cellpopulationer. Dessa förmedlande stater kan ge insikter om härstamning relationerna mellan celler inom identifierade populationer, vilket inte var möjligt med traditionella bulk RNA-Seq närmar sig. Flera scRNA-Seq bioinformatiska verktyg har nu utvecklats för att belysa detta. Sådana verktyg kan bedöma de processer som är involverade i, till exempel cancerceller som övergår till en onkogen/metastaserad stat, stamceller mognar till olika terminal öden eller immunceller skytteltrafik mellan aktivt och quiescent. Subtila transkriptom skillnader i celler kan också vara vägledande av härstamning fördomar att nyligen utvecklade bioinformatiska verktyg som FateID, kan härleda47. Eftersom skillnaderna mellan övergår celler kan vara svårt att få klarhet i tanke transkriptionell skillnaderna kan vara subtil, djupare sekvensering kan vara nödvändiga46. Lyckligtvis, täckning av ett grunt sekvenserade bibliotek kan ökas om intresserad sondera datamängden ytterligare genom att åter köra biblioteket på en annan flöde cell.
Detta protokoll tillsammans och ger en lätt-till-adapt arbetsflöde som möjliggör för användare att transcriptionally profilera hundratals till tusentals singel-celler inom ett experiment. Den slutliga kvaliteten på en scRNA-Seq datamängd är beroende av optimerad cell isolering, flödescytometri, cDNA bibliotek generation och tolkning av rå gen-barcode matriser. I detta syfte ger detta protokoll en omfattande överblick över alla viktiga steg som enkelt kan ändras för att möjliggöra studier av olika vävnadstyper.
Disclosures
Inga upplysningar
Acknowledgments
Vi erkänner stödpersonal vid anläggningen i UCDNA tjänster, liksom djur vård anläggning Personalen på University of Calgary. Vi tackar Matt Workentine för uppbackningen bioinformatik och Jens Durruthy för hans teknisk support. Detta arbete var finansieras av ett CIHR bidrag (R.M. och J.B.), en CIHR nya Investigator Award till J.B. och en Alberta barns hälsa forskning Institutet Fellowship (JS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Products | |||
| RNAse out | Biosciences | 786-70 | |
| Pentobarbital sodium | Euthanyl | 50mg/kg | |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | |
| Dispase 5U/ml | StemCell Technologies | 7913 | 5 mg/ml |
| Collagenase-4 125 CDU/mg | Sigma-Aldrich | C5138 | 2 mg/ml |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | 10mg/ml |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 15 ml Narrow bottom tube VWR® High-Performance Centrifuge Tubes | VWR | 89039-666 | |
| Sytox Orange Viability Dye | Molecular Probes | 11320972 | 1.3 nM/µl |
| Nuc Blue Live ReadyProbes | Invitrogen | R37605 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer High senitivity DNA Reagents | Agilent | 5067-4626 | |
| Kapa DNA Quantification Kit | Kapa Biosystems | KK4844 | |
| Chromium Single Cell 3' reagents | 10x Genomics | ||
| Equipment | |||
| BD FACSAria III | BD Biosciences | ||
| Agilent 2100 Bioanalyzer Platform | Agilent | ||
| Illumina® HiSeq 4000 | Illumina | ||
| Illumina® MiSeq SR50 | Illumina | ||
| 10X Controller + accessories | 10x Genomics | ||
| Software | |||
| The Cell Ranger | 10x GENOMICS | support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/overview/welcome | |
| Loupe Cell Browser | 10x GENOMICS | support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest | |
| R | https://anaconda.org/r/r |
References
- Shalek, A. K., et al. Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control for cellular variation. Nature. 510, 363-369 (2014).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161, 1202-1214 (2015).
- Zappia, L., Phipson, B., Oshlack, A. Exploring the single-cell RNA-seq analysis landscape with the scRNA-tools database. bioRxiv:206573. , (2018).
- Dulken, B. W., Leeman, D. S., Boutet, S. C., Hebestreit, K., Brunet, A. Single cell transcriptomic analysis defines heterogeneity and transcriptional dynamics in the adult neural stem cell lineage. Cell Reports. 18 (3), 777-790 (2017).
- Llorens-Bobadilla, E., et al. Single-Cell Transcriptomics Reveals a Population of Dormant Neural Stem Cells that Become Activated upon Brain Injury. Cell Stem Cell. 17 (3), 329-340 (2015).
- Trapnell, C., et al. The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells. Nature Biotechnology. 32, 381-386 (2014).
- Aibar, S., et al. SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering. Nature Methods. 14, 1083-1086 (2017).
- Mayer, C., et al. Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons. Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).
- Stratton, J. A., et al. Purification and Characterization of Schwann Cells from Adult Human Skin and Nerve. eNeuro. 4 (3), (2017).
- Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. G., Miller, F. D. Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny. Nature Protocols. 1 (6), 2803-2812 (2007).
- 10X Genomics. User Guides. , Available from: https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/ (2018).
- 10X Genomics. Chromium Single Cell 3' Training Module. , Available from: http://go.10xgenomics.com/training-modules/single-cell-gene-expression (2018).
- Agilent. , Available from: https://www.agilent.com/en-us/library/usermanuals?N=135 (2018).
- Kolodziejczyk, A. A. Single Cell RNA-Sequencing of Pluripotent States Unlocks Modular Transcriptional Variation. Cell Stem Cell. 17, 471-485 (2015).
- Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343, 776-779 (2014).
- Pollen, A. A., et al. Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex. Nature Biotechnology. 32, 1053-1058 (2014).
- 10X Genomics. Sequencing Requirements for Single Cell 3'. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sequencing/doc/specifications-sequencing-requirements-for-single-cell-3 (2018).
- Datacamp. Introduction to R. , Available from: https://www.datacamp.com/courses/free-introduction-to-r (2018).
- Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics#39; Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis. , Available from: https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357 (2018).
- 10X Genomics. User Guides. , Available from: https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/ (2018).
- UNIX Tutorial for Beginners. , Available from: http://www.ee.surrey.ac.uk/Teaching/Unix/ (2018).
- 10X Genomics. Creating a Reference Package with cellranger mkref. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/advanced/references (2018).
- 10X Genomics. System Requirements. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/overview/system-requirements (2018).
- 10X Genomics. Software Downloads. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest (2018).
- 10X Genomics. Aggregating Multiple Libraries with cellranger aggr. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/aggregate#depth_normalization (2018).
- 10X Genomics. Loupe Cell Browser Gene Expression Tutorial. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/tutorial (2018).
- scRNA-tools. A table of tools for the analysis of single-cell RNA-seq data. , Available from: https://www.scrna-tools.org/ (2018).
- Conda. Downloading conda. , Available from: https://conda.io/docs/user-guide/install/download.html (2018).
- Anaconda. r / packages / r 3.5.1. , Available from: https://anaconda.org/r/r (2018).
- Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics' Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis. , Available from: https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357 (2018).
- Satija Lab. Seurat - Guided Clustering Tutorial. , https://satijalab.org/seurat/pbmc3k_tutorial.html (2018).
- Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics' Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis. , Available from: https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357 (2018).
- Monocle. , Available from: http://cole-trapnell-lab.github.io/monocle-release/docs/#constructing-single-cell-trajectories (2018).
- Github. An R package to test for batch effects in high-dimensional single-cell RNA sequencing data. , (2018).
- Edgar, R. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nucleic Acids Research. 30, 207-210 (2002).
- Leinonen, R., Sugawara, H., Shumway, M. The sequence read archive. Nucleic Acids Research. 39, D19-D21 (2011).
- NIH. GenBank Submission Portal Wizards. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/account/register/?back_url=/geo/submitter/ (2018).
- NIH. Submitting data. , Available from: https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submission/ (2018).
- Shah, P. T., et al. Single-Cell Transcriptomics and Fate Mapping of Ependymal Cells Reveals an Absence of Neural Stem Cell Function. Cell. 173, 1045-1057 (2018).
- Anon, Method of the Year 2013. Nature Methods. 11, 1 (2013).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144, 3625-3632 (2017).
- Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq. Neuron. 96, 313-329 (2017).
- Zeigenhain, C., et al. Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
- Wu, A. R., et al. Quantitative assessment of single-cell RNA-sequencing methods. Nature Methods. 11 (1), 41-46 (2014).
- Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).
- Janes, K. A. Single-cell states versus single-cell atlases - two classes of heterogeneity that differ in meaning and method. Current Opinions in Biotechnology. 39, 120-125 (2016).
- Herman, J. S., Sagar,, Grün, D. FateID infers cell fate bias in multipotent progenitors from single-cell RNA-seq data. Nature Methods. 15 (5), 379-386 (2018).
