Summary
本稿では急性骨髄性白血病 (AML) 細胞増殖で複数の候補者の遺伝子の役割を簡単かつ迅速な捜査のためクラスター化定期的に空間短い回文を繰り返す (CRISPR) CRISPR ベース Cas9 方法を記述します。並列。この手法はスケーラブル、他癌細胞を同様に適用することができます。
Abstract
遺伝子摂動の研究は、急性骨髄性白血病の病因における個別遺伝子の役割を調べるため広く使用されています。これらの研究の多くをした完全な遺伝子破壊を達成するための複雑な遺伝子ノックアウト モデルを使用します。ノックアウト マウスとこれらの研究は、遺伝子型-表現型の関係を調査するためのエレガントで実績のあるシステムを提供しながら候補者の遺伝子を評価するための迅速かつスケーラブルな方法再生急性骨髄性白血病細胞増殖における役割またはアジア ・ マイル リミテッド モデルで生存複数の候補者の遺伝子の並列の尋問を加速するのに役立ちます。ゲノム編集技術の最近の進歩は、前例のない規模で遺伝的摂動を実行する当社の能力を大幅に強化しました。ゲノム編集の 1 つのようなシステムは、ターゲット細胞のゲノムに迅速かつ効果的な変更を加えるに使用することができます CRISPR ベース Cas9 の方法です。使いやすさとスケーラビリティ CRISPR/Cas9 を介した遺伝子削除のそれに 1 つ遺伝子の多数の尋問のための最も魅力的な技術表現型の試金。ここ、CRISPR/Cas9 を介した遺伝子破壊高スループット流れ cytometry による競争の試金と組み合わせてを使用して増殖に重要な役割を果たす可能性があります遺伝子の役割や人間の生存率を調査する簡易測定法を提案し、マウスの急性骨髄性白血病細胞株。
Introduction
過去数十年間は、急性骨髄性白血病 (AML) の病因に重要な分子経路の貢献を識別するのに焦点を当てた多くの研究努力を見てきました。伝統的に、急性骨髄性白血病細胞における遺伝子破壊は条件付きノックアウト マウスまたは短いヘアピン RNA (shRNA) を使用して行われています。ノックアウト マウスは、遺伝子欠失の時空間的制御のための洗練されたシステムを提供する間は、手間、時間がかかり、高価なは遺伝子ノックアウト マウスを生成します。さらに、遺伝子のノックアウト再結合戦略を使用して拡張が容易ではないです。これらの戦略は並列で複数の遺伝子の尋問によく自分自身を貸すか。小さい干渉の RNA (siRNA) または shRNA を使用してノック ダウン内因性 Mrna に RNA 干渉法の発見は後の多くのグループ AML の特定の遺伝子の役割を調査する RNA 干渉技術を使用し始めた。マウスとヒトの急性骨髄性白血病細胞は脂質ベースのトランスフェクションを伝統的な方法を使用して transfect に困難なのでほとんど lentivirally 採用、レトロ ウイルスでエンコードされた shRNA 急性骨髄性白血病細胞における遺伝子の機能を研究するための研究します。最近の発見は、定期的に空間の短い回文繰り返し (CRISPR) をクラスター化し、関連付けられた Ca 核酸 (CRISPR Cas9) は遺伝子ターゲティング技術1,2,3に革命をもたらしました。CRISPR Cas9 を使用して、特定の遺伝子やゲノム領域削除、編集またはできますが付いた検索効率と使いやすさ。CRISPR ベース Cas9 遺伝子編集は、シンプルさ、有効性、この技術の幅広い適用性などの多様な細胞型の遺伝子型-表現型の関係を調査するための選択の方法として現れている今。CRISPR ベース Cas9 の方法も急性骨髄性白血病、個々 の遺伝子の尋問だけを目的としたアレイまたはプールされた遺伝的画面に複数の遺伝子を対象とする方法としても可能性として並列にいくつかの遺伝子の調査での選択の方法になっています。アジア ・ マイル リミテッド依存関係4,5,6。
本稿では、安定した CRISPR Cas9 仲介された遺伝子 - に続く編集高スループット フローサイトメトリーに基づく急性骨髄性白血病細胞の成長の遺伝子破壊の影響を測定するための単純な競争力のある成長アッセイをについて説明します。このメソッドは、シンプルで効率的、かつ急性骨髄性白血病細胞における並列にいくつかの遺伝子の役割を調査するため媒体スループット実験にスケーラブルです。
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Protocol
1. 生成 AML 細胞ライン クローン安定的かつアクティブな Cas9 の高発現と
- Cas9 レンチ ウイルスの生産
- 日 0: 4 x 10 DMEM のバイオ セーフティ レベル 2 の 10 cm の細胞培養用ディッシュ L-グルタミンとペニシリン 10% 牛胎児血清 (FBS) 10 mL (BSL2)6 293 t 細胞は細胞文化フードを認定されています。37 ° C の定温器に料理を配置します。
- 1 日目: メッキ 293 t 細胞は 1 日に 70-80% の合流をする必要があります。トランスフェクション午後に次のプロトコルを使用してを実行します。
- 暖かいトランスフェクション媒体、文化メディアと部屋の温度にトランスフェクション試薬。Transfection のためのすべての必要なプラスミドを解凍します。
- PsPAX2、pMD2.G の 0.9 μ g、トランスフェクション 5 mL チューブ中の 500 μ L で pLenti Cas9 プラスミドの 9 μ g のミックス 9 μ g。
- 底部チューブ ラウンド 14 mL にトランスフェクション媒体の 1.7 mL を追加します。管の壁に触れないようにする管でトランスフェクション媒体に直接トランスフェクション試薬の 57 μ L を追加します。
- 優しくトランスフェクション試薬溶液に全プラスミド ミックスを追加し、そっと側にチューブをタップして混ぜます。20-30 分の室温で混合物を孵化させなさい。一方、シード 293 t プレートから媒体を変更します。
- プレートに滴下トランスフェクション ミックスを追加し、優しく高効率混合の横にプレートをロックします。37 ° C の定温器にプレートを配置します。
- 2 日目: セルを邪魔またはプレートから外れがないように優しくトランスフェクション プレートから上清を吸引します。上清を捨てます。新鮮な 10 %dmem 培地 10 mL を追加するには、セルを外れを避けるためにプレートの側面から軽く滑って。
- 3 日目は、10 cm の滅菌注射器にそれを描画することによってゆっくりとトランスフェクション プレートから上清を含むウイルスを収集します。注射器に収集された清は、シリンジに滅菌 0.45 μ M フィルターを添付、新鮮な滅菌 15 mL ポリプロピレン円錐管に注射器とフィルターを保持します。0.45 μ M のフィルターを通して 15 mL ポリプロピレン製コニカル チューブに上清を含むウイルスをフィルターする注射器を優しく突入します。
- -80 ° C で 2 mL クリオバイアル各 2 mL の因数でウイルス馴化培地を保存します。
- 急性骨髄性白血病細胞の情報伝達
- 日-1: 希釈滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) と 10 μ g/mL に 1 mg/mL 組換え人間フィブロネクチン フラグメント ストックします。コート組織文化は、承認 BSL2 細胞文化フードの 10 μ G/ml 組換え人間フィブロネクチン フラグメント作業溶液 2 mL で 6 ウェル プレートを扱われます。一晩室温で保管蒸発損失を避けるためにしがみつくラップでプレートをラップします。
- 0 日目: は、Cas9 を含むウイルス上清を解凍します。Spinfection の直前にコーティングされたプレートから完全に組換えの人間フィブロネクチン フラグメント ソリューションを吸い出しなさい。プレートに Cas9 とウイルスの馴化培地 2 mL を追加し、35 ° C で 90 分 1,300 x gでスピンこれはよく spinfected を付けるウイルス粒子が役立ちます。
- 一方、導入されるセルを数えると 2 x 10 の6セル 15 mL ポリプロピレン円錐管でスピンダウンします。上清を吸引し、新鮮な培地 2 mL にペレットを再懸濁します。
- Spinfection 後、すべてのウイルス上清、spinfected からも取り外して廃棄します。上清からレトロ ウイルス粒子は、spinfected の下部にも添付されます。これにも、上記の手順から媒体の 2 mL で再停止される 2 x 10 の6セルを追加します。
- 再び 1,300 x でg非常に簡単に (1-2 分) セル下部に定住するように十分なプレートをスピンします。インキュベーターにバック プレートを置き、井戸に接続されている spinfected ウイルス粒子と伝達のため一晩おきます。
- 1 日目: 細胞密度によって、増殖を避けるために導入された細胞に多くのメディアを追加します。
- 2 日目: pLenti Cas9 プラスミドはブラストサイジン抵抗マーカーがあるので 10 μ G/ml 投与導入された、untransduced (コントロール) MOLM13 ブラストサイジンまたは MLL AF9 マウス白血病細胞発現細胞 Cas9 の選択を追加します。
注:Untransduced コントロールのすべてのセルが除外されるとき、完全な Cas9 導入の MOLM13 または MLL AF9 白血病細胞のブラストサイジン選択と見なされます。以外の MOLM13 と MLL AF9 の白血病細胞株至適投与量を用いることができるように、用量応答曲線はこの実験の前に実行して必要があります。ウイルス上清の滴定は、低伝達率の場合も実行できます。
- 高 Cas9 表現するセルの選択範囲を複製します。
注:我々 は、いくつかの急性骨髄性白血病細胞株のクローンの選択する必要はありません気づいた: 一括選択 Cas9 ブラストサイジン人口はすでにいる高性能ゲノム編集します。この場合、手順 1.3 をスキップして手順 1.4 西部にしみが付くことによって一括 Cas9 ブラストサイジン急性骨髄性白血病細胞における Cas9 発現を評価するために移動することが可能です。それはまだ競争の試金に進む前にそれらの一括 Cas9 AML 細胞 (ステップ 1.5) で遺伝子編集効率を評価することが重要でしょう。我々 は単一高 Cas9 クローンの選択が異なる単一ガイド Rna (sgRNAs) の数をテストする場合に特に重要ですゲノム編集変動を減少させることを推測します。- 単一セルの並べ替え Cas9 ブラストサイジン選択 MOLM13 と MLL AF9 の白血病細胞がそれぞれ、MOLM13 Cas9 と MLL AF9 Cas9 セルと呼ぶ承認 BSL2 フードに含まれる FACS ソーターを使用してを実行します。5-10 丸底組織培養治療 96 ウェル プレートに並べ替えを実行できます。
- 単一 MOLM13 Cas9 と MLL AF9 Cas9 クローン ピックアップされているし、個別に名前をブラストサイジンの 10 μ G/ml Cas9 式の維持培と 10-20 クローン。
- 式をイムノブロット安定 Cas9 蛋白質をチェックします。
- 製造元のプロトコルに従って核抽出キットを使用して MOLM13 と MLL AF9 の白血病のすべての選択したブラストサイジン クローンの核抽出液を作る。反フラグ M2 抗体 pLenti Cas9 プラスミドの Cas9 以来 N 末端 Flag エピトープにリンクされるを使用して Cas9 蛋白質の表現をチェックします。
- 10% ビス トリス ゲルし、アッパー バンドはよく分かれているまで、120 V でゲルを実行に各核エキスから総蛋白の 50 μ g をロードします。
- 1 h の TBST バッファーで 5% ミルク ソリューションと膜をブロックします。
- 縮尺 4 ° C で 1 μ G/ml の最終濃度は一晩で反フラグ M2 抗体の希釈で膜を孵化させなさい。
- 次の日は TBST バッファーを持つ膜を洗って 1 時間室温で 1:5,000 (0.16 μ G/ml の最終的な集中) の希釈で HRP 共役抗マウス抗体とインキュベートします。
- TBST で徹底的に膜を洗浄し、ECL 基板を用いたしみを開発します。
- 西部のしみの詳細な機能分析 (図 1) で見られるように Cas9 の最高蛋白質発現と 3-4 のクローンを選択します。
- 選択されたクローンの高 Cas9 活動の確保
- 人間を対象とする sgRNAs と sgRNA エンコード ベクトルからレンチ ウイルス上清を準備または手順 1.1 で説明されているように AAVS1 セーフハーバー軌跡をマウスします。
- 上部の Cas9 を表現する MOLM13 を変換または MLL AF9 白血病・上記 spinfection 法を用いた抗 AAVS1 sgRNA のレンチ ウイルス上清をクローンします。4 日間の 2.5 μ g/mL ピューロマイシンを選択します。
- 製造元の指示に従ってゲノム DNA 抽出キットを使用してそれぞれの野生型コントロールと共にピューロマイシンを選択後 MOLM13 Cas9 または MLL AF9 Cas9 白血病のクローンからゲノム DNA を浄化します。Taq のポリメラーゼと表 1に記載されている PCR プログラムのマスター ミックス × 2 を使用して、AAVS1_test_primers と pcr のテンプレートとして DNA の使用 50 ng。
- 2% の agarose のゲルの PCR の製品を実行し、ゲルは、製造元のプロトコルに従ってゲル抽出キットを使用して 268 塩基対バンドを浄化します。サンガー シーケンス ゲル精製 AAVS1_target frag_F プライマーを用いた PCR の製品です。
- 編集 AAVS1 の比較とオンライン web ベースのツール (図 2) を使用して野生型シーケンス編集効率を評価します。
2. クローニングと急性骨髄性白血病 Cas9 細胞における sgRNAs の伝達
-
SgRNAs のクローニング中スループット
- Web ベースの CRISPR デザイン ソフトウェアを使用して興味の遺伝子のための 4-6 sgRNAs をデザインします。CRISPR デザイン ツールの数利用できるあるオンライン入力の DNA シーケンスに基づいて sgRNA シーケンスを生成する http://crispr.mit.edu/ など。
- アスタリスク付きのフィールドに適切な情報を入力します。SgRNA 設計のためのターゲット ゲノムをクリックします。シーケンスボックスでターゲット シーケンスを貼り付け、 [送信] ボタンをクリックします。
- PKLV2 U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - で複製用 W sgRNA 発現プラスミド、注文する前に感覚オリゴと逆補完アンチセンス オリゴに"AAAC"に"CACC"ヌクレオチドを付加します。96 ウェル プレートでの予混合の順序と反感覚 oligos オリゴヌクレオチド合成会社からオリゴ ミックスを分類しました。
注:我々 はした pKLV2 U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - の使用 W プラスミド sgRNA のクローニングのために BbsI 制限のサイトを持っています。他の sgRNA の発現プラスミドを使用する場合 sgRNA オリゴヌクレオチド用オーバー ハングを適切に変更する必要があります。 - 焼鈍板のラベル別 U 下 96 ウェル プレートを取る。1 μ L のマスター ミックスを作る T4 PNK、T4 DNA 結紮バッファー x 10 の 1 μ L とアニーリング反応あたりの水の 6 μ L。
- アニーリングのプレートの各ウェルにマスター ミックスの 8 μ L を追加します。1 μ L 各 100 μ M のセンスとアンチセンス オリゴ (または追加 2 μ L 混合意味アンチ意味 oligos の) マスター ミックス。ピペットの 2-3 回軽くよく混ぜて、井戸の底にミックスを簡単にプレートをスピンします。
- PCR マシンに次のアニーリング プログラムを使用: 95 ° C で 2 分 30 秒 37 ° C で 30 分が 0.1 の割合で 22 の ° C の低速冷却続いて ° C/s。焼鈍後、希釈 OligoMixラベル新鮮な 96 ウェル プレートを取る。この板でマルチ チャンネル ピペットを使用して水 (レバレッジ) と上記反応からリン酸化及び焼なまし oligos を希釈します。
- PKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - のダイジェスト 5 μ W ベクトル BbsI 制限酵素 (10,000 台/mL) の 1.5 μ L で結紮後のリニア化する適切なバッファーを 37 ° C で 2 時間使用します。
- 結紮プレートラベル新鮮な 96 ウェル プレートを取るし、20 を追加、BbsI の ng 消化 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - pKLV2-U6gRNA5 W ベクトル目的 sgRNA 結紮あたり 1 つの井戸に。これに、希釈 OligoMixプレートからリン酸化、焼なまし oligos の 2 μ L を追加します。
- 10 x T4 リガーゼ バッファーの 1 μ L と T4 DNA リガーゼの酵素の 1 μ L を追加します。ゆっくりとマルチ チャンネル ピペット ピペットし、結紮ミックス 2 時間室温で孵化させなさい。
注:結紮ミックスは、変換ステップ後の-20 ° C で保存できます。 - 一方、化学的に有能なエシェリヒア属大腸菌の雪解け 90 μ L 細胞氷上結紮のステップの終わりの前に 10 分。
- マルチ チャンネル ピペットを使用して、別 96 well プレートの各ウェルに有能なセルの 10 μ L の因数を作る。
- 含まれている有能なセル、ピペットを上下軽くステップ 2.1.8 から結紮混合物を追加し、室温で 10 分間インキュベートします。
- ピペット 5 μ L、6 に上記の反応から直接細菌 DNA のミックスのウェル プレート 100 μ g/ml のアンピシリン LB 寒天培地を含みます。変換反応のそれぞれに対して繰り返します。
- 6 ウェル プレートの別々 にラベルにそれぞれ変換反応をプレートします。それぞれに約 5-8 ガラスビーズも、円形の動きで全体 6 ウェル プレート 8-10 回を振るを追加します。
- 滅菌 20 μ L ピペット チップの各ウェルから 1-2 シングル コロニーをピックアップし、LB 寒天と 100 mg/mL アンピシリン滅菌 10 cm シャーレに慎重に標識の場所にそれを連勝します。LB プレートにストリー キング、単に対応する細菌のクローン番号付いている底部チューブ ラウンド 14 mL に含まれている媒体 LB アンピシリンの 3 mL に飛び込んだクローン用先端をイジェクトします。
- サンガーの直接細菌のプレートを送る人間 U6 プロモーター進むプライマーによるシーケンスします。
- クローンとして作られた sgRNAs の順序の確認の後の製造元の指示に従って小型準備キットを使用して対応する 14 mL チューブから DNA を浄化します。
- 分光光度計と濃度とミニ プレップの品質を測定します。SgRNA クローン プレート標識 96 well プレートに 15 ng/μ L のピペット濃度各小型準備を正規化します。
注:このプレートは、-20 ° C で保存またはウイルスの準備のために直接使用できます。
- Web ベースの CRISPR デザイン ソフトウェアを使用して興味の遺伝子のための 4-6 sgRNAs をデザインします。CRISPR デザイン ツールの数利用できるあるオンライン入力の DNA シーケンスに基づいて sgRNA シーケンスを生成する http://crispr.mit.edu/ など。
-
ウイルスの生産の sgRNA の構造と情報伝達
- 96 ウェル フォーマットで sgRNA レンチ ウイルス粒子の生産のために従う、「shRNA/sgRNA/ORF 高スループット ウイルス生産 (96 よく)"ブロード研究所の遺伝的摂動プラットフォーム (GPP web ポータル) からプロトコル (URL: https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols)。
- 生殖不能の管にウイルス上清 200 μ L を転送し、すぐに-80 ° C で凍結します。
- 日-1: コート BSL2 細胞文化フードの 10 μ G/ml の濃度で組換えヒト フィブロネクチン フラグメントの 100 μ L で底が平らな非組織文化治療 96 well プレートです。蒸発損失を避けるために、ベンチで一晩置いておくしがみつくラップを使用してプレートをラップします。
- 日 0: 各ウェルから遺伝子組換えの人間フィブロネクチン フラグメントを削除します。室温で各 sgRNA のウイルス上清を解凍します。各伝達板のコーティングに各チューブからウイルス上清の 50 μ L を追加します。35 ° C で 90 分 1,300 x gで伝達プレートをスピンします。
- Spinfection の終わりに MOLM13 Cas9 (クローン B3) 細胞培養用フラスコからをカウントします。100 μ L のボリュームの井戸あたり 10,000 のセルを使用します。デッド ボリュームを考慮したすべての伝達の井戸のセルをカウントします。
- 90 分 spinfection 後プレートを傾けることによってゆっくりと 50 μ L に調整、マルチ チャンネル ピペットを使用してすべての井戸から上清を削除します。MOLM13 Cas9 クローン B3 セルの文化の 100 μ L を追加すると、各もゆっくりと滑って縁から。
- セルの下に解決させる 35 の ° C で 2 分間 1,300 x gでプレートをスピンします。プレートを 37 ° C の組織培養グレードのインキュベーターに転送します。
- 1 日目: 新鮮培地も含む各 sgRNA の 100 μ L 導入 Cas9 MOLM13 または Cas9 MLL AF9 白血病細胞の最終的な中量 200 μ L を追加します。
3. 競争力のある成長分析
- 日 3:72 時間 (3 日目) 伝達をポスト, フローサイトメトリー (FACS) による各ウェルで BFP 陽性細胞を含む sgRNA の割合をチェックします。マークし、死んだ細胞を解析から除外する細胞生存性染料を使用します。
- 新しい井戸にアッセイ中増殖を避けるためにすべての FACS 解析後新鮮な培地で細胞の割合を再メッキを続行します。
-
BFP の負 (BFP ve) 対応 (図 3) に比べて BFP (BFP + ve) 陽性細胞の割合をチェックするごとに 2-3 日間 FACS 解析を繰り返します。(FlowJo または類似の FACS 解析ソフトウェアを使用して) 各時点の BFP 陽性細胞の割合を分析します。
- FlowJo ソフトウェアに各サンプルの Fcs ファイルをドラッグします。任意の 1 つのサンプル ファイルをダブルクリックし、対側方散乱 (SSC) の FSC と X 軸と SSC Y 軸上前方散乱 (FSC) のドットのしみをプロットします。すべてのセルをゲートします。
- ゲートのセルをダブルクリックし、対 FSC 高さ (H) または領域 (A) 点のしみ (Y 軸) 上の生存率染色上にプロットします。ゲート生存率は負 (ライブ) 細胞を染色します。
- ゲートの生きているセルをダブルクリックし、X 軸に FSC (A) 対 (Y 軸) 上 BFP のプロットします。ゲート BFP + ve の細胞。[グループ] タブの下ですべてのサンプルに選択したサンプルをドラッグしてすべてのサンプルにすべてのこれらのゲートを適用されます。
- すべてのサンプルの分析表を作成する表エディターをクリックします。テーブルに 1 つのサンプルからBFP + veの数をドラッグし、 BFP + veのセルの割合を表示するテーブルを含むすべてのサンプルのバッチ レポートを作成するテーブル エディターの表示] ボタンをクリックします。Xls としてテーブルを保存します。
- 比例した増加を計算や時間をかけて生きている細胞集団内 %bfp 陽性細胞の減少 (ルシフェラーゼ、スクランブルなど GFP sgRNA) 制御 sgRNAs で BFP 陽性細胞の比率にこの比率を比較します。
- ベースラインとして 3 日目を使用して、コントロールと同様に、興味の遺伝子を含む異なる sgRNAs の BFP 陽性細胞の比率をプロットします。
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Representative Results
本研究で我々 は最初高力価ウイルス Cas9 ブラストサイジン レンチ ウイルス プラスミドをエンコードと MLL AF9 転座をクマ MOLM13 ヒト急性骨髄性白血病細胞株を導入しました。私たちの手では、一括未整理 MOLM13 Cas9 セル西部にしみが付くことによって高レベル Cas9 式表示されずもしていないメソッドを編集-使用して高効率な遺伝子の場合に、7を前述しました。したがって、我々 は、単一細胞のクローンを確立し、西部しみが付く (図 1) で見られるようにだけ Cas9 の高レベルのクローンを選択に進んだ。我々 は 2 つの異なるクローンを選んだし、説明以前7として AAVS1 セーフ ハーバーの軌跡のサイトをターゲット sgRNAs を導入しました。ピューロマイシンを選択 MOLM13-Cas9-AAVS1 sgRNA から抽出したゲノム DNA を使用してクローン サイトをカット AAVS1 sgRNA にまたがるプライマーを用いて PCR を行った、サンガー シーケンス MOLM13 クローンごと隔離された植民地 10 から特定 268 bp PCR の製品。親シーケンスに配置、MOLM13 Cas9 クローン B3 と MLL AF9 Cas9 クローン 8 が 100% (データは示されていない) の効率性を持っていたことがわかった。我々 は、これらのクローンは、Cas9 を介したゲノム編集能力が高く、sgRNA 競争の試金を表示するを選択しました。これらの研究が実施されている間、急速にサンガー シーケンスからゲノム編集効率をテストするための web ベースのツールは潮8 (https://www.deskgen.com/landing/tide.html) や氷 (https://ice.synthego.com/#/) などの異なるグループによって開発されました。これらのツールは、非常に簡単かつ個々 のフラグメントをクローンし、クローンを複数のシーケンスを実行することがなくゲノム編集効率を評価するために費用効果が大きい。したがって、一括 Cas9 を表現する細胞はゲノムのこれらのメソッドを使用して効率を編集の最初テスト必要があります。ゲノム編集効率が高い場合に、単一細胞のクローン作成は不要です。また、私たちの研究に見られるように、その単一細胞のクローニングが必要な場合にこれらの web ベースの突然変異頻度の推定ツール提供平行していくつかのクローンのテスト法がはるかに高速です。
SgRNA のクローニングを行った複製プラスミド pKLV2 U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - sgRNA の使用 W は、青い蛍光タンパク質 (BFP) sgRNA 導入細胞と、RNA ポリメラーゼ III 駆動人間 U6 プロモーターの発現をドライブを追跡するための港湾トレーサー RNA (tracRNA) 足場と共にクローンとして作られた sgRNAs。このシステムを使用して、DOT1L、エピジェネティックな遺伝子発現制御に重要な役割を再生するのに知られていた蛋白質をターゲット 2 sgRNAs のクローンを作成しました。DOT1L は、ターゲット遺伝子9,10堆積物のモノ、ジおよびトリ メチル化ヒストン メチルトランスフェラーゼです。研究では、DOT1L は、MLL 融合遺伝子による急性骨髄性白血病で重要な役割を果たしていることを示しています。したがって、CRISPR Cas9 を使用して DOT1L 抜きは大幅以前研究11,12,13,14に沿ってマウス MLL AF9 の白血病細胞の増殖を阻害するリードする予定です。ターゲット AAVS1 セーフハーバー軌跡は、PPP1R12C 遺伝子のイントロンは、2 つの sgRNAs を使用しました。このサイトのゲノムの変化の生産 sgRNAs は MLL 白血病細胞株の増殖能力への影響を持っている可能性がありません。肯定的な制御としてターゲット DNA 複製関連遺伝子 RPA3 sgRNAs のクローンを作成します。RPA3 は、いくつか急性骨髄性白血病細胞ライン4,15,16の増殖に重要であることが示されているパン必須遺伝子です。反 RPA3 sgRNAs したがって急性骨髄性白血病細胞で強い抗増殖効果を表示、通常肯定的な制御として使用されます。BFP + ve の相対的な割合を測定した反 AAVS1 と反 RPA3 の sgRNA プラスミドを伝達後、sgRNA 導入 BFP ve 相手と比較して細胞文化 (図 3) で 2-3 日。上記で説明したプロトコルと MOLM13 または MLL AF9 急性骨髄性白血病細胞の情報伝達は untransduced 残りの 30-40% セルを残し、ウイルスの準備を 60-70% 伝達効率や BFP-ve のすべての井戸で起因しました。これにより同じ野生型細胞ゲノム編集セルの相対増殖に関する研究もできます。SgRNA 導入細胞の割合に比例して増減は、sgRNA の機能の効果を反映する測定仲介 MOLM13 Cas9 細胞における遺伝子欠失を使用されました。興味の遺伝子がテスト急性骨髄性白血病細胞の増殖のために重要である場合、sgRNA のこの遺伝子の中断につながる sgRNA 表現 BFP + ve BFP ve 細胞と比較して細胞の相対的な減少アッセイのコースの中にsgRNAs ルシフェラーゼをターゲット、GFP や非本質的な遺伝子が保持 BFP + ve に対し時間をかけて/ve の比。
2 別の反 RPA3 sgRNAs を使用して、我々 は BFP の割合の漸進的な減少を観察 + ve 細胞に比べて BFP ve untransduced 対応。対照的に、反 AAVS1 sgRNA 発現 BFP 細胞の割合は比較的一定時間をかけて、AAVS1 ターゲットがありません (図 4 a) MOLM13 細胞の増殖に及ぼす影響を示します。同様に、マウス MLL AF9 Cas9 細胞のロドプシン (Rho1)、ネガティブ コントロールと Dot1l、時間をかけて MLL AF9 白血病細胞の増殖のために知られているエピジェネティックなレギュレータ目色素遺伝子をターゲットと sgRNAs の影響を調べた.この研究、BFP + ve 2 別の反 DOT1L sgRNAs で導入したマウス MLL AF9 Cas9 細胞は BFP ve sgRNA 非導入細胞 (図 4 b) と比較して時間の経過とともに劇的な進歩的な損失を示した。対照的に、時間の経過とともに反 Rho1 sgRNA の比率は比較的変わらずに残った。これらの結果は、Dot1l 枯渇マウス白血病細胞を表現する、以前に公開された結果を確認する MLL AF9 の脆弱性を示しています。
図 1: 代表西部のしみ方結果表示異なる Cas9 レベル。CAS9 で導入した MOLM13 急性骨髄性白血病細胞株の単一細胞クローンは、反フラグ抗体を用いたフラグ Cas9 発現量のプローブされました。Cas9 の最高の表現を示すクローンは、さらなる研究に選ばれました。HEK293 T 細胞は、発現プラスミドは、ネガティブ コントロールとして肯定的な制御や Cas9 非導入 MOLM13 セルとして使用された Cas9 と transfected。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: ゲノム編集氷解析による評価 Dot1l 座の代表的な解析します。Dot1l sgRNA ・ ターゲット ・ サイトを中心とした PCR 増幅され、サンガー シーケンス氷解析を用いています。SgDot1l シーケンス (オレンジ ライン) と非ターゲット DNA シーケンス (グリーン ライン) の比較は、編集 sgRNA ターゲット サイトを対象とした sgDot1l 電池の効率の高レベルを示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 手法の概略ワークフロー 。sgRNAs は、sgRNA 式ベクトル BFP など蛍光タンパク質の共発現で複製されます。標的細胞は伝達率の 30-60% で導入、cytometry 流れ続いてすべての 2-3 日。sgRNAs 急性骨髄性白血病細胞の増殖に必要な遺伝子をターゲットと示すように時間をかけて相対的な枯渇が表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 人間の競争の試金とマウス急性骨髄性白血病細胞から代表の結果します。(、) の結果は、RPA3 の減少は、MOLM13 Cas9 クローン B3 セルを導入統計的に非常に重要な進歩を表示します。対照的に、sgRNAs AAVS1 サイトをターゲット効果があるありません。ターゲットに Dot1l (b) sgRNAs は、ロドプシン (Rho) をターゲット sgRNAs と対照をなして、競争力のある細胞増殖における顕著な減少を示します。p > 0.05。p < 0.05。誤差範囲は、平均 (SD) の標準偏差を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: プロトコルの一般的なアウトライン。(、) Cas9 ウイルスと記述されている sgRNA のクローニングの生産の各ステップのための時間。安定した Cas9 式急性骨髄性白血病細胞の単一クローンを生成中デザインと sgRNAs のクローン作成を実行できます。(b) sgRNAs FACS を用いた競争成長試験急性骨髄性白血病細胞の情報伝達のための一般的なプロトコルが表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| サイクル | サイクルの期間 | 温度 |
| 1 | 2 分 | 95 ° C |
| 35 | 30 s | 95 ° C |
| 30 s | 55 ° C | |
| 30 s | 72 ° C | |
| 1 | 5 分 | 72 ° C |
| ホールド | 無限 | 4 ° C |
表 1: AAVS1 軌跡増幅 DNA の PCR プログラム。PCR プログラム AAVS1 軌跡クローンを表現する Cas9 の Cas9 のテストの切削効率の genomic DNA からの増幅に使用されます。
の補足ファイル: sgRNA オリゴ シーケンス。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
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Discussion
本稿では、人間/マウス急性骨髄性白血病細胞 (図 5) でフローサイトメトリーを用いた急性骨髄性白血病細胞株における候補者の遺伝子の役割を調査する競争力のある成長の CRISPR ベース Cas9 アッセイを行うための詳しいプロトコルについて述べる。分析の目的は、中規模で 2、3 週間以上の急性骨髄性白血病細胞の増殖維持に関する遺伝子欠失の影響を識別するためにです。いくつかの重要なステップは説明プロトコルのスケール アップしやすく慎重に従われる必要があります。Cas9 レンチ ウイルスの生産、293 t 細胞の上清を含むウイルスへのキャリー オーバーを避けるために 0.45 μ M のフィルターを通してエアコン ウイルス中にフィルターを適用する必要は。Spinfection 中、spinfection 板パラフィルムやしがみつくの折り返しにより遠心分離中に潜在的な汚染を回避できます。しかし、組織培養のインキュベーターで戻る spinfected プレートを配置する前にラップを削除必要があります。編集効率の Cas9 発現クローンを評価するために非常に重要です。低ゲノム編集効率を持つクローンは不十分な Cas9 活動を反映し、実験の成功率に影響を与える可能性があります。実験では、まず AAVS1 軌跡をターゲット sgRNAs をアジア ・ マイル リミテッド Cas9 クローン人間を導入し、効率を編集するためにゲノム Dna の塩基配列。編集 AAVS1 の比較と野生型のシーケンスは、潮8 (https://www.deskgen.com/landing/tide.html) や氷 (https://ice.synthego.com/#/) などのオンラインの web ベースのツールを使用して評価できます。これらのプログラムは、サンガー潜在的編集された PCR のシーケンス トレース未編集の野生型または参照シーケンスするフラグメントを変更の頻度を推定を比較します。これ変異細胞の Cas9 活性の測定であるテスト sgRNA によってもたらさを評価する迅速な方法です。また、PCR のクローニング PCR クローニング プラスミドに製品など、クローンとして作るベクトル鈍のトポを実行できます、続いてサンガーする各クローンの配列アラインメントによるゲノム編集効率を評価するために個々 のコロニーのシーケンス、野生の種類。我々 は、その使いやすさとクローンの作成方法と比較して費用対効果を与え, 前者の方法を好みます。通常、塩基対の発見の点突然変異, オクターリピートなど変更します。 の広大な大多数の sgRNA 切断サイトの周り、またはシーケンスされたクローンは、非常にアクティブな Cas9 の存在を示します。したがって、我々 は MOLM13 または MLL AF9 白血病クローン B3 と 8、それぞれ、さらに実験のための最高の編集効率を選んだ。
Http://crispr.mit.edu/、sgRNAs のリストを与える web ベースのソフトウェアを使用してプロトコルに記載の異なる遺伝子をターゲット sgRNAs を考案しました。予測対象を効果とのそれらを除去するためにリストからトップ得点 sgRNAs を選択することをお勧めします。設計された sgRNAs は、(http://www.addgene.org/67974/) のウェブサイト上の 1 つなどの公開されているプロトコルのいずれかを使用して複製できます。センスとアンチセンス oligos 最初リン酸化、2.1.5 ステップに従って熱処理しました。37 ° C でまずは oligos T4 キナーゼのリン酸化のために重要とその後の PCR サイクル dsDNA にセンスおよびアンチセンス オリゴヌクレオチドのアニーリングのため重要です。それは競争の試金の導入 sgRNA 細胞を追跡するために重要である sgRNA のクローニング ベクトルに蛍光タンパク質を持つことが重要です。焼鈍と結紮術などを含むすべての段階で 96 well プレートの使用と sgRNA のクローニングがスケール アップ。結紮、きれいな PCR チューブ ストリップは、マルチ チャンネル ピペットと互換性があるので使用もできます。有能なセルを 10 μ L の 96 ウェル プレートは、各井戸前検体、sgRNA のクローンの大きいセットの変換が必要なケースで-80 ° C で凍結は、全体のプロセスを促進するために使用できます。ライゲーション反応をメッキの目的は、96 ウェル形式で行うことは困難である個々 のコロニーを拾うことです。したがって、細菌の変形のためのスケーラビリティのわずかな損失があります。まだ、全体の 96 ウェル プレートから変換反応のめっき、用もそれだけ全体のプロジェクトのための 16 の 6 ウェル プレートの合計が必要になります。変換プレートからコロニーを拾うは、次の手順に注意する必要があります。ストリー キングしながらラベル スポットの植民地は、点が他の点から明確に分離されてを確認します。暗い永久的なマーカーと、シャーレの底面の正方形グリッドをマーキングは、細菌のクローンのクロス汚染を防ぐのに役立ちます。
SgRNA 構造体の minipreps は、準備ができて、一度ウイルスは 96 ウェル形式で可能です。スループットのこのレベルでは、ウイルスを含む上清 200 μ L をフィルターする実用的ではありません。したがって、ウイルス上清は、上澄みを持ち越して、293 t 細胞からの交差汚染を避けるために、少なくとも一晩冷凍する必要があります。格納することも滅菌 PCR チューブに 50 μ L の因数でストリップを避けるためには、上澄みの分かれるフリーズします。さらに、これらのエアコン ウイルスの培養上清は、急性骨髄性白血病細胞の伝達に使用されます。低抗体価の場合ウイルス伝達は観察される細胞、BFP + ve の低周波により評価したし、ウイルスの力価および感染症 (MOI) 40-60% を確保するための異なる多様性のテスト伝達を決定する必要があります。伝達率。ウイルス力価の定量と慣性モーメント計算の説明の詳細ここで17。プロトコルの手順 3 で説明した競争の試金で非 BFP 比 BFP の分析中自動蛍光からスプリアスの工芸品を防ぐために非実行可能な細胞を除外する非常に重要なです。テスト サンプルを分析する前に、FACS の時負 BFP と BFP 肯定的なコントロールの使用は正確に電圧を設定する勧めします。それぞれの再メッキの時点で再メッキするセルのボリュームは時間時点で細胞の集中によって決まります。私たち通常再メッキ 200 μ L の合計から 20 μ L 各時点で新鮮な井戸の中へ新鮮な媒体の 180 μ L とします。優しく上下に再メッキする前にちょうどピペッティングにより細胞の徹底した混合することをお勧めします。通常、我々 は、アッセイに 15-20 日間に実施される必要があることを観察している強い予告変更 BFP + ve/ve 比遺伝子から遺伝子にもよりますが。
この実験のセットアップは、急性骨髄性白血病細胞の増殖または生存に候補者の遺伝子の役割を迅速に識別するために複数の急性骨髄性白血病細胞株における平行していくつかの遺伝子のテストに適しています。ここで説明した競争力のある拡散の試金の 1 つの警告は、それが考慮されないこと同じ内非ターゲット細胞の人口に影響を与える遺伝子をターゲットとした細胞からイベントをシグナル パラクリンなど潜在的な細胞外因性要因もです。にもかかわらず、これはまれな出来事かもしれない、このアッセイを行う場合この要因は心に負担すべき。例として急性骨髄性白血病を使用しましたが、本稿で説明した CRISPR ベース Cas9 の競争の試金をこのメソッドが並列で複数の遺伝子の役割を識別するために任意の癌細胞ラインの使用できます。遺伝子欠失の様々 な利点がある遺伝子ノックダウンに CRISPR Cas9 を使用して RNA 干渉を用いたします。まず、幅広いターゲット mRNA 阻害を示す通常、Shrna と対照をなして sgRNAs Cas9 ヌクレアーゼと相まってをもって標的遺伝子の完全なノックアウトを行います。CRISPR Cas9 ベースのメソッドより劇的な一貫した表現型でとありますにもかかわらず、Shrna と同様、個々 の sgRNAs のターゲット効率が大きく進行している可能性がありますを警告する必要。
流れ cytometry による競争の試金はセルの固定数が遺伝子摂動セルの相対増殖活性を測定するメッキが伝統的な増殖アッセイにいくつかの利点を提供しています。利点の 1 つは、セルの相対増殖することができます簡単かつ迅速に - フローサイトメトリーによる数日、メッキ ステップごとに数えるセルの必要性をとばします。これは、井戸のすべてのカウントとして、いくつかの遺伝子をターゲット候補者 sgRNAs の数が多いをテストは面倒と誤りにつながる可能性があります便利です。異なり、細胞増殖の試金の ATP ベースの計測、cytometry 流れはこの方法が長期的な分析のために有用となる生きた細胞のサンプリングで実行できます。これを演技後半に及ぼす急性骨髄性白血病細胞の増殖を示し、長期的な試金がありますエピジェネティックな変調器などの要因の研究で特に有益です。第二に、同じ内非導入細胞の存在は試金のためのベースラインを設定する使用することができます制御された細胞集団もできます。第三に、マルチ チャンネル ピペットを使用してアッセイ、96 ウェル形式でセットアップを行うことがほぼ完全にできるとき、大幅に全体のプロセスをスピードアップするウイルスの作製と最終的に流れフローサイトメトリー評価 sgRNAs のクローニングから蛍光。
ここで説明する方法は、効率的にスケール アップ並列アレイ画面内に最大 96 の sgRNAs の調査のためにすることができます。4-6 sgRNAs per 遺伝子を仮定すると、このメソッドしたがって使用できます並列で少なくとも 16-24 遺伝子の急速な尋問のため。急性骨髄性白血病細胞で尋問する必要があります全体の分子経路などの遺伝子の多数の場合プール CRISPR ベース Cas9 の画面がより便利になります。
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Disclosures
A.J.D は、A2A 医薬品 (ニュージャージー)、Salgomed (サンディエゴ) 治療コンサルタントです。他の作家を宣言する競合があります。
Acknowledgments
PCW Cas9 プラスミドだったエリック ・ ランダー & デヴィッド ・ サバティーニ (Addgene プラスミド # 50661) と pKLV2 U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - からの贈り物 W プラスミドから遊佐ラボ (Addgene プラスミド #67974。フローの分析と並べ替えとタイムリーなヘルプ SBP 医療探索所フローサイトメトリー コアに感謝したいと思います。西暦女性タタ記念財団のサポートを確認したいと思いますまた次の資金調達のサポートを確認したいと思います: NIH/NCI P30 CA030199 がんセンター主催グラント、V 財団とサンディエゴの NCI のがんセンター (C3) #PTC2017to A.J.D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FLAG-M2 Antibody | sigma-aldrich | F3165, lot # SLBS3530V | |
| Anti-mouse Antibody | Invitrogen | 31446, lot # TA2514341 | |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Fisher | 34095 | |
| ChemiDoc Imaging System | BIO RAD | 17001401 | |
| Sorvall Legend RT centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Blasticidin | Thermo Fisher | R21001 | |
| SYTOX Red | Thermo Fisher | S34859 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985062 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965-092 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875-093 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | SAFC | 12303C | |
| single gRNA vector | Addgene #67974 | pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W | |
| CelLytic Nuclear extraction kit | sigma-alorich | NXTRACT | |
| XtremeGENE 9 | sigma-alorich | 6365787001 | |
| Retronectin | Takara | T100B | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| T4 PNK | NEBioLabs | M0201S | |
| T4 DNA ligation buffer | NEBioLabs | B0202S | |
| T4 DNA Ligase enzyme | NEBioLabs | M0202S | |
| Ampicillin | Fisher scientific | BP1760-25 | |
| LB agar | Fisher scientific | BP9724-500 | |
| LB Broth | Fisher scientific | BP9731-500 | |
| Qiagen mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher | NanoDrop One | |
| Recombinant Murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Recombinant Murine M-CSF | Peprotech | 315-02 | |
| Stable competent cells | NEBiolabs | C3040I | |
| 10 cm Tissue Culture dishes | Fisher Scientific | 353003 | |
| Cell lysis solution | Qiagen | 158906 | |
| Protein precipitation solution | Qiagen | 158910 | |
| DNA hydration solution | Qiagen | 158914 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| BbSI | New England BioLabs | R0539S | |
| APEX 2.0x Taq Red Master Mix Kit | Genessee Scientific | 42-138 | |
| Puromycin | Fisher scientific | BP2956100 | |
| 50 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495949A | |
| 15 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495970C |
References
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